View
124
Download
5
Category
Preview:
Citation preview
La culture des bactéries
CIVEL / Microbiologie
La culture des bactéries
I. Multiplication des bactéries
Bactérie mère
Allongement Invagination Division
2 bactéries filles
La scissiparité
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
méthode des quadrants
2 : Diviser la boîte de petri en 4 quadrants
3 : soulever le couvercle de la boite de Pétri et déposer l’inoculum (à l’aide de l’oese) sur une petite surface au point initial.
4 : stériliser l’oese et après refroidissement faire des stries serrées sur toute la surface des quadrants 1 et 2
5 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries serrées sur les quadrants 2 et 3.
6 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries serrées sur les quadrants 3 et 4.
7 : stériliser l’oese et placer la boite (correctement identifiée) à l’envers (couvercle vers le bas) dans l’étuve.
3
4
2
1
1
2 3
4Isolement sur milieux solides, par la méthode des quadrants
Zone riche
Colonies isolées
1
2 3
4- Le dépôt est effectué en zone 1-2, les colonies y sont serrées et petites.- La fin de l’isolement se fait en zone 4 : on retrouve des colonies isolées
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
Colonie isolée
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens) Variantes
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
Initiales, N°de poste, référence de la souche
Ne jamais écrire sur le couvercle !!
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
En milieu solide : méthode par épuisement
En milieu solide : méthode par épuisement
Face Profil
En milieu solide : méthode par épuisement
Gélose inclinée
Vue de profil
Vue de face
Stries
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
En milieu solide : méthode par épuisement
L’examen macroscopique
En milieu liquide
L’examen macroscopique : En milieu liquide
SURFACE : Voile, Anneau
CULOT : Couleur, adhérence
Importance du trouble +(bulles ? Homogénéïté, couleur…)
L’examen macroscopique : En milieu liquide
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
En milieu solide : méthode par épuisement
L’examen macroscopique
En milieu liquide
En milieu solide
L’examen macroscopique : Sur milieu solide
L’étude de colonies
L’examen macroscopique : Sur milieu solide
L’étude de colonies
Taille, forme, relief, contour,
aspect de la surface, transillumination,
consistance, couleur,
présence d’un halo…
Halo opaque
Halo clair
Centre noir (colonie)
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
III.1. Définitions
-Milieux de culture = préparation dans laquelle un microorganisme peut se multiplier. Il doit donc comporter tous les éléments nutritifs et les conditions physico-chimiques (pH, T°, concentration en ions…) nécessaires au développement du germe étudié.
-Ensemencer = c’est introduire un microorganisme dans ou sur un milieu de culture.
-Culture = c’est le résultat de la multiplication d’un microorganisme.
-Culture pure = milieu ne contenant qu’une seule espèce bactérienne. (Notion de clone bactérien)
La culture des bactéries
III.2 : composition chimique moyenne sèche d'une bactérie
Éléments Pourcentage (en masse sèche)
Carbone 50
Oxygène 20
Azote 14
Hydrogène 8
Phosphore 3
Soufre 1
Potassium 1
Sodium 1
Calcium 0,5
Magnésium 0,5
Chlore 0,5
Fer 0,2
divers 0,3
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
III.3. Composition d’un milieu de culture
- Source de C et N et d’énergie (glucides (C), lipides (C et P), protides (C et N = peptone)) = elles fournissent de l’énergie et des matériels cellulaires aux bactéries.
Peptones (muscles, cervelle d'animaux, caséine, gélatine, soja...) : contient des aa, fact de croissance, ions, glucides !!
- Eléments minéraux = Na+, K+, Cl-, PO42-, Mg2+… Ils ont un rôle
dans l’équilibre physico-chimique (pression osmotique) et les besoins en minéraux de la bactérie (+ CoEnzyme)
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
III.3. Composition d’un milieu de culture
-Eau = (solvant indispensable à la vie sur terre) rôle majeur dans les réactions de solvatation, hydratation, réactions chimiques et enzymatiques se réalisent majoritairement en milieu aqueux.
-Facteurs de croissance = ils stimulent la croissance et sont indispensables à certaines bactéries dites exigeantes (éléments que les bactéries ne savent pas synthétiser).
-Agar = composé présent dans les milieux solides. C’est un polyoside extrait d’algues japonaise (=gélose) qui à la propriété d’être liquide à >56°C et solide à 40°C.
(- Autres : indicateur de pH, agents sélectifs…)
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
Exemple : la gélose ordinaire (GO)
Peptones = hydrolysat de protéines (source d’aa)
5 g
source d’A, N, énergie + facteurs de croissance + apporte des ions
Extrait de viande = macération de viande contenant des protéines, glucides, vitamines et sels minéraux.
1g
NaCl 5g Maintien de la pression osmotique
Agar 15g Solidifiant, support pour colonie
Eau Qsp 1LSolvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
Exemple : le citrate de Simmons
Citrate de Sodium 1g Seule source de C
NaCl 5g Maintien de la pression osmotique
Sulfate de magnésium 0,2g Cofacteur enzymatique
Dihydrogenophosphate 1gSystème tampon (limite les variations de pH)
Hydrogénophosphate de potassium
1g
Bleu de bromothymol 0,08g Indicateur de pH
Agar 15g Solidifiant, support pour colonie
Eau Qsp 1LSolvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
Milieux empiriques
Milieux synthétiques
Milieux semi-synthétiques
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
Exemple : la gélose ordinaire (GO) – Nature du milieu : Milieu Empirique
Peptones = hydrolysat de protéines (source d’aa)
5 g
source d’A, N, énergie + facteurs de croissance + apporte des ions
Extrait de viande = macération de viande contenant des protéines, glucides, vitamines et sels minéraux.
1g
NaCl 5g Maintien de la pression osmotique
Agar 15g Solidifiant, support pour colonie
Eau Qsp 1LSolvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
Exemple : le citrate de Simmons – Nature du milieu : Milieu synthétique
Citrate de Sodium 1g Seule source de C
NaCl 5g Maintien de la pression osmotique
Sulfate de magnésium 0,2g Cofacteur enzymatique
Dihydrogenophosphate 1gSystème tampon (limite les variations de pH)
Hydrogénophosphate de potassium
1g
Bleu de bromothymol 0,08g Indicateur de pH
Agar 15g Solidifiant, support pour colonie
Eau Qsp 1LSolvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques
La culture des bactéries
III.4. Caractéristiques physico-chimiques
- pH = voisin de la neutralité (7 < pH < 7,5).
RQ : certaines bactéries peuvent soit alcaliniser soit acidifier le milieu au cours de leur croissance ce qui peut finir par entraver leur multiplication. On a donc recours à des systèmes tampons pour limiter les écarts de pH (Ex : système KH2PO4 et K2HPO4)
+ Conditions d’incubation :
- T°C = elle doit être choisie en fonction du germe étudié (en général 37°C)
- atmosphère = présence ou absence d’O2…
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
La culture des bactéries
IV.1. Conditionnement
- Les milieux liquides = on parle de bouillon de culture.
- Les milieux solides = on parle de gélose. Ils peuvent être conditionnés en boite de Pétri ou en tube (gélose inclinée) / agar-agar
Isolement : Macroscopie / vérification de pureté
IV. Les différents types de milieux de culture
La culture des bactéries
IV.2. Classification
421. Selon la composition
- Milieux empiriques = composition non connue exactement (extrait de viande…)
- Milieux synthétiques = composition qualitative et quantitative exactement connue.
- Milieux semi-synthétiques = la base est empirique et on additionne une molécule connue.
IV. Les différents types de milieux de culture
La culture des bactéries
IV.2. Classification
422. Selon l’utilisation
- Milieux de conservation = milieu en général très pauvre
- Milieux d’identification = milieux servant à identifier le germe (un caractère)
- Milieux d’isolement = milieux servant à séparer les bactéries contenues dans un échantillon polymicrobien pour pouvoir, par la suite, les étudier séparément.
IV. Les différents types de milieux de culture
La culture des bactéries
IV.2. Classification
On distingue :
a) les milieux d’isolement non sélectifs : permettent la culture de la plupart des bactéries.(GO, GTS, BCP…)Milieux usuel ou ordinaire : pour les microorganismes non exigeant (peptones, glucide, ions, eau)Milieux enrichis : addition de vitamines, sang...
b) les milieux sélectifs = contiennent un inhibiteur ou de conditions de culture défavorable qui empêche la culture des germes sauf celui qu’on étudie.
IV. Les différents types de milieux de culture
Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs
Agents sélectifs
natureEx de
milieuxBactéries inhibées
Cristal violet ColorantsDrigalski
Bactéries Gram positifDesoxycholate Dérivé des sels
biliairesBile
BEABactéries Gram
négatif (et certaines Gram positif)
Azide (de Sodium)
?
Drigalski
BEA
Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs
Agents sélectifs
natureEx de
milieuxBactéries inhibées
Cristal violet ColorantsDrigalski
Bactéries Gram positifDesoxycholate Dérivé des sels
biliairesBile
BEABactéries Gram
négatif (et certaines Gram positif)
Azide (de Sodium)
?
Acide nalidixique +
colimycineAntibiotiques
GS + ANC
Bactéries à Gram négatif
NaCl à 75g/L Sel Chapman
Gram- et certains Gram +
(Enterococcus et Streptococcus)
Cétrimide AntiseptiqueGélose au Cétrimide
Toutes bactéries sauf les
Pseudomonas (et quelques exeptions)
Drigalski
BEA
Chapman
Les milieux sélectifs : Présence d’ose et d’indicateur de pH
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
Milieux empiriques Milieux synthétiques Milieux semi-synthétiques
Milieux de conservation
Milieux d’identification
Milieux d’isolement non sélectifs
Milieux d’isolement sélectifs
Milieux d’enrichissement
La culture des bactéries
CIVEL / Microbiologie
Recommended