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240
6. Biocapteurs6.1 Principe d’un biocapteur
Biocapteur = élément de reconnaissance moléculaire + transducteur
L’élément de reconnaissance moléculaire réagit spécifiquement avec le bio-analyte d’intérêt.
Le transducteur agit en tant que détecteur, convertissant l’évènement de reconnaissance moléculaire en un signal facilement mesurable.
élément de reconnaissancemoléculaire
transducteur
analyte analyte
élément de reconnaissancemoléculaire
transducteur
signal signal
241(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
L’élément de reconnaissance moléculaire et le transducteur sont intégrés dans un seul dispositif (petit et portatif) permettant de doser directement l’analyte d’intérêt sans l’ajout d’autres réactifs ou de pré-traitement de l’échantillon.
242
L’élément de reconnaissance moléculaire:est immobilisé à/près de la surface du transducteur par physisorption, chimisorption ou par piégeage dans une membrane inerteoffre une spécificité et une sensibilité élevées pour l’analyte, ainsi qu’une réponse rapideex. enzymes, anticorps, ADN, cellules entières, micro-organismes
Le transducteur:est le composant d’un biocapteur qui détecte les changements physiques se produisant dans l’élément de reconnaissance moléculaire suite à la liaison de l’analyte et les convertit en un signal de sortie qui peut être amplifié, affiché et sauvegardépeut convertir le signal provenant d’un évènement de reconnaissance moléculaire soit directement ou par le biais d’un médiateur chimique (ex. glycomètre)
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,Bioanalytical Chemistry, 2004)
Principe de fonctionnementd’un biocapteur
243(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
Modes de transduction:le type de reconnaissance moléculaire détermine le type de transducteur utiliséex. spectrophotométrie, électrochimie, calorimétrie et piézo-électricité
244
Combinaisons différentes
Détection de H2O2/O2, électrodes aux enzymes
ampérométrie- Enzyme- Micro-organisme- Tissue - Anticorps marqué avec enzyme
Électrodes rédox et sélectives aux ions (ex. électrode de verre, électrodes sélectives au CO2, NH3 et sulphide)
potentiométrie- Enzyme- Micro-organisme- Tissue (plante ou animale)- Anticorps marqué avec enzyme
Électrochimie
ExempleTransducteurÉlément biologique
245
BIAcore (avec surfaces d’Au ou Ag)
résonance de plasmons de
surface (SPR)
- Anticorps- Antigène- Enzyme- Acide nucléique
Électrodes de Pt ou Au pour déterminer le changement de conductivité de la solution due à la production d’ions
Photodiodes, fibre-optiques, puces à ADN
Conductimétrie
Optiquefluorescence
- Enzyme-Bicouche lipidique
- Anticorps- Acide nucléique
Électrochimie
ExempleTransducteurÉlément biologique
246
Dispositifs piezoélectriques, microbalance à cristal quartz
Thermisteur ou thermopile
Acoustique
Calorimétrie
- Anticorps- Antigène- Enzyme- Acide nucléique
- Enzyme- Micro-organisme- Cellule
ExempleTransducteurÉlément biologique
B.M. Paddle, « Biosensors for chemical and biological agents of defence interest »,Biosensors & Bioelectronics 1996, 11, 1079-1113
247
6.2 Biocapteur à base d’enzyme
Le 1er biocapteur (développé par Clark et Lyons en 1962 pour la détection du glucose) était constitué de la glucose oxydase (GO) piégée à la surface d’une électrode de Pt par une membrane à dialyse permettant la diffusion des substrats et produits à/de la couche enzymatique.
La conversion du D-glucose (S) en gluconolactone (P) et H2O2est détectée par électrochimie:
enzyme piégée dans une
membrane semi-perméableS + O2 P + H2O2
électrode de référenceélectrode
de travailélectrode auxiliaire
H2O2 2H+ + O2 + 2e
-
Eappliqué = +0.70 V vs. E.C.S.
iCapteur ampérométrique
248
L’amplitude du courant mesuré (i) dépend de quatre facteurs:
cinétique de transfert de masse qui détermine les vitesses auxquelles les substrats peuvent être fournis à et les produits enlevés de la couche enzymatique
cinétique enzymatique qui détermine la vitesse à laquelle le H2O2 est généré à l’intérieure de la couche enzymatique
cinétique de la réaction électrochimique qui détermine la vitesse à laquelle le H2O2 produit dans la réaction enzymatique est converti en O2efficacité de conversion, i.e. fraction de H2O2 oxydée
Les réactions se produisent dans une mince couche à la surface du transducteur; des concentrations stables des réactifs et des produits existent dans cette couche lorsqu’un signal constant estobtenu.
249
Fe(CN)64-
Fe(CN)63-
FAD
FADH2
C6H12O6
C6H10O6
électrode
glucose oxydase
e-glucose
gluconolactone
contacteélectrique
électrode de travail/enzyme
électrode deréférence Ag/AgCl
zone réactive
Bandelette-test pour le glucose
Glycomètre - biocapteur ampérométrique
250
L’accepteur physiologique (O2) est remplacé par un médiateur synthétique (1,1’-diméthyl-ferrocène ou Fe(CN)63-/4-) pouvant transporter les électrons du centre rédox de l’enzyme à la surface de l’électrode.
Due à l’utilisation d’un médiateur artificiel, l’analyse devient insensible à la fluctuation du taux d’oxygène (i.e. N2 vs. air)
L’analyse peut aussi être effectuée à des potentiels plus bas (élimination d’espèces interférentes).
(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)
Courbes d’étalonnage enregistrées pour le glucose avec le ferrocène
comme médiateur
251
sonde moléculaire
6.3 Microréseau à base d’ADN
Un microréseau à base d’ADN permet l’analyse en parallèle de plusieurs gènes sur un seul dispositif. Des dizaines de milliers de réactions peuvent être effectuées simultanément sur une seule puce à ADN.
Cette nouvelle technologie exploite l’appariement de deux oligonucléotidescomplémentaires. Avec un microréseau d’ADN, il est possible d’identifier la séquence d’un gène et de détecter des mutations génétiques.
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
252
Fabrication de macro- ou microréseaux d’ADN
Une puce à ADN contient un arrangement ordonné d’oligonucléotidesimmobilisés en forme de points sur un support solide miniaturisé(généralement du verre). Chaque point d’une puce contient jusqu’à~106 oligonucléotides identiques, mais la séquence nucléotidique varie d’un point à l’autre.
253
Dans un macroréseau, la taille des points est ≥ 300 µm. Il y a 1,000 à 10,000 différents points par puce.
Les macroréseaux sont fabriqués avec un dispositif piezoélectriqueprogrammable (cf. imprimante à jet encre)
(1) (2) (3) (4) (5)
Étapes de fabrication d’un macroréseau
254
Modes d’immobilisation des oligonucléotides:
Couplage covalent d’un oligonucléotide
1- Modification de la surface de verre avec un silane fonctionnalisé
OHSi
H3COH3CO
H3COX
SiH3CH3C
ClXOH
Si XO
O
O
O Si XH3C
H3C
+
ou
+
95% acetone/5% eau
(ou X= NH2, SH, CHO, ) O
255
2- Réaction avec oligonucléotide aminé, NH2-(CH2)6-O-(PO)2-oligo
H21,4-phénylenediisothiocynate
256
CHO
CH=
- Attaque nucléophilique (-NH2, -SH, -OH) sur des époxydes
257
Couplage non-covalent (adsorption électrostatique)groupements phosphate chargés négativement de l’ADN
– Surface modifiée avec un γ-amino propylsilane– Surface modifiée avec une couche de poly-L-lysine
258
puce à ADN d’Affymetrix
Dans un microréseau, la taille des points est de 20 à 50 µm (ex. puce à ADN d’Affymetrix).
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
259
Fabrication d’un microréseau par photolithographie
www.affymetrix.com
O OSi SiH3C CH3 H3C CH3OH OH
plaque de verre
ClSi(CH3)2
-HCl
260
Principe d’une puce à ADN
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
(marqueur fluorescent)
261
Lecteur de microréseaux-microscope confocal à fluorescence induite par laser
λexcitation: Vert (532 nm)Rouge (633 nm)
262
C
Séquençage de l’ADN avec un microréseau
Un microréseau constititué de 44 = 128 points de tetranucléotides. Pour simplicité, seulement une chaîne est illustré par point.
Un microréseau après réaction avec de l’ADNpartiellement digéré. L’hybridation avec les tetranucléotidesdu réseau est indiquée en rouge.
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
263
Marqueurs fluorescents: rhodamine et fluoresceinou Cy3 et Cy5 λexcitation: Vert (532 nm)
Rouge (633 nm)
264
Microréseaux et les couleurs des points
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