Dynamique et interactions moléculaires dans la cellule vivante · Intensité : bleach 100% -...

Dynamique et interactions moléculaires

dans la cellule vivante:FRAP, PA-GFP, FLIP, FCS, FRET

Christophe KLEINPlateforme d’ Imagerie ex-vivo

Centre de Recherche des Cordeliers - 75006 ParisChristophe.Klein@crc.jussieu.fr

Lippincott-Schwartz and Patterson, Science (2003)

- Le photobleaching est un processus irréversible.

-On crée une 2ème espèce moléculaire spatialement distincte.

- Les molécules fluorescentes et bleachées se redistribuent(homogénéisation des concentrations) avec une vitesse « D ».

-> La fluorescence de la zone bleachée ré-augmente progressivement.

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching

Microscope confocal à balayage laser

Objectif

PMTC.A.N.

RAM

Ecran,

DD.

Photons

Signal analogique

(U en V)

Signal numérique

(NG codé sur 8,12 bit)

AOTF

« Réactions photochimiques irréversibles»

Oxydation (Oxygène sigulet : radical libre) DécompositionPolymérisation

Réaction avec d ’autres molécules

Photo-destruction (photobleaching, fading)- Caractérisitque d ’un fluorochrome- Dépend de l ’environnement

Ne pas confondre avec le quenching :Inhibition réversible, dépendante de l ’environnement. - Oxygène- Halogènes (I, Br... par ex : Br-dUTP)- Transfert d ’énergie (Chromosome bandingpar ex : DAPI/CA3, DAPI/Methyl Green...)

Photobleaching

1ère loi de Fick

J=-D dC/dx

D = coefficient de diffusion latérale

Loi de Stokes-Einstein

D =kT/6hRh

J

J = flux en molécules/sec à la position xi

x0 xi

La diffusion

On considère fluo F(x,t) proportionnelle à concentration C(x,t)

2ème loi de Fick : équation de diffusion (EDP)2

2 ),(),(

x

txCD

t

txC

Mobilité dans la membrane : FRAP 2D

Utilisation de modèles d’analyse, solutions de l’équation de diffusion 2D pour différentes conditions initiales.

2

2

2

2 ),,(),,(),,(

y

tyxC

x

tyxCD

t

tyxC

C(x,t) fonction décrivant le profil d’intensité au cours du temps

2

2 ),(),(

x

txCD

t

txC

F(x,t)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

x

F(t

)

t=0 s

t=0.3 s

t=1 s

t=5 s

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

0 5 10 15 20 25 30 35

t

F(t

)

x=0.5

Solution de l’équation de diffusion 1D

t

x

x

Flu

ore

scence

0211

1

!)(

n

d

n

tn

n

ktf

Avec :

d = w2 / 4D : temps caractéristique de diffusion

w : demi-largeur du « spot » à la hauteur de 1/e2

D : Coefficient de diffusion latérale

k : quantité de bleach

k= aT I(0)

T : durée du bleach

I(0) : intensité du bleach

a : constante de vitesse du bleach

F(0)/F0 = (1-e –k)/k

F(t)= MF0 f(t) - MF0 + F0

Axelrod et al. Biophys. J. (1976)

Cinétique de récupération de la fluorescence pour un profil

de région bleachée gaussien

t

dIt

dIt

dtf 22.2exp)( 10

I0 et I1 les fonctions de Bessel modifiées d’ordre 0 et 1.

•Axelrod et al. Biophys. J. (1976)•Soumpasis Biophys J. (1983)•Kubitschek et al. Biophys. J. (1994)

d : temps de diffusion caractéristique

w : rayon de la région bleachée.D = w2 / 4d

)0()(

)0()()(

FF

FtFtf

Fluorescence normalisée

x

Flu

ore

scence

Cinétique de récupération de la fluorescence normalisée pour un

profil de région bleachée circulaire uniforme

5 µm

Mesure de la vitesse de diffusion de phospholipides

membranaires NBD-Sphingomyeline

Cellules cultivées dans des Labtek 170µm

Incorporation NBD-SM 4µM 10 minutes

Problème de l ’internalisation:

Après 10 min membranaire

Après 20 min Golgi

Après 40 min cytosol

3 µm

Zone Bleachée : ROI circulaire 3 µm, 22 pixels

Bleaching

Bleaching

Taille des images : 512x64

Vitesse de balayage: 1.76µsec/pixel, 196 msec/image

Durée du Bleach : 5 scans, 230 msec

Intensité : bleach 100% - images 0.5 à 1%

Intervalle :

100 msec 10 sec

500 msec 10 sec

2 sec 60 sec

Vitesses plus élevées : Line scanning + spot bleaching

Bleaching

Résultats bruts

Zone analysée: profondeur de champ 1.2 µm

3 µm

Analyse

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50 60

F(0)

F()

F0

MB

M : % de marqueur capable de diffuser

Fraction immobile = interaction?

)0(

)0()(

0 FF

FFM

100)0(

10

F

FB

B : % de bleaching

0 sec 2.5 sec 5 sec 25 sec

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

temps (sec)

Inte

ns

ité

de

flu

ore

sc

en

ce

no

rma

lis

ée d =2.20 sec

D=0.255 µm²/sec

Exemple d’acquisition

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 5 10 15 20 25 30

Time (sec)

Norm

aliz

ed F

luore

scence Inte

nsity

cdx

control

Effet de la cyclodextrine

7618

*

29

*

28

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

0 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 5 mg/ml

D (

µm

2/s

)

Effet de la cyclodextrine

Mobilité dans la cellule : FRAP 3D

2

2

2

2

2

2 ),,,(),,,(),,,(),,,(

z

tzyxC

y

tzyxC

x

tzyxCD

t

tzyxC

3D : en excitation multiphotonique(bleaching & photoactivation)

Vitesse d ’acquisition 3D limitante3D,t : volume de données important.Recalage des stacks.

-> difficile a mettre en oeuvre

I(t)=Ifinal (1-(w²(w²+4pDt)-1)1/2)

Ellenberg & Lippincott-Schwartz, Methods, 19, 362-372, (1999).

Approximation diffusion 1D : « Strip bleaching »

…Ou diffusion 2D

Blonk et al., J. Microscopy, (1993).Phair and Misteli, Nature (2000).

D :

« Vitesse»

Obstacles:

« Trajet »Liaisons: « Feux

rouges »

Canaux, pores:

« Bouchons »

Mobilité = Diffusion + phénomènes complexes

Complexes

mobiles

Verkman, TIBS (2002)

Diffusion complexe dans le cytosol :

diffusion relative

Verkman, TIBS (2002)

Modèles de réaction-diffusion

Sprague et al., Biophys J. (2004)Sprague & McNally, Trends Cell Biol. (2005) Log(koff)

Sprague & McNally, Trends Cell Biol. (2005)

Diffusion coupled

•Notion de diffusion apparente ou diffusion effective : Deff

Diffusion uncoupled

Modèles de réaction - diffusion

x

Flu

ore

scence

Phair and Misteli, Nature (2000).

Exemple de mesure de Deff

Interactions protéine-chromatine

Diffusion en géométrie complexe

Influence de la géométrie des organelles (ER)

Sbalzarini et al 2005

Sous-estimation de D d’un facteur entre 2 et 4x !!

Membrane non plane,avec une anisotropie de courbure

Résolution numérique d’équations aux dérivées partielles (E.D.P.)

On utilise des valeurs numériques pour les fonctions à calculer (dérivées) au lieu d’une expression analytique, pas toujours disponible ou calculable.

Principe général : discrétisation de l’espace et du temps simplifiant le calcul des dérivées sur l’espace discrétisé

Problèmes : - solution analytique pas toujours calculable (coeff. non-constants, géométrie

complexe), - hypothèses souvent non vérifiée expérimentalement : par ex, domaine infini !- conditions aux bords variables et complexes en pratique, - paramètres d’acquisition variables (donc modification du profil photoblanchi)

¶

¶tC(x,y,t) = D

¶2

¶x2+

¶2

¶y2

æ

è ç

ö

ø ÷ C(x,y,t) - kb I 2

0e-4

x2 +y2

s 2

C(x,y,t)

Exemple d’équation d’évolution : diffusion 2D + photoblanchiment

Autre intérêt: explorer l’influence des différents paramètres d’acquisition sur les courbes de FRAP et sur les valeurs de D et M

Résolution numérique d’E.D.P.

• Avantage : équations discrétisées faciles à écrire, donc code « simple »• Inconvénients :

- Grille fixe et régulière, contrainte sur les pas dx et dt, donc calculs lourds (mémoire, tps de calcul)- Ecriture difficile (voire impossible) pour des géométries complexes

• Différences finiesEchantillon décrit comme une grille fixe cartésienne, NxMxP (3D), NxM (2D) ou N (1D)

x

x

t

n

kCoordonnées :

Dérivées premières :

Dérivées secondes :

0 N-1n

(Schéma FTCS)

Condition de stabilité :

• Avantage : Adapté à des géométries complexes (cellule « réaliste », pas un carré !)calcul plus rapide et optimisé en fonction de la précision nécessaire (maillage irrégulier)

Méthode très largement utilisée, donc de nombreux logiciels existent (pas forcément adaptés pour nos problèmes !)

• Inconvénient : formulation des éléments parfois difficile, méthode plus complexe

Résolution numérique d’E.D.P.

• Eléments finis

Grille (maillage) pas forcément régulière, éventuellement adaptative

Elément simple : typ. triangle (2D), tétraèdre (3D)

On calcule une approx. de la solution sur chaque élément

On « assemble » les différents éléments pour former la solution globale (« raboutage » des fonctions élémentaires)

Résolution numérique d’E.D.P.

Exemple d’utilisation pour en FRAP

D’après F. Müller, Univ. Graz

Simulation numérique par Monte-Carlo

x

y

Ex : marche aléatoire sur une grille (Random Walk)

Probabilité de « saut » d’un site à l’autre :p = 1/4 (quatre directions)

Pour la FRAP, on utilise N marcheurs pour représenter les molécules du système en train de diffuser

Exemple de données générées :

• Avantages : - extrêmement souple (lois locales, frontières, processus) et générique- simple à programmer (en première approche!)• Inconvénient : calculs lourds (mémoire et temps), ne permet pas de fitter des données (pas de correspondance avec modèle théorique)

bar Chambre

Hépatocytes isolés maintenus en culture 5 à 6h.

3µM Calcéine AM pendant 20 minutes, à 37°C.

Calcéine (623 Da), est un marqueur de la pérméabilité des gap

junctions.

Mesure des flux intercellulaires :

Pérméabilité des gap junctions

% de recupération t1/2 (sec)

Contrôle 64 +/-2 105 +/-6

Vasopressine (10 nM) 56 +/-3 84 +/-11

Noradrenaline (10µM) 76 +/-10 81+/-14

Octanol (500 µM) 11 +/-3 ND

Clair et al., J. Cell Sci (2001) 114, 1999-2007

Mesure des flux Golgi<->RE

Dahm et al. , Mol. Biol. Cell (2001).

Mesure des flux nucléo-cytoplasmiques

PA GFP = Photo-Activable GFP

Patterson & Lippincott-Schwartz (2002) Science 297:1873-1877

Avant photoactivation:

Exc 488nm Exc 405nm

*Seules les molécules activées sont fluorescentes. On peut suivre leur durée de vie (dégradation) et leur comportement en absence de synthèse.

*Photoactivation est généralement rapide <1sec : équivalent voir meilleur que le photobleaching.

*Permet de marquer spécifiquement une cellule et de suivre son devenir au sein d’une population. A condition qu’il n’y ait pas de communication entre les cellules.

PA-GFP : Après irradiation à ~400nm excitabilité à 488 est augmentée d’un facteur 100. Patterson et Lippincott-Schwartz (2002)

Kaede : “ feuille d’érable ” (corail) : abs508/em518 -> abs572/emm582 après irradiation à ~400nm(Ando et al. 2002). Forme des tétramères.

KFP1 : (anémone de mer) Augmentation de la fluo rouge (x30) après irradiation en vert (~532nm) (Chudakov et al. 2003). Forme des tétramères.

PS-CFP : (anémone de mer) 402/468 -> 490/511 le ratio vert/cyan augmente de 1500 . Monomèrique.(Chudakov et al. 2004)

Dronpa : (Corail) “ Erasable ” PA-GFP. Dron : ninja “ disparaître ” PA : photoactivable…Excitation 503/em518nm. « Bleache » très rapidement à 490nm retrouve sa fluorescence très rapidement après irradiation à 400nm. (Ando et al. 2004).

Dendra : (Dendronephthya, corail de la mer rouge). exc486/emm505 -> exc558/emm575 après irradiation à 405nm ou 488 nm. Monomérique. (Gurskaya et al. 2006)

0

250

500

0 60 120 180 240 300

Temps (sec)

Inte

nsit

é d

e f

luo

rescen

ce

FLIP :

Fluorescence Loss Induced by Photobleaching

Résultat qualitatifRE = structure continue

+ActD

t1/2

- Act D 45 sec+Act D 120 sec

En présence d ’ActD, UBF reste

plus longtemps sur son site.

FLIP : temps de résidence

Chen and Huang, J. Cell Biol (2001)

Quand il est impossible de faire du FRAP…

FCS : Fluorescence Correlation Spectroscopy

• Direct read out:

· Mean Number of Molecules

· Diffusion times

· Bound/free ratio

• Calculated molecular parameters: ·

. Concentration c [mol/l]

· Binding constants K [mol -1]

· On/off-rate constants kass [mol-1s-1]; kdiss [s-1]

Notion de modélisation de cinétiqueDécodage de la fréquence des oscillations calciques par NFAT.

Tomida et al., EMBO J. (2003).

y1 : NFAT cytoplasmique phosphoryléy2 : NFAT cytoplasmique déphosphorylé (par calcineurine) 1-y1- y2 : NFAT nucléaire

dy1/dt = -k1.y1 + k2.y2 + k4.(1-y1- y2)dy2/dt = k1.y1 – (k2 + k3).y2

En absence de calcium, k1=0

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 10 20 30 40 50 60 70 800.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0.24

0.28

NFAT cytoplasmique déphosphorylé= y2NFAT nucléaire = 1-(y1+y2)

[Ca2+] [Ca2+]

1- Acquisition d’une série d’image time-lapse.

2- Analyse des images : mesure de l’intensité de fluorescence moyenne dans le noyau et dans le cytoplasme au cours du temps.

3- Fit des données et détermination des valeurs expérimentales des paramètres du modèle.

K1 = 0.359 min-1

K2 = 0.147 min-1

K3 = 0.060 min-1

K4 = 0.035 min-1

Mesure des paramètres cinétiques in-vivo…

La déphosphorylation est 10 fois plus rapide que la phosphorylation !

Dundr et al., Science, (2002).

Modélisation et FRAP (ou iFRAP)

Mesure du temps d’élongation de RP1 in vivo

Elongation : 140sec soit 93 nucléotides/sec pour un gène d’ADNr humain de 13.3kb.

GFP-RPA194 GFP-UBF

Rq : La cordycepine bloque la RPI en phase d ’élongation mais pas UBF qui est un facteur d ’initiation

r : Forester radius :

Distance pour laquelle le transfert

d’énergie est actif à 50%

Interactions moléculaires in situ : FRETFlorescence Resonance Energy Transfer

eBFP & eGFP

eCFP & eYFP

eGFP & Rhodamine

FITC & Rhodamine

FITC & CY3

Trypsine

440nm

490nm 530nm

490nm

440nm

Sondes basées sur le FRET

Exc 440nm

Les méthodes de photoblaching et photoactivation peuvent être utilisées, entre

autre, pour étudier:

*Mobilité des molécules membranaires (lipides et protéines).

*Mobilité des molécules intracellulaires (GFP-protéine).

*Interactions moléculaires (Ex : protéines de la chromatine)

*Echanges entre compartiments intracellulaires (Ex : trafic nucléo-

cytoplasmique).

*Interactions cellulaires (Ex : fonctionnalité des gap-junctions).

*La technique de FRET permet de mettre en évidence des interactions

moléculaires

Conclusion