Methodes de Daignostic en Virologie

METHODES DE METHODES DE DAIGNOSTIC EN DAIGNOSTIC EN

VIROLOGIEVIROLOGIE

Pr. Ag. O. BAHRIPr. Ag. O. BAHRI

Laboratoire de Virologie CliniqueLaboratoire de Virologie Clinique

Institut Pasteur de TunisInstitut Pasteur de Tunis

METHODES DIRECTES

Détection et caractérisation du virus ou l’un de ses constituants

METHODES INDIRECTES

Détection, titrage et caractérisation des anticorps spécifiques

Prélèvement = acte clé pour le diagnostic virologique

Qualité du prélèvement Fiabilité du diagnostic

- Réaliser le bon prélèvement au bon moment et dans le

bonnes conditions

- Le choix du ou des échantillons, de leurs modalités de

prélèvement, de transport et de conservation doivent être de

qualité optimale.

Quels sont les prélèvements réalisés pour un

diagnostic virologique ?

- Diagnostic indirect: anticorps présents dans différents

liquides biologiques (plasma ou sérum selon que le sang est

prélevé avec ou sans anticoagulant) 5 à 10ml de sang veineux suffisent pour effectuer la

recherche de plusieurs marqueurs ou faire plusieurs sérologies Conservation des échantillons de plasmas ou de sérums au

congélateur

- Diagnostic direct:

* Sang

* LCR

* Selles

* Prélèvements broncho-pulmonaires: Sécrétions nasales, LBA, ……

* Prélèvements de gorge

* Urines

* Prélèvements cutanés (vésicules, ulcérations)

* Prélèvements génitaux

* Prélèvements conjonctivaux

* Biopsies tissulaires

Choix du prélèvement à réaliser

Choix du site en fonction de la clinique, du virus à rechercher et de la physiopathologie de l’infection virale

• Porte d’entrée

• Sites de multiplication

• Site d’excrétion des virus

Réalisation des prélèvements

- Importance+++ de la qualité du prélèvement

- Réalisation le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication+++ pendant phase d’incubation)

Acheminement des prélèvements au laboratoire

- Milieux de transport pour virologie (+++ pour culture de virus)

- Transport rapide

- Sécurité

- Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement

TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES

Visualisation des Visualisation des particules viralesparticules virales

Microscopie électronique:Microscopie électronique:PrincipePrincipe

- Visualisation de la particule virale

- Agrandissement 10 – 40 fois

celui du microscope optique

Microscopie électronique:Microscopie électronique:PrincipePrincipe

Coloration négative par ajout de produit contrastant

Mise en évidence des différentes structures de l’objet - Particule virale: aspect clair - Produit contrastant: aspect sombre

Microscopie électronique: Microscopie électronique: Avantages et limitesAvantages et limites

AVANTAGES AVANTAGES

– – virus non cultivables virus non cultivables gastro-entérites virales : gastro-entérites virales : rotavirus, calicivirus, rotavirus, calicivirus, astrovirus….astrovirus….

– – Nouveaux virusNouveaux virus

– – Immuno-microscopie Immuno-microscopie électronique (augmente électronique (augmente la sensibilité)la sensibilité)

LIMITESLIMITES

– – Techniques coûteuses Techniques coûteuses (équipement)(équipement)

– – Techniques lourdes et Techniques lourdes et demandant un personnel demandant un personnel expérimentéexpérimenté

– – Manque de sensibilité: Manque de sensibilité: Nécessité d’une bonne Nécessité d’une bonne concentration suffisante des concentration suffisante des échantillons à étudier échantillons à étudier (virus: > 10(virus: > 1066 copies/ml) copies/ml)

Isolement viral Isolement viral sur Support biologique sur Support biologique

Virus = Parasite intra-cellulaire obligatoireVirus = Parasite intra-cellulaire obligatoire

Culture possible sur cellules vivantes SENSIBLESCulture possible sur cellules vivantes SENSIBLES

Systèmes biologiques Systèmes biologiques utilisablesutilisables

Systèmes Systèmes inin vivovivo Animaux de laboratoireAnimaux de laboratoire

SourisSouris RatRat SingeSinge Furet ……Furet ……

Hôtes animaux naturelsHôtes animaux naturels Vecteurs naturelsVecteurs naturels

Insectes (Moustiques)Insectes (Moustiques) TiquesTiques

SystèmesSystèmes in ovoin ovo Œuf de poule embryonnéŒuf de poule embryonné

Systèmes Systèmes ex vivoex vivo Organes isolésOrganes isolés Cultures cellulairesCultures cellulaires

Inoculation à l’œuf de poule embryonné (OPE)

- Depuis 1932:

Utilisation pour nombreux virus

- Intérêt actuel limité- Isolement virus grippal- Production de souches vaccinales

Inoculation à l’OPEInoculation à l’OPEDétection du virus amplifiéDétection du virus amplifié

Inoculation à l’OPEInoculation à l’OPEDétection du virus amplifiéDétection du virus amplifié

Technique d’hémadsorption

Culture de cellules: base diagnostique virologiqueCulture de cellules: base diagnostique virologique

Dissociation des cellules par action enzymatique (trypsine)Dissociation des cellules par action enzymatique (trypsine)

Trois types de lignées cellulaires- Cellules primaires- Lignées diploïdes- Lignées continues

Cellules primaires Cellules primaires

- Origine: Tissus normaux (organismes adultes/embryonnaires++)

- Caractéristiques: a- Sensibilité+++

b- Nombre de passages limité

Lignées diploïdes Lignées diploïdes

- Origine: Fibroblastes humains

- Caractéristiques: a- Sensibilité bonne aux virus

b- Nombre de passages limité

Cultures primaires et secondairesCultures primaires et secondaires

trypsine

trypsine

Culture Ire

trypsine

Culture IIre

Nombre de passages : 2-3 ¢ épith, 50 fibroblastes

Multiplication tapis continu

Aspect originel : épithélioïde ou fusiforme

Confluence : inhibition de contact : monocouche

Les lignées continuesLes lignées continues

- Origine: Tumeurs malignes ou transformation spontanée ou viro-induite de cultures primaires ou secondaires

- Caractéristiques: a- Capacité de prolifération infinie

b- Acquisition possible de nouveaux caractères

c- Stockage dans l’azote liquide

d- Susceptibilité différente en fonction des virus

Inoculation par un prélèvement contenant un virus

Culture de cellules saines

Effet cytopathogène (ECP)

ECP = Modification de la morphologie des ECP = Modification de la morphologie des cellules infectées par un virus suivie d’une lyse cellules infectées par un virus suivie d’une lyse

cellulaire plus ou moins rapidecellulaire plus ou moins rapide

Paramètres définissant l’ECP- Nature des cellules montrant l’ECP- Type de l’ECP- Délai d’apparition de l’ECP

ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique

d’un groupe ou genre viral d’un groupe ou genre viral Nécessité de typage Nécessité de typage

Cas du virus de la rougeoleCas du virus de la rougeole

Cellules B95a non infectées ECP sous forme de syncythium

S’agit-il du virus de la rougeole ou autre paramyxovirus?

ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique

d’un groupe ou genre viral d’un groupe ou genre viral Nécessité de typage Nécessité de typage

Immunofluorescence

Préparation d’un frottis sur lame à puits

ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique

d’un groupe ou genre viral d’un groupe ou genre viral Nécessité de typage Nécessité de typage

Immunofluorescence

Cellules non infectées Fluorescence spécifique du virus de la rougeole

ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique

d’un groupe ou genre virald’un groupe ou genre viral

Cellules saines

Cellules infectées par un entérovirus

Manipulation sous hotte à flux laminaire

Asepsie rigoureuse

Limites Limites de la culture de cellulesde la culture de cellules

1- Problèmes liés aux virus1- Problèmes liés aux virus

- Absence de système cellulaire universel- Absence de système cellulaire universel- Virus non cultivables- Virus non cultivables- Virus à culture lente- Virus à culture lente- ECP absent ou discret- ECP absent ou discret- Virus de culture dangereuse- Virus de culture dangereuse

Limites Limites de la culture de cellulesde la culture de cellules

2- Problèmes liés à la technique2- Problèmes liés à la technique- Entretien coûteux et délicat des cellules- Entretien coûteux et délicat des cellules- Asepsie rigoureuse- Asepsie rigoureuse- Organisation particulière du laboratoire- Organisation particulière du laboratoire

3- Problèmes liés aux prélèvements3- Problèmes liés aux prélèvements- Collection très précoce- Collection très précoce- Stérilité- Stérilité- Conditions d’acheminement adéquat au laboratoire- Conditions d’acheminement adéquat au laboratoire

TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES

Détection des antigènes Détection des antigènes virauxviraux

-Immunocytodiagnostic:Immunocytodiagnostic:

Immunofluorescence Immunofluorescence Immunoperoxydase Immunoperoxydase

Antigènes intracellulaires

-Détection d’antigènes Détection d’antigènes solubles:solubles: ELISA ELISA Agglutination au latex Agglutination au latex Immunochromatographie Immunochromatographie

Antigènes libres

Détection des antigènes Détection des antigènes virauxviraux

IMMUNOCYTODIAGNOSTICIMMUNOCYTODIAGNOSTIC

Immunofluorescence Immunofluorescence Immunoperoxydase Immunoperoxydase

Technique Technique d’immunofluorescenced’immunofluorescence

PrincipePrincipe IF indirecte IF directe

Détection des antigènes par IF

Applications: Rage

Détection des antigènes par IF

Applications: Adénovirus

Cellules infectées par adénovirus

Détection des antigènes par IF

AVANTAGES

- Rapidité de la technique

- Recherche simultanée de plusieurs antigènes viraux pour un même prélèvement (Ex: viroses respiratoires)

LIMITES

- Qualité du prélèvement (présence de cellules obligatoires)

Technique Technique d’immunoperoxydase d’immunoperoxydase

(Enzyme: Peroxydase)

Coloration

Substrat

Coloration

Substrat

Identification du HSV par immunoperoxydase

MRC5 infectés par HSV

Détection des antigènes Détection des antigènes virauxviraux

DETECTION D’ANTIGENES SOLUBLESDETECTION D’ANTIGENES SOLUBLES

ELISA ELISA Agglutination de microparticules en latex Agglutination de microparticules en latex

Immunochromatographie Immunochromatographie

Technique ELISATechnique ELISAPrincipePrincipe

Technique ELISATechnique ELISA

AVANTAGES

- Rapidité du test

- Moins de contrainte concernant la qualité du prélèvement

Technique d’agglutination Technique d’agglutination au latex:au latex:

Principe et applicationPrincipe et application

Détection des rotaviruset des adénovirus

dans les selles

- Particules de latex sensibilisées par des anticorps spécifiques- Antigène présent Agglutination visible à l’œil nu- Rapidité+++

TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES

Hydrogen Bonds

LaLa séséquencequence nucléotidique nucléotidique

Cytosine (C)

Adénine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

Désoxyribose (Sucre) Acide phosphorique

(Phosphate)

Guanine (G)

Thymine (T)

Adénine (A)

Cytosine (C)

Bases des techniques moléculaires:1- Complémentarité entre les bases nucléotidiques2- Possibilité de dénaturation/renaturation des acides nucléiques

Techniques de biologie Techniques de biologie moléculairemoléculaire

Trois étapes nécessairesTrois étapes nécessaires

Extraction du génome viralExtraction du génome viral

Hybridation et/ou amplificationHybridation et/ou amplification

Révélation des hybrides ou des amplifiatsRévélation des hybrides ou des amplifiats

TCGATACGCT

AGCTATGCGA

hybridation simple

extraction ARN

ADN CibleCible: séquence de génome : séquence de génome

viral choisie pour l’étudeviral choisie pour l’étude Sonde nucléique marquée:Sonde nucléique marquée:

ADN ou ARN ADN ou ARN Marquage de la sonde:Marquage de la sonde:

Sonde chaudeSonde chaude Sonde froideSonde froide

Révélation des hybrides Révélation des hybrides formésformés

Hybridation moléculaire

Principe de la technique Principe de la technique d’ADN branchésd’ADN branchés

Hybridation en milieu liquide avec amplification du signal

Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction Principe Principe

Amplification in vitro d’une région spécifique d'un acide nucléique

obtention d’une quantité suffisante pour la détection et l’étude

1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

Cas des génomes à ARN: Cas des génomes à ARN: RT-PCR RT-PCR

- ADN cible

- Amorces

- Taq Polymérase

- Tampon (sels, cations bivalentes

- MgCl2

- dNTP

Révélation des produits Révélation des produits amplifiésamplifiés

Migration des produits amplifiés sur gel

Avantages de la PCRAvantages de la PCR SensibilitéSensibilité++++++

Rapidité de réalisation Rapidité de réalisation Standardisation actuellement possible pour certains infections viralesStandardisation actuellement possible pour certains infections virales

Inconvénients de la PCR • Coût et appareillage spécial• Risque de résultats faussement négatifs

- Présence d’inhibiteurs dans les prélèvements- Utilisation de contrôles internes

• Risque de résultats faussement positifs

- Contamination inter-échantillons

- Contamination par les produits des PCR précédentes

Séparation totale des activités pré et post PCR Séparation totale des activités pré et post PCR par manipulation dans 3 locaux différentspar manipulation dans 3 locaux différents

Pièce de préparation de réactifsPièce de préparation de réactifs Pièce de traitement des échantillonsPièce de traitement des échantillons Pièce d’analyses des produits amplifiésPièce d’analyses des produits amplifiés

Conditions de manipulation de la PCR

– Utilisation de témoins et de contrôles• Témoin négatif et témoin positif• Contrôles d’extraction, d’amplification et d’hybridation

METHODES DIRECTES

Détection et caractérisation du virus ou l’un de ses constituants

METHODES INDIRECTES

Détection, titrage et caractérisation des anticorps spécifiques

Anticorps élaborés par l’hôte infecté en réponse à l’infection virale

Tests Tests sérologiquessérologiques

Techniques sérologiques

Inhibition de l’hémagglutination(IHA)

Inhibition de l’hémagglutination(IHA)

Séroneutralisation

Réaction de fixation du complément

Immunofluorescence

Principe de l’ELISA

Variantes de l’ELISA

Détection des IgM par ELISADétection des IgM par ELISA

Risques: - Faux Positifs (Facteur rhumatoïde)

- Faux négatifs (Présence d’IgG spécifiques)

Détection des IgM par ELISADétection des IgM par ELISA

Technique d’immunocaptureELISA indirecte

Prétraitement des sérums

Avant réaction

Importance de l’avidité des IgG

Avidité FAIBLE Infection RECENTE

Avidité FORTE Infection ANCIENNE

Tests de confirmation Tests de confirmation - Western Blot

- Immunoblot

Tests de confirmation Tests de confirmation - Western Blot

- Immunoblot

Tests de confirmationTests de confirmation

Tests de confirmation Tests de confirmation

Western Blot VIH-1• 1: Contrôle +• 2: Contrôle -• A: Négatif• B: Indéterminé• C: Positif

ConclusionConclusion

MultiplicitéMultiplicité++++++ des moyens d’étude des virus des moyens d’étude des virus

Techniques d’utilisation variable en fonction du virus en cause Techniques d’utilisation variable en fonction du virus en cause Savoir faire le bon choix des testsSavoir faire le bon choix des tests

Avoir le maximum de renseignements possibles sur le diagnostic ou Avoir le maximum de renseignements possibles sur le diagnostic ou l’étude à réaliser l’étude à réaliser

Avoir les bons prélèvements collectés au bon momentAvoir les bons prélèvements collectés au bon moment

S’aider d’une bonne recherche bibliographique pour les travaux de S’aider d’une bonne recherche bibliographique pour les travaux de recherche pour faire le bon choix des techniquesrecherche pour faire le bon choix des techniques