Les virus comme vecteurs thérapeutiques Par Patrick Salmon chercheur au Département de...

Les virus comme Les virus comme vecteurs thérapeutiquesvecteurs thérapeutiques

Par Patrick Salmonchercheur au Département de Microbiologie

et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève

Parkinson,Huntington

HypercholestérolémieHémophilie

Dystrophies

Mucoviscidose

ImmunodéficiencesAnémies

Thérapie génique: quelques applications

WWW.genetherapy.com

Questions à se poser lorsqu’on envisage une thérapie génique

Ou…

WWW.genetherapy.com

What?

Where?

When?

WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer? Quelle est la taille de sa séquence

codante?

WHERE? Quelles sont les cellules à cibler?

WHEN? Combien de temps le transgène doit-il être exprimé?

Son expression doit-elle être régulée?

MALADIE HEREDITAIRES

Pathologie Défaut génétiquePrévalence Cible thérapeutique

Immunodéficience ADA, X-SCID rare CSH ou lympho T

Hémophilie A facteur VIII 1: 10.000 mâles foie, muscleHémophilie B facteur IX 1: 30.000 mâles CSH, fibroblaste Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1:1.000.000 foiefamiliale

Mucoviscidose CFTR (transporteur 1:3.000 cauc. poumon des ions chlores)

Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSHanémie falciforme, thalassémie

Maladie de Gaucher glucocérébrosidase 1:450 (éthnie!) CSH

Emphysème héréditaire -1 antitrypsine 1:3.500 foie et poumon

Maladies candidates pour la thérapie génique

Maladies candidates pour la thérapie génique

Cancer 1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes

maladies dégénératives:Parkinson 1 million aux USAAlzheimer 4 millions aux USA neurones, cellules gliales

désordres « immunologiques »:diabète de type I dizaines de millions cellules du pancréas, autres…

Cardiovasculaire:resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires

maladies infectieuses:SIDA, hépatite B ou C centaines de millions CSH, hépatocytes

MALADIE ACQUISES

Pathologie Prévalence Cible thérapeutique

Le vecteur idéal- Est défini par les exigences thérapeutiques (expression stable ou transitoire).- Peut atteindre de hautes concentrations permettant l’infection de nombreuses cellules.- Est aisément produit par des techniques reproductibles.- Pour l'expression à long terme, est intégré dans un site spécifique du chromosome, ou persiste en épisome stable. - Possède une unité transcriptionelle contrôlable.- Cible certaines cellules spécifiquement.- Est dénué de composants induisant une réponse immunitaire.

MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent

adéquat...

VecteurVecteur

VecteurVecteur

CellulesCellules

CellulesCellulesGénétiquement Génétiquement

ModifiéesModifiées

IsolationIsolation

TransplantationTransplantation

InjectionInjection

Thérapie génique: in ou ex?

In vivo Ex vivo

Vecteurs pour la thérapie génique

Viraux• adénovirus• virus adéno-associé (AAV)• rétrovirus: oncorétrovirus lentivirus• virus herpes• virus à ARN (polio, sendaï, etc…)

Non viraux• ADN nu• liposomes

Vecteurs viraux

Vecteurs viraux

Trois familles de virus utilisés pour le Trois familles de virus utilisés pour le développement de vecteursdéveloppement de vecteurs

AAVAdénovirus Rétrovirus

Adénovirus

OOOOH…Ne s’intègre pasImmunogénique (moins si « éviscéré »)Peut induire une « acute phase response »

AAAH!Grande capacité (30-40 kb)Facile à produire à hauts titresInfecte les cellules non-mitotiques

Non-enveloppé Génome: ADNTaille: 70-90 nm

AAV

OOOOH…Faible capacité (4 kb)Difficulté de production (« dependovirus! »)LE VECTEUR s’intègre au hasardImmunogénicité conditionnée par lacontamination par le virus helper

AAAH!Infecte les cellules non-mitotiquesLE VIRUS s’intègre à un site spécifique

Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 20-30 nm

Retrovirus

OOOOH…S’intègre au hasardN’infecte pas les cellules non-mitotiques(ONCORETROVIRUS)

AAAH!Capacité raisonnable (10 kb)Facilité de production adéquateInfecte les cellules non-mitotiques (LENTIVIRUS)S’intègrePas de transfert de séquences codantes virales

Enveloppé Génome: ARN-ADN Taille: 90-120 nm

Cycle de réplication du HIV

MaturationAttachement

Fusion

decapsidation

Retro-Transcription

ImportNucléaire

Intégration

Transcription

ExportNucléaire

Assemblagebourgeonnement

ModificationsPost-traductionnelles

SynthèseProteines

CCR5CXCR4

CD4

Transduction par vecteur lentiviral

Fusion / Décapsidation

Rétro-Transcription

Import Nucléaire

Intégration

Endocytose

Attachement

Expression

Quelques dates marquantes…

1996: Un vecteur lentiviral peut effectuer le

transfert, l’intégration et l’expression à long terme

un gène dans les neurones in vivo.

1998: Transduction stable de CSH humaines

capables de reconstituer des souris NOD/SCID.

2000: Traitement de la mucopolysacharidose, du

Parkinson et de la thalassemie dans des rongeurs.

2002: transgenèse avec vecteur lentiviral.

2003: Premier essai clinique avec un vecteur

lentiviral.

1e génération

2e génération

3e génération

Génome HIV-1TATREV

CMV

CMV polyA

TATREV

CMVpolyA

RSV polyAREV

VIFVPRVPU NEF

TATREV

VIFVPRVPU NEF

LTR LTRGAG

POL

GAGPOL

GAGPOL

GAGPOL

Plasmides d’empaquetage lentivecteurs:

polyA

gag

pol

env

éléments actifs en cis

LTR LTR dPPT

Capacité: 10 kb

RRE

tat

nefvprvif

vpu

rev

SD SA

Vecteur de transfert

cPPTRRE

cPPT rev

LTR LTRdPPT

Prototypes de lentivecteurs

Inductible

Ubiquiste Gene XEF1-a cPPTRRE

Gene Xgp91phox cPPTRRE

Gene XTet-O cPPTRRE

Gene X cPPT

RRE

Gene YBicistronique

Gene X cPPT

RRE

U6sihRNAU6sihRNA

Inhibiteur

Spécifique

WPRE SIN

SIN

SIN

SIN

SIN

WPRE SIN

WPRE SIN

WPRE SIN

SIN SIN

Production de lentivecteurs

CMV

RSV An

GAGPOL

An

REV

CMV An

VSV G

50 TU/cellule x jour

293T

WPREGene XLTR cPPT

RRE

LTR

Dox

30 TU/cellule x jour

Lignée stable productrice de lentivecteurs

WPREGene XLTR cPPT

RRE

LTR

CMV

Tet An

GAGPOL

An

REV

Tet An

VSV G

Titration d’un vecteur lentiviral

1. Décompte des particules:p24-CA

2. Décompte des génomes:real-time QPCR

1. Titration provirale:real time QPCR

2. Expression du trangène:FACS, etc…

Applications

Hepatocytes comme cibles de thérapie Hepatocytes comme cibles de thérapie géniquegéniquePour le traitement de maladies hépatiquesCrigler-Najjar type I (Bilirubine UDP-Glucuronosyl transferase)

Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl acetoacetate hydrolase)

Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase)

Maladie de Wilson (ATP 7B)

Hépatite viral B ou C (Immunisation intracellulaire)

Comme site de production de protéines systémiquesMaladies génétiques hépatiquesEmphysème (alpha-1 Antitrypsine) Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX)Trouble du métabolisme lipidique (Apolipoprotéines)Maladies génétiques non-hépatiquesDiabète type I (Insulin, PDX-I)Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase)Thalassémie (Erythropoiétine)

Hypercholestérolémie homozygote familiale

(récepteur low-density lipoproteins -LDL-)

Récolte

Purification des hépatocytes

Lobectomie

20%

Réimplantation

Transfert de gène

Culture

5 wks1%

50% hepatectomy

x100

x200

R2 R2

31%0.02%

GFP

FL2

1%2 wks

x100

x200

70% hepatectomy

2x107 hep.

Gfp-LV, moi 10, with vit E

CSH

Précurseur myeloide

Précurseur érythroide

Précurseur Lymphoide

Neutrophiles, monocytes

Lymphocytes

Erythrocytes

Migration Migration (transdifferenciation?)(transdifferenciation?)

CSH

Précurseur myéloide

Précurseur érythroide

Précurseur lymphoide

Neutrophiles, monocytes

Lymphocytes T

Erythrocytes

IL-7

IL-15IL-7

IL-7IL-15

Il-7 et homéostase des lymphocytes T

IL-7R

c

YY

P

PJAK1

JAK3

Cyt C

Bcl-2Bcl-X

Bad

PI3-K

Anti-apoptose

STAT3STAT5a

STAT5b

Pro-differenciation

P-Bad

IL-7

CSHPrécurseur lymphoide

Lymphocytes T

X-SCID

IL-7

IL-15IL-7

IL-7IL-15

TransductionTransduction

CSHCSHGénétiquement Génétiquement

ModifiéesModifiées

Isolation des CSHIsolation des CSH

TransplantationTransplantation

Thérapie génique des « enfants bulles »

Chaîne ILRLTR LTR

Thérapie génique X-SCID

Vecteur: MLV (oncorétrovirus)

Cibles: ~ 2x108 cellules CD34+ activées

Efficacité de transduction: ~ 30%

Fraction de cellules sanguines positives pour le transgène:- lymphocytes T: ~ 100%- neutrophiles: ~ 0.1%

Chaîne ILRLTR LTR

TransgèneLTR LTRPromoteur

Oncogène

Oncogène

Effet promoteurEffet “enhancer”

Oncogenèse par intégration

Promoteur LMO2

Leucémie post-thérapie génique X-SCID

Chaîne ILRLTR LTR Exon 2

Exon 4

Exo

n 3

Exon 5

Exon 1

IL-7

IL-15

IL-15

IL-15

IL-7

IL-7

IL-7

IL-7

Thérapie génique X-SCID

11 enfants traités

1 sans réponse

2 leucémies (1 rémission, 1 rechute)

8 à la maison avec une vie normale

Thérapie génique SCID-ADA

4 enfants traités

4 enfants guéris

Conclusion: les vecteurs viraux peuvent être

thérapeutiques,

MAIS…

Quelques axes de recherche en thérapie

génique

- vectorologie (ex: ciblage)

- toxicologie (ex:

oncogenèse)

- immunologie (ex:

tolérization)

- développement de

modèles

Intégration des vecteurs rétroviraux

Promoteur Exon 1

Exon 3

Exon 2

Exon 4MLV

HIV

Intégration ciblée

Promoteur Exon 1

Exon 3

Exon 2

Exon 4