Phénotypage de la réparation de lADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro...

Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique

Anne-Laure RAFFIN

Soutenance de thèse : 5 Juin 2009

Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques

Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

1. Introduction

• La réparation de l’ADN

• Le Xeroderma pigmentosum

• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

2. Objectifs

3. Matériels et Méthodes

• Préparation des lysats cellulaires

• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

4. Résultats

• Le niveau basal de réparation

• Réponse à une irradiation UVB

• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

5. Conclusions et perspectives

1. Introduction

2. Objectifs

4. Résultats

L’ALTÉRATION DE LA MOLÉCULE D’ADN

Double hélice d’ADN

ADN lésé

Lésion de l’ADN

Source de dommages

Introduction: la réparation de l’ADN

LES RÉPONSES CELLULAIRES FACE AUX DOMMAGES DE L’ADN

cellule

Arrêt réplication Arrêt de la transcription

Source endogène ou exogène de dommage

Lésions de l’ADN

Mutagénèse

- Restauration de la séquence d’ADN

- Reprise du cycle cellulaire

Réparation de l’ADN

Cancérogenèse

Apoptose

LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN

(CH3)n T

Site abasique

Adduits volumineux

Dimère de Pyrimidine

Coupure double brins

Pontages intra et inter-brin

Uracile Modification de la base

Alkylation

mésappariement

O6 methyl guanosine

(CH3)n T

Site abasique

Adduits volumineux

Alkylation

mésappariement

O6 methyl guanosine

Petites lésions: modifient la structure chimique des composants de l’ADN mais ne déforment pas la double hélice

(CH3)n T

Site abasique

Adduits volumineux

Alkylation

mésappariement

O6 methyl guanosine

Lésions volumineuses: modifient la structure chimique des composants de l’ADN et déforment la double hélice

LES DIFFÉRENTS VOIES DE RÉPARATION DE L’ADN

(CH3)n T

BER NER NHEJ / HR MMR DR

BER: Base Excision Repair

NER: Nucleotide Excision Repair

NHEJ: Non-Homologous End joining

HR: Homologous Recombination

MMR: MisMatch Repair

DR: Direct Reversal

LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER

Reconnaissance du dommage

BER NER

XPC, (XPE), XPA and TFIIH

Glycosylases

Excision du dommageGlycosylases + AP endonucléase

Endonucléases XPG et XPF-ERCC1,

Resynthèse de l’ADN Polymérases δ, ε, RPA, XPA?

Polymérase β + Polymérases δ, ε

Ligature Ligase ILigase III ou I

Base Excision Repair Nucleotide Excision Repair

GG et TC-NER

LES ADN N-GLYCOSYLASES ET L’APE1

• Substrats: petites lésions de l’ADN

• Fonction des ADN N-glycosylases: coupure de la liaison N-Glycosidique

• Spécificité des ADN N-Glycosylases: un type de dommage ou un groupe de

dommages

• Exemple d’ADN N-Glycosylases: UNG (Uracile), OGG1 (8-oxoG), NTH1 (Diol de

Thymine, 5 Formyluracile), NEIL1 (Diol de Thymine, Fapy-A, Fapy-G, 8-oxoG)

• Fonction de APE1 et des ADN N-Glycosylases bifonctionnelles : coupure de la

liaison phosphodiester

LES RÔLES DE XPA ET XPC

• Substrats: lésions volumineuses de l’ADN

• XPC:

– Spécificité d’intervention: uniquement réparation globale du génome

– Fonction: Reconnaissance de l’ADN endommagé (1er facteur à intervenir)

• XPA:

– Spécificité d’intervention: réparation globale du génome et réparation couplée à la

transcription

– Interactions avec d’autres facteurs de la NER: TFIIH, ERCC1 et RPA

– Fonction(s): « Chef d’orchestre » de la NER: de la reconnaissance du dommage à la

resynthèse de l’ADN

= Rôle complexe qui reste encore à clarifier

BER NER

• Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997)

• XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (d’Errico et al.,

2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008)

• hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000)

• RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000)

• XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999)

• Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydatif que des cellules

saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)

LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION

BER NER

• Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997)

• XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (d’Errico et

al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008)

• hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000)

• RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000)

• XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999)

• Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydant que des cellules

saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)

LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION

LES CARACTÉRISTIQUES DU XERODERMA PIGMENTOSUM

• 1968: relation XP – déficience de la NER (Cleaver 1968)

• 7 groupes XP (A à G): déficience d’une protéine de la NER + XPV

• Hypersensibilité aux UV : apparition de lésions pigmentaires dès le plus jeune âge

• Apparition cancer: risque multiplié par 1000. Tumeurs de la peau vers l’âge de 8

ans (Daya-Grosjean et al. 1995)

• Certaines formes: troubles neurologiques

• Espérance de vie: 15-20 ans (XP classiques) (de Boer and Hoejmakers 2000)

• Pas de traitement

• Diagnostic: test UDS (Unscheduled DNA Synthesis)

Introduction: le Xeroderma pigmentosum

LES AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES TESTS DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN

Vision minimaliste de la réparation de l’ADN: une lésion étudiée à la fois

Test in vitro sur support permettant une mesure conjointe de la réparation de plusieurs lésions à partir d’un seul lysat cellulaire

Introduction: Les outils pour étudier la réparation

UDS (Unscheduled

DNA Synthesis)

HCR (Host Cell Reactivation)

Imagerie cellulaire

Excision-Resynthèse en

solution (Wood, 1988)

Paramètres mesurés

Principe du test

incorporation nucléotide

radiomarqué (resynthèse)

"Récupération" d'une activité enzymatique

Anticorps fluorescent,

protéine de la réparation

fluorescente

incorporation nucléotide

radiomarqué (resynthèse)

Mesure d'activités enzymatiques de réparation de l'ADNRecrutement des facteurs de la réparation dans le temps et l'espace

Test in vivo

Inconvénients

Radioactivité

Durée

1. Introduction

2. Objectifs

4. Résultats

LES OBJECTIFS DE L’ÉTUDE

• Proposer un outil de diagnostic de la maladie XP alternatif à l’UDS

– Fiabilité

– Rapidité

– Sensibilité

– Peu de cellules

Utiliser l’outil « puce réparation » pour caractériser des phénotypes de

réparation de l’ADN de lignées XP

Objectifs

• Etudier la réparation de l’ADN de lignées XPA et XPC

– Quel est le niveau basal de réparation? Influence de la concentration protéique

– Quelle est la réponse à un traitement génotoxique? UVB

1. Introduction

2. Objectifs

4. Résultats

LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES

Tampons ioniques

Protéines

Test in vitro de la réparation

dosage

Matériels et Méthodes

Congélation

DMSO+SVF+milieu

Fibroblastes SV40 de patients XP

3 à 5 x 106 cellules

(Test en solution de Wood et al.: 109 cellules)

LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION

[support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!!

Puce OligoPuce Plasmide

Gain de fluorescence

lésions

plasmide

surface de la biopuce

incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5

Excision des lésions + Resynthèse

LES LÉSIONS DE LA PUCE PLASMIDE

8oxoGuanine

Diols de pyrimidine

CH3CH3

6-4 PP

Photoproduits

T-T CPD

Bases alkylées

Adduits

CisplatineG

AT CTAGCATGGCC

TACGA CGT CCGG

Sites abasiques

PARAMÈTRES MESURÉS

Phénotype de

réparation

Quantification de la fluorescence totale

Part relative de l’intensité de fluorescence des différentes lésions

pCPD-64

p8oxoG

pGlycol

pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol

taleSoustraction

du contrôle

Somme des Intensité de fluo pour la même lésion

Profil d’ER

(Excision-Resynthèse)

LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION

[support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!!

Puce OligoPuce Plasmide

fluorophore Cy3

lésions

oligonucléotide

incubation aveclysat cellulaire

Excision des lésions

Perte de fluorescence

Gain de fluorescence

lésions

plasmide

incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5

Excision des lésions + Resynthèse

LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES MESURÉES AVEC LA PUCE OLIGO

- NTH1: Diol de thymine, Dihydrothymine

- NEIL1?: Diol de thymine, Dihydrothymine

- UNG: Uracile (U-A ou U-G)

- SMUG1: Uracile (U-A ou U-G)

- TDG: Mésappariement G-T

- MBD4: Mésappariement CG-GT

- MPG: Ethénoadénine

- APE1: THF (équivalent site abasique)

1. Introduction

2. Objectifs

4. Résultats

Résultats: Niveau basal de réparation

0,3 mg/mL

- Déficience pour la réparation des lésions prises en charge par la BER et la NER

Implication de la protéine XPC dans la réparation des petites lésions

Phénotype XPC ≠ Phénotype Témoin

PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (1)

Lysat témoin

inXPCXPA

Phénotype XPA = Phénotype Témoin à cette concentration protéique

Rôle de XPA dans la réparation de la 8-oxoG? Pas de rôle établi dans la littérature (Klein et al., 1992; Dusinska et al., 2006 ≠ Rünger et al., 1995)

PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (2)

0,3 mg/mL

Lysat témoin

PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DE L’ADN DE LYSATS TOTAUX

La discrimination des phénotypes XP est encore plus difficile avec les lysats totaux

ER XPC = 85 % du témoin

ER XPA = 100 % du témoin

pCPD-64 p8oxoG pAlkB pAbaS pGlycol

inXPCXPA

Lysat témoin

Tg siteabasique

OligoContrôle

CG-GT dHT EthdA U-G U-A

)Témoin FibroblasteXPCXPA

PHÉNOTYPE D’EXCISION DE LYSATS NUCLÉAIRES

- Activités glycosylases et APE1 équivalentes dans tous les lysats testés sauf pour l’excision des diols de thymine

- Le lysat XPA excise les diols de thymine avec une plus faible efficacité que le lysat témoin: interaction XPA avec NTH1, NEIL1?

CONCLUSIONS NIVEAU BASAL DE RÉPARATION

Niveau basal + concentration standard de protéines

– XPC < Témoin

– XPA = Témoin

XPC joue un rôle dans la réparation des petites lésions

BER et XPA?

??Faire varier des paramètres expérimentaux pour gagner de l’information

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB

Exposition des cellules aux UVB (attention à la confluence)

0, 5 et 20 J/m²

Cycle cellulaire

(Cytométrie en flux)

Cytotoxicité

(test MTT)

Réparation de l’ADN

(test in vitro d’ER)

CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB

Les cellules XP sont plus sensibles aux UVB

0 20 40 60 80 100 120

Doses UVB (J/m²)

Témoin fibro

XPC fibro

XPA fibro

CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB

Souche témoin

Sub-G1 G1 S G2phases du cycle

Souche XPC-/-

Sub-G1 G1 S G2

phases du cycle

Souche XPA -/-

0 J/m²

5 J/m²

20 J/m²

0J/m² 20J/m²

0J/m² 20J/m²0J/m² 20J/m²

Fibroblastes

CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB

Souche témoin

Souche XPC-/-

Sub-G1 G1 S G2

phases du cycle

Souche XPA -/-

0 J/m²

5 J/m²

20 J/m²

Fibroblastes

• Les cellules XP réagissent différemment des cellules témoin suite aux UVB

• XPC XPA5 J/m²

EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H)

pCPD-64 p8oxo pAlkB pAbaS pGlycol

adié Témoin Fibroblaste

• Stimulation de l’ER avec le lysat nucléaire témoin

Après l’irradiation UVB des cellules :

Stimulation

Inhibition

EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H)

pCPD-64 p8oxo pAlkB pAbaS pGlycol

adié Témoin Fibroblaste

• Peu ou pas d’effet de l’irradiation sur la réparation des lysats XP

Après l’irradiation UVB des cellules :

Inhibition

Stimulation

CONCLUSIONS RÉPONSE AUX UVB

UVB + concentration standard de protéines

– Stimulation des activités d’ER avec le lysat nucléaire témoin

– Pas de stimulation pour les lysats XP

Meilleure discrimination des phénotypes de réparation après un traitement préalable des cellules

Rappel: Sans irradiation, XPA = Témoin

Translocation des protéines de réparation vers le noyau en réponse à un traitement génotoxique: XPA (Wu et al., 2007), XPD (Fung et al., 2008)

Néo-synthèse des protéines de la réparation en réponse à l’irradiation UV

1. Introduction

2. Objectifs

4. Résultats

p8oxo-G

0,E+00

1,E+07

2,E+07

3,E+07

4,E+07

5,E+07

6,E+07

7,E+07

0 1 2 3

temps de réparation (h)

0,E+00

1,E+07

2,E+07

3,E+07

4,E+07

5,E+07

0 1 2 3

temps de réaction (h)

pCPD-64

0,0E+00

5,0E+07

1,0E+08

1,5E+08

0 1 2 3

temps de réaction (h)

Résultats: Effet de la concentration protéique

EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (1)

• Plus de protéines: cinétique différente suivant les lésions (vitesse initiale, plateau, allure biphasique)

0,9 mg/mL protéines

0,3 mg/mL protéines

Mécanismes différents suivant la concentration?

Lysat nucléaire témoin

pCPD-64p8oxoGpCisPpAlkBpAbaSpGlycol

Augmentation de la part relative d’ER des photoproduits, des adduits du cisplatine et de la 8-oxoG

Activités NER et réparation de la 8-oxoG favorisées à forte concentration

Lysat nucléaire témoin0,3 mg/mL 0,9 mg/mL

EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (2)

EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LES PHÉNOTYPES DE RÉPARATION XP

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

concentration du lysat nucléaire (mg/mL)

Lysat XPC

Lysat témoin

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

concentration du lysat nucléaire (mg/mL)

Lysat XPA

• Nette diminution du niveau relatif de réparation de XPA à partir de 0,7 mg/mL

(sauf pour les diols de pyrimidine)

Lysat témoin

• Léger effet de la concentration sur le niveau relatif d’ER du lysat nucléaire XPC

pour les photoproduits, les adduits du cisplatine et la 8-oxoG

CONCLUSIONS EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE

Niveau basal + beaucoup de protéines

– Meilleure efficacité des activités NER et de réparation de la 8-oxoG

– Peu d’effet de la concentration sur le profil relatif de XPC

– Effet de la concentration sur le profil relatif de XPA

Rappel: avec peu de protéine, XPA = Témoin

Meilleure discrimination des phénotypes XP à fortes concentrations protéiques

DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (1)

• Nos tests in vitro d’excision-resynthèse et d’excision permettent d’appréhender

la réparation de l’ADN comme un réseau enzymatique dynamique et complexe

Résultats

• Les ratios Protéines / ADN ou Protéines / Lésions sont des paramètres à prendre

en considération lors des tests in vitro

• Les niveaux de réparation obtenus pour XPA et XPC sont supérieurs à ceux de

la littérature obtenus avec d’autres méthodes de mesure in vivo (Athas et al., 1991;

Cleaver 2005) et in vitro (Masutani et al., 1993)

• Le niveau basal avec la concentration standard est à considérer: il apporte de

nouvelles informations quant aux régulations et mécanismes mis en jeu à de telles

concentrations protéiques. Que se passe-t-il in vivo?

DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (2)

Résultats

Stimulation de la réparation en réponse aux UVB

Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG à forte concentration??

2. Irradiation UVB

3. Augmentation de la concentration protéique

Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG: Implication des facteurs XP dans la réaction d’ER

Discrimination possible

1. Niveau basal + concentration protéique standard

Activités NER limitantes? A quoi est dû le niveau basal?

Discrimination difficile

1. Introduction

2. Objectifs

4. Résultats

• Effet de la concentration protéique sur le phénotype d’ER

BILAN: TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN

Conclusions et perspectives

Informations complémentaires

Type de test Puce oligo Puce plasmideActivités mesurées Excision Excision-resynthèse

Enzymes concernées ADN N -Glycosylases et APE1

Résultante d'un enchaînement de plusieurs réactions

Réaction en présence d'ATP

NON OUI

Concentration protéique du lysat

20 µg/mL 300 µg/mL

APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (1)

Niveau basal avec concentration protéique standard : faible discrimination des phénotypes XP

DIAGNOSTIC ?

Irradiation des cellules au préalable

Augmentation de la concentration protéique

Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC

Approfondir l’étude à tous les groupes de complémentation, de A à G

Approfondir les phénotypes et arriver à déterminer une signature de la réparation de l’ADN pour chaque groupe XP pour pouvoir clairement les identifier

pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pGlycolPo

)Témoin fibroblaste

Tester des petites molécules: M1

APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (2)

[M1]= 0,1 mM

[Lysat nucléaire]= 0,7 mg/mL

M1 0 mM

• Profil de XPC très différent de XPA

• En utilisant des petites molécules, il serait possible de discriminer facilement les différents groupes de complémentation?

PERSPECTIVES

Fibroblastes primaires: Confirmer les résultats obtenus à partir des lignées

Amélioration du test : nature des lésions (photoproduits: séparer les CPDs

des 6-4 PPs)

Comprendre la signification du niveau basal

Approfondir l’effet de la concentration sur les activités de réparation (lysats

totaux, autres groupes de complémentation)

Rôle de XPA dans la réparation des dommages oxydatifs? Hypothèse:

Relation avec les troubles neurologiques développés par ces patients

Echantillon: arriver à travailler à partir d’un prélèvement sanguin?

Remerciements

Laboratoire FRE 29-39, IGR, Stabilité génétique et oncogenèse (Pr. Alain Sarasin)

Laboratoire CEA, Stabilité génétique et oncogenèse (Dr. Denis Biard)

Laboratoire CEA, Plateforme cytométrie en flux, iRTSV (Véronique Collin-Faure, Serge Candéias)

CEA, INSTN, Contrat de Formation par la Recherche

Sylvie Sauvaigo

Zohra Termache

Sylvain, Francette, Jocelyne, Gwenaëlle

… Et tout le LAN

Florence Pivard et Sandrine Bessette, stagiaires ESTBB en 2007 et 2008

MERCI!

TITRE DE DIAPO

Partie

Phénotypage de la réparation de lADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro...

Documents

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