View
6
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
140
Chapitre 7
Modélisation
Les formes de modèles présentées dans la littérature pour les cellules de plantes sont non
structurés et ne sont aucunement prédictifs. De plus, ils ne donnent aucune appréciation des
états métaboliques des cellules. Le modèle développé ici poursuit les travaux de Bouchard-
Marchand (2000) et Jolicoeur (1998), qui s’étaient limités au métabolisme primaire. Les
résultats générés lors des cultures de racines transformées deC. roseusprésentées aux cha-
pitres précédents ont fournit les bases biologiques du modèle présenté ici. Leur exploitation
permettra de déterminer certains paramètres du modèle.
Le modèle proposé dans ce chapitre pose la structure d’un modèle prédictif dont le but est
de prévoir le comportement métabolique d’une culture de racines transformées deC. roseus
en mode cuvée et semi-continu. L’originalité de ce modèle est qu’il tient compte de nom-
breuses voies métaboliques primaires pour décrire la croissance et la production de TIA. Il
informera sur le statut de voies métaboliques activées ou inhibées selon le statut nutritionnel
des racines.
Un tel modèle est cependant ambitieux, car il vise à constituer un outil utile de valida-
tion d’hypothèses basées sur la physiologie des racines. Au moment de la rédaction de ce
mémoire, ce modèle est stable numériquement, mais n’est pas optimisé pour décrire les mé-
tabolismes primaires et secondaires deC. roseus. Aussi, la structure du modèle est présentée
comme base de travail ultérieur. Des hypothèses de modélisation sont posées et nombre im-
141
portant de paramètres devront être déterminés lors de travaux futurs. L’objet principal de ce
travail est d’apporter une nouvelle structure de modèle qui pourra être facilement ajustée
par la suite. Les différents paramètres (lois cinétiques, constantes) seront aussi adaptables à
d’autres espèces de plantes.
7.1 Objectifs et synoptique du modèle
Les objectifs du modèle sont relativement simples, mais dans cette simplicité se cache
une grande complexité. Le modèle doit être capable d’estimer l’orientation du métabolisme
de la cellule selon l’état physiologique de la cellule et certains signaux. Cette capacité doit
l’amener a prédire les dynamiques extra et intracellulaire des espèces chimiques étudiées.
Afin de remplir cet objectif, il est nécessaire de comprendre le fonctionnement de la cel-
lule vivante. La revue de littérature et les chapitres précédents apportent beaucoup d’infor-
mations à ce sujet. Selon une vision purement physique, la cellule vivante est un bioréacteur
dans lequel se produit un nombre extraordinaire de réactions biochimiques simultanément et
qui est capable d’évoluer selon son environnement. Ceci est thermodynamiquement possible
grâce à l’utilisation d’énergie externe apportée sous la forme de photons ou de matières orga-
niques. Sans cette énergie, la cellule meurt. Vu la complexité et notre connaissance limitée du
réseau métabolique impliqué, modéliser l’ensemble de ces réactions biochimiques de manière
exhaustive ne se produira probablement pas avant longtemps. En revanche, il est possible de
faire une synthèse simplifiée des phénomènes régissant la vie d’une cellule.
Le modèle doit être capable de prédire l’évolution d’un système en culture cuvée. Ce
genre de système n’est jamais en état stationnaire. Le modèle doit donc intégrer des notions
de cinétique afin de rendre compte de l’évolution du système. Il doit aussi intégrer la connais-
sance des mécanismes cellulaires et de leur régulation, ceci afin de donner à la cellule simulée
un pouvoir de décision. Ceci implique nécessairement l’écriture d’un réseau de réactions chi-
miques décrivant le fonctionnement de la cellule. Ce réseau est appelé réseau métabolique.
142
Les voies métaboliques primaires sont nombreuses et partagent de nombreux intermé-
diaires. Aussi, le réseau métabolique décrivant toutes ces réactions est relativement complexe.
Pourtant, d’un point de vue mécanistique, plusieurs voies métaboliques clefs ont été isolées
(section 2.1): la glycolyse, la voie des pentoses phosphates, le TCA, etc. Si on souhaite don-
ner au modèle un pouvoir décisionnel sur le choix des voies métaboliques à privilégier, il
faut obtenir un moyen de réguler ces voies simplement. Cette tâche serait probablement dif-
ficile à réaliser avec un modèle purement cinétique. En effet, il faudrait incorporer dans les
lois cinétiques de chaque réaction des paramètres décrivant la participation de chaque voie
métabolique dans le flux total de la réaction.
Le fait de supposer que certains intermédiaires réactionnels sont à l’état stationnaire per-
met de simplifier une partie des calculs du réseau métabolique. Cette hypothèse est justifiée
par le maintient de l’homéostasie de la plupart des intermédiaires réactionnels impliqués dans
le métabolisme primaire. Les calculs utilisés dans l’analyse de flux métaboliques (MFA) sont
en effet suffisamment puissants pour déterminer les flux de sortie d’un système à l’état sta-
tionnaire en fonction des flux d’entrée (Stephanopoulos et al., 1998). La technique d’analyse
de la structure des réseaux métaboliques1 (ASRM) développée par le même auteur permet de
trouver les voies métaboliques indépendantes dans un réseau métabolique.
Le modèle proposé utilise les nécessités d’une description cinétique et les avantages du
calcul par la technique du ASRM pour simplifier une partie du réseau métabolique. La mo-
délisation est divisée en deux parties.
La première partie est chargée de décrire la cinétique de transport des nutriments dans
la cellule, la cinétique de stockage de ces nutriments, la cinétique de stockage des macro
molécules créées par la cellule et la cinétique de croissance liée a l’utilisation de ces macro-
molécules. L’ensemble des réactions décrivant ces dynamiques nutritionnelles est appelé le
sous-réseau métabolique transitoire primaire (SMTP). Dans le cas présent deC. roseus, le
métabolisme secondaire est décrit également par des lois cinétiques à partir de deux précur-
1. Analysis of structure of metabolic networks.
143
seurs : la tryptamine et la sécologanine. Les réactions du métabolisme secondaire forment ce
qu’on appelle par la suite le sous-réseau métabolique transitoire secondaire (SMTS).
La seconde partie est chargée de décrire la synthèse de macro molécules, de précurseurs
de métabolites secondaires et la génération d’énergie à partir des nutriments disponibles dans
le cytosol. Cette partie est décrite par un réseau de flux métaboliques considérés comme étant
à l’état stationnaire. Ce réseau est nommé sous-réseau métabolique stationnaire (SMS). Il est
simplifié en voies métaboliques indépendantes par la technique de ASRM.
Les navettes énergétiques définies à la section 2.1 (ATP, NADH et NADPH) ne sont pas
considérées comme des métabolites dont la concentration est à l’état stationnaire. Ils forment
le bassin des navettes énergétiques, dont le contenu est dynamique.
Ainsi, le modèle fonctionne de cette manière : le SMS est réduit en voies métaboliques
indépendantes pour lesquelles des lois cinétiques sont assignées. L’ensemble de ces voies
indépendantes et des voies du SMTP et du SMTS forment le réseau métabolique complet,
décrit par des lois cinétiques. Les espèces chimiques du réseau complet sont représentées par
un vecteurX dont la variation par rapport au temps s’exprime simplement par:
dXdt
= F(X)−µX
La fonctionF calcule les variations des bassins de nutriments, macro-molécules et méta-
bolites secondaires en fonction du contenu de ces bassins. Comme la plupart des cinétiques
utilisées sont de type Monod,F est non linéaire. Le terme−µX représente la dilution des
espèces intracellulaires à cause de la croissanceµ. Un schéma résumant le fonctionnement du
modèle est présenté sur la figure 7.1.
Le fait d’avoir réduit en chemins métaboliques indépendants les réactions du SRS présente
deux avantages:
1. le nombre de réactions cinétiques est réduit,
144
Figure 7.1 –Synoptique du modèle cinétique.
145
2. le modèle peut choisir en temps réel quel chemin métabolique privilégier selon le statut
nutritionnel de la cellule. Ces décisions sont appuyées sur des connaissances acquises
lors de l’expérimentation et fournies dans la littérature.
Dans un premier temps, les hypothèses du modèle en entier sont présentées. Ensuite, les
voies métaboliques indépendantes du SMS sont déterminées. Enfin, le STMP et le SMTS sont
décrits, ainsi que l’intégration des voies métaboliques indépendantes du SMS dans le modèle
cinétique.
7.2 Hypothèses de modélisation
7.2.1 État quasi-stationnaire
On suppose que les réactions du métabolisme primaire sont à l’état stationnaire. Les bas-
sins de nutriments alimentant ces réactions ne sont en revanche pas à l’état stationnaire.
7.2.2 Bassins de nutriments
Le trois nutriments utilisés sont le Pi, l’azote sous forme de nitrate (NO3) ou d’ammonium
(NH4), et les glucides sous forme de saccharose (SAC), glucose (GLU) et fructose (FRU).
Dans la cellule, ces nutriments existent dans le cytosol et dans le vacuole (Pi (VPi), saccharose
(VSAC) et nitrate (VNO3)). Ce choix est basé sur les résultats présentés dans les chapitres
précédents et ceux sur les racines transformées de carotte (Bouchard-Marchand , 2000).
7.2.3 Bassins des métabolites
Les métabolites produits par les réaction biochimiques sont stockés dans des bassins. Ce
sont les acides aminés (AA), les lipides (LIP), les phosphates organiques (nucléotides, etc.)
(OP), la paroi cellulaire (STH), les acides organiques (ORA), et l’amidon (STA). Ils sont
utilisés pour la croissance ou en cas de limitation nutritionnelle, comme source de nutriments
via des réactions de catabolisme explicitées. L’amidon fait exception dans le sens où il n’est
146
pas utilisé directement pour la croissance. Il est synthétisé et stocké dans les plastides. Il est
considéré comme réserve de glucides en cas de carence de saccharose, glucose ou fructose.
La tryptamine (TRY) et la sécologanine (SEC) représentent aussi deux bassins de méta-
bolites alimentés par le métabolisme primaire et utilisé par le métabolisme secondaire.
7.2.4 Croissance
La croissance est modélisée de manière exponentielle où le taux spécifique de croissance
suit une forme de Teissier (Bouchard-Marchand , 2000; Jolicoeur, 1998):
µ= µmax.∏i
(1−e−Ki([Métabolitei ]−[Seuili ])
)
où i est un élément de l’ensemble {acides aminés, lipides, phosphates organiques, paroi cel-
lulaire, navettes énergétiques}.
7.2.5 Lois cinétiques
Les vitesses de réactions suivent pour la plupart des cinétiques de Monod, à une ou deux
affinités. En effet, les réactions de transport ou de conversion chimiques sont toutes enzyma-
tiques et ce type de réactions est bien décrit par une cinétique de Monod.
Les problèmes surviennent lorsqu’on désire tenir compte des navettes énergétiques dans
les lois cinétiques. En effet, la plupart des transports de nutriments sont actifs et font donc
intervenir de l’ATP. Beaucoup de réactions enzymatiques nécessitent des cofacteurs tels que
le NAD+/NADH ou le NADP+/NADPH. De même, le Pi est utilisé dans la plupart des ré-
actions mettant en jeu de l’ATP. Si ces navettes énergétiques ne sont plus disponibles, les
réactions qui les utilisent doivent avoir une vitesse de réaction nulle.
Plusieurs options sont possibles. Si une réaction utilise un substrat S et par exemple du
NADH, les cinétiques enzymatiques à 2 substrats peuvent être utilisées. Si des réactions mo-
léculaire d’ordre 1 pour chaque substrat et pour l’enzyme sont utilisées, selon le mécanisme
147
réactionnel, trois types de cinétiques sont obtenues: adsorption séquentielle ordonnée des 2
substrats sur l’enzyme, adsorption séquentielle aléatoire des 2 substrats sur l’enzyme, et mé-
canisme ping-pong qui nécessite la formation d’au moins 2 produits. Par exemple, la cinétique
du premier mécanisme s’écrit pour deux substrats A et B (Michal, 1999):
1v0
=1
vmax+
KAM
vmax× [A]+
KBM
vmax× [B]+
KABM
vmax× [A]× [B]
Ce genre de cinétiques n’est pas adaptés aux réactions décrites dans le modèle développé
dans ce chapitre. En effet, ce ne sont pas des réactions élémentaires. Les réactions du modèle
intègrent la plupart du temps un transport ou des réactions enzymatiques successives, associés
à une consommation énergétique.
Afin de pouvoir tester le modèle avec des simulations, deux formes de cinétiques peuvent
être envisagées. La première est basée sur un mécanisme dans lequel la réaction chimique
est élémentaire et tous les substrats se fixent en même temps sur l’enzyme. Il est facile de
montrer que la vitesse de réaction s’écrit:
v = vmax
∏i
[Si ]
Km +∏i
[Si ]
D’un point de vue mathématique, ce genre de relation risque de causer des problèmes de
précision en calcul flottant et de stabilité numérique si on utilise beaucoup de substrats. De
plus, cela défini un seulKm pour l’ensemble de la réaction. Or les réactions modélisées ne
sont pas élémentaires. Aussi la cinétique suivante est proposée:
v = vmax ∏i
[Si ]K i
m +[Si ]
Cette forme de cinétique permet d’ajuster individuellement l’influence de la concentration
de chaque produit sur la vitesse de réaction. Le désavantage principal de cette forme de loi
cinétique est qu’il introduit beaucoup de paramètres.
Certaines réactions ont des coefficients stœchiométriques élevés pour les navettes éner-
148
gétiques. Pour tenir compte de l’ordre partielνi des réactifs, on peut améliorer la relation
précédente:
v = vmax ∏i
[Si ]νi
(K im)νi +[Si ]νi
Ainsi, le modèle utilise pour la majorité des lois cinétiques ce type de loi.
7.2.6 Fonctions de décisions
Le modèle doit décider quelle voie métabolique il privilégie selon le statut nutritionnel
de la cellule et en cas d’élicitation. Ces décisions dépendent des concentrations des bassins
nutritionnels. La manière la plus simple de modéliser une décision est d’utiliser une condition
du genre :
δ(S,Ss) =
0 si S< Ss,
1 si S> Ss.
où Ss est la concentration seuil de la décision. On multiplie alors la vitesse d’un flux par
δ(S,Ss).
Cette approche n’est pas très satisfaisante pour des phénomènes biologiques et les fonc-
tions sigmoïdes sont plus appropriées pour décrire une réponse continue au lieu d’un réponse
discrète (Thornley et Johnson, 1990):
σ(S,Ss,n) =Sn
Sns +Sn
oùn est l’ordre de la sigmoïde. Cette fonction est une généralisation de la fonctionδ puisque
limn→+∞
σ(S,Ss,n) = δ(S,Ss)
Pour une valeur den = 1, on retrouve un fonction de Monod classique. Dans la suite du
149
chapitre, on fera appel aux fonctions de Monod par la notationσ(S,Ss,1). Pourn > 2, ces
fonctions ont une tangente horizontale à l’origine et un point d’inflexionSi tel que:
Si = Ss
(n−1n+1
) 1n
Ces fonctions sont utilisées chaque fois que le modèle doit prendre une décision pour
calculer la répartition des flux métaboliques dans les voies métaboliques.
7.2.7 Expression des concentrations
Les concentrations extracellulaire sont exprimées en mM. En effet, les vitesses de trans-
port des nutriments sont décrites par des cinétiques de Monod qui dépendent de la concen-
tration en mM des nutriments. Les concentrations intracellulaires sont exprimées en mmol.g
DW−1. L’utilisation de concentrations exprimées en mmol.g FW−1 pourrait être envisagée si
on pouvait déterminer les concentrations des différents métabolites en mM en utilisant des
techniques comme la RMN. Les mesures effectuées dans ce projet ne tiennent pas compte de
la compartimentation des différents métabolites dans la vacuole, les plastides, les mitochon-
dries, etc. Il est nécessaire d’exprimer les concentrations par unité de biomasse, afin de rester
consistant avec l’écriture de la loi de conservation de la matière.
7.2.8 Navettes énergétiques
Les navettes énergétiques utilisées sont le NADH, le NADPH et le NTP, nom générique
englobant tous les nucléotides trisphosphatés (ATP, GTP, CTP et UTP). Ces trois navettes
énergétiques ont leur partenaire : NAD+, NADP+et NDP respectivement. Les bassins de na-
vettes énergétiques sont dynamiques.
On suppose que les sommes (NDP+NTP), (NAD++NADH) et (NADP++NADPH) restent
constantes dans le temps et sont négligeables devant les concentrations des nutriments et des
métabolites. On néglige donc la formation et la dégradation de ces navettes. Cette hypothèse
est très contestable, notamment pour le NTP dont les concentrations cellulaires ont été repor-
150
tée comme étant assez élevées : de l’ordre de 10 mmol/g DW dans les cellules mammifère
CHO (Chinese Hamster Ovary) (Nyberg et al., 1999).
7.2.9 Simplification des voies métaboliques
Les voies métaboliques primaires sont simplifiées. Cette hypothèse se justifie par le nombre
très élevé de réactions impliquées. Pour les objectifs du modèle, il est peu probable que tenir
compte de toutes les réactions de biosynthèse soit requise.
On considère notamment que tous les acides aminés sont synthétisés à partir de l’oxoglu-
tarate (voir figure 2.3). En réalité, l’oxoglutarate est la molécule où se fixe l’ammonium pré-
sent dans tous les acides aminés. Mais le squelette carboné des différents acides aminés pro-
vient non seulement de l’oxoglutarate, mais aussi de l’oxaloacétate, du ribosyl-5-phosphate,
et de l’érythrose-5-phosphate + glycéraldéhyde. Ces squelettes carbonés sont aminés par une
transamination à partir du glutamate ou de la glutamine (Michal, 1999). La synthèse du tryp-
tophane est explicité sous une forme simple dans le SMS, car cet acide aminé intervient
explicitement dans la formation des précurseurs des TIA.
La synthèse des nucléotides est différente selon le type du nucléotide. Cette synthèse est
modélisée par une réaction chimique dont le bilan est la moyenne des bilans de production
des quatre nucléotides.
La synthèse de la paroi cellulaire fait intervenir également beaucoup de réactions car sa
structure chimique est très complexe (Reid, 1997). La réaction bilan de cette synthèse est
une moyenne des différentes réactions impliquées dans la synthèse de la paroi cellulaire, en
considérant qu’un précurseur (le glucose-6-phosphate) est convertit en une certaine unité de
paroi cellulaire.
La synthèse et la dégradation des lipides ont été simplifiées en considérant qu’un acétyl-
coenzyme A qui est normalement intégré dans un lipide vient augmenter le bassin des lipides
(réactions biochimiques explicitées par Harwood (1997)).
151
Les voies anaplérotiques sont simplifiées en une seule voie : phosphoénolpyruvate−→oxaloacétate.
7.2.10 Voies alternatives de la glycolyse
Les voies alternatives de la glycolyse (Plaxton, 1998) sont prises en compte au niveau de
la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3 disphosphoglycérate et phosphoénolpy-
ruvate en pyruvate.
7.3 Sous-réseau métabolique stationnaire
7.3.1 Schéma métabolique proposé
Le schéma métabolique du SMS a été établi à partir de l’étude du métabolisme primaire
des cellules de plantes (section 2.1). Il est présenté sur la figure 7.2. Les nutriments utilisés
par le métabolisme primaire sont le glucose, le fructose, le saccharose et l’ammonium. Les
produits du réseau métabolique sont l’amidon, les hexoses structuraux (constituants de la pa-
roi cellulaire), les molécules organiques phosphatés (nucléotides, phospholipides et acides
nucléiques), les acides aminés, les acides organiques, la tryptamine et la sécologanine. Les
concentrations de ces espèces ne sont pas à l’état stationnaire. Enfin, les navettes énergé-
tiques, l’ammonium et le Pi sont utilisées par le SMS. Toutes ces espèces chimiques ont une
concentration dépendante du temps.
Les intermédiaires du SMS dont la concentration est considérée comme indépendante
du temps sont le glucose-6-phosphate, le phosphoénolpyruvate (glycolyse), le fructose-6-
phosphate, le glycéraldéhyde-3-phosphate (glycolyse et voie des pentoses phosphates), le
ribulose-5-phosphate, l’érythrose-5-phosphate (voie des pentoses phosphates), l’acétyl-co-
enzyme A, l’oxaloacétate, l’oxoglutarate (TCA), et le chorismate (voie de l’acide shiki-
mique). Les différentes voies métaboliques primaires ont été simplifiées (figure 7.2). Les
bilans métaboliques de ces voies sont présentés sur le tableau 7.1. Ils ont été établis à partir
152
Figure 7.2 – Sous-réseau métabolique. AA: acides aminés, A-CoA: acetyl-coenzymeA, CHO: chorismate, E4P: érythrose-4-P, F6P: fructose-6-P, FRU: fructose, G3P:glycéraldéhyde-3-P, G6P: glucose-6-P, GLU: glucose, GST: structural glucides; SEC: sé-cologanine, LIP: lipides, PEP: phosphoénolpyruvate, PYR: pyruvate, OAA: oxaloacétate,OP: molécules organiques phosphatées, ORA: acides organiques, OXO: oxoglutarate, R5P:ribulose-5-P, STA: amidon, STH: hexoses structuraux, SAC: saccharose, TRY: tryptamine.
des ouvrages de références (Michal, 1999; Taiz et Zeiger, 1998).
153
Tableau 7.1 –Réactions du SMS.Réaction Réaction Référence
1 GLU + NTP −→ G6P + NDP 1,2,62 FRU + NTP −→ F6P + NDP 1,2,63 G6P + 2 NADP −→ R5P + 2 NADH 14 3 R5P −→ 2 F6P + G3P 15 E4P + 2 PEP + NTP + NADH −→ CHO + 4 Pi + NDP + NAD 26 CHO + 2 AA + 2 NTP + R5P −→ PYR + 2 NDP + PPi + G3P + TRY 27 PEP −→ OAA + Pi 1,68 OXO+2 NAD + NDP + Pi −→ OAA + 2 NADH + NTP 19 PYR + NAD −→ NADH + ACOA 110 OXO + NH4 + 3 NADPH + 3 NTP −→ AA + 3 NADP + 3 NDP + 3 Pi 211 ACOA + NTP + 2 NADPH −→ LIP + NDP + Pi + 2 NADP 112 2 R5P −→ F6P + E4P 113 3 ACOA + 2 NADPH + 3 NTP −→ SEC + 2 NADP + 3 NDP + 3 Pi 114 G6P −→ F6P 1,2,615 ACOA + OAA + NAD −→ OXO + NADH 116 PEP + NDP −→ PYR + NTP 1,2,617 PEP −→ PYR + Pi 3,618 G3P + Pi + NDP + NAD −→ PEP + NTP + NADH 1,2,619 G3P + NADP −→ PEP + NADPH 3,620 F6P + NTP −→ 2 G3P + NDP 1,2,621 R5P+PYR + NTP −→ SEC + NDP + 2 Pi 422 R5P + 3.75 AA + 7 NTP + 0.25 NAD −→
7 NDP + 3.5 Pi + 1.75 PPi + 0.25 NADH + OP 223 G6P + 2 NTP + NADPH −→ STH + 2 NDP + NADP + Pi + PPi 224 STA + Pi −→ G6P 125 G6P + NTP −→ STA + NDP + PPi 226 LIP + 2 NTP + NAD −→ 2 NDP + PPi + NADH 527 ACOA −→ ORA28 ORA −→ ACOA29 F6P + PPi −→ 2 G3P + Pi 330 SAC + 2 NTP −→ G6P + F6P + 2 NDP 131 SAC + PPi −→ G6P + F6P 3
1 Taiz et Zeiger (1998)2 Michal (1999)3 Plaxton (1998)4 Contin et al. (1998)5 Harwood (1997)6 Brownleader et al. (1997)
7.3.2 Réduction du sous-réseau métabolique stationnaire en voies indé-
pendantes
Méthode. Pour réduire le SMS en voies indépendantes, on écrit la matrice des coefficients
stœchiométriques des réactions du réseau en ne tenant compte que des intermédiaires réac-
tionnels pour lesquels on a supposé un état stationnaire. Cette matrice est appelée matrice
SIMS (Stephanopoulos et al., 1998; Simpson et al., 1999). C’est une matricen×m écrite de
cette manière :
154
no. réaction
︷ ︸︸ ︷
N =
ν11 · · · ν1m...
.. ....
νn1 · · · νnm
no. métabolite
Ainsi νi j est le coefficient stœchiométrique du métabolitei dans la réactionj.
Dans notre cas, il y 31 réactions et 11 métabolites. La matrice SIMS est donc une matrice
11×31.
La détermination des voies métaboliques nécessite le calcul de la matrice noyauK qui est
une matricen×m:
no. voie métabolique
︷ ︸︸ ︷
K =
ν11 · · · ν1p...
.. ....
νm1 · · · νmp
no. réaction
La matriceK décrit chaque voie indépendante comme une combinaison linéaire des 31
réactions du SMS. Elle est une solution non triviale de l’équation (Stephanopoulos et al.,
1998):
N.K = 0
Comme cette équation admet une infinité de solutions, il est nécessaire de fixer arbitraire-
ment une partie de la matriceK. On peut ensuite calculer le reste de la matrice. Pour trouver
K, on procède comme suit. On décompose N en deux matrices:
N =(
N1 N2
)
155
tel queN1 soit une matrice carrée inversible (ceci peut nécessiter le changement des numéros
de réaction dans le réseau métabolique).
On décomposeK en 2 matrices:
K =
K1
K2
tel queK2 soit une matrice carrée de dimension le nombre de colonnes deN2. C’est cette
matrice qui constitue la partie du noyau qu’on fixe arbitrairement.
On a alors la relation :
(N1 N2
).
K1
K2
= 0
qu’on peut écrire :
N1.K1 +N2.K2 = 0
Dans cette équation, la seule inconnue estK1. CommeN1 est inversible, il vient:
K1 =−(N1)−1.N2.K2
De manière pratique, on peut commencer par poserK2 = I (I étant la matrice identité). Le
calcul deK1 permet ensuite de voir quels chemins métaboliques indépendants sont obtenus.
Souvent, les chemins obtenus sont physiquement non réalistes (par exemple le pyruvate donne
du ribose-5-phosphate). Cependant, ces chemins indépendants forment une base des chemins
métaboliques du système. En calculant des combinaisons linéairement indépendantes de ces
chemins, il est possible d’obtenir une nouvelle base de chemins indépendants qui ont une
signification physique.
156
(1) Biosynthèse duTryptophane
(2) chemin de l’acidemévalonique + synthèse de la
sécologanine
(3) Conversionglucose-fructose
(4) Voie des pentose phosphateet TCA
(5) Biosynthèse des acidesaminés
(6) Régulation de la pyruvatekinase
(7) Biosynthèse des lipides (8) Régulation de la conversiondu glycéraldéhyde-3-P
Figure 7.3 –Voies indépendantes du sous-réseau métabolique stationnaire (1 à 8).
Résultats. Les matricesN1, N2, etK du système sont données en annexe. Les 31 réactions
chimiques faisant intervenir 11 intermédiaires se simplifient en 20 voies métaboliques indé-
pendantes présentées sur les figures 7.3 et 7.4.
157
(9) Glycolyse + TCA (10) Biosynthèse de lasécologanine par les triosesphosphatés et le pyruvate
(11) Biosynthèse desphosphates organiques
(12) Biosynthèse de la paroicellulaire (hexoses structuraux)
(13) Dégradation de l’amidon (14) Biosynthèse de l’amidon (15) Dégradation des lipides (16) Biosynthèse des acidesorganiques
(17) Dégradation des acidesorganiques
(18) Régulation de laphosphofructokinase
(19) Voie de l’invertase (20) Voie de la saccharosesynthétase
Figure 7.4 –Voies indépendantes du sous-réseau métabolique stationnaire (9 à 20).
158
Ces voies sont représentatives des chemins métaboliques primaires qui sont importants
pour le système étudié. On retrouve la glycolyse + TCA et la voie des pentoses phosphates
+ TCA. On trouve la biosynthèse des acides aminés, de la paroi cellulaire, des phosphates
organiques, des lipides, des acides organiques, de la tryptamine (via le tryptophane), et de
la sécologanine selon les deux voies reportées dans la littérature (Contin et al., 1998; Taiz et
Zeiger, 1998).
L’ensemble de ces biosynthèses utilisent le glucose comme précurseur. Quatre voies in-
dépendantes permettent de moduler la source des glucides. Ces voies, telles qu’elles sont
écrites, ne sont pas physiquement acceptables (flux négatifs): fructose−→ glucose (voie
3), saccharose−→ 2 glucose (voies 19 et 20 selon l’état phosphaté de la cellule) et ami-
don −→ glucose (voie 13). Néanmoins, comme ces voies métaboliques sont indépendantes,
la superposition de la voie 3 sur une voie de biosynthèse permet d’obtenir la même voie de
biosynthèse dont le squelette carboné ne provient plus du glucose, mais du fructose.
Dans le même ordre d’idées, les voies 8 et 18 ont apparemment un bilan nul (glycéral-
déhyde-3-phosphate−→ glycéraldéhyde-3-phosphate par exemple). Ces deux voies per-
mettent de décrire les mécanisme adaptatifs de la cellule à une carence de phosphate (Plaxton,
1998). La superposition de ces voies sur une voie de biosynthèse utilisant une partie de la gly-
colyse permet par exemple de modéliser le fait que le phosphoénolpyruvate n’est pas convertit
en pyruvate par la pyruvate kinase, mais par une voie faisant intervenir la malate déshydro-
génase et la phosphoénolpyruvate décarboxylase. Les conséquences sur la consommation des
navettes énergétiques sont différentes.
On retrouve ces mécanismes avec les voies 15 et 17 qui décrivent la dégradation des
lipides et des acides organiques en acétyl-coenzyme A elle même utilisée pour le TCA.
Ainsi, on dispose de 11 voies de biosynthèse (y compris la glycolyse et la voie des pen-
toses). On peut partager la source de glucides pour ces voies entre le saccharose, le glucose et
le fructose. Enfin, on peut simuler une adaptation de la cellule à une carence en phosphate en
utilisant deux voies métaboliques alternatives. L’originalité de ce modèle réside dans les pro-
159
priétés d’indépendance linéaire grâce à l’obtention d’une base (au sens des espaces vectoriels)
de voies métaboliques.
7.3.3 Détermination des équations bilans des voies indépendantes
Le calcul précédent a permis de caractériser 20 voies indépendantes, combinaisons li-
néaires des 31 réactions du SMS. Dans le réseau métabolique complet, ces 20 voies sont
considérées comme 20 réactions ayant comme réactifs et produits toutes les espèces chi-
miques entrant en jeu dans les 31 réactions et dont la concentration n’est pas supposée
constante dans le temps. Il s’agit donc des produits et des réactifs du métabolisme primaire,
ainsi que des navettes énergétiques et du Pi. De manière plus explicite, le vecteurX1 :
X1 =
AA
FRU
GLU
SEC
LIP
NAD
NADH
NADP
NADPH
NDP
NH4
NTP
ORA
Pi
PPi
SAC
STA
STH
TRY
OP
décrit les 20 espèces2 qui entrent en jeu dans les 20 voies métaboliques et dont la concentra-
tion est dépendante du temps.
Pour connaître le bilan des voies indépendantes sur ces espèces, il faut d’abord écrire la
matrice stœchiométriqueN3 des 31 réactions du SMS en fonction de ces 20 espèces. Dans
notre cas, c’est une matrice20×31. Ensuite, la matriceR tel que :
2. Le fait qu’il y ait 20 espèces n’a strictement rien à voir avec le fait qu’il y ait 20 voies métaboliques. C’estun pur hasard.
160
Tableau 7.2 –Bilan des voies métaboliques indépendantes du SMS.
Reaction # Reaction
1 2 AA + 3 GLU + 10 NAD + 6 NADP + NTP + Pi −→ 10 NADH + 6 NADPH + NDP + PPi + TRP2 1,5GLU + 6 NAD + 2NADP −→ 6 NADH + 2 NADPH + SEC3 GLU −→ FRU4 GLU + 5 NAD + 6NADP + 2 NDP + 2 Pi −→ 5 NADH + 6 NADPH + 2 NTP5 GLU + 4 NAD + 3 NADPH + 2 NTP + NH4 −→ AA + 4 NADH + 3 NADP + 2 NDP + 2 Pi6 NTP −→ NDP + Pi7 0,5GLU + 2 NAD + 2 NADPH −→ LIP + 2 NADH + 2 NADP8 NADH + NADP + NTP −→ NAD + NADPH + NDP + Pi9 GLU + 10 NAD + 4 NDP + 4 Pi −→ 10NADH + 4 NTP10 1,5GLU + 2 NADP + NTP + NAD −→ SEC + 2 NADPH + NDP + Pi + NADH11 3,75 AA + GLU + 0,25 NAD + 2 NADP + 8 NTP
−→ 0.25 NADH + 2 NADPH + 8 NDP + 3,5 Pi + 1,75 PPi + OP12 GLU + NADP + 3 NTP −→ NADPH + 3 NDP + Pi + PPi + STH13 NDP + Pi + STA −→ GLU + NTP14 GLU + 2 NTP −→ 2 NDP + PPi + STA15 LIP + 4 NAD + NTP + Pi −→ 4 NADH + NDP + PPi16 0.5GLU + 2 NAD + NDP + Pi −→ 2 NADH + NTP + ORA17 3 NAD + NDP + ORA + Pi −→ 3 NADH + NTP18 NDP + PPi −→ NTP + Pi19 SAC −→ 2GLU20 SAC + PPi + 2 NDP −→ 2GLU + 2 NTP
R= N3.K
représente la matrice stœchiométrique des 20 voies métaboliques indépendantes en fonction
des 20 espèces considérées.
Cette matrice permet d’écrire les 20 voies métaboliques indépendantes du SMS comme 20
réactions individuelles auxquelles on assigne une loi cinétique. Ces réactions sont présentées
dans le tableau 7.2
7.4 Sous-réseaux métaboliques transitoires
7.4.1 Sous-réseau métabolique transitoire primaire
Le schéma 7.5 propose la structure générale du sous-réseau métabolique transitoire pri-
maire et ses interactions avec le sous-réseau métabolique stationnaire et le sous-réseau mé-
tabolique transitoire secondaire. La numérotation des réactions commence à 21, les 20 pre-
mières réactions étant les 20 voies indépendantes identifiées dans la section précédente.
161
Figure 7.5 – Sous-réseau métabolique transitoire primaire. AA: acide aminés, EFRU:fructose extracellulaire, EGLU: glucose extracellulaire; ENH4: ammonium extracellulaire;ENO3: nitrate extracellulaire; EPi: phosphate extracellulaire; ESAC: saccharose extracel-lulaire, FRU: fructose cytosolique, GLU: glucose cytosolique; LIP: lipides; NAD: NAD+;NADH: NADH; NADP: NADP+; NADPH: NADPH; NDP: nucléoside diphosphate; NH4:ammonium cytosolique; NO3: nitrate cytosolique; NTP: nucléoside triphosphate; O2: dioxy-gène; ORA: acides organiques; Pi: phosphate cytosolique; PPi: pyrophosphate cytosolique;SEC: sécologanine; SFRU: fructose apporté; SGLU: glucose apporté; SNH4: ammonium ap-porté; SNO3: nitrate apporté; SPi: phosphate apporté; SSAC: saccharose apporté; STA: ami-don; STH: hexoses structuraux; TRY: tryptamine, X: biomasse, VNO3; nitrate vacuolaire;VPi: phosphate vacuolaire.
162
Les nutriments présents dans le milieu de culture sont transportés dans la cellule. Il
s’agit du saccharose (ESAC), glucose (EGLU), fructose (EFRU), ammonium (ENH4), ni-
trate (ENO3) et du Pi (EPi). Ces nutriments peuvent être ajoutés au milieu par un système
externe, afin de modéliser un mode semi-continu. Les six nutriments contenus dans ce sys-
tème d’alimentation sont respectivement notés SSAC, SGLU, SFRU, SNH4, SNO4 et SPi.
Le saccharose peut-être hydrolysé en glucose + fructose dans le milieu de culture à l’aide
des invertases apoplastiques (réaction 35) ou dans le cytosol. Dans ce dernier cas, c’est le
SMS qui prends en charge l’hydrolyse du saccharose.
Le saccharose, le nitrate et le Pi peuvent être stockés dans la vacuole pour une utilisation
ultérieure. Le pyrophosphate est converti en Pi. La dégradation des phosphates organiques est
modélisée par la réaction 23 qui libère du Pi. On néglige le recyclage du squelette carboné
lors de cette réaction.
La réaction 69 est responsable de la formation de la biomasse. Sa vitesse de réaction est
précisémentµ. Elle consomme les bassins d’acides aminés, de phosphates organiques, de
lipides et de paroi cellulaire.
La respiration, qui régénère l’ATP et le NAD+est représentée par la réaction 37. La perte
d’énergie associée à la maintenance et autres réactions dont on ne tient pas compte est comp-
tabilisée dans la réaction 36.
Le tableau 7.3 rassemble les lois cinétiques des réactions du SMTP. Dans ce tableau, les
dépendances en navettes énergétiques ne sont pas indiquées pour plus de lisibilité car elle
suivent la loi cinétique définie dans la section 7.2.5
7.4.2 Sous-réseau métabolique transitoire secondaire
Le sous réseau métabolique transitoire secondaire décrit l’accumulation des alkaloides
dans la cellule. La figure 7.6 présente ce réseau. Bien que les alkaloides soient intracellu-
laires, l’utilisation de l’huile de silicone a permis l’extraction de la tabersonine et de la löch-
nericine hors du cytosol. Il est possible que dans un avenir proche il soit réaliste d’extraire
163
Tableau 7.3 –Lois cinétiques des réactions du SMTP.
Réaction # Vitesse de réaction Mécanisme et référence
21 v21 = vmax21
EGLUEGLU+Km
H+-symport (Tanner et Caspari, 1996)
22 v22 = vmax22
EFRUEFRU+Km
H+-symport (Tanner et Caspari, 1996)
23 v23 = vmax23
OPOP+Km
(1−σ(Pi,Pis,1))
24 v24 = vmax24
ESACESAC+Km
H+-symport (Tanner et Caspari, 1996)
25 v25 = vmax25
ENH4ENH4+Km
uniport (Howitt et Udvardi , 2000)
26 v26 = vmax26
NO3NO3+Km
Monod
27 v27 = vmax27
NO3NO3+Km
H+-symport (Williams et Miller , 2001)
28 v28 = vmax28
VNO3VNO3+Km
uniport (Williams et Miller , 2001)
29 v29 = vmax29
PiPi+Km
actif (non caractérisé) (Raghothama, 1999)
30 v30 = vmax30
VPiVPi+Km
uniport (non caractérisé) (Raghothama, 1999)
31 v31 = vmax31
PPiPi+Km
Monod
32 v32 = vmax32
Nh4Nh4+Km
uniport (Williams et Miller , 2001)
33 v33 = vmax33
NO3NO3+Km
diffusion facilité (Williams et Miller , 2001)
34 v34 = vmax134
ENO3ENO3+Km1
+vmax234
ENO3ENO3+Km2
H+ symport à haute et basse affinité (Crawford et Glass,1998)
35 v35 = vmax35
ESACESAC+Km
Monod
36 v36 = vmax36
NTPNTP+Km
Monod
37 v37 = vmax37
NDP×NADHNDP×NADH +Km
Monod
38 v38 = vmax138
EPiEPi+Km1
+vmax238
EPiEPi+Km2
H+-symport à haute et basse affinité (Raghothama, 1999)
39 v39 = vmax39
PiPi+Km
uniport (non caractérisé) (Raghothama, 1999)
40 v40 = vmax40
SACSAC+Km
Monod
41 v41 = vmax41
VSACVSAC+Km
Monod
164
Figure 7.6 – Sous-réseau métabolique transitoire secondaire. AJM: ajmalicine, CAT: ca-tharanthine, EAJM: ajmalicine extracellulaire, ECAT: cathranthine extracellulaire, EHOR:hörhammericine extracellulaire, ELOC: löchnericine extracellulaire, ETAB: tabersonine ex-tracellulaire, EVBL: vinblastine extracellulaire, EVCR: vincristine extracellulaire, EVIN:vindoline extracellulaire, HOR: hörhammericine, LOC: löchnericine, TAB: tabersonine,VBL: vinblastine, VCR: vincristine, VIN: vindoline.
les autres alkaloides. Aussi le modèle prévoit des bassins extracellulaires pour les alkaloides.
Les cinétiques d’accumulation des alkaloides extracellulaires ne sont probablement pas en-
zymatiques.
De nombreuses recherches sont orientés vers le déblocage de la voie tabersonine−→vindoline (DeLuca et Laflamme , 2001). Aussi, les bassins de vindoline, vinblastine et vin-
cristine ont été prévu, même si à l’heure actuelle ils restent vides dans les cultures de racines
transformées deC. roseus.
On connaît mal la dépendance des réactions du métabolisme secondaire en terme de na-
vettes énergétiques. Dans l’état actuel des travaux, les réactions du métabolisme secondaire
165
ne sont pas complètement caractérisées.
Il est prévu d’intégrer dans les cinétiques de ces réaction l’effet d’un ajout d’acide jasmo-
nique exogène.
7.5 Fonctionnement du modèle
7.5.1 Système différentiel du système.
Le système est décrit par les concentrations en nutriments, métabolites primaires et se-
condaires en utilisant le vecteurX tel que:
X =
X1
X2
X3
où chaque sous vecteur décrit respectivement les espèces impliquées dans le SMS, le SMTP
et le SMTS, les espèces impliquées uniquement dans le SMTP et les espèces impliquées
uniquement dans le STMS:
X1 =
AA
FRU
GLU
SEC
LIP
NAD
NADH
NADP
NADPH
NDP
NH4
NTP
ORA
Pi
PPi
SAC
STA
STH
TRY
OP
X2 =
VNO3
VPi
VSAC
EFRU
EGLU
ENH4
ENO3
EPi
ESAC
NO3
X3 =
STR
AJM
SER
CAT
TAB
LOC
HOR
VIN
VBL
VCR
EAJM
ESER
ECAT
ETAB
ELOC
EHOR
EVIN
EVBL
EVIN
L’évolution du système est géré par la fonctionF tel que:
166
dXdt
= F(X)−µX
La fonction F est chargée de calculer les variation des concentrations de toutes les espèces.
7.5.2 FonctionF d’évolution
Brièvement, si on connaît la matrice stœchiométrique d’un sous-réseau métabolique et
la valeur des flux de chaque réaction du réseau, la variations dans le temps des espèces chi-
miques du réseau se calcule ainsi:
dXdt
= S.Φ
où S est la matrice stœchiométrique du réseau (présentée en annexe) etΦ est un vecteur
contenant les valeurs des flux de chaque réaction.
Le SMS a permis de décrire 20 voies indépendantes métaboliques. Parmi celles-ci figurent
9 voies de biosynthèse, la glycolyse et la voies de pentoses phosphates, et 9 réactions de
régulation de la source de glucide et des mécanismes adaptatifs de la cellule face à une carence
en Pi. La stratégie cellulaire pour calculer tous les flux est proposée sur le schéma 7.7.
La première étape consiste à calculer la distribution des différentes sources de glucides
dans le flux total des réactions de biosynthèses. On vérifie si la somme des concentrations
intracellulaires cytoplasmiques de glucose, fructose et saccharose est inférieure à un seuilHs.
Si c’est le cas, l’amidon stocké dans les plastides est utilisé comme source de glucides, en
plus des autres sucres intracellulaires. Sinon, seuls le glucose, le fructose et le saccharose sont
utilisés.
L’étape suivante consiste à calculer les flux des réactions de biosynthèse, de glysolyse
et de la voie des pentoses phosphates. On a déjà mentionné que toutes les réactions de bio-
synthèse font appel au glucose comme précurseur carboné, mais qu’en superposant les voies
167
Figure 7.7 –Stratégies du modèle pour l’orientation du métabolisme.
168
3, 14, 19 et 20 on obtient une voie de biosynthèse qui utilise le fructose, l’amidon ou le
saccharose (par deux mécanismes).
Chaque réaction de biosynthèse peut utiliser comme source de glucide le glucose, fruc-
tose et saccharose. Le flux total de chaque réaction de biosynthèse est la somme des flux de
la réaction à partir de ces trois nutriments, chacun de ces flux ayant une dépendance pour sa
source de glucide en une fonction de Monod. Ces flux individuels associés à chaque source
de glucide ont la même dépendance en navettes énergétiques. Ainsi, chaque réaction de bio-
synthèse est écrite de cette manière :
v = vmax.
(∑
C∈{GLU, FRU, SAC}σ(C,KmC,1)
)∏
N∈{navettes énergétiqes}σ(N,KmN ,νN)
Pour chaque source de glucide, le modèle calcule tous les flux de biosynthèse dépendant
de cette source et faisant varierX1. Si la source de glucide n’est pas le glucose, il assigne aux
flux du glucide la valeur du flux de glucose puis remplace la valeur du flux du glucose par
0. Finalement, il additionne pour chaque espèces du vecteurX1 les flux calculés pour chaque
source de glucide et calcul la variation deX1 en multipliant le vecteur des flux obtenus par la
matrice stœchiométriqueR du SMS.
Le reste de l’algorithme est simple. On test s’il y a suffisamment de NADH ou non pour
la chaîne respiratoire. Si ce n’est pas le cas, le modèle décide de dégrader des lipides qui
alimentent le TCA (réaction 15). Le test suivant détermine si il faut mettre en œuvre les voies
alternatives de la glycolyse ou non. La décision est modélisée par des fonction sigmoïdes telle
que définies dans la section 7.2.6. Le calcul des autres flux se fait ensuite par produit matriciel
comme expliqué précédemment.
169
7.6 Conclusion
Le code source est donné en annexe et est constitué des quatre programmes:modele.m ,
kernel.m , matrix.m et sigma.m . Le programmemodele.m démarre la modélisation et af-
fiche les résultats. Le programmesigma.m est la fonction sigmoïde utilisée par les lois ciné-
tiques et les décisions du modèle. Les matrices stœchiométriques sont calculés (pour le SMS)
et stockées (pour tous les sous-réseaux) dansmatrix.m . Enfin, la fonctionF est calculé dans
kernel.m .
L’état d’avancement des travaux a permis de faire fonctionner les modèle écrit en code
MatlabR©. Le modèle est stable numériquement, mais de nombreux paramètre restent à être
déterminés (Kmi et vmaxi ). Ceci est très encourageant pour l’optimisation future du modèle.
Recommended