I. Obtention d’Ac polyclonaux Obtention d’Ac...

I. Obtention d’Ac polyclonaux

II. Obtention d’Ac monoclonaux

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1. Animaux concernés

2. Protocole d’immunisation

3. Réponses primaire et secondaire

2

Ils sont produits par des animaux suite à une immunisation

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� Exempts de maladies (statut sanitaire contrôlé et quarantaine)

� Elevés dans des conditions codifiées (locaux respectant température, hygrométrie, surface et hauteur réglementaires)

� Non stressés avant et pendant le protocole

� Euthanasiés en fin de protocole

Température des locaux (°C) Hygrometrie

Surface des cages / stalle

Directive européenne

Hauteur minimale de la cage (cm)

Directive européenne

Souris 20-24 55+/-10% 180 cm² 12

Rat 20-24 55+/-10% 350 cm² 14

Cobaye 20-24 55+/-10% 600 cm² 18

Lapin 15-21 55+/-10% 2500 cm² 35

Poule 15-21 55+/-10% 500 cm² 35

Chèvre 10-24 55+/-10% 0,8 m² /

Directive : 86/609/CEE Décret n°2001-486 du 6 juin 2001

� Etape 1 : Un Antigène est inoculé à un animal par voie parentérale : ce

dernier produit des Ac reconnaissant différents épitopes du même

antigène selon le mécanisme suivant :

� Etape 2 : Le taux d’Ac plasmatique augmente alors.

� Etape 3 : Prélèvement sanguin

� Etape 4 : Purification des Ac plasmatiques

http://www.ac-nancy-metz.fr/enseign/svt/ressourc/rescien/immuno/immacpol.htm

Injection de l’antigène

par voie parentérale*

Rencontre de l’antigène et des

cellules de l’immunité dans les

OLS (ganglions et rate)

Présentation de

l’antigène dégradé par

les cellules présentant

l’antigène aux LT4

spécifiques (TCR)

dans le contexte du

CMHII

Prolifération clonale des

LB spécifiques (BCR)

pour différenciation en P

pour cellules mémoires

Augmentation

de la

concentration

plasmatique

des anticorps

spécifiques

Prélèvement

sanguin

Purification des

anticorps

plasmatiques

*sous cutanée, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale (LB retrouvés dans les gangliions) , intraveineuse (LB retrouvés dans la rate)

+

Variables en ce qui concerne : � Espèce et nombre d’animaux immunisés

� Durée du protocole

� Nombre d’injections

� Quantité injectée

� Nombre de prélèvements

Espèce

Nombre minimal d’animaux

par protocole

Durée du protocole

(en jours)

Nombre d’injections

par animal

Quantité injectée

par injection

Nombre de prélèvements

par animal Quantité finale

2 70 4 100-250 µg / 25 œufs (15-20 mg IgY spécifiques)

1 35 3 100-250 µg / 6 œufs (600 mg d’IgY totales)

Lapin 1 77 5 150-250 µg 3 150 ml

Chèvre 1 77 5 150-250 µg 2 300 ml

Souris 5 35 3 20-50 µg 1 375 µl

Rat 3 38 3 150 µg 1 900 µl

Cobaye 3 49 4 150 µg 1 12 ml

Poule

La réponse primaire présente � Un temps de latence � Un taux d’anticorps

� modéré � qui décroît rapidement � constitué d’IgM puis d’IgG

Titre en anticorps

Temps en semaines

La réponse secondaire présente • Une réponse immédiate • Un taux d’anticorps

• important • qui reste élevé • constitué essentiellement par des IgG

Premier

contact avec

l’antigène

Second

contact avec

l’antigène

IgG

IgM

IgG

IgM

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I. Obtention d’Ac polyclonaux

II. Obtention d’Ac monoclonaux

1. Généralités

2. Obtention des hybridomes

3. Isolement des hybridomes

4. Clonage et sélection des hybridomes

5. Conservation des hybridomes

6. Production des Ac

7. Sélection des Ac

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Mise au point en 1975 par Köhler et Milstein d’une technique permettant d’obtenir

� Une culture d’hybridomes, cellules issues de la

fusion � de cellules cancéreuses se multipliant en lignée continue

� de lymphocytes B producteurs d’anticorps spécifiques

� Produisant de grandes quantités d’anticorps spécifiques d’un seul épitope appelés � AcM : anticorps monoclonaux � ou mAb : monoclonal Antibody

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Les Lymphocytes

� obtenus par immunisation animale (injection ag + adjuvant)

� prélevés au niveau des organes lymphoïdes secondaires puis isolés sur gradient de ficoll

� ne donnant pas de lignées cellulaires continues in vitro (cellules mortelles)

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� Les solutions utilisées : • solutions de polymères de sucres de

composition variable

• de densités différentes permettant la séparation de cellules de différentes densités.

� Technique • très simple,

• peu onéreuse

• mais peu sélective

• ne permettant pas de séparer des cellules de densité proches.

Séparation des lymphocytes à partir d’une suspension de cellules spléniques en gradient de Ficoll

Dépôt

d’un volume de suspension cellulaire (d = 1,006)

sur un volume de Ficoll (d=1,077)

Centrifugation 30 minutes à 500 g à 18-20 °C

Anneau de lymphocytes (+M et plaquettes)

Plasma

Ficoll

Culot contenant polynucléaires et hématies

� myélomateuses responsables d’hémosarcomes (cancer du tissu conjonctif : moelle osseuse rouge)

� capables de proliférer par non régulation cellulaire in vivo donnant des myélomes

� constituant in vitro des lignées cellulaires continues (« immortalisées »)

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Choix des cellules : même espèce que les lymphocytes avec une double mutation

- HGPRT- -> incapacité de synthétiser les nucléotides AMP et GMP nécessaires à la réplication de l’ADN - Incapables de produire des anticorps.

Les cellules cancéreuses

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Par procédé chimique : ajout de polyéthylène glycol (PEG facilitant la fusion membranaire

Par procédé physique : électrofusion à l’aide d’un champ électrique

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Après fusion: seuls les hybridomes nous intéressent. Pour cela nous utilisons la particularité des cellules de myélome que nous avons choisi : elles sont HGPRT-

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La fabrication des purines et pyrimidines peut emprunter la voie endogène (bloquée par l’aminoptérine) ou la voie exogène nécessitant alors de la thymidine et de l’hypoxanthine (voie faisant intervenir l’HGPRT).

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Ainsi il faut utiliser le milieu HAT : hypoxanthine/ AMinoptérine/ Thymidine pour sélectionner nos hybridomes. Sur ce milieu, - l’aminoptérine bloque la voie endogène, - seule la voie exogène peut être utilisée, - or chez les cellules de myélome, l’enzyme HGPRT n’étant pas

fonctionnelle, la synthèse des purines est impossible et ces cellules ne se développent pas sur le milieu.

Lymphocyte B

Pas de lignée cellulaire car incapacité de division sur milieu HAT : mort cellulaire

Hybridome �Multiplication possible (HGPRT+ des LB) �Lignée stable (cellules cancéreuses) �Production d’anticorps (LB)

Cellule myélomateuse HGPRT-

Pas de lignée cellulaire stable Pas de production importante d’anticorps

FUSION

FUSION

FUSION

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Ainsi : - les fusions LB/LB meurent rapidement car elles ont une durée

de vie limitée, - les fusions Myélome/myélome ne peuvent se développer donc

seuls les fusions LB/Myélome se développent.

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� Culture en milieu gélosé � Culture en boite à 37°C en atmosphère enrichie à 5% en CO2 � Prélèvement des colonies obtenues pour mise en culture des UFC en puits.

� En plaque par dilution limite � Réalisation de séries de dilutions pour obtenir 1 cellule pour un puits ou deux puits.

� Caractérisés par des tests immunologiques sur le surnageant du milieu de culture � avant (identification des hybridomes producteurs

d’anticorps), � pendant (sélection des clones d’intérêt) � après le clonage (vérification de la spécificité)

� Grâce à des techniques

• sensibles (de l’ordre de 10 ng d’anticorps par mL de surnageant)

• reproductibles • de réalisation rapide

� Quand � Aux divers stades de la sélection

� Pourquoi � Pour pallier à toute contamination ou accident ultérieur

� Comment � Par congélation d’un culot de centrifugation cellulaire contenant 107 cellules. � mélangé avec le milieu de congélation (10 % de DMSO* dans du SVF* dans la glace)

� transvasé en tube à congélation � placé à -20 °C pendant environ 30 minutes � transféré à -80°C pendant 1 journée. � conservé sous azote liquide

DMSO : DiMéthylSulfOxyde, cryoprotecteur ; SVF : Sérum de Veau Foetal

� Cultures primaires et secondaires de taille progressive en récipients à fond plat puis en bouteilles cylindriques mises à incuber sur un agitateur à rotation lente et régulière.

� Cultures à grande échelle en bioréacteurs (capacité entre 10 et 10 000 l)

Peut se faire in vivo!

Essentiellement par Chromatographie � d’exclusion (ou gel filtration)

� basée sur la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur poids moléculaire

� d’immunoaffinité � technique hautement spécifique de molécules en fonction des

interactions � permettant d’isoler :

� soit des anticorps d’intérêt à partir de l’antigène qui a servi à l’immunisation

� soit les antigènes d’intérêt à partir des anticorps fixés sur la colonne

� d’affinité sur protéines A ou G � technique utilisant la propriété de ces protéines bactériennes de se lier

spécifiquement avec la partie Fc des IgG des mammifères.

réponse polyclonale (antisérum) anticorps monoclonal (mAb)

plusieurs épitopes un seul épitope

plusieurs un seul

élevée variable

toutes variable selon la classe produite

lapin, mouton, cheval, chèvre, poule souris

obtentionimmunisation répétée chez l'animal,

prélèvement au pic de la réaction secondaire

culture in vitro d'un hybridome obtenu à partir d'une souris

immunisée

délai 6 semaines 6 mois

variabilité des lots

très grande car liée :

- à l'animal

- au temps

très faible:

- production in vitro très homogène

- conservation des hybridomes dans l'azote liquide

inconvénient

utilisation de nombreux animaux

pour fournir de grandes quantités d'anticorps

à chaque immunisation = un lot d'antigène

instabilité de certains hybridomes

exigence de culture

problème éthique lié à la production "en ascite".

avantage simplicité faible quantité d'antigène nécessaire pour immunisation

plupart des anticorps à visée thérapeutique

études immunologiques ponctuelles et simples

recherche fondamentale (spécificité fine)

- applications diagnostic et industrielles très nombreuses

- quelques anticorps à visée thérapeutique (anti-TNF..)

espèce productrice

utilisations principales

production

Comparaison

spécificité

nature (type et classe)

affinité

fonctions biologiques

� Test de grossesse et d’ovulation

�Utilisation thérapeutique des Ac monoclonaux pour lutter contre les cellules cancéreuses

�Utilisation pour les tests ELISA