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ii
ÉTUDE DE GÉNOMIQUE COMPARATIVE D’ISOLATS ESCHERICHIA SPP. PROVENANT D’ANIMAUX DE
FERME
par
Catherine Lefebvre García
mémoire présenté au Département de biologie en vue
de l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DES SCIENCES
UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE
Sherbrooke, Québec, Canada, 19 janvier 2016
iii
Le 19 janvier 2016
le jury a accepté le mémoire de Madame Catherine Lefebvre García
dans sa version finale.
Membres du jury
Professeur François Malouin
Directeur de recherche
Département de biologie
Professeur Sébastien Rodrigue
Évaluateur interne
Département de biologie
Professeur Pierre-Étienne Jacques
Président-rapporteur
Département de biologie
iv
SOMMAIRE
Escherichia coli possède une grande plasticité génomique comme en témoigne la diversité des
souches à l’intérieur de cette espèce bactérienne. Bien que la majorité des souches soient
inoffensives ou à tout le moins opportunistes, plusieurs ont acquis des facteurs de virulence
spécifiques leur procurant un pouvoir pathogénique. Les souches pathogènes comme E. coli
O157 :H7 sont responsables de cas de morbidité, mortalité et pertes économiques importantes
dans l’industrie agro-alimentaire dans le monde entier. L’évolution bactérienne est un
mécanisme continuel qui se fait via l’échange d’éléments génétiques mobiles, de mutations
ponctuelles et autres réarrangements génétiques. Ces changements génétiques peuvent
procurer des avantages sélectifs permettant une adaptation bactérienne rapide face aux stress et
changements environnementaux et favorisant le développement de pathogènes émergents.
Dans la première partie de ce projet, nous avons étudié la région intergénique mutS-rpoS, qui
est une des plus grandes sources de polymorphisme chromosomique chez les entérobactéries.
Notre analyse génomique comparative a permis de confirmer le polymorphisme à l’intérieur
même d’un ensemble de souches Escherichia spp., Salmonella spp. et Shigella spp. De plus,
nous avons pu confirmer que certains types de polymorphismes dans la région mutS-rpoS
étaient fortement associés à certains types de pathogènes chez E. coli. Dans notre analyse,
nous avons ressorti un groupe de gènes à l’intérieur de la région mutS-rpoS qui pourraient
sevir comme marqueur chromosomique intéressant pour les E. coli extra-intestinaux (ExPEC),
un groupe comprennant des souches hautement pathogènes et difficiles à définir par les tests
actuelllement disponibles. Dans notre analyse bio-informatique, nous avons isolé ce groupe de
gènes associé aux ExPEC et nous l’avons caractérisé in sillico. Nous avons également inclus
dans l’analyse deux souches hypermutables du genre Escherichia spp. de notre collection,
isolées d’animaux de ferme. L’hypermutabilité ou la capacité d’acquérir des mutations plus
rapidement que la normale accélère le processus d’évolution et la capacité d’adaptation de ces
souches. La région mutS-rpoS est reliée au système de réparation de l’ADN bactérien
(MMRS) et pourrait être impliquée dans l’apparition du phénotype d’hypermutabilité. Durant
v
les dernières années, de plus en plus d’espèces du genre Escherichia ont été isolées de cas
cliniques d’animaux et d’humains. Ces souches atypiques ont un potentiel de virulence très
élevé, des combinaisons de gènes de virulence et des variants génétiques différents des
souches typiques, et certaines souches ont même évolué en tant que pathogènes. Les souches
de l’espèce E. albertii ont été isolées récemment et ont un grand potentiel de virulence autant
chez les humains que chez les oiseaux. Ces souches sont souvent confondues avec d’autres
organismes pathogènes comme E. coli dans les tests biochimiques, et le manque de
connaissances sur E. albertii rend son identification difficile. Dans la deuxième partie de ce
projet, nous avons identifié des gènes spécifiques aux souches d’E. albertii ainsi que des gènes
de virulence présents chez E. albertii par comparaisons génomiques, ce qui a permis de
développer et optimiser un test PCR (réaction en chaîne par polymérase) visant l’identification
génomique rapide et fiable d’E. albertii.
Mots clés : Enterobacteriaceae/Escherichia albertii/Methyl-directed mismatch repair system
(MMRS)/mutS-rpoS/organisme pathogène émergent
vi
REMERCIEMENTS
La réalisation de ce mémoire a été possible grâce au concours de plusieurs personnes à qui je
voudrais témoigner ma gratitude.
Tout d’abord, un merci spécial à mon directeur de recherche, Pr François Malouin de m’avoir
permis d’effectuer mon projet de maîtrise dans son laboratoire et de son grand dévouement
tout au long de mes études graduées. Merci aux organismes qui ont permis de soutenir le
projet: l’Université de Sherbrooke, le NSERC/CRSNG et Agriculture et Agroalimentaire
Canada (AAFC-AAC). Un gros merci à tous les membres du laboratoire que j’ai côtoyés. Un
merci particulier à mon collègue Rolland Jr. Vaillancourt; à Céline Ster, assistante de
recherche au laboratoire et au Pr Moussa S. Diarra (Guelph Food Research Center, AAFC-
AAC) pour leur soutien technique dans mes projets de recherche et les corrections du
mémoire. Merci également à mes deux conseillers de recherche : Pr Pierre-Étienne Jacques et
Pr Sébastien Rodrigue ainsi que Pr Vincent Burrus et les membres de leurs laboratoires qui
m’ont apporté de l’aide au niveau des analyses bio-informatiques et de mutagénèse. Je
remercie plus particulièrement mes parents Hélène Lefebvre et Luis Angel García Herrero
ainsi que mon frère Samuel Lefebvre García pour le amour inestimable, leur encouragement et
leur soutien tout au long de mes études.
vii
TABLE DES MATIERES
SOMMAIRE ........................................................................................................................... IV
REMERCIEMENTS .............................................................................................................. VI
TABLE DES MATIERES .................................................................................................... VII
LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................ X
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................... XIII
CHAPITRE 1 ............................................................................................................................. 1
INTRODUCTION ..................................................................................................................... 1
1.1. Escherichia coli .......................................................................................................... 1
1.1.1. Les virotypes intestinaux ........................................................................ 1
1.1.2. Les virotypes extra-intestinaux .............................................................. 6
1.2. Le mécanismes évolutifs ........................................................................................... 8
1.3. Les mutations ........................................................................................................... 15
1.3.1. L’hypermutabilité ................................................................................. 15
1.3.2. Les gènes mutateurs .............................................................................. 16
1.4. Le système de réparation de l’ADN: le MMRS .................................................... 17
1.4.1. La région mutS-rpoS ............................................................................. 19
1.5. Souches atypiques et l’émergence de souches pathogènes .................................. 20
1.5.1. E. albertii ................................................................................................ 23
1.6. Objectifs et hypothèses ........................................................................................... 24
1.6.1. Objetif 1 : Projet MMRS ...................................................................... 24
1.6.2. Objectif 2 : E. albertii ............................................................................ 25
CHAPITRE 2 ........................................................................................................................... 26
viii
CHARACTERIZATION OF THE MUTS-RPOS REGIONS IN ESCHERICHIA,
SHIGELLA AND SALMONELLA AND IDENTIFICATION OF MOLECULAR
MARKERS FOR EXTRA-INTESTINAL E. COLI (EXPEC) ............................................ 26
2.1. Introduction du premier article ............................................................................. 26
2.2. Résumé du premier article ..................................................................................... 27
2.3. Premier article ......................................................................................................... 28
ABSTRACT ..................................................................................................... 29
MATERIALS AND METHODS ................................................................... 32
RESULTS ........................................................................................................ 34
DISCUSSION .................................................................................................. 42
CONCLUSION ............................................................................................... 48
ACKNOWLEDGEMENTS ........................................................................... 48
REFERENCES ................................................................................................ 48
CHAPITRE 3 ........................................................................................................................... 54
MULTIPLEX PCR METHODS FOR SPECIFIC DETECTION OF ESCHERICHIA
ALBERTII STRAINS .............................................................................................................. 54
3.1. Introduction du deuxième article .......................................................................... 54
3.2. Résumé du deuxième article ................................................................................... 55
3.3. Deuxième article ...................................................................................................... 56
ABSTRACT ..................................................................................................... 57
INTRODUCTION ........................................................................................... 58
MATERIALS AND METHODS ................................................................... 61
RESULTS ........................................................................................................ 65
DISCUSSION .................................................................................................. 71
ix
CONCLUSION ............................................................................................... 73
ACKNOWLEDGEMENTS ........................................................................... 74
REFERENCES ................................................................................................ 74
CHAPITRE 4 ........................................................................................................................... 78
DISCUSSION ET CONCLUSION ........................................................................................ 78
4.1. Le MMRS et la région mutS-rpoS .......................................................................... 78
4.2. E. albertii, une souche pathogène émergente ........................................................ 82
4.3. Conclusion générale ................................................................................................ 83
BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................. 84
x
LISTE DES ABREVIATIONS
AAF Fimbriae d’adhérence aggrégative
aEPEC EPEC atypique
ADN Acide désoxyribonucléique
APEC E. coli pathogénique aviaire
AEEC E. coli de type attachant et effaçant
A/E Attachement/Effacement
Aggr Activateur de trascription du fimbriae d’adhérence I d’EAEC
AIEC E. coli adhérent invasif
AMP Adénosine monophosphate
ARN Acide ribonuléique
ARNt ARN de transfert
ATP Adénosine triphosphate
BFP Bundle forming pili
cGMP Guanosine monophosphate cyclique
CTDB Toxine cytholéthale B (Cytolethal distending toxin B)
Ctx Toxine cholérique
DAEC E. coli à adhérence diffuse
EAEC E. coli entéroaggrégatif
EAST1 Entérotoxine 1 stable à la chaleur d’EAEC
Eae Intimine
EAF E. coli adherence factor (plasmide)
EHEC E. coli entérohémorragique
EIEC E. coli entéroinvasif
EPEC E. coli entéropathogène
Esp Protéines sécrétées chez E. coli
ETEC E. coli entérotoxigénique
xi
ExPEC E. coli pathogène extra-intestinal
FMN Flavine mononucléotide
Hly Hémolysine
Inv Invasion
IS Séquence d’insertion
LEE Locus d’effacement des entérocytes
LT Entérotoxine thermolabile (heat-labile)
MAEC E. coli causant des méningites
MLST Multilocus sequence typing
MMRS Système de réparation des mésappariements dans l’ADN
(Méthyl-directed mismatch Repair System)
NMEC E. coli causant des méningites néonatales
ORF Phase ouverte de lecture (Open reading frames)
PAI Îlot de pathogénicité
PCR Réaction en chaîne par polymérase
ShET1 Entérotoxine 1 de Shigella
SHU/HUS Syndrome hémolytique urémique
SNP Polymorphisme d’un seul nucléotide
SSB Protéine de liaison à l’ADN simple brin
ST Entérotoxine stable à la chaleur (heat-stable)
STEC E. coli producteur de toxines shiga-like
SST3 Système de sécrétion de type III
Stx Toxine shiga
tEPEC EPEC typique
tir Translocated intimin receptor
Tn Transposon
Tsh Hémagglutinine thermosensible
ufc/cfu Unités formatrices de colonies
UPEC E. coli pathogénique causant infections urinaires (uropathogène)
xii
UTI Infections du tractus urinaire
Vtx Vérocytotoxine
xiii
LISTE DES FIGURES
1. Les relations entre les virotypes humains chez E. coli ..................................................... 8
2. Les mécanismes d’évolution des souches E. coli pathogènes ........................................ 14
3. Le système de réparation de l’ADN (MMRS)................................................................ 15
4. L’évolution des souches atypiques ................................................................................. 20
1
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1. Escherichia coli
Escherichia coli fait partie de la flore bactérienne intestinale normale des humains et des
animaux. E. coli est un organisme très diversifié. Bien que la majorité des souches soient
inoffensives, il existe une variété de souches pathogènes pouvant causer des infections autant
intestinales qu’extra-intestinales (Croxen et Finlay, 2010). Il est estimé qu’E. coli est
responsable de la mort de plus de deux millions de personnes par année (Tenaillon et al., 2010
; Russo et Johnson, 2003). Les souches pathogéniques sont groupées en virotypes (décrits ci-
dessous) selon leur capacité à causer certains types de maladies et syndromes et selon leur
facteurs de virulence (Croxen et Finlay, 2010).
1.1.1. Les virotypes intestinaux
1. Escherichia coli entérohémorragique (EHEC): Les souches EHEC colonisent l’iléon
distal et le colon des humains et causent des des colites hémorragiques (diarrhée sanglante)
(Croxen et Finlay, 2010). Les EHEC peuvent coloniser les ruminants de façon
asymptomatique (Croxen et Finlay, 2010). Les bovins constituent le principal réservoir et
source de transmission aux humains (Croxen et Finlay, 2010). En plus de la viande
contaminée, les légumes, les fruits et l’eau de consommation contaminés sont des vecteurs
proprices à la transmission chez l’humain (Croxen et Finlay, 2010).
2
Les EHEC sont des producteurs de la toxine Shiga-like (Stx), aussi appelée vérocytoxine
(Vtx). Toutes les souches productrices de cette toxine, en incluant les EHEC, se nomment
les STEC (E. coli producteurs de toxine Shiga-like). Les souches peuvent avoir soit les
formes Stx1 ou Stx2 de la toxine ou les deux en même temps (Croxen et Finlay, 2010). La
toxine Stx est activée par des dommages à l’ADN et par la réponse SOS qui sont induits
par des stress environnementaux comme l’ajout d’antibiotiques au milieu de croissance
(Croxen et Finlay, 2010). Il s’agit d’une toxine AB5 semblable à celle produite par Shigella
dysenteriae ayant des récepteurs spécifiques à la surface de certaines cellules intestinales
(cellules de Paneth) et sur les cellules épithéliales rénales (Beddoe et al., 2010; Croxen et
Finlay). Ces récepteurs ne sont pas présents chez les bovins, ce qui explique l’absence
d’infections des bovins par les EHEC (Croxen et Finlay, 2010 ; Pruimboom-Brees et al.,
2000). Dans 6-25 % des cas d’infections chez l’humain, cette toxine peut traverser la
barrière intestinale, atteindre les reins et mener au syndrome hémolytique urémique (SHU)
(Bryan et McAdam, 2015). Le SHU est caractérisé par une insuffisance rénale aigüe
mortelle dans 3-5 % des cas (Bryan et McAdam, 2015 ; OMS, 2015). La forme Stx2 de la
toxine est plus souvent associée avec le SHU que le type Stx1 (Croxen et Finlay, 2010). Le
traitement antibiotique des infections causés par les EHEC n’est pas utilisé, car il pourrait
favoriser la libération de la toxine Stx dans l’hôte (Croxen et Finlay, 2010).
Les EHEC possèdent également le système de sécrétion de type III (SST3) (Croxen et
Finlay, 2010 ; Kaper et al., 2004). Chez E. coli, ce type sécrétion est retrouvé seulement
chez les EHEC et chez les EPEC (E. coli entéropathogène) et est essentiel pour la
colonisation et la pathogénicité des souches. Le SST3 permet l’injection de son propre
récepteur (Tir) dans les entérocytes du gros intestin principalement puis, la liaison
irréversible d’une adhésine (intimine; EaeA) à Tir permettant l’adhérence irréversible de la
bactérie à l’hôte. L’injection de EspF et autres effecteurs dans la cellule hôte provoque la
destruction des jonctions serrées des cellules et mène éventuellement à la diarrhée (Roe, et
al. 2003 ; Smith, et al. 2002). Pour certains gènes (eaeA, tir, espA, espB, espD) associés au
SST3, des variants ont été détectés dans plusieurs souches d’E. coli pathogènes (Lefebvre
3
et al., 2008). L’intimine, codée par le gène eaeA, est considérée comme un facteur de
pathogénicité crucial et plus de 10 variants ont été décrits (Frankel et al., 1998; Torres et
al., 2005; Zhang et al., 2002). Le locus d’effacement des entérocytes (LEE), un îlot de
pathogénicité, code pour la majorité des protéines et effecteurs associés au SST3 (Croxen
et Finlay, 2010).
La souche la plus connue parmi les EHEC est E. coli O157 :H7, qui possède en plus
d’autres facteurs importants pour la colonisation codés par le plasmide pO157 (Croxen et
Finlay, 2010). La dose infectieuse de cette souche est très faible, de l’ordre de 10-100
unités formatrices de colonies (ufc) ou moins (Gordon et al., 2013). Cette souche est
hautement virulente et elle est responsable de nombreuses éclosions à travers le monde, en
particulier dans les pays développés (Japon, Amérique du Nord et certaines parties de
l’Europe). E. coli O157: H7 a été entre autres responsable de la tragédie de Walkerton
(ON, 2000) ayant causé la mort de sept personnes et plus de la moitié des résidents ont été
malades via l’ingestion de l’eau du robinet contaminée (Salvadori et al., 2009). Bien que
moins connus, il ne faut pas négliger l’importance sur la santé humaine d’autres sérotypes
non O157 comme O26, O45, O103, O111, O121 et O145 qui sont testés de routine dans le
bœuf (Gordon et al., 2013; Kalchayanand et al., 2012).
2. E.coli entéropathogène (EPEC) : Les EPEC typiques (tEPEC) peuvent causer la
dysenterie (diarrhée liquide aigüe, parfois sanglante) chez les mammifères. Chez les
humains, les tEPEC sont une des premières causes de diarrhée chez les jeunes enfants (< 2
ans) dans les pays en développement. Les humains sont d’ailleurs le seul réservoir connu.
Les tEPEC, de façon similaire aux EHEC, possèdent le locus LEE qui code pour le
système de sécrétion de type III et peuvent causer des lésions d’attachement et effacement
(A/E) dans l’intestin grêle. En plus de l’intimine et autres facteurs impliqués, le bundle-
forming pili (BFP) qui est codé par le plasmide E. coli adherence factor (EAF) va
permettre un attachement localisé sur les entérocytes (Gordon et al., 2013). Dans les
4
études phylogénétiques par multilocus sequence typing (MLST), deux lignées principales
tEPEC sont décrites (EPEC1 et EPEC2) (Gordon et al., 2013).
Un groupe d’EPEC atypiques (aEPEC) est bien reconnu. Les aEPEC possèdent le système
de sécrétion codé par le LEE comme chez les EPEC typiques. Contrairement aux souches
types, les aEPEC ne possèdent pas le plasmide EAF (absence du BFP), ne produisent pas
de toxine Shiga-like et une adhérence diffuse a été observée chez certaines souches
(Gordon et al., 2013). Il semble que le groupe atypique est une cause plus importante de
maladie chez les adultes et les enfants que les EPEC typiques et sont prévalents autant
dans les pays développés que ceux en développement (Gordon et al., 2013). Les réservoirs
des aEPEC sont les humains, mais aussi des animaux comme les chiens, chats, bovins,
mouton, souris et singes (Moura et al., 2009; Trabulsi et al., 2002).
3. E. coli entéroinvasif (EIEC) : Les EIEC ont la capacité d’invasion et de destruction des
entérocytes du côlon en se multipliant dans le cytoplasme et en se déplaçant de cellule en
cellule (Gordon et al., 2013). Les EIEC ont des mécanismes de pathogénicité similaires
aux espèces du genre Shigella spp. et produisent un syndrome très similaire à la
Shigellose, incluant une diarrhée semblable à la dysenterie avec fièvre (Gordon et al.,
2013). De plus, les EIEC possèdent un plasmide d’inavsion (inv) similaire à celui chez
Shigella et les deux genres sont souvent confondus (Gordon et al., 2013). Diverses
éclosions EIEC chez l’humain ont eu lieu et sont associées avec les hamburgers et le lait
non pasteurisé contaminés. Aucun réservoir animal n’est connu (Gordon et al., 2013).
4. E. coli entéroaggrégatif (EAEC) : Les EAEC colonisent le petit et le gros intestin de
façon exclusive chez les humains (Gordon et al., 2013). Les EAEC possèdent les
facteurs d’ahérence agrégative AAF (sur le plasmide pAA) ainsi que l’activateur de
transcription aggr (Gordon et al., 2013). Les EAEC ont la capacité de s’aggéger entre
eux et de coloniser la muqueuse intestinale à la manière d’un biofilm, favorisant la
persistance de l’infection et la libération de facteurs de virulence associés à la
5
destruction cellulaire comme des enterotoxines (EAST1) et des cytotoxines (ShET1 :
Shigella enterotoxin 1) (Gordon et al., 2013). Les souches enteroaggrégatives causent
des diarrhées aigües et persistantes (Gordon et al., 2013). En plus des dommages
intestinaux, une souche EAEC (E. coli O78 :H10) est à l’origine d’une élosion
d’infections urinaires (UTI) communautaires (Olesen et al., 2012). La souche
O104 :H4 est une souche EAEC atypique, mais hautement virulente puisqu’elle
possède les caractéristiques des EAEC, mais possède aussi la toxine shiga-like (Stx),
normalement associée avec les STEC (EHEC) (Brzuszkiewickz et al., 2011). Elle est
la cause d’une des plus grandes éclosions à E. coli (Europe, 2011) qui a eu lieu via la
transmisision des germes de fenugrecs contaminés menant à l’infection de plus de
3000 personnes et 53 morts (Jandhyala et al., 2013).
5. E. coli entérotoxigénique (ETEC) : Les ETEC colonisent les tissus de l’intestin grêle
des humains et des animaux et causent des diarrhées abondantes liquides et des
crampes abdominales (Fleckenstein et al., 2010). Les ETEC sont la cause principale de
la maladie chez les enfants et les voyageurs dans les pays sous-développés, transmise
par la nourriture ou l’eau contaminée (Fleckenstein et al., 2010). Les ETEC sont
caractérisés par la présence d’une ou plusieurs toxines. La toxine heat-labile (LT) a
une fonction similaire à la toxine cholérique (ctx) (Fleckenstein et al., 2010). La heat
stable (variants : ST1a ou St1b) résiste 30 minutes à 100 °C (Todar, 2008-2012, online
review : http://textbookofbacteriology.net/e.coli_4.html). Le variant ST1a est isolé des
humains et des animaux tandis que la ST1b est retrouvée seulement chez les humains
(Fleckenstein et al., 2010). Les ETEC induisent la diarhée via les toxines ST1a et ST1b
par l’activation de la guanylate cyclase-c sur les membranes de la bordure en brosse
intestinales, causant une augmentation d’AMP cyclique (adénosine monophosphate),
de cGMP (guanosine monophosphate cyclique) et une sécrétion hydroélectrolytique
(Field et al, 1978 ; Giannella, 1983). Les ETEC peuvent aussi coder pour la toxine
EAST1, associée à la destruction cellulaire chez les EAEC (Gordon et al., 2013).
6
1.1.2. Les virotypes extra-intestinaux
Les infections extra-intestinales à E. coli se retrouvent chez les humains, le porc et la
volaille.
6. E. coli pathogène extra-intestinal (ExPEC) : Chez l’humain, les souches ExPEC
peuvent coloniser l’intestin (habituellement asymptomatique), mais vont aussi
coloniser des organes extra-intestinaux. Ils possèdent une grande variété de facteurs de
virulence : adhésines de type fimbriae et non fimbriae, invasine, sidérophores,
hémolysine (hlyA) leur permettant de s’adapter à des environnements diversifiés. Les
infections extra-intestinales les plus connues sont les infections urinaires (E. coli
uropathogénique : UPEC) et les méningites surtout néonatales (NMEC). Les UPEC
sont responsables de 80 % des infections urinaires et les NMEC de 30 % des cas de
méningites néonatales (Redford et Welch, 2002). Presque tous les ExPEC qui peuvent
causer la méningite néonatale peuvent aussi causer des infections urinaires (Gordon et
al., 2013; Russo et Johnson, 2000), mais l’inverse n’est pas nécessairement vrai. Un
des groupes les plus répandues parmi les ExPEC est le groupe ST131. Plusieurs
souches de ce groupe sont résistantes aux β-lactamases (CTX-M ou TEM) (Gordon et
al., 2013). Certaines souches ExPEC ont été isolées de patients avec diverses
infections comme la pneumonie, la cholécystite et la péritonite (Gordon et al., 2013).
Des souches du type STEC ont également été isolées dans des cas d’infection extra-
intestinales (Tarr et al., 1996). Diverses études ont démontré que les ExPEC et les
souches commensales, habituellement non-pathogéniques, partagent de larges fractions
génomiques et sont souvent difficiles à différencier par les méthodes
phylogénétiques/moléculaires (Khöler et Dobrindt, 2011). Un nombre limité d’ExPEC
peuvent être identifiés par MLST (Khöler et Dobrindt, 2011).
7
E. coli pathogénique aviaire (APEC) : Les APEC se retrouvent dans la flore intestinale
normale de la volaille (poulet, dinde, canard), mais certaines souches peuvent induire des
infections invasives extra-intestinales chez la volaille (Mellata et al., 2003). Les éclosions sont
férquentes dans les élevages aviaires entraînant d’énormes pertes économiques. Les APEC
peuvent causer des : colibacilloses, septicémies, péritonites, périhépatites, aérosacculites,
infections respiratoires chroniques, ostéomyélites, etc (Mellata et al., 2003). Ces souches
possèdent différents gènes de virulence leur permettant de survivre en dehors du système
digestif comme : le plasmide pAPEC, des sidérophores (aérobactine), des hémolysines (hlyE)
et des hémagglutinines thermosensible (tsh) (Mellata et al., 2003). L’aérobactine est un
sidérophore permettant à la batérie de se multipler dans des conditions pauvres en fer comme
c’est le cas dans le tractus urinaire. Les fimbirae 1 et P quant à eux favorisent l’adhérence de
la bactérie au tractus respiratoire et la tsh est un autotransporteur retrouvé dans la majorité des
souches APEC hautement virulentes (Dozois et al., 2000). Lses sérotypes O1, O2, O35 et O78
sont les plus prévalents (Mellata et al., 2003). Il a été démontré que les souches UPEC
(ExPEC) humaines, les AIEC (E. coli adhérent invasif), les APEC (ExPEC) se ressemblent
beaucoup phylogénétiquement et partagent quelques gènes de virulence (Gordon et al., 2013).
La ressemble génétique des souches extra-intestinales humaines et aviaires indique une
possible transmission de ces souches entre les différents hôtes (Singer, 2015).
Bref, les E. coli pathogènes sont très diversifiés, et les transferts de gènes latéraux sont
particulièrement fréquents chez E. coli. Il est très difficile d’établir une nomenclature précise
en incluant toutes les souches atypiques et émergentes (Gordon et al., 2013). La figure 1
résume les relations entre les différents virotypes définis jusqu’à maintenant.
8
Figure 1 : Les relations entre les virotypes humains chez E. coli (adapté de Gordon et al.,
2013). Ce diagramme de Venn illustre chaque virotype (cercles) ayant des facteurs de
virulence et une pathogénicité spécifiques. Certaines souches, comme la souche O104 :H4,
partagent des facteurs de virulence avec plusieurs virotypes.
1.2. Le mécanismes évolutifs
Il est estimé que seulement 20 % du génome de base (core genome) est retrouvé dans
l’ensemble des souches d’E. coli (Gordon et al., 2013; Rasko et al., 2008). La souche
commensale E. coli K-12 MG1655 (NC_000913.3, NCBI ressource coordinators) à un
génome de 4,641,652 pb tandis que la souche E. coli O157 :H7 EDL933 (AE005174.2, NCBI)
possède un génome de 5,528,445 pb, avec 1,387 nouveaux gènes par rapport à la souche K-12
EPEC
atypique
EPEC
typique
9
(Gordon et al., 2013; Perna et al, 2001). Des études comparatives ont démontré la présence de
plusieurs séquences phagiques et éléments d’insertion chez plusieurs souches d’E. coli, ce qui
indique une grande plasticité chez le genre Escherichia spp. (Blattner et al., 1997). Chez E.
coli le spectre de pathogénicité est très diversifié incluant des infections intra et extra-
intestinales. L’évolution peut être adatative (augmentation du fitness) ou le fruit du hasard
suite à l’évolution de souches commensales. Plusieurs mécanismes génétiques peuvent être
utilisés par les bactéries pour favoriser la diversité génétique (Gordon et al., 2013). Ces
mécanismes sont : 1) le transfert horizontal de nouveaux gènes et 2) les altérations des gènes
existants (Gordon et al., 2013).
1) Le transfert horizontal (latéral) : Il s’agit d’un processus d’échange de matériel
génétique entre deux organismes qui ne sont pas des descendants. Chez les procaryotes, le
transfert latéral de gènes contribue grandement à la diversité et est l’un des facteurs
principaux d’acquisition de résistance aux antibiotiques. Chez E. coli, les gènes de
virulence transmis par transfert horizontal (conjugaison, transformation ou transduction)
peuvent provenir de d’autres souches E. coli ou d’autres genres (Shigella spp., Salmonella
spp.). Les facteurs de virulence sont fréquemment codés par des éléments génétiques
mobiles qui peuvent être mobilisés dans d’autres souches et être intégrés dans le génome
bactérien (Kaper et al., 2004). Les gènes de virulence sont le plus souvent localisés sur des
éléments génétiques mobiles et comprennent : les plamides, les prophages, les îlots
chromosomiques ou les transposons.
a) Les plasmides sont des éléments circulaires non chromosomiques qui ont la capacité
de se répliquer de façon indépendante. Les plasmides contribuent à la dissémination de
gènes apportant des avantages sélectifs, la plupart du temps, il s’agit de gènes de
virulence ou de résistance aux antibiotiques. Chez E. coli, différents plasmides sont
retrouvés codant pour des déterminants virulents (Mellmann et al., 2009). Chez
O157 :H7 EHEC, on retrouve le plasmide pO157 qui code pour des toxines; chez les
EPEC, on retrouve le plasmide EAF codant pour le bundle forming pili; chez les EIEC,
10
on retrouve le plasmide d’invasion; chez les ETEC, on retrouve des plasmides codant
pour des facteurs de colonisation et des toxines (entérotoxine LT); chez les EAEC, on
retrouve des plasmides codant pour des facteurs d’adhérence et des toxines; chez les
ExPEC, on retrouve les plasmides ColV et Vir. Chez Shigella, les gènes mxi et spa
codant pour le système de scérétion de type III sont localisés sur le plasmide pWR100
(Gordon et al., 2013).
b) Les prophages sont des bactériophages, c’est–à-dire des virus infectant les bactéries et
qui suite à l’injection de leur génome, celui-ci est intégré dans le génome bactérien
sous la forme de prophage. Ceci est la forme latente du phage où les gènes viraux se
retrouvent dans la bactérie. En conditons de stress (ex. : dommages cellulaires, UV), le
prophage est excisé du chromosome bactérien et entre dans le cycle lytique. À ce
moment, il y a lyse de la cellule et le phage peut infecter d’autres cellules (Gordon et
al., 2013). Des prophages sont retrouvés chez E. coli et codent pour des facteurs de
virulence qui sont exprimés dans la cellule hôte apportant un avantage évolutif. Chez
E. coli O157, par exemple, les prophages ont joué un rôle dans l’émergence de cette
souche pathogène alimentaire. En effet, les bactériophages (H-19B) codent pour les
toxines Stx1 et Stx2 (Dobrindt, 2005). Chez E. coli O157, jusqu’à 12 % du génome
bactérien est composé de séquences de prophages (Casjens, 2003 ; Ohnishi et al.,
2000). En plus, plusieurs gènes codant pour les effecteurs du SST3 comme EspJ
(Dahan et al., 2005) et NleA (Gruenheid et al., 2004) sont codés par des prophages. La
toxine ctdB (cytolethal distending toxin B) chez les EPEC (Asakura et al., 2007) ainsi
que la heat labile enterotoxin chez les ETEC (Jobling et Holmes, 2012) sont également
codés par les prophages.
c) Les îlots de pathogénicité sont définis comme une classe d’îlots génomiques (10-200
kb) ayant des gènes et éléments (IS, séquences répétées, intégrase) permettant leur
mobilité et leur recombinaison dans le chromosome bactérien. La majorité des PAIs
(îlots de pathogénicité) sont associés avec des locus d’ARNt (ARN de transfert). Les
11
îlots de pathogénicité codent pour des déterminants virulents, ainsi qu’un large spectre
de fonctions reliées à la pathogénicité. Ils jouent un rôle dans la pathogénicité et
contribuent à la diversité des microorganismes pathogènes chez les humains, mais
aussi chez les animaux et les plantes (Gordon et al., 2013). Par exemple, chez les
EHEC-EPEC, le locus d’effacement des entérocytes (36 kb) est un îlot de
pathogénicité majeur (McDaniel et al., 1995) qui code pour les protéines du système
de sécrétion de type 3 (SST3) (Boerlin et al., 1998 ; Garmendia et al., 2005 ; Kaper et
al., 2004). D’autres effecteurs sont situés sur des îlots de pathogenicité non-LEE
comme la EspC ou la Lymphostatine/ facteur d’adhérence EHEC (lymphostatin/EHEC
factor for adherence; lifA/Efa1). Plusieurs îlots de pathogenicité ont été décrits chez
des souches UPEC également. Chez la souche E. coli 536 UPEC par exemple, deux
ont été décrits : hémolysine opéron (hly) (PAI I536) et un autre avec d’autres gènes hly
et des gènes pour le pili (prf) (Hacker et al., 1990) (PAI II536). Environ 80 % des
souches NMEC ont le sérotype capsulaire K1 (Kaper et al., 2004). L’îlot de
pathogénicité kps code pour la capusle (pheV) chez E. coli K1.
d) Les transposons sont de petits segments d’ADN codant pour des transposases, leur
permettant de changer de position dans le génome (chromosomique ou plasmidique) de
façon autonome, mais qui ne peuvent pas se répliquer de façon autonome (Croxen et
al., 2013). La majorité du temps, les transposons sont excisés et reintregrés dans le
même génome, mais parfois ils peuvent être déplacés dans le génome d’autres
bactéries via le transfert d’ADN génomique ou plasmidique. Parfois, les transposons
peuvent induire des mutations et des changements dans la taille du génome menant à
un arrêt prematuré de la transcription. Les transposons peuvent aussi transporter des
gènes de virulence comme des résistance aux antibiotiques (Bhunia, 2008). Les
transposons les plus simples sont les séquences d’insertion codant pour la transposase
et sont encadrées par des motifs nucléotidiques inversement répétées spécifiques à la
transposase. Les transposons sont généralement associés aux eucaryotes, mais il est
possible d’en retrouver chez les bactéries (Bzuszkiewickz et al., 2011). L’entérotoxine
12
ST chez ETEC, par exemple, est codée par un transposon (Gordon et al., 2013; Mainil,
2013).
2) Les altérations génétiques représentent un deuxième type d’évolution génétique.
a) Les mutations faux-sens sont celles qui remplacent un nucléotide par un autre, ce qui
amène une modification de l’acide aminé codé. Les mutations peuvent être de
transition lorsqu’une base purique est remplacée par une base purique ou qu’une base
pyrimidique est remplacée par une base pyrimidique. Une mutation de transversion est
lorsque la base purique est remplacée par une base pyrimidique ou vice-versa. Ces
mutations peuvent amener des avantages évolutifs positifs ou négatifs. Les mutations
non-sens ont lieu lorsque le changement nucléotidique amène la création d’un codon
stop prématuré. L’introduction d’un codon stop prématuré va générer la production de
protéines tronquées ou mal repliées et affecter la fonction protéique, en particulier
lorsque les mutations se situent dans le site actif de la protéine, ce qui peut être toxique
pour la bactérie. Finalement, des mutations silencieuses (synonymes) ont lieu
lorsqu’un nuclétotique est remplacé par un autre nucléotide, mais n’amène aucun
changement dans l’acide aminé codé et donc, n’amene aucun changement dans la
structure de la protéine produite. Toutefois, ces mutations peuvent affecter le taux de
traduction suite à des modifications affectant la stabilité de l’ARN par exemple.
b) Les insertions et délétions (indel) sont un autre type de changement génétique.
Lorsque l’addition ou la suppression nucléotidique n’est pas un multiple de trois, il y a
un décalage du cadre de lecture dans toute la partie en aval du génome. La plupart du
temps, il y aura apparition d’un codon-stop prématuré dans la protéine codée. Autant
les insertions que les délétions peuvent amener une inactivation du gène et /ou de la
fonction protéique. Parfois, la délétion peut avoir lieu sur plusieurs gènes reliés ou sur
un opéron, ce qui évite d’avoir des métabolites ou réactions secondaires non-désirées.
Comme mentionné ci-haut les mutations ponctuelles non-sens peuvent amener
13
l’inactivation également. Ces mécanismes d’inactivation peuvent avoir lieu lorsqu’une
bactérie n’utilise plus certains gènes, au fil du temps la fonction sera perdue. Ils
peuvent aussi avoir lieu de façon adaptative lorsque la bactérie devra réduire son
génome afin d’améliorer son efficacité énergétique. Ce dernier mécanisme de
réduction adaptative va favoriser l’émergence de nouveaux variants bactériens, en
particulier chez les souches pathogènes. La duplication d’un gène peut mener à une
augmentation de l’expression de la protéine codée. Certaines souches d’E. coli O157 :
H7 par exemple, possèdent deux copies du gènes de virulence codant pour la toxine
Shiga-like 2 (Gordon et al., 2013). Des études in vitro ont en effet démontré que cette
duplication des gènes était correlée avec une augmentation de la production de la
toxine (Stx2). De plus, les duplications de gènes peuvent mener à l’émergence de
nouvelles protéines (Gordon et al., 2013).
La variabilité d’E. coli est très grande, et différents mécanismes contribuent à sa
diversité comme le transfert d’éléments génétiques mobiles codant la plupart du temps
pour des déterminants virulents et les modifications génétiques comme les mutations.
Les souches commensales et pathogéniques font face à une pression sélective et
doivent continuellement s’adapter. Il se peut aussi que certains facteurs auparavant non
essentiels pour la virulence soient déjà présents dans une souche et deviennent
importants pour la virulence de cette même souche dans d’autres conditions. Cela
pourrait favoriser l’évolution des souches commensales par exemple. La pathogénicité
des souches dépend à la fois de l’hôte (système immunitaire, type d’hôte) et de la
bactérie (gènes de virulence).
14
Figure 2 : Les mécanismes d’évolution des souches E. coli pathogènes (adapté de
Kaper et al., 2014). Cette figure montre les éléments génétiques mobiles et autres
mécanismes génétiques menant au développement de certaines virotypes E. coli à
partir de souches commensales.
15
1.3. Les mutations
1.3.1. L’hypermutabilité
Figure 3 : Le système de réparation de l’ADN (MMRS) (adapté de Hanne et al., 2013). Le
système de réparation de mésappariements des bases dans l’ADN existe chez les procaryotes
et les eucaryotes. Chez E. coli, ce système est basé sur l’hémi-méthylation de l’ADN lors de sa
réplication, et les protéines clés MutH, MutL et MutS sont impliquées directement dans la
reconnaissance et la réparation du mésappariement.
A. Procaryotes (E. coli) B. Eucaryotes
16
Les « mutateurs » (mutators) ou souches hypermutables sont des organismes avec un taux de
mutations plus élevé que la normale. En général, ces souches sont considérées comme des
mutateurs faibles lorsque le taux de mutations est de 10-20 fois plus haut que la normale,
mutateur moyen lorsque le taux de mutations est de 100-1000 fois plus haut que la normale et
mutateurs élevé lorsque le taux est plus grand 1000 fois plus haut que la normale. Les souches
hypermutables d’E. coli ont en général un taux de mutations de 100-1000 fois plus élevé que
la normale alors que le taux de mutations chez les souches sauvages (non hypermutables) est
extrêmemnt faible (Jayaraman, 2009). Le phenotype hypermutable amène des hauts coûts
énergétiques (fitness) et, à long terme, un trop haut taux de mutations peut être nocif et même
fatal pour l’organisme. Pour certains organismes, les mutations acquises procurent un
avantage évolutif. En effet, les mutations permettent une adaptation plus rapide que la normale
à un nouvel en environnement, leur permettant de survire en présence de différents facteurs
comme la compétition avec la microflore ou d’autres souches pathogènes, les réponses
immunitaires et les thérapies. Un haut taux de mutations chez les bactéries peut favoriser
l’apparition de résistances aux antibiotiques, ce qui pose un réel problème pour la santé
humaine. Surprenament, il a été démontré que dans la nature on retrouve un haut taux de
souches E. coli et Salmonella spp. hypermutables (>1 %) (Jayaraman, 2009; LeClerc et al.,
1996). Une autre étude a demontré qu’en effet autant dans les souches pathogènes que
commensales un haut taux de souches hypermutables est retrouvé (Jayaraman, 2009; Taddei et
al., 1997).
1.3.2. Les gènes mutateurs
Les gènes mutateurs sont des gènes qui lorsque mutés amènent un phénotype
d’hypermutabilité, c’est-à-dire un taux de mutations plus élevé que la normale et sont
impliqués dans diverses voies métaboliques. Certains mutateurs ont la tendance d’augmenter
seulement certains types de transitions, transversions, déletions et/ou changements de cadre de
lecture. Le gène mutT par exemple, qui est un très fort mutateur, augmente la fréquence des
17
transversions AT > CG. Les principaux gènes mutateurs chez E. coli sont décrits dans Miller
(1996).
Les gènes impliqués dans le système de réparation de l’ADN formant le MMRS sont tous de
forts mutateurs spontannés: mutS, mutL, mutH, uvrD et dam. Le gène mutD est un très très fort
mutateur et est impliqué dans le processus de correction des erreurs dans l’ADN. Les gènes
impliqués dans la réparation et la prévention des dommanges dommages oxidatifs (mutY,
mutM et mutT) sont également mutateurs, en particulier mutT qui est un fort mutateur. Le gène
oxyR est un plus faible mutateur, jouant un rôle clé dans la régulation positive des dommages
oxidatifs. D’autres gènes comme ndk, une kinase nucléoside diphosphate; sodA et sodB des
superoxides dismutases et mutA, mutC, des ARNt (ARN de transfert) sont des mutateurs
faibles à modérés (Miller, 1996).
Il a été reporté que certains gènes lorsque surexprimés, induisent des niveaux élevés de
mutations chez l’organisme. Chez E. coli, par exemple, les niveaux du gène dinB (polymérase
à ADN IV, à faible fidélité) sont surexprimés suite à l’induction du système SOS, ce qui induit
un haut taux de mutations. Le SOS est un système de survie des bactéries en réponse à des
dommages faits à l’ADN. Un haut taux de mutations est également observé lorsque les gènes
codant pour le facteur sigma S (rpos) ou la méthylase (dam) sont surexprimés (Yang et al.,
2004).
1.4. Le système de réparation de l’ADN: le MMRS
Chez E. coli, le MMRS (Methyl-directed Mismatch Repair System) permet de détecter et de
réparer les mésappariements des bases introduites par la polymérase lors de la réplication tout
en conservant l’appariement initial (Friedberg et al., 2005; Fukui, 2010). L’ADN polymérase
III, l’enzyme responsable de la réplication chez E. coli, peut introduire de 1 à 40 bases
erronnées à chaque réplication du chromosome, mais comme mentionnée ci-haut ce taux
d’erreur est extrêmement faible en réalité grâce au système de réparation de l’ADN. Le
18
MMRS permet ainsi de limiter les mutations délétères et le maintient de l’espèce. Le MMRS a
d’autres rôles comme sa contribution à bloquer les événements de recombinaison génétique
hétérologue entre séquences partiellement homolgogues, ce qui prévient l’infiltration d’ADN
étranger dans le génome. Il est également impliqué dans les réponses de dommages à l’ADN.
Le système MMRS est basé sur la reconnaissance de l’état hémiméthylé de l’ADN après la
réplication (Cebula et LeClerc, 2000). L’enzyme Dam est une méthylase, responsable de la
méthylation sur les séquences 5’GATC3’. Il y a un court moment suite à la réplication où seul
le brin matrice est méthylé, ce qui permet au MMRS d’identifier le brin nouvellement
synthétisé qui n’est pas encore méthylé. MutS forme un dimère (MutS2), reconnaît les
mésappariements sur le brin non méthylé et s’y lie. MutH se lie aux sites non méthylés GATC
sur le brin fille. Un dimère de MutL (MutL2) se lie au complexe MutS-ADN. Un changement
conformationnel survient alors dans l’ADN en présence de MutS, d’ATP et de MutL, ce qui
permet la liaison du mauvais appariement (MutS-MutL) et à la séquence GATC non méthylée
(MutH) la plus proche et active MutH. MutH, une endonucléase, peut alors cliver le nouveau
brin d’ADN à réparer près du site non méthylé GATC (5’ - >3’ ou 3’ -> 5’). Cela sert de porte
d’entrée pour UvrD (Hélicase II) qui va séparer les deux brins d’ADN et libèrer le brin fille.
Les exonucléases vont pouvoir digérer la partie à corriger sur le brin fille (ExoVII ou RecJ 5’ -
> 3’; ExoI ou ExoX 3’ -> 5’). Des protéines SSB (protéines de liaison à l’ADN simple brin)
se lient au brin brin matrice et le protègent jusqu’à ce que la machinerie de synthèse arrive. Le
brin complémentaire sera polymérisé par l’ADN polymérase III en utilisant le brin méthylé
comme matrice. La ligase va alors permettre l’hybridation de deux brins d’ADN. Finalement,
la méthylase Dam méthyle le brin nouvellement synthétisé (Hanne et al., 2013). La Figure 3
représente le mécanisme détaillé du MMRS.
Le MMRS est hautement conservée et est retrouvé dans tous les êtres vivants. Chez l’humain,
des mutations dans les homologues des protéines du MMRS (MutHLS) et autres gènes
impliquées dans l’hypermutabilité sont associés à certains types de cancers (human hMSH2 :
Syndrome de Lynch: cancer colorectal héréditaire; cancer ovarien…) (Hanne et al., 2013).
19
Certaines souches bactériennes ont un MMRS muté ou dysfonctionnel et cela se traduit par
une introduction de mutations. Le système de réparation de l’ADN est le mécanisme le plus
important impliqué dans l’apparition du phénotype hypermutable. Il peut y avoir
développement de résistance aux antibiotiques par mutations. Un MMRS non fonctionnel
permet aussi à des ADN hétérologues (jusqu’à 30 % de divergence) d’être recombinés à
l’intérieur d’un génome (Fukui, 2010 ; Matic, et al. 1995; Matic, et al. 1996 ; Vulic, et al.
1997), ce qui peut favoriser par exemple le transfert de gènes de virulence à partir d’espèces
plus éloignées phylogénétiquement. Cela peut favoriser le développement de nouveaux
virotypes chez E. coli. Les connaissances sur les mutations sont esssentielles pour comprendre
les processus évolutionnaires et moléculaires.
1.4.1. La région mutS-rpoS
La région mutS-rpoS contient des gènes importants dans la réparation de l’ADN et dans
l’intolérance aux mutations et est hautement polymorphique à l’intérieur mêmes des souches
d’E. coli. Il s’agit donc d’une région favorable aux insertions et aux délétions (Herbelin et al.
2000; LeClerc, et al. 1996; LeClerc, et al. 1999). Les mutations dans la région mutS-rpoS
pourraient être une cause ou une conséquence du MMRS défectueux. Il est possible qu’une
souche ayant un MMRS défectueux acquière des gènes de virulence dans la région mutS-rpoS.
Le gene mutS est un gene clé dans le système de reparation de l’ADN, MMRS. Il a été
démontré en effet que des mutations dans ce gene amènent un phenotype hypermutable. Le
gene rpoS, le facteur sigma S est aussi un mutateur spontannée et induit des mutations en
particulier lorsque surexprimé. Différents types de régions mutS-rpoS existent chez les
entérobactéries. Chez E. coli chaque region semble corrélée avec certains types de virotypes.
20
Figure 4 : L’évolution des souches atypiques. Les souches atypiques résultent de l’acquisition
de facteurs de virulence atypique ou de combinaisons spécifiques de facteurs de virulences
provenant de souches reconnues pathogènes. La souche E. coli O104 :H4 par exemple,
possède des facteurs de virulence associés à deux souches pathogènes différentes : les E. coli
entéroaggréagatifs et les E. coli producteurs de Shiga-toxine (Brzuszkiewicz et al., 2011). Ces
souches peuvent devenir des souches pathogènes émergentes comme ce fut le cas de la souche
O104 :H4, responsable d’une éclosion diarrhéique majeure en 2011 (Frank et al., 2011).
1.5. Souches atypiques et l’émergence de souches pathogènes
Les souches atypiques sont en général formées par des combinaisons de gènes de virulence ou
de variants différents des souches typiques connues. Elles sont peu étudiées, mais de plus en
plus isolées de cas cliniques.
Chez E. coli, par exemple, comme mentionné précédemment, il existe un groupe d’EPEC
atypique reconnu. Ce groupe atypique possède les facteurs de virulence retrouvés chez les
21
EPEC typiques comme le LEE, mais ne possède pas le plasmide EAF (Karper et al., 2004).
Les EPEC atypiques sont de plus en plus isolés dans les pays industrialisés et ont causé deux
grandes éclosions impliquant des adultes et des enfants (Trabulsi et al., 2002). Il existe
également des souches atypiques EAEC qui n’ont pas le régulon AggR contrairement aux
souches typiques (Kaper et al., 2004).
La souche E. coli O104 :H4 est un autre exemple de souche atypique. Cette souche possède
des caractéristiques propres aux EAEC, mais peut aussi produire la toxine Stx comme les
STEC-EHEC. Par sa combinaison de gènes de virulence EAEC et STEC, un nouveau virotype
a été proposé pour la souche O104 :H4: Entero-Aggregative-Hemorragic E. coli (EAHEC).
Cette souche a causé une large éclosion d’origine alimentaire en 2011 en Europe
(Brzuszkiewickz et al., 2011 ; Jandhyala et al., 2013).
Des études ont trouvé des facteurs de virulence spécifiques aux souches DAEC (E. coli à
adhérence diffuse), décrites pour leur habileté à adhérer des façon diffuse chez les cellules
Hep-2/HeLa ainsi que chez d’autres virotypes comme les EAEC, ETEC, EPEC et même chez
les souches extra-intestinales UPEC. Leur implication dans la pathogénicité humaine n’est pas
définie (Gordon et al., 2013).
Chez les ExPEC (NMEC), on observe des résistantes émergentes aux antibiotiques de type β-
lactamases à large spectre (CTX-M ou TEM) (Blanco et al., 2011; Gordon et al., 2013;
Moissenet et al., 2011). Cela pose un réel problème pour la santé humaine, car cette résistance
émergente a été observée sur les souches hautement pathogéniques comme ST131. Il devient
un véritable défi de trouver des traitements alternatifs.
En bref, les souches atypiques chez E. coli ont des caractéristiques peu communes ou non
retrouvées dans les souches actuelles suite à, par exemple, l’acquistion de combinaisons de
gènes de virulence (O104 :H4), des variants de gènes (ex. intimine) et des résistances aux
antibiotiques (NMEC). Cette évolution a lieu par l’intermédiaire d’un ou plusieurs transferts
22
latéraux, mutations ponctuelles, insertions/délétions. Elles ont des grands potentiels virulents
et ont la possibilité d’évoluer en souches pathogéniques.
Une souche bactérienne pathogène est définie comme l’agent causal d’une maladie infectieuse
(Cleaveland et al., 2007). Pour qu’une souche pathogène soit considérée comme émergente,
elle doit possèder au moins l’une de ces caractérisitiques spécifiques : première apparition
dans la population humaine, augmentation de son incidence, détection sur de noveaux
territoires ou/et première association avec la maladie. Les causes de l’émergence sont
nombreuses : augmentation de la consommation d’aliments frais ou non cuits,
complexification des chaînes de transport de la nourriture, augmentation des voyages
internationaux (ETEC), progression dans les méthodes de détection et identification des
souches pathogènes et des symptômes associés. L’incidence d’une souche pathogène peut
augmenter suite à l’apparatition d’un nouvel hôte ou à des chagements évolutifs, à long terme
(Cleaveland et al., 2007; Woolhouse et Dye, 2001). Il existe aussi des souches pathogènes qui
re-émergent après un certain temps dû à des changements à long-terme de leur épidémiologie.
La souche O157 :H7 a été identifiée en 1982 comme étant la cause de deux éclosions sévères
associées à la restauration rapide. Aucune souche similaire n’avait été reconnue comme
pathogène à ce moment et elle a connu une augmentation drastique dans les années suivantes.
En 1994, il a été reporté que cette souche était la cause de 30 éclosions différentes. Il n’est pas
connu quels sont les déterminants qui ont amené l’émergence de cette souche, mais il se
pourrait les changements dramatiques dans le bétail et l’industrie du bœuf soient impliqués. Il
est toutefois, évident qu’une multitude de facteurs mènent à l’émergence de souches
pathogènes. De plus, une augmentation de l’utilisation de bœuf dans des produits comme les
hamburgeurs qui sont fabriqués en masse peut avoir favorisé la transmission rapide des
souches pathogènes chez les humains. Une amélioration des programmes de surveillance et les
méthodes de détection des bactéries pathogènes peut aussi influencer. Il se peut aussi que les
facteurs de virulence, la faible dose infectieuse et sa capacité de colonisation asymptomatique
des EHEC aient favorisés l’émergence de cette souche pathogène en débit des changements
23
dans l’industrie agro-alimentaire du bœuf. Cette souche est souvent utilisée comme modèle
d’étude de microorganismes pathogènes émergents dans les pays industrialisés (Armstrong et
al., 1996).
D’autres exemples de microorganismes pathogènes alimentaires émergents sont
Campylobacter jejuni, Mycobacterim paratuberculosis, Yersinia enterolitica, Listeria
monocytogene, etc. Récemment, Escherichia fergusonii et Escherichia albertii, des souches
ayant un génome très proche de celui d’E. coli, ont été reconnues comme des souches
pathogènes émergentes (Bhunia, 2008).
1.5.1. E. albertii
Escherichia albertii est une souche pathogène émergente chez les humains et les animaux
(Huys et al., 2003). Les premières souches étaient initiallement classées en tant que H. alvei
par des tests biochimiques. Même encore aujourd’hui, les tests de routine ne permettent pas
l’identification rapide d’E. albertii, et il est estimé qu’un nombre considérable de souches
aurait été confondu avec d’autres souches comme E. coli. En effet, E. albertii possède
plusieurs gènes de virulence dont le LEE comme les EPEC et les EHEC et la cytotoxine ctdB
présente aussi chez les EPEC. Certaines souches expriment également certains variants Stx
(Hinenoya et al., 2014 ; Maheux et al., 2014 ; Murakami et al., 2014 ; Nimri, 2013 ; Oaks et
al., 2010 ; Oh et al., 2011 ; Ooka et al., 2012).
E. albertii peut causer de la diarrhée avec de la fièvre, des vomissements et des crampes
abdominales (Albert et al., 1991 ; Albert et al., 1992 ; Huys et al., 2003). Elle est aussi la
cause de plusieurs cas d’infection et de quelques écosions à travers le monde (Asoshima et al.,
2014 ; Oaks et al., 2010 ; Oh et al., 2011 ; Ooka et al., 2012 ; Nimri, 2013). E. albertii a aussi
été isolé d’oiseaux sauvages et domestiques, félins, cochons, bœuf, poulet, laitue et dinde. En
2004, elle était responsable de la mort de centaines de Common redpoll (Acanthis flammea) en
Alaska (Oaks et al., 2010).
24
1.6. Objectifs et hypothèses
Ce projet s’inscrit dans un projet plus large visant à analyser les facteurs de virulence et de
pathogénicité acquis chez des souches atypiques d’E. coli qui pourraient favoriser le
développement de souches pathogènes émergentes. Alors que de plus en plus d’E. coli
atypiques sont impliqués dans les maladies humaines, peu de recherches visent à expliquer
leur origine chez les animaux de ferme ou à diminuer leur dissémination; c’est ce que nos
efforts permettront de faire.
Par les études passées dans le laboratoire (Lefebvre et al., 2008), une variété de souches
atypiques ont été isolées de bovin et poulet, et deux de ces souches sont à la base de mon
projet de maîtrise. La première souche E. coli 06-03-01-17 est d’origine bovine. Elle a un
sérotype O157 et, selon les études d’hybridation sur puce, elle présente un profil de gènes de
virulence semblable aux souche O157: H7 ou autres EHEC, mais incomplet (ex.: absence de
toxines Stx, absence du plasmide pO157 et non-mobile). Cette souche est hypermutable,
multi-résistante aux antibiotiques avec des variants du SST3 atypique, non retrouvés chez E.
coli et provoque des lésions A/E atypiques. La deuxième souche E. albertii ECC-Litt-3-1 est
d’origine aviaire, hypermutable et possède aussi un SST3 atypique. Elle avait été initiallement
classée comme une souche E. coli atypique par la présence entre autres de variants du SST3
atypiques, mais les études de génomique ont permis sa ré-identification en tant qu’E. albertii.
1.6.1. Objetif 1 : Projet MMRS
Nous croyons que les souches hypermutantes atypiques qui seront étudiées ont un certain
pouvoir de colonisation et de virulence. Nous croyons aussi que le MMRS est impliqué dans
l’apparition de ces souches et leur caractérisation moléculaire permettra de comprendre leur
capacité d'adaptation aux pressions sélectives, leur virulence et le risque de causer des
maladies chez les animaux et l'humain.
25
Le but de la première partie de ce projet est de caractériser et comparer la varaibilité dans les
regions mutS-rpoS chez E. coli, Salmonella, Shigella et les deux isolats atypiques : E. coli 06-
03-01-17 et E. albertii ECC-Litt-3-1. Le phenotype hypermutable de ces souches est fort
probablement la conséquence de mutations dans les genes du MMRS et nous pensons qu’elle
pourrait être aussi liée à la région mutS-rpoS region. Aussi, deux genes situés dans la région
mutS-rpoS ont été explorés en tant que marqueurs pour l’identification et la caractérisation des
E. coli extra-intestinaux.
1.6.2. Objectif 2 : E. albertii
L’objectif est d’identifier des gènes spécifiques à E. albertii par des études de génomique
comparative et de développer une méthode PCR pour le détecter et caractériser certains de ces
gènes de virulence. E. albertii est une souche pathogène émergente au niveau agro-
alimentaire, mais peu caractérisée pour l’instant. Elle a été impliquée dans plusieurs cas
d’éclosion alimentaire, mais aucun test rapide et efficace n’existe pour détecter la présence
d’E. albertii dans les aliments et éviter de la confondre avec d’autres Enterobactériaceae.
26
CHAPITRE 2
Characterization of the mutS-rpoS regions in Escherichia, Shigella and Salmonella and
identification of molecular markers for extra-intestinal E. coli (ExPEC)
2.1. Introduction du premier article
Characterization of mutS-rpoS regions in Escherichia, Shigella and Salmonella and
identification of molecular markers for Extra-intestinal E. coli (ExPEC)
Auteurs : Catherine Lefebvre Garcia,
Rolland Jr. Vaillancourt, Pierre-Étienne Jacques,
Sébastien Rodrigue, Moussa S. Diarra, François Malouin
Statut de l’article : Cet article sera soumis sous peu à la revue Applied and Environmental
Microbiology.
Avant-propos : La rédaction de cet article a été faite par Catherine Lefebvre Garcia sous la
supervision des Prs François Malouin et Moussa S. Diarra. Le séquençage Illumina des
souches ECC-Litt-3-1 et 06-01-03-17 a été réalisé par les membres du laboratoire du Pr.
Sébastien Rodrigue (M. Vincent Baby et M. Dominik Matteau). Les analyses des résultats de
séquençage ainsi que les comparaisons génomiques et protéiques ont été faites par Catherine
Lefebvre Garcia, avec la collaboration de : Pr Pierre-Étienne Jacques, Pr Sébastien Rodrigue,
M. Vincent Baby et M. Rolland Jr. Vaillancourt. L’analyse des groupes de protéines
orthologues chez différentes souches pathogéniques d’E. coli avec le programme CogSoft a
été faite par M. Rolland Jr. Vaillancourt.
27
2.2. Résumé du premier article
La région chromosomique mutS-rpoS est connue pour être hautement polymorphique parmi
les Enterobacteriaceae. Dans cet article, nous avons pu confirmer cette diversité génomique
par la comparaison des régions inter-géniques mutS-rpoS de 115 souches des genres
Escherichia spp., Shigella spp. et Salmonella spp.. À l’intérieur même des souches d’E. coli,
quatre groupes différents de régions mutS-rpoS ont été identifiés et chaque polymorphisme
semble associé à un virotype spécifique chez E. coli.
Dans nos travaux, nous avons exploré plus en profondeur la région mutS-rpoS associée aux
ExPEC. En effet, comme les ExPEC sont très diversifiés en terme de pathogénicité, hautement
virulents et souvent difficiles à identifier, la région mutS-rpoS est un marquer potentiel très
intéressant. Un groupe de gènes à l’intérieur de cette région (c3302-04) était retrouvé
exclusivement chez les ExPEC les plus virulents. Dans cette étude, nous avons donc étudié ce
groupe de gènes et protéines associées chez des souches d’E. coli par des comparaisons
génomiques et protéiques. Nous avons étudié le polymorphisme à l’intérieur de ces gènes, les
variations génétiques (SNPs; polymorphisme d’un seul nucléotide) dans les régions codantes
ainsi que les fonctions moléculaires et les rôles biologiques des protéines codées par ces
gènes. L’étude de ces gènes est un pas de plus vers la compréhension de la virulence des
souches extra-intestinales.
Dans cette étude, nous avons ajouté un isolat bovin hypermutable de notre laboratoire : 06-01-
03-17 qui possède le même groupe de gènes dans la région mutS-rpoS que les ExPEC. Cet
isolat était initialement associé aux EPEC par la présence des facteurs de virulence associés
aux lésions d’attachement et d’effacement. Notre étude pourrait aider l’identification de
souches émergentes avec un haut potentiel de virulence comme l’isolat bovin caractérisé dans
cette étude.
.
28
2.3. Premier article
Characterization of mutS-rpoS regions in Escherichia, Shigella and Salmonella and
identification of molecular markers for Extra-intestinal E. coli (ExPEC)
Catherine Lefebvre Garcia,1
Rolland Jr. Vaillancourt,1 Pierre-Étienne Jacques,
1 Sébastien
Rodrigue,1 Moussa S. Diarra,
2 François Malouin
1*
Centre d’Étude et de Valorisation en Diversité Microbienne (CEVDM), Département de
biologie, Faculté de sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada1;
Guelph Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC), Guelph, Ontario,
Canada2
Running Head: ExPEC markers in mutS-rpoS region
*Address correspondence to François Malouin, francois.malouin@usherbrooke.ca
29
ABSTRACT
Extra-intestinal Escherichia coli (ExPEC) can cause a large variety of infections in humans
and birds worldwide and possess diversified virulence genes in order to colonize extra-
intestinal sites making their specific detection as a group challenging. The mutS-rpoS region
is a hot spot for recombination and lateral gene transfer and has been described as a good
ExPEC marker (Ewers et al., 2014). The objectives of the present study were to perform
comparative and phylogenetic analyses of mutS-rpoS polymorphisms among 115
Enterobacteriaceae and to identify molecular markers for ExPEC. Our results showed that the
specific ExPEC loci c3302-04 allows the identification of non-synonymous SNPs located in
coding regions for conserved domains. According to our results, the protein c3302 was
computationally associated with catabolic activity, but not with β-lactamase activity as
previously suggested, and presents multiple predicted zinc binding sites. The c3303 locus, an
insertion sequence, indicates a possible recombination site while the protein c3304 was
associated with redox activity with a FMN (flavin mononucleotide) binding sites. The mutS-
rpoS region c3302-04 was also found in one atypical E. coli (intimin positive and
hypermutable) isolate from cattle. Data from the present study confirmed that the mutS-rpoS
intergenic region c3302-04 is a marker for highly pathogenic strains of ExPEC. Our data also
showed the potential of these genes in the virulence of ExPEC.
KEY WORDS: mutS-rpoS region, Extra-intestinal E. coli, ExPEC, Enterobacteriaceae,
Methyl-directed mismatch repair system (MMRS), atypical E. coli, c3302-3304
30
INTRODUCTION
Escherichia coli is a naturally commensal bacterium of humans and animal guts. E. coli
species exhibit high genome diversity and genome plasticity. About only 18 % of the genome
of the commensal K-12 is conserved in all E. coli strains (Herbelin et al., 2000). Some strains
have acquired virulence factors making them public health concerns, and the cause of
significant economic losses to the food industry. In addition to causing serious intestinal
damages, some E. coli strains (Extra intestinal pathogenic E. coli: ExPEC) have the ability to
infect extra-intestinal sites such as the urinary tract (Uropathogenic E. coli: UPEC) and the
blood stream of newborns (Neonatal Meningitis E. coli: NMEC). ExPEC strains possess a
broad spectrum of virulence factors such as adherence systems, toxins and iron uptake systems
for their adaptation to new environments (Ewers et al., 2014). The ExPEC group is large,
highly diversified and thus poorly defined (Singer, 2015).
Whole-genome sequencing and comparative studies in E. coli have pointed out many sites of
genomic variations which allowed better understanding of the genome evolution in E.coli. The
region between the mutS and rpoS genes is one of the most polymorphic regions in
Enterobacteriaceae. Among E. coli strains, this region of 3 to 14 kb, is a hot spot for
mutations and gene acquisition by horizontal transfer between species (Brown et al., 2001 ;
Ferenci, 2003 ; Kotewicz et al., 2003).
The gene mutS plays an important role in the methyl-mismatch directed DNA repair system
(MMRS). Together mutL, smutH and mutS are the major genes associated with the MMRS
pathway, which roles are to detect and correct DNA mismatch errors induced mostly by the
polymerase and to prevent heterologous recombination (Tsui et al., 1997). Homologs of the
mutS gene have been found in most bacteria and eukaryotes. Mutations in the mutS gene result
in hypermutable strains leading up to a 100-fold increase in mutations and recombination
events with foreign DNA in the host chromosome (Brown et al., 2001 ; Ferenci, 2003).
31
Mutator strains, mostly caused by mutS mutations are found in more than 1 % of all E. coli
and Salmonella isolates (LeClerc et al., 1996).
The rpoS gene encodes the σS
subunit of the RNA polymerase, an alternative sigma factor that
plays a central role in the transcription and expression of genes involved in stress adaptation
and survival (Ferenci, 2003). The rpoS gene is transcribed in the late exponential phase. It can
be activated by different environmental conditions like UV-radiation, temperature and
oxidative stress. The rpoS gene is the most important regulator of the stationnary phase genes.
It regulates hundred of genes associated with stress resistance (DNA damage, presence of
reactive oxygen species, osmotic shosk), transport regulation and metabolism (Landini et al.,
2014). It is also involved in the virulence and adaption to hostile environments of many
pathogens as pathogenic E. coli, Salmonella and Vibrio species (Dong and Schellhorn, 2009;
Dong and Schellhorn, 2010).
The mutS-rpoS polymorphism seems to be correlated with the E. coli pathotypes and several
studies suggested that this polymorphism offers an interesting potential for the
characterization of pathogenic strains (Culham and Wood ; Ewers et al., 2014, 2000; Hilali et
al., 2000; LeClerc et al., 1999). The role of the mutS-rpoS region is not clearly described but
is possibly linked with virulence factors and pathogenicity.
The objective of this study was to compare the mutS-rpoS region of E. coli and more
specifically of ExPEC, Salmonella and Shigella strains. Also, two genes (c3302 and c3304),
specifically found in the mutS-rpoS region of documented ExPEC strains, were explored for
their potential as markers to detect this E. coli pathotype. Part of this work has been presented
previously in summary form (Lefebvre Garcia et al., 2014, poster). Finally, we used this
information to characterize further an E. coli O157 strain previously reported as a
hypermutable EPEC that was multi-resistant to antibiotics and that clustered with the ExPEC
32
strains based on hybridization results on DNA arrays (Lefebvre et al., 2005 ; Lefebvre et al.,
2010).
MATERIALS AND METHODS
Bacterial genomes. For this study, 115 completed and draft genomes of strains from the
genus Escherichia spp., Salmonella enterica serovars and Shigella spp. were used (Table 1).
Genomes from NCBI nucleotide database (NCBI ressource coordinators, 2015) of commensal
K-12 and those of representative strains of most of the pathotypes: EHEC (Enterohemorrhagic
E. coli), EPEC (Enteropathogenic E. coli), ETEC (Enterotoxigenic E. coli), ExPEC
(Extraintestinal E. coli), NMEC (Neonatal Meningitis E. coli) and UPEC (Uropathogenic E.
coli) were selected. These genomes were downloaded on 2014, except for three isolates: E.
coli 06-01-03-17 (Lefebvre et al., 2005 ; Lefebvre et al., 2010), E. albertii ECC-Litt-3-1
(2Lefebvre et al., 2009) and E. fergusonii that are from our strain collection (Forgetta et al.,
2012).
Whole-genome sequencing and assembly. The complete genome of E. coli 06-01-03-17 was
sequenced using the Illumina technology with 50 bp paired-end reads. Illumina sequencing
libraries were prepared as previously described (Rodrigue et al., 2010). The resulting
sequences were assembled using de novo gsAssembler (Newbler, Roche, version 2.6)
software. The reads were also mapped on E. coli, Shigella and Salmonella strains and were re-
assembled to maximise the assembly of different regions possibly originating from other
strains or species. The results were uploaded to the Rapid Annotation using Subsystem
Technology (RAST) (Aziz et al., 2008 ; Aziz et al., 2012 ; Overbeek et al., 2014) for a
preliminary annotation. Specific annotations of regions and genes of interests were done using
BLASTn (The BLAST Sequence Analysis Tool) (NCBI ressource coordinators, 2015) and
results were visualized with CLC Genomics Workbench.
33
Genomic comparisons and data visualization. The sequences of interest were extracted
from all the 115 genomes of Escherichia, Salmonella and Shigella strains (Table 1). The
mutS-rpoS DNA sequences were identified by comparison of the the mutS and rpoS genes
with known regions in strains E. coli K-12 MG1655, E. coli O157:H7 and E. coli CFT073 and
using using BLASTn, homemade UNIX shell program and CodonCode Aligner (CodonCode
Corporation, 2013) for length detection. The intergenic mutS-rpoS regions were then
compared and groups of putative genes with similar length were then compared by BLAST to
check DNA and amino acid similarity. The ORFs (Open Reading Frames) in the mutS-rpoS
region of the isolates 06-01-03-17 and ECC-Litt-3-1 were predicted and contig organisation
was done with Contiguator2 (Galardini et al., 2011). The ORFs with repetitive regions, gaps
between contigs or uncertain sequences were re-sequenced by the Sanger method (Plate-forme
d’Analyses Génomiques de l’Université Laval, Quebec, Canada). The SNPs were confirmed
to be real SNPs when found in all the contigs obtained from the whole-genome sequencing
data (BLAST, CLC workbench). The genetic organization of all the mutS-rpoS sequences was
visualized with CLC-Workbench.
Phylogeny. For phylogenetic studies, sequences of interest (gyrB semi-conserved gene) were
aligned with Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation (MUSCLE, EMBL-EBI)
((Edgar, 2004 ; McWilliam, 2013). Phylogenetic analysis was carried out using MEGA
software Ver. 6 (Tamura et al., 2013) and a phylogenetic tree was reconstructed using the
Neighbor-joining method. The setting options were as follows: The test for branch support
was assessed with 100 bootstraps replications, Substitutions type was nucleotide and the
model was the Kimura 2-parameter model, rates among sites were Gamma-distributed with
the gamma parameter 2, Gaps/missing data treatment was Complete deletion. No significant
difference was found when using other algorithms such as Maximum Likelihood (PhyML) and
Parcimony (BioNJ).
Protein analysis. The molecular function, the biological process and the binding sites were
found in silico by submission of the translated DNA sequence of c3302 and c3304 genes to
34
the I-TASSER (Roy et al., 2010; Yang et al., 2015; Zhang, 2008) online platform which uses
many databases such as Gene Ontology (GO) database (Gene Ontology Consortium, 2001).
The DNA coding regions were translated into amino acid sequence using ExPASy
Bioinformatics Resource Portal (standard genetic code) (Artimo et al., 2012). The conserved
domains were found by NCBI Conserved Domain Search and BLASTx of the translated
sequences of c3302 and c3304 against all the bacterial sequences available in the non-
redundant database of NCBI (NCBI ressource coordinators, 2015).
RESULTS
Genomics and phylogeny. The complete genome of the isolate 06-01-03-17 was sequenced
and assembled. The chromosome is of 3,935,416 bp and has 4,117 coding sequences
estimated. Figure 1 shows the cladogram based on the semi-conserved gyrB gene (Fukushima
et al., 2002) for 81 Escherichia strains. The separations of the Escherichia species are clearly
visible: E. coli, E. albertii, E. fergusonii. Also, some E. coli serotypes/pathotypes such as
O157:H7 STEC (EHEC), O145:H28 STEC (EHEC), O104:H4 (EAEC-STEC), O55:H7
(EPEC) and O111:H- (EPEC) formed distinctive clusters. However, most of the E. coli
pathotypes (in colors) did not form specific clusters based on the gyrB sequence. The isolate
E. coli O157:H- strain 06-01-03-17 clustered with most of the ExPEC but also with AIEC and
some strains with uncharacterized pathotypes. The E. coli strains, in black, with
uncharacterized pathotypes (include commensal and putative non-pathogenic strains) did not
seem to form a specific cluster. Figure 1S shows a cladogram based on the semi-conserved
gyrB gene showing a good phylogenetic separation of Escherichia, Salmonella and Shigella
strains.
35
Figure 1: Cladogram resulting from the alignments of the gyrB gene using Neighbor-joining
method (100 bootstraps). The branch support values are in percentages. The analysis was done
on 81 strains: 68 Escherichia coli, including strain 06-01-03-17 (our collection); 3 Escherichia
fergusonii; 7 E. albertii, including the strain ECC-Litt-3-1 (our collection); 1 E. hermanii; 1 E.
vulneris and 1 E. blattae. The E. coli pathotypes are color-based: pale blue: EHEC strains
(Enterohaemorrhagic E. coli); dark purple: EPEC (Enteropathogenic E. coli); yellow: EAEC-
STEC (Enteroaggregative and Shiga-toxigenic E. coli); dark blue: ETEC (Enterotoxigenic E.
coli); green: EAEC (Enteroaggregative E. coli); red: ExPEC (Extra-intestinal E. coli)
including UPEC (Uropathogenic E. coli) and NMEC (Neonatal Meningitis E. coli); light
purple: AIEC (Adherent-Invasive E. coli); grey: APEC (Avian Pathogenic E. coli). E. coli
strains that are in black are strains with uncharacterized pathotype (unknown pathogenicity or
non-pathogenic).
36
Figure 1S: Circular cladogram based on the gyrB gene using Neighbor-joining method (100
bootstraps). The branch support values are in percentages. The analysis was done on 115
strains: 81 Escherichia spp., including strains E. coli 06-01-03-17 and ECC-Litt-3-1 from our
collection, 5 Salmonella spp., 29 Shigella spp. In pale blue: E. coli strains; dark blue: E.
albertii; green: E. fergusonii; black: E. blattae, vulneris and hermannii; purple: Shigella spp.;
red: Salmonella spp.
Patterns found in the mutS-rpoS region. As expected, the E. coli pathotypes seems to be
correlated with mutS-rpoS patterns. Figure 2 shows seven different mutS-rpoS patterns found
in Escherichia, Salmonella and Shigella strains and the count of analyzed strains associated to
37
each pattern and similar to what was found previously (Ewers et al., 2014 ; Martinez-Garcia et
al., 2002). The mutS, rpoS and pphB genes were conserved in almost all E. coli strains.
The first pattern constitutes a 6.7 Kbp intergenic region with six predicted ORFs (the ygbI to
ygbN gene cluster) following mutS and pphB. This pattern was mostly observed in strains with
uncharacterized pathotypes including commensal E. coli K-12. It also was noted in all Shigella
sonnei and S. boydii (Figure 1: pattern II in Ewers et al., 2014). The second pattern of 2.8 Kbp
with 4 predicted ORFs (Z4045-48) presented no homology with the intergenic region of the
first pattern described above (Figure 1: pattern I in Ewers et al., 2014). This second pattern
was found in all O157:H7 (EHEC), most of the EHEC and in some EPEC strains as well as in
most of the S. dysenteriae and in all E. fergusonii. An insertion sequence instead of the pphB
locus was found in S. dysenteriae. The third pattern was a combination of the ygbI-N and
Z4045-48 gene groups found in patterns 1 and 2 and was detected in all O104:H4 strains
(EAEC-STEC) and in the majority of EPEC and E. albertii strains (Figure 1: pattern IV in
Ewers et al., 2014). The fourth pattern also harbored the ygbI-ygbN group found in the first
pattern in addition to a novel and unique group of 3.7 Kbp with two predicted ORFs (c3302
and c3304) (Figure 1: pattern III in Ewers et al., 2014). This pattern was observed in the
majority of ExPEC strains and in the the atypical and hypermutable O157 isolate 06-01-03-17.
The fifth pattern, showing only the mutS and rpoS genes in this region, was found in other
Escherichia species such as E. vulneris, E. hermannii and E. blattae. In some of these strains,
the rpoS gene was not detected. The sixth pattern was composed of some of the genes of the
groups ygbI-N and Z4045-48 and presented multiple insertion sequences. This pattern was
present in all Shigella flexneri strains. The seventh and last pattern was found in Salmonella
enterica strains and carried a unique group of 5 putative ORFs (t2811-15) although it also
contained homologs of the genes described in pattern 1 and 2. Noteworthy, those sequences
were partial and appeared in a reversed orientation compared to those found in E. coli strains
(i.e., ygbM-ygbI and Z4048-45).
38
Characterization of the c3302-04 region: phylogeny. The 3.7 Kb intergenic region with
putative genes c3302-04 representing the fourth mutS-rpoS pattern described above (Figure 2)
was previously reported in E. coli CFT 073 ExPEC (UPEC) (Culham and Wood, 2000 ; Ewers
et al., 2014). This region showed high homology (BLASTn) with the mutS-rpoS regions in 21
E. coli (5 uncharacterized strains, 3/3 AIEC, 1/2 APEC, 11/14 ExPEC, and isolate 06-01-03-
17) (Figure 2). All the targeted regions in these strains were aligned and a phylogenetic tree
was constructed with the region c3302-04 found in the 21 strains (Figure 3, left).
Characterization of the c3302-04 region: SNPs. The non-synonymous SNPs (nsSNPs) in
each of the 21 strains sharing pattern 4 (Figure 2) are represented by black boxes in the Figure
3. The SNPs profiles of the strain correlates with the clusters formed in the phylogenetic tree
(Figure 3, left). However, synonymous SNPs, which do not induced a change in the amino
acid produced, were found in a much higher frequency (not shown), an observation that
corroborates a previous study (Heberlin et al, 2000). Only one nsSNP found in the locus
c3302 of E. coli O6:H31:K15 str. 536 ExPEC (UPEC) was located in the region corresponding
to the zinc binding domain. All mutations found in the c3304 locus were located in the region
corresponding to the conserved FMN-reductase (Flavin mononucleotide) domain (Figure 3).
The region c3302-04 of isolate 06-01-03-17 clusters relatively closely (75 %) to that of E. coli
06:H3:K15 str. 536 ExPEC (UPEC) and E. coli 06:H31 str. F11 ExPEC (UPEC). The three
strains shared only one nsSNP in the 5’ c3302 locus and no nsSNP in the 3’ c3304 locus.
Isolate 06-01-03-17 harbored also a second SNP in the c3302 locus which is found in strains
E. coli ATCC 25922 and E. coli CFT 073 ExPEC (UPEC). A deletion was observed at the 3’
region of the locus c3302 in E. coli O25 str. NA114 ExPEC (UPEC). The strain E. coli ED1a
presenting a unique SNPs profile and did not cluster closely any other strains in the
cladogram.
39
Characterization of the c3302-04 region: proteins. The 5’ c3302 locus and the 3’ c3304
locus encode for two putative proteins that we named proteins c3302 and c3304, respectively.
A non-coding sequence was inserted between the two locus in all strains analyzed (Figure 3).
The analysis of the conserved domain in all strains using protein comparison in the NCBI
database ((NCBI ressource coordinators, 2015) showed a major zinc binding domain and
multiple punctual zinc binding sites in Protein c3302 while a major FMN-reductase binding
domain and multiple punctual FMN binding sites were detected in Protein c3304 (Figure 3).
Table 2 shows the predicted function of proteins c3302 and B according to I-TASSER
algorithms and comparison with the GO database. Protein c3302, encoded by the 3’ c3302
locus showed the highest similarity score, although relatively low (64 %), with proteins having
a β-lactamase/antibiotic/catabolic activity as well as with zinc ions binding proteins. Antibiotic
susceptibility tests performed in vitro, showed however no resistance of the two tested ExPEC
strains (E. coli CFT073 and E. coli 06-01-03-17) to cefotaxime and meropenem, ruling out the
presence of a functional metallo(Zn)--lactamase (data not shown). Protein c3302 showed a
lower similarity score (40 %) with proteins associated with electron carrier activity, FMN
binding and oxidoreductase activities. Protein c3304, encoded by the 5’ c3304 locus, had the
highest score similarity (99 %) with proteins binding to FMN, another high score (86 %) with
proteins having an electron carrier activity and a lower score (56 %) with proteins with
oxidoreductase activities.
40
Figure 2: Physical map (top of the figure) of the seven genomic mutS-rpoS patterns found in
Escherichia, Salmonella and Shigella spp. For each group of strains (same strains as in Figure
1 and 1S) listed, n represents the total number of strains in this group and, below each physical
map, the corresponding number of strains having the mutS-rpoS pattern. The groups of genes
in the mutS-rpoS region are classified by colours: in grey: mutS, pphB and rpoS genes; green:
ygbI-ygbN (locus b2735-b2740 from E. coli K-12 MG1655 GeneBank NC_000913.3); pink:
Z4045-Z4048 (locus Z4045-48 E. coli O157:H7 EDL933 STEC (EHEC) GeneBank
AE005174.2); orange: c3302-c3304 (locus c3302-04 E. coli 06:H1:K2 CFT073 ExPEC
(UPEC) GeneBank AE014075.1); blue: t2811-t2815 (locus t2811-15 Salmonella enterica
subs. enterica serovar Typhi Ty2 GeneBank AE014613.1). IS: Insertion Sequence.
41
Figure 3: On the left, cladogram based on the complete c3302-04 region using Neighbor-
joining method (100 bootstraps). The branch support values are in percentages. The analysis
was done for the 21 strains having the genes c3302-c3304 in their mutS-rpoS region (see
Figure 2, pattern 4, in orange). The physical map of the c3302 gene (coding for the putative
protein c3302), the c3303 region (IS, insertion sequence) and the c3304 gene (coding for the
putative protein c3304) shows the nsSNPs represented by small black boxes. The bigger black
box in E. coli O25 str. NA114 corresponds to a genomic deletion. On the top of the figure, in
red, is shown the putative zinc binding domain localization on protein c3302 and, in green, the
FMN (flavin mononucleotide) binding domain localization on protein c3304. Red arrows
represent the specific nucleotide sites possibly involved in zinc binding and the green arrows
in FMN binding.
42
Table 2: Predicted molecular and biological processes of the proteins c3302 and c3304
according to GOntology (GO).
DISCUSSION
Even though the 16S rDNA analysis is often used to classify organisms, it is not ideal for
separation of closely related species such as Shigella spp. and E. coli (Christense et al., 1998 ;
Fukushima et al., 2002). On the other hand, the DNA sequence of gyrB is often used in MLST
typing (multilocus sequence typing) of E. coli and is better than 16S rDNA to define
phylogenetic relationships of Shigella, E. coli and Salmonella (Fukushima et al., 2002). In this
study, the phylogenetic analysis of 115 Enterobacteriaceae was first done using the gyrB
housekeeping gene and allowed good separation of Escherichia spp., Salmonella spp. and
Shigella spp. (Figures 1 and 1S). In Figure 1S, Shigella spp. and E. coli cluster very closely.
Studies suggest that Shigella species are close enough to E. coli to be considered as a new E.
coli pathotype (Russo and Johnson, 2000). Also, in our study (Figure 1S), the strain Shigella
43
dysenteriae SD1D clustered perfectly with strain E. coli HS; both potential commensal strains
isolated from healthy human (Kaur et al., 2014; Rasko et al., 2008). The Escherichia species
(E. albertii, E. fergusonii and E. coli) are phylogenetically close but can all be distinctively
separated from each other by the gyrB-based analysis (Figure 1). The only exception was
strain E. albertii TW11588, an non-virulent environmental strain (Luo et al., 2011), which did
not cluster with the E. albertii group (Figure 1) as shown in the phylogenetic of core genes by
Luo et al. (2011).
Despite their phylogenetic cohesiveness, E. coli strains are very heterogeneous in terms of
pathogenicity and content in virulence genes. As mentioned above, E. coli strains can be
separated in three main categories: commensal, intestinal pathogen and extra-intestinal
pathogen. Commensal strains lack virulence traits found in pathogenic strains and do not
usually cause infection. Intestinal pathogenic strains are generally divided in well-known
pathotypes based on specific combinations of virulence traits such as that found in STEC-
EHEC, EPEC, ETEC, AIEC, and EAEC strains (Girardini et al., 2012; Russo and Johnson,
2000). Some atypical strains such as the highly virulent strains E. coli O104:H4 possess a
combination of virulence genes from the STEC (e.g., intimin) and EAEC pathotypes
(Brzuszkiewicz et al., 2011). Extra-intestinal pathogenic strains in addition to their ability to
colonize the intestinal tract of mammals and birds can infect almost all extra-intestinal organs
and thus cause a large range of diseases. At this time, only a few groups of site-specific
ExPEC are relatively well described in humans (UPEC and NMEC) and in avian strains
(APEC) (Russo et Johnson, 2000). As shown in Figure 1, some well-known intestinal E. coli
pathogens formed distinctive clusters by the gyrB-based phylogeny, but were not well
separated from non-pathogenic E. coli strains, similarly to that previously reported by
Fukushima et al. (2002). For example, our results indicated that the strains belonging to the
group of human and avian ExPEC (UPEC, NMEC; APEC), were not grouped in one specific
cluster and most of them could not be separated from other non-ExPEC strains (Figure 1).
ExPEC strains can have many combinations of virulence genes and their pathogenicity can be
influenced by many factors. Also, many ExPEC cannot be differentiated from commensal
44
strains based on their virulence profile (Köhler and Dobrindt, 2011) and commensal strains
can cause extra-intestinal infections when the host is compromised (Russo and Johnson,
2000). In brief, even if the gyrB-based phylogeny can separate E. coli from other
Enterobacteriaceae, it did not allow a good separation of pathogenic and non-pathogenic E.
coli strains. This was particularly true for ExPEC strains, which are composed of a large
number of strains with a wide range of pathogenic traits while also genetically similar to
commensal strains. We found here that the mutS-rpoS region may help discerning pathotypes,
including ExPEC strains.
The mutS-rpoS region is a chromosomal hot spot for recombination and gene exchange
(Brown et al., 2001). The mutS and rpoS genes are conserved among Enterobacteriaceae but
the intergenic mutS-rpoS region is highly diversified (Martinez-Garcia et al., 2003). The
groups of genes found in the mutS-rpoS region are not essential but most likely provide some
evolutionary advantages or abilities to adapt to stress or new environmental conditions. The
mutS-rpoS region may have contributed in evolution of pathogenic strains (Ewers et al., 2014).
The mutS-rpoS region was associated with some pathotypes in E. coli and this DNA region
could serve as chromosomal marker for virulence in E. coli strains (Herbelin et al., 2000 ;
Köhler and Dobrindt, 2011). Some particularities of the mutS-rpoS for ExPEC strains region
were recently reported (Ewers et al., 2014) and our study provides additional characterization
that documents further this DNA region and putative function in ExPEC.
We explored the intergenic mutS-rpoS region among 115 strains of the genus Escherichia,
Shigella and Salmonella. As shown in Figure 2, four of the seven mutS-rpoS region patterns
found in E. coli correlate with specific E. coli pathotypes. Pattern 1 is composed of six
specific putative coding regions, ygbI-ygbN, and is present in all mutS-rpoS region of
commensal K-12 and Shigella sonnei strains (Figure 2). This region may be an indicative of
lower or no pathogenicity. This region was also present in a majority of the uncharacterized E.
coli strains, a group composed mainly of commensal and non-pathogenic strains. Pattern 2
encloses four specific putative coding regions (Z4045-Z4048) and is found in most (77%)
45
EHEC strains and in all E. coli O157:H. It was also found in all Escherichia fergusonii and in
most of Shigella dysenteriae. This region may be associated with a common Shigella-like
ancestor and this is supported by the fact that the main Shigella-associated virulence factor:
Shiga-toxin (stx) is usually found in E. coli O157:H7, S. dysenteriae and E. fergusonii. Ewers
et al. (2014), did also associated this mutS-rpoS region with the typical EHEC strains (E. coli
O157:H7) and other EHEC class 1 as named by LeClerc et al. (1999). Pattern 3 shows a mix
of patterns 1 and 2 and contains both regions, ygbI-ygbN and Z4045-Z4048. This mutS-rpoS
pattern is found in O104:H4 strains, which contain virulence factors from EAEC and STEC
strains. This indicates lateral transfer between commensal strains (pattern 1) and E. coli
O157:H7 STEC-EHEC (pattern 2). Pattern 3 is found in EAEC-STEC strains but also in E.
albertii, in a majority of EPEC (67 %) including the EPEC reference strain E. coli E2348/69
and in some EHEC (23 %). All those pathotypes share a common major virulence factor, the
intimin, encoded by the LEE and leading to A/E lesions. This mutS-rpoS pattern is thus
associated with the groups of EPEC 1 and 2 and EHEC group 2 as defined by LeClerc et al.
(1999) and also reported by Ewers et al. (2014). The forth pattern is composed of nine putative
coding regions and is a mix of pattern 1 (ygbI-ygbN) with an additional unique coding region
(c3302-04). The latter region is the only region that is not found in other patterns among E.
coli and even among the large family of Enterobacteriaceae. The region c3302-04 may have
been transferred from another pathogenic strain that is still unknown.
The mutS-rpoS pattern 4 could thus be a good marker for ExPEC identification as we have
previously reported in a preliminary study (Lefebvre Garcia et al., 2014, poster) and as also
suggested by Ewers et al. (2014). This pattern was found in the majority (79 %) of ExPEC
including the UPEC strain E. coli CFT 073 and NMEC strains. In the study of Ewers et al.,
(2014), this mutS-rpoS pattern was also associated with E. coli CFT073 (UPEC) and other
highly pathogenic uro-pathogens (Culham and Wood, 2000; Heberlin et al., 2000). In the
same study, the strains having this fourth mutS-rpoS pattern both of clinical and faecal origin
were found exclusively in the B2 phylogenetic group. The B2 group is composed of the most
virulent ExPEC strains such as ST95, ST127, ST372, ST73, ST80 and the multi-resistant
46
ST131 (Clermont et al., 2013 ; Culham and Wood, 2000 ; Ewers et al., 2014). The
chromosomal virulence genes csgA, malX, chuA, vat and sitD were closely associated to this
mutS-rpoS pattern (Ewers et al., 2014). In our study, we found that other ExPEC strains
(21 %) could also be associated with the mutS-rpoS region pattern 2 (Figure 2), which is found
in highly pathogenic E. coli O157:H7 strains. One of the genes of pattern 2, slyA, has been
proved to cause tissue invasion in Salmonella strains and may thus help extra-intestinal tissue
invasion in E. coli strains (Buchmeier et al., 1997 ; Ewers et al., 2014). We found that one out
of two APEC strains also presents this pattern 2, which supports that APEC and ExPEC can be
closely related and can share some genetic background (Köhler and Dobrindt, 2011).
Also, in our study, all three AIEC strains as well as the atypical O157 isolate E. coli 06-01-03-
17 showed pattern 4. E. coli 06-01-03-17 was originally isolated from a healthy bovine host
but possesses virulence factors found in at least two highly pathogenic E. coli groups, ExPEC
and EPEC, having the capacity to induce intimin-associated lesions (1Lefebvre et al., 2009).
Furthermore, this isolate demonstrated a hypermutable phenotype which could be associated
with a defective MMRS (Kotewicz et al., 2002).
Besides, two others mutS-rpoS patterns (patterns 6 and 7, Figure 2) were found respectively in
Shigella flexneri and Salmonella enterica strains. Those patterns were composed of a mix of
patterns 1 and 2 suggesting lateral gene transfer between commensal E. coli, EHEC O157:H7,
Shigella flexneri and Salmonella enterica stains. In Shigella flexneri, the mutS-rpoS pattern
was however incomplete compared to those of E. coli and demonstrated many insertion
sequences, a sign of multiple recombination events in the mutS-rpoS region. In Salmonella
enterica strains, the mutS-rpoS intergenic region was found to be in the opposite orientation to
that found in E. coli strains and contained a novel group of genes not found in any of the E.
coli or Shigella strains analyzed.
In pattern 4, the proteins encoded by genes c3302 and c3304 in the mutS-rpoS region thus
appear associated with ExPEC strains.
47
In our study, the designated protein c3302, encoded by the 3’ c3302 locus, showed the highest
score similarity, although relatively low (64 %), with proteins having a β-
lactamase/antibiotic/catabolic activity and with proteins binding the zinc ion. However, the β-
lactamase function was excluded based on in vitro tests for strains harboring c3302-04 region.
Several studies, have also observed that the putative role of the protein encoded by c3302
showed limited level of similarity to enzymes implicated in antibiotic hydrolysis (Bellais et
al., 1999 ; Culham and Wood, 2000 ; Ewers et al., 2014;). We found that protein c3302 also
showed some similarity with proteins associated with electron carrier activity, FMN binding
and oxidoreductase activity and we suggest that protein c3302 may have a role in catabolic
activity ion (zinc) dependant. Besides, protein c3304, encoded by the 5’ c3304 locus, has
almost a perfect score similarity with proteins binding to FMN and several FMN binding sites
and a high score similarity with proteins having an electron carrier activity or oxidoreductase
activity. Culham and Wood (2000) has found low (26%) similarity between the 3’ locus c3304
(ORF183) and the WrbA protein, a flavodoxin-like protein expressed by E. coli K-12
MG1655 during stationary phase. Homologues of this protein exist in bacteria, yeast and
plants. Additional studies are needed to investigate the link between the two proteins.
However, the two proteins seem to have a similar function that is associated with
oxidoreductase and electron carrier activity.
However, some non-synonymous SNPs were found and may affect the expression or function
of the encoded proteins. For example, one unique nsSNP found in the c3302 gene of strain E.
coli O6:H3:K15 is in the conserved zinc binding domain. Also, all the nsSNPs found in the
c3304 region could have an effect on the FMN binding to the protein c3304 (Figure 3). Only
two exceptions, the atypical isolate 06-01-03-17 possesses a combination of nsSNPs found in
two different clusters of strains and strain E. coli ED1a showed a unique nsSNP pattern not
found in any other strains analyzed. The strains analyzed were grouped based on the sequence
of the complete c3302-04 DNA region and clustered according to their nsSNP patterns (Figure
3). Such an analysis could help characterization of ExPEC pathogenic subtypes and provide
additional information on the phylogeny of strains.
48
CONCLUSION
In this study, the mutS-rpoS intergenic regions of 115 strains: E. coli, Salmonella and Shigella
strains were compared and seven mutS-rpoS polymorphisms were identified. In E. coli strains,
four different mutS-rpoS patterns were found in specific pathotypes. One of the pattern was
strongly associated to ExPEC strains. This pattern is composed of a 3.7 Kb region that
contains the c3303-04 genes not found in other E. coli or Enterobacteriaceae. Those genes
represent interesting markers for ExPEC strains and ExPEC strains may be discriminated
further based on the nsSNP patterns found in this DNA region. Genes c3303-04 encodes two
proteins apparently having a similar function associated with oxidoreductase and electron
carrier activity. The functionality of those proteins and their role in ExPEC pathogenicity
remain to be determined.
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by Agriculture and Agri-Food Canada through the Sustainable
Agriculture Environmental Systems (SAGES) program to M. S. Diarra and by grant 89758-01
from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) to F.
Malouin.
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54
CHAPITRE 3
Multiplex PCR Methods for Specific Detection of Escherichia albertii Strains
3.1. Introduction du deuxième article
Multiplex PCR Methods for the Detection and Molecular Identification of Escherichia
albertii
Auteurs de l’article: Catherine Lefebvre Garcia, Rolland Jr. Vaillancourt, Pierre-Étienne
Jacques, Sébastien Rodrigue, Moussa S. Diarra, François Malouin
Statut de l’article: Cet article sera soumis sous peu à la revue Applied and Environmental
Microbiology.
Avant-propos : La rédaction de cet article a été faite par Catherine Lefebvre Garcia sous la
supervision des Prs François Malouin et Moussa S. Diarra. Le séquençage Illumina des
souches ECC-Litt-3-1 et 06-01-03-17 a été réalisé par les membres du laboratoire du Pr.
Sébastien Rodrigue (M. Vincent Baby et M. Dominik Matteau). Les analyses des résultats de
séquençage ainsi que les comparaisons génomiques et protéiques ont été faites par Catherine
Lefebvre Garcia, avec la collaboration de : Pr Pierre-Étienne Jacques, Pr Sébastien Rodrigue,
M. Vincent Baby et M. Rolland Jr. Vaillancourt. Les réactions PCR ont été optimisées et
réalisées par Catherine Lefebvre Garcia avec le soutien technique de Mme Céline Ster et le Pr
François Malouin.
55
3.2. Résumé du deuxième article
Escherichia albertii est un organisme pathogène alimentaire émergent. E. albertii possède
plusieurs facteurs de virulence importants comme ceux associés aux lésions A/E chez les
EHEC-EPEC et exprime la toxine cytoléthale CDTB (Cytolethal distending toxin).
L’incidence de cette bactérie pathogène reste inconnue, mais des souches d’E. albertii ont été
reocnnues pour être l’agent causal d’éclosions diarrhéiques partout à travers le monde.
Il a été démontré qu’E. albertii a été directement impliqué dans des épisodes ponctuels et
sporadiques de diarrhée chez l’humain et les oiseaux. Le poulet pourrait représenter un vecteur
majeur pour la transmission chez l’humain. E. albertii ressemble beaucoup phénotypiquement
à d’autres Enterobacteriaceae et il a à maintes reprises été confondu avec E. coli ou Hafnia
alvei par les tests biochimiques.
Dans le laboratoire, un isolat de poulet E. albertii : ECC-Litt-3-1 a été isolé, caractérisé, et son
génome a été séquencé. Des analyses bio-informatiques incluant des comparaisons
génomiques avec d’autres souches d’E. albertii connues ont permis l’identification de gènes
spécifiques à E. albertii. Nous avons par la suite développer une méthode génomique (PCR)
pour identifier rapidement et spécifiquement E. albertii. Il s’agit d’une PCR nichée amplifiant
le gène putatif fumarate reductase permet la détection rapide et efficace d’E. albertii parmi
d’autres entérobactéries. La limite de détection est de 1-100 cfu. Une autre PCR mutlipex a été
dévelopée amplifiant des gènes de virulence présents chez E. albertii ainsi que trois gènes
spécifiques à E. albertii codant pour la fumarate reductase, superoxide reductase et Yad-like
fimbriae, permettant la caractérisation précoce des souches. Ces méthodes pourraient être
développées comme test de routine pour détecter et identifier des souches d’E. albertii dans
des spécimens cliniques. De plus, des études chez le poulet pourraient permettre de mieux
caractériser la prévalence d’E. albertii et son rôle dans la transmission chez l’humain.
56
3.3. Deuxième article
Multiplex PCR Methods for the Detection and Molecular Identification of Escherichia albertii
Catherine Lefebvre Garcia,1 Rolland Jr. Vaillancourt,
1 Pierre-Étienne Jacques,
1 Sébastien
Rodrigue,1 Moussa S. Diarra,
2 François Malouin
1*
Centre d’Étude et de Valorisation en Diversité Microbienne (CEVDM), Département de
biologie, Faculté de sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada1;
Guelph Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC), Guelph, Ontario,
Canada2
Running Head: PCR Detection and Identification of E. albertii
*Address correspondence to François Malouin, francois.malouin@usherbrooke.ca.
57
ABSTRACT
Escherichia albertii is associated with infections in humans and animals worldwide. This
emerging and potential foodborne pathogen is often misidentified by biochemical tests which
hardly discriminate it from other Enterobacteriaceae. In this study, whole genome sequencing,
comparative genome analysis and PCR methods were developed for an accurate detection of
E. albertii and some of its virulence genes. Genes specific to E. albertii were used to design
specific primers. A nested PCR using primers targeting an E. albertii putative fumarate
reductase gene provided accurate discrimination of E. albertii from other tested enterobacteria
with a detection limit of 1-100 cfu. Other nested multiplex PCR using primers targeting the
virulence genes eae (intimin) and ctdB (cytolethlal toxin subunit B) as well as three unique E.
albertii genes coding for the fumarate reductase, superoxide reductase and a Yad-like
fimbriae, provided some characterization of the isolates. Data from the present study showed
that whole genomic sequencing allowed the development of PCR methods to significantly
improve the detection of E. albertii while providing insight on the virulence potential of this
bacterium.
Key words: Multiplex PCR detection, Escherichia albertii, Enterobacteriaceae, food-borne
infections, emerging pathogen
58
INTRODUCTION
Escherichia albertii is an emerging enteric pathogen of humans and animals (Huys et al.,
2003). The first five strains of E. albertii, initially classified as Hafnia alvei, were isolated
from Bangladeshi children with diarrhea and symptoms such as dehydration, fever, vomiting
and abdominal distending (Albert et al., 1991; Albert et al., 1992; Huys et al., 2003). Sporadic
cases of E. albertii infections have occurred worldwide and several E. albertii outbreaks have
been reported (Asoshima et al., 2014 ; Nimri, 2013 ; Oaks et al., 2010; Oh et al., 2011; Ooka
et al., 2012;). In 2004, E. albertii caused the death of one hundred of Common redpoll
(Acanthis flammea) in Alaska (Oaks et al., 2010). E. albertii has been isolated from ill and
healthy birds and also from feline (Ooka et al., 2012), swine (Hinenoya et al., 2014), ground
beef, chicken giblet (liver), lettuce and turkey (Maeda et al., 2015). The chicken is considered
as a potential reservoir for human transmission (Oaks et al., 2010; Maeda et al., 2015). In
2003, a restaurant-associated outbreak occurred in Fukuoka, Japan. The causative agent of this
outbreak was originally described as an atypical E. coli but was later, classified as an E.
albertii strain (Ooka et al., 2013). Little is known on the prevalence and the distribution of E.
albertii in the environment and the food system. In United States, around 62,000,000 of food-
borne illnesses and around 3,200 deaths have unknown etiology and, emerging pathogens such
as E. albertii could be an important pathogen involved in these illnesses.
E. albertii strains can express several virulence genes including eae and ctdB as well as shiga-
like toxin (stx) which are directly associated with diarrhea (Hinenoya et al., 2014; Maheux et
al., 2014; Murakami et al., 2014; Nimri, 2013; Oaks et al., 2010; Oh et al., 2011; Ooka et al.,
2012). The eae gene located in the Locus of Enterocyte Effacement (LEE) encodes an intimin
protein which induces irreversible host-cell adhesion. In enterohemorragic E. coli (EHEC) and
enteropathogenic E. coli (EPEC) strains, this intimin and associated proteins (LEE or non-
LEE) cause attachment and effacement lesions (A/E) on the intestinal epithelium leading to a
severe diarrheal disease in the host. It has been reported that the intimin of E. albertii strains,
can cause A/E lesions in a rabbit model and induce atypical pedestal in vitro. In addition, some
59
E. albertii strains express the Stx but only the subtypes 2f (Ooka et al., 2012; Maeda et al.,
2015 ; Maheux et al., 2014; Murakami et al., 2014; Nimri, 2013; Ooka et al., 2012) or 2a
(Brandal et al., 2015) have been reported. The shiga-like toxin is a major virulence feature of
EHEC (STEC: Shiga Toxigenic E. coli) which can lead in 5-7 % of infected people to the
hemolytic uremic syndrome (HUS), a major concern for public health. Another important
characteristic of the majority of E. albertii strains is the presence of the ctdB gene encoding
the enzymatically active subunit of the cytolethal distending toxin: CDT. The CDT toxin cause
damages in host cell DNA and block the cellular replication cycle at the G1 or G2 phase, in
association with cell distension and eventually death. The ctdB gene is also common in STEC
(Shiga toxin producing E. coli) strains such as E. coli O157:H7, which can cause the
hemolytic uremic syndrome in up to 50 % of infected patients (Rosser et al., 2008). CTDB
homologues can also be found in other pathogenic genus such as Shigella spp. and
Campylobacter spp.. Until now, the E. coli heat labile and heat stable enterotoxin and the E.
coli EIEC (E. coli enteroinvasive) and Shigella invasion genes associated with a virulence
plasmid have not been detected in E. albertii strains.
E. albertii shares many phenotypic and genotypic features with other members of the
Enterobacteriaceae family and has probably been misclassified or non-detected by routine
tests. It represents a major pathogen in the food industry and its study should not be neglected.
The aim of this study was to identify specific and unique molecular targets to develop rapid
and specific multiplex PCR methods for the detection of E. albertii strains and identification
of some virulence genes. This was achieved using whole genome analysis of known E. albertii
strains as well as of an atypical eae-positive Escherichia strain isolated from broiler chicken.
60
Table 1 List of bacterial strains used in this study
Those strains will be used to test the PCR method for the detection and identification of E.
albertii. Gene’s description and length correspond to descriptions from E. albertii KF1;
GenBank Accession Number: CPOO7O25.1.
61
Table 2 List of primers used in this study
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. All strains used in this study are presented in Table 1. The sequenced
isolate E. albertii ECC-Litt-3-1 initially identified as an atypical eae-positive atypical E. coli,
was from our collection. This strain was isolated from the litter of broiler chicken (Lefebvre et
al., 2009).
ECC-Litt-3-1 genome sequencing and assembly. The complete genome of the isolate ECC-
Litt-3-1 was sequenced using the next-generation Illumina technology. Illumina sequencing
libraries were prepared as fpreviously described (Rodrigue et al., 2010) and sequenced using
50 bp paired-end reads. The resulting sequences were assembled using the de novo
gsAssembler (Newbler) software version 2.6. The reads were also mapped to E. coli, Shigella
and Salmonella reference strains and were combiened for a final assembly. The results were
uploaded to the Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST, Aziz et al., 2008) for
a preliminary annotation. A specific annotation of regions and genes of interests was
62
performed using BLASTn (NCBI ressource coordinators, 2015) and results were visualized
with CLC Genomics Workbench (CLC Bio, Qiagen).
ECC-Litt-3-1 biochemical profiling. The biochemical properties of the strain ECC-Litt-3-1
were investigated using the API 20E strips according to the manufacturer’s specifications (API
20E Analytical Profile Index Biomérieux, QC, Canada). Additional characterization included
others biochemical tests: motility (Motility Test Medium), lactose fermentation (MacConkey
Agar and Trypticase Soy Agar) and sugar fermentation of glucose, mannitol, sorbitol and
rhamnose (Phenol red method). The E. albertii strains LMG 20973, E. albertii LMG 20976
and E. coli K-12 MG1655 were used as controls.
Genomic DNA extraction. Whole genomic sequences of all bacterial strains were extracted
with the GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich, Oakville, ON), according to
the recommendations of the manufacturer.
Identification of distinctive genes. The identification of E. albertii-specific genes was done
in three steps. (1) The whole genome sequence of E. albertii KF1 (Fiedoruk et al., 2014) was
compared to the whole genome of E. coli K-12 MG1655 (NCBI nucleotide) using Contiguator
2 Bacterial Genomes Finishing Tool (default parameters) and all regions present in both
strains were excluded. (2) A second whole genome comparison was done to find conserved
genes among the four available E. albertii genomes documented in NCBI in 2014-2015 (KF1:
CP007025.1; TW15818: WGS project NZ_AEJY00000000.1; TW08933: WGS project
NZ_AEJU00000000.1; NBRC 107761/LMG 20976: WGS project NZ_BBMY00000000.1;
TW07627: WGS project NZ_BBMY00000000.1), in comparison to the genome of ECC-Litt-
3-1 using BLASTn (NCBI). (3) Finally, the conserved regions (100 % of homology and 100
% coverage) in all E. albertii strains were compared against the complete database of bacteria
available in NCBI and only unique and ubiquitous sequences in E. albertii strains were
chosen. Those regions were submitted to BLASTn (NCBI), BLASTx (NCBI) and RAST for
63
annotation (NCBI ressource coordinators, 2015). This analysis was done in parallel with the
analysis of orthologous protein clusters as described below.
Orthologous protein clusters comparisons. Eugene Koonin group’s COG software
(COGsoft, version 4.2.2), featuring the EdgeSearch algorithm, was used to compare the
clusters of orthologous groups (COG) between the E. albertii strains (Kristensen et al., 2010 ;
Tatusov et al., 2000). The program is freely available on the NCBI website
(http://ftp.ncbi.nih.gov/pub/wolf/COGs/COGsoft/). Briefly, COGs were constructed using the
PSI-BLAST function available on the NCBI website by comparing isolates between them and
determining the proteins likely to belong to an orthologous family (Altschul et al,. 1997).
Then, clusters were constructed using the symmetrical best hits between the isolates. These
results were manually separated to identify unique clusters of each isolates for comparison
purposes. The functions of clusters were then determined by RAST.
Primers design and in silico PCR. Primers were designed with the Primer3 online
application (Rozen and Skalestsky, 2000) in the selected coding regions specific to E. albertii.
The GyrB (DNA gyrase subunit B) gene was used as an internal positive control for
amplification of Enterobacteriaceae. The tested strains and primers used for the detection and
the identification of E. albertii are presented in Tables 1 and 2, respectively. In silico PCR
amplification (NCBI ressource coordinators, 2015) was performed using each pair of primers
with primer-BLAST (NCBI) to verify specificity of the primers in E. albertii.
Detection of E. albertii. A duplex nested colony PCR for the specific detection of E. albertii
strains among other Enterobacteriaceae was elaborated. The strains tested were E. albertii
ECC-Litt-3-1; two E. albertii (LMG20973 and LMG 20976), eight pathogenic and non-
pathogenic E. coli and four other pathogenic Enterobacteriaceae (Salmonella; Citrobacter;
Enterobacter and Escherichia fergusonii) that could be found in chicken. The primers were
designed to amplify two genetic targets: a region inside the semi-conserved gyrB gene (DNA
gyrase subunit B gene), which is the positive control for Enterobacteriaceae, and a region
64
inside of a putative fumarate reductase gene (FRD), specific to E. albertii strains. A second set
of primers (gyrB_nested and FRD_nested) hybridizing within the two first PCR products,
respectively, were designed to increase the sensitivity of the PCR (Table 2).
PCR detection limit for E. albertii. The duplex nested PCR for detection of E. albertii was
done with the primers previously described (gyrB, gyrB_nested, FRD and FRD_nested). In
order to verify the sensitivity of the PCR assay, different quantities of starting genomic
material in the first PCR were tested. (1) Ten-fold dilutions of E. coli K-12 MG1655 (105-10
0
cells); (2) Ten-fold dilutions of E. albertii ECC-Litt-3-1 (105-10
0 cells); (3) A mix of E. coli
(105 cells) and ten-fold dilutions of E. albertii (10
5 to 10
0 cells). The nested PCR was
performed using as starting material one µl of the first PCR reaction.
Identification of E. albertii and some of its virulence genes. This multiplex PCR was
performed on DNA of presumptive colonies of E. albertii. The primers (Table 2) were design
to amplify three E. albertii unique genes encoding for the putative fumarate reductase,
superoxide reductase and Yad-like fimbriae as well as two major virulence genes (eae and
ctdB II, III ,V) that can be found in E. albertii strains. The PCR was tested on ECC-Litt-3-1; E.
albertii LMG20973; E. albertii LMG 20976; E. coli K-12 MG1655.
PCR program and electrophoresis gel visualisation for all assays. The final 25-μl volume
of the PCR mixture contained 12.5 μl of Taq PCR Polymerase (New England Biolabs), 0.5
μM of each primer, 6.5 µl of molecular analysis-grade water, and genomic material (bacteria
or genomic DNA). The cycling conditions were 94°C for 3 min followed by 35 cycles of 94
°C for 30 s, 60 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s. The PCR products were separated on a 1 %
Tris-acetate-EDTA buffered agarose electrophoresis gel stained with ethidium bromide. The
migration was 100 volts for 70 min. The bands were referenced to a 100-bp DNA ladder (New
England BioLabs Inc., Ville, Canada) to size the amplicons.
65
RESULTS
Bioinformatics. The whole genome of ECC-Litt-3-1 was sequenced and the chromosomal
DNA was assembled into 359 contigs. The genome size is of 4,293,476 bp and there are 4,179
predicted coding sequences. The complete gyrB (2415 bp) sequence comparison with the
whole bacterial non redundant (nr) NCBI nucleotide database showed the highest similarity
values with E. albertii KF1 at 99 % and with E. fergusonii ATCC 35469 and some E. coli
strains such as the uropathogenic E. coli CFT073, the avian pathogenic E. coli APEC O1 and
E. coli SMS-3-5 at 94 %. The species-specific primers used in this study were tested by in
silico PCR analysis and showed specific amplification of E. albertii strains among all the
bacterial NCBI genome database. Only one E. coli strain was amplified by all the species-
specific E. albertii and virulence gene primers designed in this study: E. coli 80B_L1 (WGS
project NZ_CDRK00000000.1, NCBI) and therefore, we suspected it to be an E. albertii.
ECC-Litt-3-1 biochemical profiling. The results of the API 20E test on type strains
E. albertii LMG20973 and LMG 20976 corresponded to that was found in other studies (Huys
et al., 2003), i.e., the identification of E. coli or Hafnia alvei with a poor confidence level.
Additional conventional tests for ECC-Litt-3-1 were done and it was found to be non-motile at
35 °C, glucose fermenting positive (with gas) and negative for the fermentation of lactose,
mannitol (variable), sorbitol and rhamnose. Considering only the biochemical tests of this
study, the strain ECC-Litt-3-1 has the same biochemical profile as E. albertii LMG20973.
Strain ECC-Litt-3-1 and E. albertii LMG20973 differed from E. coli K-12 MG1655 by the
lack of motility, the ornithine decarboxylase (positive) and showed no fermentation of lactose.
Detection of E. albertii. The result of the detection of E. albertii by PCR is shown in Figure 1.
The positive control gyrB product is of 982 bp, in the first PCR and 553 bp in nested PCR for
all Enterobacteriaceae tested including E.coli, E. fergusonii and Salmonella. The fumarate
reductase (FRD)-specific E. albertii PCR product was, as expected, of 351 bp in the first PCR
and of 160 bp in the nested PCR. The amplification product was observed only in E. albertii
66
strains but not in other Enterobacteriaceae and the results thus corresponded to in silico PCR
analysis.
PCR detection limit for E. albertii. Figures 2 and 3 show the results of the nested PCR
detection of E. albertii using variable quantities of starting genomic material in the first PCR:
E. albertii ECC-Litt-3-1 (105-1 cfu; left panel, Figure 2); E. coli K-12 MG1655 (10
5-1 cfu;
right panel, Figure 2) or a mix of E. coli (105 cfu) with E. albertii (10
5-1 cfu). The primers
targeting gyrB amplified specific products in both E. coli and E. albertii and the primers
targeting the FDR gene produced an amplicon only in E. albertii. The E. albertii products
resulting from the nested PCR assay were detectable using as little as 1-100 cfu as starting
material in the first PCR reaction. This was true even if E. albertii was mixed with as high as
105 E. coli cfu (Figure 3).
Identification of E. albertii and some of its virulence genes. Figure 4 shows the
amplification results using all six pairs of primers (Table 2) tested in simplex and in multiplex
for three E. albertii and one E. coli strains. The FRD, superoxide reductase and Yad-like
fimbriae primers amplified products of 351 bp, 164 bp and 555 bp, respectively, only in all
tested E. albertii strains. The results corresponded to the in silico PCR analysis. The eae and
cdtB primers amplified products of 698 and 351 bp in the E. albertii strains but not in E. coli
K-12 MG1655. Only the positive control, gyrB (982 bp) is amplified in both E. albertii and E.
coli strains, in both simplex and multiplex assays.
67
Figure 1 Detection of E. albertii by duplex PCR using the primers: gyrB_982 and FRD_351
for the first PCR and nested primers (gyrB_nested_553 and FRD_nested_160) and showing
amplification of the fumarate reductase (FRD) (351 bp and 160 bp) only in E. albertii strains
but not in the others Enterobacteriaceae tested. GyrB and gyrB_nested primers (targeting the
DNA gyrase subunit B gene) are used as postive controls. Lanes 1-15, first PCR; lanes 16-30,
nested PCR.
Lanes: M: 100-bp DNA Ladder; 1, 16: E. albertii ECC-Litt-3-1; 2, 17: E. albertii LMG
20973; 3, 18: E. albertii LMG 20976; 4, 19: E. coli K-12 MG1655; 5, 20: E. coli O127:H6
E2348/69 EPEC; 6, 21: E. coli O45:K-:H- ECL1001 EPEC; 7, 22: E. coli O78:H11 H10407
ETEC (ATCC 35401); 8, 23: E. coli O6:H1:K+ CFT073 UPEC; 9, 24: E. coli ATCC 25922;
10, 25: E. coli O1:K1:H7 NCTC 9001 APEC (ATCC 11775); 11, 26: E. coli O78:K80:H9
chi7122 APEC 12, 27: Salmonella enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028); 13, 28:
Citrobacter freundii (ATCC 8090); 14, 29: Enterobacter cloacae (ATCC 35030); 15, 30:
Escherichia fergusonii ECD 227.
68
Figure 2: Duplex PCR using the primers: gyrB_982 and FRD_351 for the first PCR and
nested primers (gyrB_nested_553 and FRD_nested_160) showing amplification of the
fumarate reductase (FRD) (351 bp and 160 bp) in E. albertii strain only and not in E. coli
strain. GyrB and gyrB_nested primers (targeting the DNA gyrase subunit B gene) were used as
positive controls.
Lanes: 1-6: E. albertii ECC-Litt-3-1 (105-1 cfu) first PCR; 13-18: E. albertii ECC-Litt-3-1
(105-1 cfu) nested PCR; 7-12: E. coli K-12 MG1655 (10
5-1 cfu) first PCR; 19-24: E. coli K-
12 MG1655 (105-1cfu) nested PCR.
69
Figure 3 Duplex PCR using the primers: gyrB_982 and FRD_351 for the first PCR and nested
primers (gyrB_nested_553 and FRD_nested_160) showing amplification of the fumarate
reductase (FRD) (351 bp and 160 bp) only in E. albertii strains. The gyrB and gyrB_nested
primers (targeting the DNA gyrase subunit B gene) are used as positive controls. In each PCR
reaction, 105 cells of E. coli were added to ten-fold dilutions of E. albertii (10
5 to 1 cfu).
Lanes: 1-6: ECC-Litt-3-1 (105 to 1 cfu) and E. coli K-12 MG1655 (10
5 cfu) first PCR; Lanes
7-12: 1 µl of the first PCR reactions (lanes 1-6) were used in the nested PCR assay.
70
Figure 4. PCR identification of some virulence genes in E. albertii. Simplex and mutliplex
PCR using the primers gyrB_982, intimin_698, Yad-like_558, CDT, FRD_351 and SOR_164
showing amplification in E. albertii. The gyrB and gyrB_nested primers are used as positive
controls. The primers Yad-like_558, FRD_351 and SOR_164 target unique genes in E. albertii
strains. The primers: intimin_698 and CDT target the intimin (5’ eae) and the cytolethal toxin
(cdtB II, III, V), two virulence genes that can be found in in E. albertii and some other
Enterobacteriaceae.
Lanes: M: 100-bp DNA Ladder; 1-6: ECC-Litt-3-1 simplex; 7: E. albertii ECC-Litt-3-1
multiplex; 8-13: E. albertii LMG 20973 simplex; 14: E. albertii LMG 20973 multiplex: 15-
20: E. albertii LMG 20976 simplex; 21: E. albertii LMG 20976 multiplex; 22-27: E. coli K-
12 MG1655 simplex; 28: E. coli K-12 MG1655 multiplex.
71
DISCUSSION
Commercial biochemical test like API 20E or API 50CH (Biomérieux) have not integrated E.
albertii in their database yet and will lead typically to identification of E. albertii strains as
Hafnia alvei, E. coli, Shigella, Salmonella enterica or Yersinia ruckeri. In this study, ECC-
Litt-3-1 was, not surprisingly, identified as Hafnia alvei by API 20E strips. Even if E. albertii
shares many biochemical characteristics with Hafnia alvei or inactive E. coli (also called
Alkalescens/Dispar), their pathogenicity remains completely divergent. The 16S rDNA based
phylogeny is a typical method used in bacterial identification. In fact, many studies have used
this method to correctly classified E. albertii isolates into the Escherichia/Shigella
phylogenetic lineage. However, 16S rDNA sequencing does not usually allow good
discrimination between closely related strains when used alone as an identification method.
Also, the semi-conserved gene gyrB, used in this study allowed better separation of
Enterobacteriaceae. The gyrB gene in E. albertii isolate Litt-3-1 showed 99 % homology with
E. albertii KF1 and 94 % with E. coli and E. fergusonii. Other studies using DNA-DNA
hybridization studies, O-antisera serotyping, plasmid profile analysis (E. coli pVIR, pO157 or
pEAF), chromosome integration site of the LEE (in the pheU tRNA), phoE (OMP gene)
specific Escherichia/Shigella lineage gene and susceptibility to specific antibiotics and to
Hafnia alvei phages have helped the classification of E. albertii isolates into the Escherichia
family and provided hints for the creation of the new species E. albertii. The presence of
virulence genes can also help identification of specific strains and species. In particular, the
intimin gene eae can be found in typical EHEC strains. The intimin subtypes identified in
E. albertii strains are usually rare or previously undescribed in E. coli (Ooka et al., 2012).
Whole-genome sequencing has become more affordable in the last decade and has provided a
lot of information about bacterial genomic contents useful for phylogenetic classification.
Until now, only five E. albertii complete genomes are available on the NBCI nucleotide
database and only one multiplex PCR for E. albertii has been developed (Hyma et al., 2005).
The primers of this PCR are designed to detect regions in lysP (lysine specific permease) and
72
in mdh (malate dehydrogenase), two housekeeping genes of the E. albertii lineage. These
primers have been used in other studies. The study of Konno et al. (2012) expanded the PCR
test by targeting additional genes: stx, eae, uidA (β-D-glucuronidase) and ctdB. However,
Maeda et al. (2014) reported the amplification of a nonspecific product using the lysP/mdh
primers on other pathogenic species isolated from bean sprouts, which may lead to a false
positive detection of E. albertii in food. They also designed a novel set of primers: EA0134-
283F/EA0134-446R amplifying a 209 bp product specific to E. albertii. The latter primers
were tested on pure bacterial colonies but not on food samples. We found that such primers
however show some single nucleotide polymorphism (SNP) for strains E. albertii ECC-Litt-3-
1, KF-1, TW08933, TW15818, and E. coli 80B, the latter being possibly a E. albertii (data not
shown).
The PCR primers and method we have developed and reported here showed high specificity in
detecting E. albertii strains (in silico and using reference strains in vitro). Furthermore, the
nested primers we designed help to increase sensitivity for detection of as low as 1-100 cfu
even when mixed with a larger proportion of other Enterobacteriaceae such as E. coli. This is
thus a simple and easy PCR method that could be used as a routine test to accurately detect E.
albertii in food or fecal samples.
Besides, we also developed a multiplex PCR method that could be used on presumptive E.
albertii isolates with the objective of also characterizing their virulence potential. The
virulence genes eae and ctdB were chosen as targets because they appear to be critical
components of the virulence of E. albertii (Hinenoya et al., 2014; Maheux et al., 2014;
Murakami et al., 2014; Nimri, 2013; Oaks et al., 2010; Oh et al., 2011; Ooka et al., 2012).
Those genes were amplified in all E. albertii strains we tested including isolate ECC-Litt-3-1.
There are about 20 different subtypes of the intimin encoding gene. The intimin gene can be
found in other Enterobacteriaceae such as Citrobacterium and diarrheagenic E. coli causing
A/E lesions. The 3’ region of this gene, encoding the domain responsible for binding to host
epithelial cells, is highly variable (Oaks et al., 2010). The eae primers we selected in this study
73
were designed to target a well conserved 5’ region found in E. albertii but also in
EHEC/EPEC strains. Additionally, the cytolethal distending toxin (CDT) can be isolated from
a variety of pathogens including pathogenic E. coli, Shigella and Campylobacter spp.. The
CdtB subunit is an enzymatically active region homologous to a class of phosphodiesterases
which includes nucleases (Hyma et al., 2005). The primers of ctdB gene amplify a common
region in the subtypes II, III and V which are the most commonly subtypes found in E. albertii
strains (Maheux et al., 2014).
Our multiplex PCR that aims at strain characterization also amplifies three other genes unique
to E. albertii for confirmation of species identification. The specificity of the PCR assay was
demonstrated against three E. albertii and 12 other chicken pathogens. In silico PCR was also
performed against all de Enterobacteriaceae genomes available in the NCBI database. Finally,
the two PCR methods developed here (nested PCR for detection of E. albertii in mixed
samples and the multiplex PCR for species confirmation and strain characterization) allowed
confirmation of the classification of the isolate ECC-Litt-3-1 as an E. albertii eae and ctdB
positive. This potential pathogenic strain ECC-Litt-3-1 was isolated from chicken litter and
was initially misidentified as E. coli (Lefebvre et al., 2009). The next step is to test our PCR
methods on food or clinical samples.
CONCLUSION
E. albertii is poorly characterized and its incidence in food and its clinical impact are unknown
probably due in part to its misidentification by biochemical tests. E. albertii strains have a
high pathogenic potential and the detection of such emerging pathogens should not be
neglected. In this study, we develop two PCR methods for the detection of E. albertii among
other enteric bacteria and for the identification of some of its related virulence genes. The
primers were designed to target three specific and unique E. albertii genes, not previously
identified in other studies, and showed high specificity in vitro and in silico. This method is
very sensitive and can detect as low as 1-100 cfu even among a large concentration of other
74
Enterobacteriaceae. The PCR methods developed here could help quick identification of E.
albertii strains in routine tests and will certainly help the global distribution and clinical
impact of E. albertii strains in health and agro-food sectors.
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by Agriculture and Agri-Food Canada through the Sustainable
Agriculture Environmental Systems (SAGES) program to M. S. Diarra and by grant 89758-01
from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) to F.
Malouin.
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78
CHAPITRE 4
DISCUSSION ET CONCLUSION
4.1. Le MMRS et la région mutS-rpoS
Certaines souches d’Escherichia coli ont acquis des gènes favorisant leur colonisation et leur
virulence chez les humains et les animaux. En effet, il existe plusieurs virotypes causant une
variété d’infections autant intestinales qu’extra-intestinales, en passant par la dysenterie, les
infections urinaires et la méningite. Les souches commensales et pathogéniques font face à
une pression sélective et doivent continuellement s’adapter à des nouvelles conditions
environnementales. À titre d’exemple, les études précédentes dans notre laboratoire ont
démontré que l’utilisation d’antibiotiques en tant que promoteurs de croissance chez les
animaux de ferme favorise le développement de souches résistantes (Lefebvre et al., 2005).
La variabilité d’E. coli est très grande et différents mécanismes contribuent à sa
diversité comme le transfert d’éléments génétiques mobiles codant la plupart du temps pour
des déterminants virulents et les modifications génétiques. Plusieurs études, ont en effet
démontré que le génome d’E. coli possède de nombreuses séquences d’insertion et de
bactériophages. De nombreux échanges génétiques entre des souches d’E. coli spp.,
Salmonella spp. et Shigella spp. ont eu lieu par le passé et comme nous l’avons démontré ces
souches sont très proches phylogénétiquement.
Afin d’atteindre les objectifs du projet, des études de génomique comparative ont été réalisées
sur certaines régions génomiques chez les entérobactéries. Nous avons inclut dans l’analyse
deux isolats atypiques hypermutables du genre Escherichia (06-01-03-17 et ECC-Litt-3-1)
dont les génomes complets ont été séquencés. Durant la dernière décennie, une augmentation
79
drastique de l’utilisation des technologies de séquençage à haut débit a été observée. Ces
technologies sont de plus en plus accessibles et permettent de produire des résultats sur
l’ensemble du génome. Cela peut s’avèrer très utile pour mieux comprendre les mécanismes
d’évolution au niveau génomique. Les applications des données de séquençage sont
nombreuses et incluent: l’épidémiologie, le diagnostic clinique, l’identification de cibles
moléculaires thérapeutiques, la génétique et même la surveillance des souches pathogènes
émergentes et les mécanismes reliés à cette émergence.
Le but de la première partie de ce projet était de caractériser et comparer la variabilité dans les
régions mutS-rpoS chez E. coli, Salmonella, Shigella et les deux isolats atypiques
hypermutables. Le phénotype hypermutable de la souche 06-01-03-17 est fort probablement la
conséquence de mutations dans les gènes du MMRS et nous pensons qu’elle pourrait être aussi
liée à la région mutS-rpoS. Aussi, deux gènes spécifiques aux ExPEC hautement pathogènes
ont été explorés en tant que marqueurs pour l’identification et la caractérisation des E. coli
extra-intestinaux.
La région mutS-rpoS est une des principales sources de diversité chromosomique chez E. coli.
C’est une région connue pour être hautement polymorphique et favorable aux mutations et aux
transferts latéraux chez les souches d’E. coli et même chez la grande famille des
Enterobacteriaceae. Comme décrit dans la littérature, nous avons observé sept régions mutS-
rpoS différentes de longueurs variables, ce qui nous a permis de constater la grande variabilité
dans cette région chez Escherichia spp., Salmonella spp. et Shigella spp. Chez, E. coli, la
région mutS-rpos a été décrite comme étant un bon marqueur de la pathogénicité des souches
puisque cette région est corrélée avec certains virotypes. De plus, les gènes à l’intérieur de
cette région sont vraisemblablement reliés à la virulence des souches et à l’adaptation rapide
dans un nouvel environnement (Ewers et al., 2014). Chez E. coli, quatre régions mutS-rpoS
ont été retrouvées et sont associées majoritairement à certains virotypes: 1) K-12 and
commensal 2) O157:H7 and EHEC 3) O104:H4 and EAEC and EPEC 4) ExPEC.
80
Nous avons examiné une sous-région de 3.7 kb à l’intérieur de la région mutS-rpoS retrouvée
chez la majorité des E. coli extra-intestinaux: c3302-04. Cette région n’est pas retrouvée chez
d’autres Enterobacteriaceae disponibles dans la banque de données NCBI. Comme décrit par
Ewers et al., 2014), cette sous-région est liée presqu’exclusivement au groupe phylogénétique
B2, composé des souches ExPEC hautement virulentes comme la souche multi-résistante
ST131 (Ewers et al., 2014; Clermont et al., 2013; Culham et Wood, 2000).
Bien qu’il existe énormément d’information dans la littérature sur la virulence des souches
intestinales, très peu d’information est disponible sur les souches invasives comme les ExPEC.
En plus de leur habileté à coloniser le tractus intestinal des mammifères et des oiseaux, elles
peuvent infecter pratiquement tous les organes et causer une grande variété de maladies. Les
groupes de souches les plus connues chez les souches d’E. coli extra-intestinales sont les
UPEC (urinaires) et les NMEC (méninigite) chez l’humain et les APEC, chez les oiseaux. La
présence de la région c3302-04 chez les APEC reste à confirmer, mais diverses études ont
démontré une grande similarité génomique entre les ExPEC humains et les APEC.
En plus, les souches ExPEC sont souvent confondues avec les souches commensales et la
différenciation basée sur leur profil de virulence est difficile. Il est connu que toute souche
pathogène peut coloniser de façon asymptomatique, mais peuvent être nocives lorsque les
défenses naturelles de l’hôte sont affaiblies. Nous avons en effet observé que certaines souches
E. coli dont la pathogénicité n’a pas été observée jusqu’à maintenant ont la même région
mutS-rpoS que les ExPEC et autres virotypes. Cela porte à croire que ces souches ont un
potentiel de virulence élevé et pourraient être de futures souches pathogènes émergentes. Il
serait quand même intéressant d’identifier les genes de virulence chez les souches étudiées
afin d’avoir une meilleure idée de leur profil de virulence et de leur virotypes, en particulier
les souches commensales, non pathogènes ou atypiques ayant une region mutS-rpoS différente
des autres souches du même virotype.
81
La région c3302-04 a été explorée en tant que marqueur pour l’identification et la
caractérisation des E. coli extra-intestinaux. Cette région a possiblement été transférée d’autres
genres ou espèces pathogéniques. Les rôles des régions codantes c3302 et c3304 sont
sûrement intimement associées à la pathogénicité de la plupart des ExPEC et autres souches
reliées: résistance aux mutations, colonisation et invasion extra-intestinale. Dans cette étude, le
locus c3302 était associé à la liaison au zinc et des activités cataboliques tandis que c3304 était
plutôt associé à la liaison du FMN (flavine mononucléotide) et les activités d’oxido-réduction.
Entre ces deux régions codantes, on retrouve une séquence d’insertion, ce qui indique un site
potentiel pour le transfert latéral et les recombinaisons génétiques dans cette région. Des
études supplémentaires pourraient être faites dans le but de vérifier si ces deux genes sont
toujours transférés ensemble et/ou si leur function est reliée.
En comparant cette région chez les souches d’E. coli, nous avons observé que les loci c3302-
04 sont très bien conservés. La majorité des mutations n’ont pas d’effet sur la protéine codée,
mais quelques mutations clés, situées dans les domaines protéiques conservés ont été trouvées.
Ces mutations pourraient avoir un effet important sur l’expression de la protéine et sur la
pathogénicité des souches et peut apporter des informations sur la phylogénie et la virulence
des ExPEC. La region c3302-04 était aussi présente chez l’isolat bovin E. coli hypermutable
06-01-03-17 et les mutations dans cette region pourraient être impliquées dans l’apparition du
phenotype d’hypermutabilité. Il serait intéressant de vérifier l’effet de cette region sur la
virulence de cet isolat ainsi que chez des souches UPEC et APEC dans un modèle animal;
d’étudier l’implication de chaque SNP dans la région c3302-04 sur l’expression des protéines
et leur rôle dans la virulence et de vérifier si les mutations dans le MMRS sont impliquées
dans l’apparition du phénotype hypermutable (identificaiton de SNPs, creations de mutants et
test d’hypermutabilité).
82
4.2. E. albertii, une souche pathogène émergente
L’isolat E. albertii ECC-Litt-3-1 était initiallement caractérisé comme E. coli eae+ atypique
par la présence des combinaisons de gènes de virulence et de variants différents de ce qui est
connu chez E. coli. Toutefois, cet isolat présentait de nombreuses caractéristiques
phenotypiques et génotypiques similaires à E. coli. En effet, plusieurs études ont démontré que
les souches d’E. albertii ont souvent été confondues avec d’autres membres des
Enterobacteriaceae et qu’ils ont probablement été souvent mal classifiés ou non détectés par
les tests de routine. Les tests commerciaux biochimiques n’incluent pas E. albertii dans leur
méthode de détection et notamment en utlisant le système API 20E, E. albertii est souvent
confondu avec Hafnia alvei et E. coli.
E. albertii est un bon exemple de bactérie pathogène émergente au niveau agro-alimentaire.
Elle a été impliquée dans plusieurs cas d’éclosion alimentaire. Elle est toutefois peu
caractérisée pour l’instant et aucun test rapide et efficace n’existe pour détecter la présence
d’E. albertii dans les aliments afin de ne pas le confondre avec d’autres Enterobacteriaceae.
Les objectifs de cette deuxième partie étaient d’identifier des cibles moléculaires spécifiques à
E. albertii par des études de génomique comparative en incluant l’isolat E. albertii ECC-litt-3-
1 et de développer une méthode PCR pour le détecter et caractériser certains de ces gènes de
virulence.
Les objectifs ont été atteints, car deux méthodes PCR ont été développées afin d’identifier et
caractériser les souches d’E. albertii. Une première méthode PCR a été développé avec une
cible moléculaire (fumarate reductase) spécifique à E. albertii. Cette méthode a été testée dans
un mélange d’entérobactéries, et E. albertii a été correctement identifié avec une sensibilité
allant jusqu’à 100 cfu. La deuxième méthode PCR permet l’identification de deux autres gènes
spécifiques à E. albertii, permettant la confirmation du premier PCR et la détection de certains
gènes de virulence présents chez les souches d’E. albertii. Il serait intéressant de tester cette
méthode PCR sur des échantillons cliniques, dans le poulet par exemple, et d’évaluer
83
l’incidence de cette souche pathogène dans les aliments et son risque de transmission chez
l’humain.
Bref, ces méthodes PCR développées pourraient permettre l’identification d’E. albertii dans
les tests de routine et aider la compréhesion globale de cette souche pathogène dans le secteur
agro-alimentaire.
4.3. Conclusion générale
Pour conclure, les souches atypiques étudiées dont celles incluses dans cette étude
représentent un modèle d’étude de l’évolutive des souches pathogéniques suite à l’acquisition
d’avantages sélectifs ponctuels ou permanents. Les souches atyiques sont des réservoirs
malléables pour l’échange et la transmission de facteurs de virulence. Ces souches ont un
risque zoonotique important et elles sont de plus en plus isolées de cas cliniques, mais leur
mécanisme évolutif est peu compris. Nous avons également étudié les souches hypermutables,
la région mutS-rpoS et les mutations à l’intérieur de cette région qui sont tous des mécanismes
majeurs dans la diversité génomique et le tranfert de déterminants virulents favorisant
l’adapatation et l’évolution des souches pathogènes.
La souche bovine E. coli 06-01-03-17 est une souche atypique avec des facteurs de virulence
associés aux ExPEC/EHEC et une région mutS-rpoS identifique aux souches hautement
pathogènes extra-intestinales. L’isolat avaire ECC-Litt-3-1 possède des caractéristiques et
gènes de virulence associés à la souche pathogène émergente: E. albertii. Bien que ces deux
souches aient été isolées à partir d’animaux de ferme en santé et même si leur pathogénicité
chez l’humain n’a pas été investiguée, elles ont un grand potentiel de virulence. Cela démontre
que les souches atypiques méritent une attention particulière et ont des facteurs de virulence
favorisant leur émergence.
84
À long terme, nos travaux permettront d’identifier les mécanismes d’évolution, de
dissémination et d’émergence de zoopathogènes. Plus concrètement, ces recherches font partie
d’un projet plus large ayant pour but ultime l’identification des pratiques d’élevage pouvant
diminuer l’incidence des souches virulentes chez les animaux de ferme.
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