View
2
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS
ÉCOLE DOCTORALE Santé Sciences et Technologies
INSERM U966 Morphogenèse & Antigénicité du VIH et des virus des hépatites
THÈSE présentée par :
Marion DEPLA
soutenue le : 27 septembre 2011
pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité : Virologie
MODÉLISATION IN VITRO ET ÉTUDE BIOCLINIQUE DE LA STÉATOSE INDUITE PAR LE VIRUS DE L’HÉPATITE C
THÈSE dirigée par
Pr Philippe ROINGEARD
JURY :
M GUYADER Dominique PU-PH, Université de Rennes 1 Président du jury M DELERS François MCU-PH, Université Pierre&Marie Curie,Paris Rapporteur M WYCHOWSKI Czeslaw DR CNRS, Institut de Biologie de Lille Rapporteur M LERAT Hervé IGR, Université de Paris Est Examinateur M ROINGEARD Philippe PU-PH, Université François Rabelais,Tours Directeur de thèse
Remerciements
« On a beau chercher on ne trouve jamais que soi même » Anatole France.
Au-delà de l’aventure scientifique, c’est une véritable aventure humaine qu’il m’a été donné
de vivre à vos côtés. C’est sans nul doute une des parties les plus dures à rédiger de ma
thèse, où cette fois-ci ce n’est pas la raison qui guide mes mots. Ce n’est donc pas sans
émotions que j’écris ces quelques lignes pour vous remercier.
Philippe, merci de m’avoir fait confiance et de m’avoir fait une place au sein de ton équipe.
Tu t’es toujours rendu disponible pour moi tout au long de ma thèse sans compter tes heures
à parler avec moi de « mes gouttelettes », tu as toujours su me guider et m’épauler pour
mener à bien mes projets. C’est quotidiennement que tu nous pousses à nous dépasser, moi
en tant que ta thésarde bien sur, mais tous autant que nous sommes au labo. Merci à toi de
m’avoir permis de présenter mes travaux en congrès et de les publier. Mais par dessus tout
merci d’être un chef humain à l’écoute de nos problèmes et nos besoins, qui jongle avec nos
caractères si différents. Les futurs étudiants ont bien de la chance de t’avoir à leur côté.
Enfin merci d’avoir constitué cette équipe dynamique et soudée…J’ai souvent entendu que
dans sa carrière il y a LE labo, celui où l’on dit « je vais au labo » comme on dirait « je vais
à la maison ». C’est l’impression que j’avais…merci pour ça.
Merci au Professeur Dominique Guyader d’avoir accepté de juger mon travail en présidant mon
jury de thèse. Merci à Monsieur François Delers et Monsieur Czeslaw Wychowski d’avoir
accepté d’être les rapporteurs de mes travaux.et à Monsieur Hervé Lerat d’en être
l’examinateur. Honorée d’être jugée par mes pairs, c’est avec un grand intérêt que j’attends
de discuter avec vous de ce travail.
Alain, mon binôme préféré pour aller aux poubelles. Merci de m’avoir apporté ton aide sur le
projet virostéatose, tu mérites amplement le titre de Dr ès Séquençage. Promis je dirais pas
aux autres que c’est toi le Père Noël et que des fois tu mets une ceinture de ninja pour nous
faire rire (ou soulager ton dos je sais plus)
Alexis et Audrey, la relève plus motivée que jamais et bourrée d’humour.décalé Alexis je crois
que tu es le seul à comprendre mon penchant pour les grands nains de jardins et la
royauté…merci pour ça ! Merci pour les moments et les rires partagés avec vous cette année.
Amélie, j’ai apprécié nos longues discussions cherchant à marier inlassablement statistique et
recherche. Merci à toi pour ton efficacité et ton aide précieuse.
Anne, discrète et si forte. L’amitié que l’on a construite est durable et n’a fait que se
renforcer ces derniers temps. J’ai toujours été admirative de la volonté dont tu fais preuve
au quotidien au labo pour voir se réaliser tes projets. Ne perds pas cette qualité, même si des
fois c’est difficile. Te faire peur dans les couloirs et te rappeler le chemin des Halles va me
manquer…mais tu n’es pas à l’abri de me voir débarquer chez toi pour un petit barbeuk !
Christine, merci pour ton sourire au quotidien et merci d’avoir chaque année mis tant de cœur
dans l’organisation du téléthon. Y participer était important pour moi, merci de m’en avoir
donné l’opportunité.
Christophe et son « madame raplapla », merci à toi de m’avoir guidée au début de ma thèse
avec grande pédagogie, et merci (ou pas) de m’avoir familiarisé au doux monde du design de
primers !
Denys, merci d’être avec nous au quotidien là haut, d’être confronté à nos réels problèmes et
de nous rappeler « qu’à 14h tout doit être niquel ». Mais merci avant tout de remplir nos
yeux de joie chaque année avec ZE calendrier.accroché avec précaution dans notre bureau.
Elodie, c’est toujours avec beaucoup d’intérêt que j’écoutais tes conseils avisés, tes p’tits
trucs et astuces pour réussir au mieux les manips. Merci pour ça.
Eric, le plus grand fan de JP Madder, qu’il m’ait jamais été donné de rencontrer. Tu m’as
été d’une grande aide tout au long de ma thèse, à me conseiller et me guider au mieux dans
le monde lipidique. Merci pour tes conseils pour la rédaction de ce manuscrit. Et je sais bien
que les sessions d’ABBA dans le L3 vont te manquer !
Dear 똥, dear Eun Yeung, I’ll miss your laugh and your every day.good mood.Thanks for the
bird mascot “yu ku yuk yuk”. Thank you for being the only one to enjoy listening to
Nostalgia and sing with me!
Ma petite Laura, que es la más guapita, la más guapita !! Tu as été la première à m’accorder
ton amitié au détour d’une formation à la Rochelle J’ai vécu à tes côtés des moments forts
et riches en émotions de ceux qui bâtissent une solide amitié. Tu es toujours là pour les
autres et surtout pour moi, c’est ton essence ça coule dans tes veines et dans celles de
Benito, merci de m’avoir toujours accueillie chez vous et conseillée J’ai hâte d’arroser avec de
la Sangria magique mon nouveau pied à terre en Touraine.
Loïc, je reste quelquefois perplexe sur la qualité de tes blagues, mais j’apprécie le point
d’honneur que tu mets à nous les raconter. Merci pour ces derniers moments à Vialle.
Ludo, merci de n’avoir pas compté ton temps pour m’aider dans la réalisation de mes
manips.très colorées Merci pour la « danse qui est à nous ».
Manue, ma petite kkuèt ! On en aura vécu des choses ensemble…des rires, des pleurs, du
grand n’importe quoi et des grandes joies. Toutes ces choses qui me donnent confiance dans
notre amitié et sa durée…tu sais une histoire de personne qui se compte sur les doigts de la
main. Au-delà de ça, le labo ne tournerait pas sans toi…tu es maligne, débrouillarde et rusée,
pour moi c’est ça la vraie intelligence, n’en doutes jamais. Toujours prête à dégainer l’attirail
de bricolo-bricolette pour nous aider…pour m’aider Jamais tu n’as compté tes heures à
m’écouter, m’épauler, me protéger. Tu m’as énormément apporté au quotidien au
labo…comme en dehors, je ne te remercierai jamais assez pour ça.
Pauline, Dr Ferraris, si généreuse et pêchue. La seule à transformer le sas du L3 en cabine
d’essayage, à lire les mails de Madame Carton à 2h du matin.et mettre un point d’honneur à
la visite de l’armoire à poudres Il faudrait t’inventer si tu n’existais pas…Ton amitié aussi
m’est chère et précieuse, et passera les frontières. J’ai adoré nos debriefs scientifiques (ou
pas), à refaire le monde et le cycle viral à la fois, à pleurer et rigoler de notre sort sur fond
« d’envie d’aimer ». Merci à toi d’avoir été là pour moi Dr Ferraris !
Romu, merci à toi pour tes conseils de vieux thésard ! Passer derrière toi n’était chose facile,
car ton empreinte est fortement ancrée au labo. Je te lègue mon manuel de décollage de
fusée à Vialle que tu appréciais tant.
Suzie, ma petite Zizie Pinguouin, être à tes côtés le 23 juillet 2011 pour témoigner de cet
évènement restera sans nul doute le point le plus fort de notre amitié. Je te vois évoluer,
t’affirmer et prendre confiance en toi tous les jours au labo, plus qu’admirative de ton
organisation et du parcours que tu as réalisé. Tu as toujours été là pour moi à me
comprendre sans avoir besoin de parler. J’ai adorée être ta voisine de bureau à partager nos
joies et nos peines. Au-delà de çà, tu es une source d’inspiration inépuisable de phrases chocs
et de situations rocambolesques, comme en témoigne notre mur de porte qui t’est en partie
dédiée ou les traces de cirage au fond du couloir! Pour tout ça, je te remercie.
Valentina, j’ai essayé mais j’arriverai jamais à retenir les quelques mots en italien qui traînent
sur un post-it ! Merci à toi de nous avoir fait bien rire à de nombreuses reprises dans ton
apprentissage du français. J’ai apprécié discuter avec toi dans notre bureau quand les
personnes se faisait rares au labo !
Vincent, le p’tit veinard. Entouré de toutes ces filles, tu devais te sentir bien heureux
(perdu…je sais plus ce qu’il faut dire). Tu manies la langue française avec brio toujours à
l’affût de jeux de mots improbables, à transformer les présentations PP en jeu de puissance 4
et à battre tous les records au QPUC. Merci pour tes imitations plus que réalistes « J’ai
tout… ». J’ai adoré te faire peur dans le L2 et écouter la BO de la petite maison dans la
prairie dans votre labo.
Virginie, la douce Virginie. J’aime savoir que tu as trouvé ton bonheur à Lyon et que c’est la
vie que tu souhaitais menée. Mais saches qu’ici tu m’as manqué, tu nous as manqué. Le trio
des filles de Vialle quoi ! Tu es la première à avoir pris du temps pour moi et à m’avoir fait
découvrir Tours by night…un vendredi en sortant du labo. Merci pour ça !
Wootichai, un chanteur, un danseur. Tu as de multiples facettes qui m’ont fait t’apprécier.
Toujours un sourire accroché à tes lèvres, c’était très agréable de maniper avec toi et de
discuter guitare !
Samia & Floriane, nos chemins se séparent souvent au-delà des frontières. Cela ne nous a pour
l’instant jamais empêché de garder contact, je pense même que ça renforce notre amitié.
Merci d’avoir toujours répondues présentes à mes côtés dans les bons comme dans les mauvais
moments.
Nadine & Sarah, l’administration et moi ça fait deux, heureusement vous étiez là. Merci à
vous deux d’avoir tour à tour veillé sur nous pour que nos thèses se passent au mieux. Vous
avez été d’une grande aide. Nadine, merci à toi pour les clafoutis aux cerises et les randos
téléthon…L’âge c’est dans la tête tu le sais, ça tombe bien car toi tu as 30 ans et tu
débordes d’énergie ! Merci à toi pour ça.
Un grand merci aussi aux filles de microscopie, qui m’ont souvent vu envahir leurs locaux avec
« mes gouttelettes » ou « mes patients ». Merci à Brigitte, Monique, Claude, Isabelle,
Fabienne et Juliette qui m’ont aidé de près ou de loin à la réalisation de mes projets et
m’ont toujours soutenu et encouragé. Un énorme merci aussi à Marie, toujours un sourire aux
lèvres et prête à discuter avec moi de tout et de rien et surtout prête à m’écouter, ton
aide sur le projet virostéatose a été plus que précieuse, merci de m’avoir fait de la place à
tes côtés pour mener à bien mes projets.
Sylvie, aujourd’hui je soutiens ma thèse et tu manques cruellement à l’appel. Sans toi, le
projet virostéatose n’aurait pas pu aboutir. C’est ta voix que j’entends encore dans les
couloirs me demander comment ça se passe pour moi et me dire quel foie tu venais de couper.
Tu laisses un grand vide là haut, tu laisses un grand vide tout court. Merci à toi.
Merci aussi aux garçons de microscopie, Pierre-Yves, Rustem, Pierre-Ivan et Julien. Vous
m’avez initié au monde merveilleux de la microscopie et vous m’avez aidé à de maintes
reprises tout au long de ma thèse. sans sourciller. Merci de m’avoir fait une place dans la
grotte au MET et dans la famille microscopie.
Merci enfin à Manue B, Martine, Catherine, Tanawan, Francis, Alain G, Jean-Christophe M,
Jean-Christophe P, Antoine, Jack qui ont aussi su m’aidé et me guider au cours de ma thèse.
Comment vous oubliez, vous le Comité CHG, Sandra, Noémie, Delphine, Mathilde, Hubert,
Caro, Mumu et Cédric. J’aime à dire que CHG est ma 2ème maison…et c’est une 2ème famille
que j’ai trouvé là bas. Un réel exutoire, un passage obligé en sortant du labo, une bande
d’amis totalement déjantés mais tellement présents quand il fallait…J’ai adoré être votre
« Madame La Présidente » pendant toute cette année, partager avec vous rires et pleurs,
mais surtout RIRE, rire de nous et rire de tout. Merci à vous d’avoir été là.
Mes fidèles amies, Axelle, Bérangère, Betty, Delphine, Laurence, Tiana et Yaëllle, on en a fait
du chemin depuis les bancs du lycée et les cours de Mr Meyer. Qui aurait cru qu’en
remplissant nos fiches de présentation à la rentrée scolaire, 10 ans plus tard on aurait toutes
réussi à faire ce qu’on voulait ? Moi j’y ai toujours cru. Merci à vous d’avoir été là dans les
étapes importantes de ma vie et merci encore d’être là aujourd’hui.
Ma Clémence, ma Marine et ma Marie-Amélie. Impossible de chiffrer le nombre d’heures
passées avec vous à discuter de tout et de rien, de nos vies et de nos envies. Vous êtes des
amies fidèles, là pour moi jour et nuit dans les bons et les mauvais moments, vous savez tout
de moi. Merci à vous d’être vous.
Merci à ma famille qui a toujours su me booster et me redonner confiance en moi. Merci
d’avoir cru en moi et mes projets. Romain, merci de m’épauler et de délirer avec moi, même
si aujourd’hui des kilomètres nous séparent.
Papa, Maman, vous savez comme il a toujours été difficile pour moi de faire le moindre choix.
Vous nous avez toujours donné l’opportunité à Romain et à moi de nous réaliser, sans
compter les heures à nous guider, à nous rassurer sur nos décisions, à nous aimer. C’est sans
nul doute grâce à vous que nous sommes heureux aujourd’hui et que nos projets aboutissent.
Sans vous je n’aurais pas fait le choix de partir sur Tours…pourtant un des meilleurs choix que
j’ai eu à faire jusqu’à aujourd’hui. Merci.
1
Résumé L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) est une cause fréquente de maladie chronique
du foie. Le risque de carcinogenèse augmente si les patients développent une cirrhose ou une fibrose
importante. La cirrhose viro-induite constitue certainement un élément prépondérant dans ce
processus, mais le mécanisme reste mal connu. On suspecte cependant un rôle majeur de certaines
protéines virales dans la survenue d’un hépatocarcinome. Il reste donc pertinent d’étudier les
mécanismes initiant cette cirrhose hépatique. Lors de l’infection, le HCV va détourner et modifier à
son profit le métabolisme de la cellule hôte et notamment le métabolisme lipidique très actif dans le
foie. Ainsi l’infection chronique in vivo est caractérisée dans plus de 50% des cas par une
accumulation excessive de lipides sous forme de gouttelettes lipidiques (GL) dans les hépatocytes
induisant la stéatose hépatique. Chez l’individu chroniquement infecté stéatose métabolique et virale
peuvent ainsi co-exister. La part réellement imputable au virus dans l’établissement de la stéatose reste
donc très difficile à évaluer. De plus le rôle précis, direct ou indirect des différentes protéines virales
dans l’établissement des plates formes de réplication, d’assemblage et de sécrétion des particules
virales reste encore à déterminer. L’accumulation de GL qui est observée in vivo et dans de nombreux
modèles cellulaires in vitro semble être au cœur des mécanismes d’assemblage de la particule virale et
de la pathogenèse liée à l’infection.
L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre comment le HCV pouvait induire une
telle accumulation de GL et d’étudier l’impact de la variabilité du virus sur l’intensité de ce
phénomène.
Nous avons tout d’abord développé une étude fondamentale in vitro qui nous a permis, en
analysant qualitativement et quantitativement ces regroupements de GL, de conforter l’idée qu’au
moins une des protéines virales, la protéine de capside, en détournant les GL, est directement
impliquée dans l’établissement de la stéatose hépatique. De plus, les éléments originaux que nous ont
apportés ces travaux nous ont amené à proposer un modèle de la dynamique des GL au sein d’une
cellule.
L’approche bio-clinique que nous avons ensuite présentée s’inscrivait dans la continuité de ce
travail in vitro et visait à vérifier l’impact de la variabilité du HCV sur la stéatose viro-induite in vivo.
Une analyse morphométrique des GL ne nous a pas permis d’établir d’association entre l’intensité de
la stéatose et la nature du génotype. De plus, notre étude a montré que la variabilité qui est plus ou
moins observable au sein des protéines de capside et NS5A du HCV semble avoir un effet mineur sur
la sévérité de la stéatose hépatique in vivo. Nous pensons que les facteurs propres à l’hôte
prédomineraient pour définir et moduler l’intensité de la stéatose viro-induite.
Mots clés : virus de l’hépatite C, stéatose hépatique, gouttelettes lipidiques
2
Abstract Hepatitis C Virus (HCV) infection is a major cause of chronic liver disease. The risk of
carcinogenesis increases when patients develop cirrhosis or significant fibrosis. Virus-induced
cirrhosis constitutes a major element in this process, but the associated mechanisms remains unclear.
However, a direct role of some viral proteins in the development of hepatocellular carcinoma is also
suspected. It is therefore relevant to study the mechanisms initiating the hepatic fibrosis and cirrhosis.
Upon infection, HCV will hijack and modulate the host cell metabolism, including the lipid
metabolism which is particularly active in the liver. In vivo chronic infection is characterized in more
than 50% of infected individuals by an excessive accumulation in hepatocytes of triglycerides in the
form of lipid droplets (LD), inducing steatosis. In chronically infected individuals, metabolic and
virus-induced steatosis can co-exist. Thus, it remains very difficult to assess the part related to the
virus in the development of steatosis. In addition, the precise role of the different viral proteins in the
establishment of replication, assembly and secretion of virus particles remains to be determined. LD
accumulation which is observed in vivo and in many in vitro cell models seems to be important for the
assembly mechanisms of the viral particle and for the viral pathogenesis.
The aim of this thesis was to understand how HCV could induce such LD accumulation and to
study the impact of the viral variability on this phenomenon intensity.
We first developed an in vitro study to analyze qualitatively and quantitatively the LD
clustering. Our study confirmed that at least one viral protein, the capsid protein, is directly involved
in the development of steatosis by hijacking LD. In addition, our study led us to propose a model for
the intracellular LD dynamics.
We then developed a bio-clinical study to analyze the impact of HCV variability on the virus-
induced steatosis in vivo. We performed a morphometric analysis of the LD encountered in the liver
tissue of chronic HCV carriers to precisely quantify their steatosis. We did not find any association
between the degree of steatosis and the nature of the viral genotype. Our study suggests that the
variability which is more or less observable in the capsid and NS5A proteins appears to have a minor
effect on the severity of steatosis in vivo. We conclude that individual host factors seem to play a
much greater role than viral factors in the development and severity of the HCV-induced steatosis.
Keywords: hepatitis C, steatosis, lipid droplets
3
Table des matières
Introduction
I) L’hépatite C...................................................................................................................... 10
A. Découverte ................................................................................................................... 10
B. Epidémiologie .............................................................................................................. 10
C. Modes de transmission ................................................................................................. 11
D. Evolution pathologique ................................................................................................ 12
1. Hépatite aiguë........................................................................................................... 12
2. Hépatite chronique ................................................................................................... 12
E. Thérapies ...................................................................................................................... 13
1. Thérapies actuelles ................................................................................................... 13
2. Thérapies en cours d’expérimentation ..................................................................... 14
3. Thérapies vaccinales ................................................................................................ 15
II) Le virus de l’hépatite C .................................................................................................... 16
A. Taxonomie.................................................................................................................... 16
B. Structure de la particule virale ..................................................................................... 17
C. Organisation génomique .............................................................................................. 17
1. Les extrémités non codantes .................................................................................... 18
a) L’extrémité 5’ non codante (5’UTR) ................................................................... 18
b) L’extrémité 3’ non codante (3’UTR) ................................................................... 19
2. La partie codante ...................................................................................................... 19
a) Les protéines structurales ..................................................................................... 20
(1) La protéine de capside C .............................................................................. 20
(2) Les protéines d’enveloppe E1 et E2............................................................. 23
b) Les protéines non structurales .............................................................................. 24
(1) La protéine p7............................................................................................... 24
(2) La protéine NS2 ........................................................................................... 25
(3) Le complexe NS3/4A................................................................................... 26
(4) La protéine NS4B......................................................................................... 27
(5) La protéine NS5A......................................................................................... 27
(6) La protéine NS5B......................................................................................... 29
3. La protéine F ou ARFP ............................................................................................ 30
D. Variabilité génomique .................................................................................................. 30
4
E. Cycle infectieux............................................................................................................ 32
1. Attachement et entrée............................................................................................... 32
a) Les facteurs d’attachement................................................................................... 32
(1) Les glycosaminoglycanes............................................................................. 32
(2) Les lectines................................................................................................... 32
(3) Le rôle des lipoprotéines .............................................................................. 33
b) Les récepteurs....................................................................................................... 33
(1) Le récepteur aux LDL .................................................................................. 33
(2) Le récepteur scavenger SR-BI......................................................................33
(3) La tétraspanine CD-81 ................................................................................. 34
(4) La protéine claudine-1.................................................................................. 34
(5) La protéine occludine ................................................................................... 34
c) Modèle d’entrée du virus...................................................................................... 34
2. Traduction et maturation .......................................................................................... 35
3. Réplication ............................................................................................................... 36
4. Assemblage et sécrétion ........................................................................................... 36
F. Modèles d’étude ........................................................................................................... 38
1. Les modèles in vivo.................................................................................................. 38
a) Les primates ......................................................................................................... 38
b) Les rongeurs ......................................................................................................... 39
2. Les modèles in vitro ................................................................................................. 40
a) Les cultures primaires et les lignées immortalisées ............................................. 40
b) Le modèle réplicon............................................................................................... 40
c) Le modèle des virus-like particle (VLP et système SFV).................................... 41
d) Le modèle des pseudoparticules virales (HCVpp)............................................... 42
e) Le modèle en culture cellulaire (HCVcc) ............................................................43
f) Le modèle HCVpc................................................................................................ 43
III) Virus de l’Hépatite C et métabolisme lipidique............................................................... 44
A. Le métabolisme lipidique............................................................................................. 44
1. Synthèse et dégradation lipidique ............................................................................ 44
a) Lipogenèse : synthèse des acides gras.................................................................. 44
b) Synthèse des triglycérides (TG) ........................................................................... 44
c) Métabolisme des lipides ....................................................................................... 45
d) Régulateurs transcriptionnels de la lipogenèse et la lipolyse............................... 46
5
(1) Les protéines de la famille des PPAR .......................................................... 46
(2) Le facteur SREBP-1c ................................................................................... 46
(3) Le facteur ChREBP...................................................................................... 46
(4) Le récepteur LXR......................................................................................... 47
2. Le transport des lipides ............................................................................................ 48
a) Structure et classification ..................................................................................... 48
b) Le métabolisme des lipoprotéines ........................................................................ 49
(1) La voie exogène ........................................................................................... 49
(2) La voie endogène : synthèse des VLDL....................................................... 50
(3) La voie inverse : la voie de retour du cholestérol ........................................ 51
3. Les gouttelettes lipidiques........................................................................................ 52
a) Structure et composition des GL.......................................................................... 52
b) Fonction des GL................................................................................................... 54
c) Biogenèse et croissance........................................................................................ 55
(1) Modèles de biogenèse .................................................................................. 55
(2) GL et membranes du RE : une relation étroite ? .......................................... 57
(3) GL : des organites dynamiques .................................................................... 60
d) GL et synthèse des VLDL.................................................................................... 60
B. Syndrome métabolique associé au HCV...................................................................... 61
1. Données cliniques .................................................................................................... 61
2. L’insulino-résistance et le diabète de type 2 ............................................................ 62
a) Insulino-résistance métabolique........................................................................... 62
b) Insulino-résistance viro-induite............................................................................ 63
3. La stéatose hépatique ............................................................................................... 64
a) Histologie ............................................................................................................. 64
b) Stéatose métabolique............................................................................................ 65
(1) Insulino-résistance : cause ou conséquence ? .............................................. 66
(2) Assemblage et sécrétion des VLDL............................................................. 67
(3) ß-oxydation mitochondriale ......................................................................... 67
c) Stéatose viro-induite............................................................................................. 68
(1) Variabilité génotypique et stéatose .............................................................. 68
(2) Stéatose et polymorphismes génétiques chez l’hôte .................................... 69
(3) Stéatose et évolution de la maladie .............................................................. 69
(4) Le rôle de la protéine de capside.................................................................. 71
6
(5) Le rôle de la protéine NS5A......................................................................... 75
(6) Le rôle des autres protéines du HCV ........................................................... 75
C. Cycle viral du HCV et métabolisme lipidique : modèle .............................................. 77
1. Protéine de capside et accumulation de GL ............................................................. 77
2. Protéine NS5A, GL et assemblage viral................................................................... 78
3. GL et enveloppement des nucléocapsides................................................................ 78
4. VLDL et sécrétion des particules virales ................................................................. 79
Objectifs du travail 81
Résultats & Discussion 85
I) Etude in vitro des regroupements de gouttelettes lipidiques induits par le virus de
l’hépatite C. Impact sur la biogenèse des gouttelettes lipidiques............................................. 86
II) Étude bio-clinique VIRO-STÉATOSE : impact de la variabilité du virus de l’hépatite C
sur la stéatose hépatique......................................................................................................... 112
Conclusions & Perspectives 153
Bibliographie 159
7
Liste des figures & tableaux
Figure 1 : Prévalence mondiale de l’infection par le HCV ..................................................... 11
Figure 2 : Evolution clinique de l’infection par le HCV.......................................................... 13
Figure 3 : Famille des Flaviviridae ......................................................................................... 16
Figure 4 : Structure de la particule virale ............................................................................... 17
Figure 5 : Organisation génomique du HCV........................................................................... 18
Figure 6 : Structures et associations membranaires des protéines structurales et non
structurales du HCV................................................................................................................. 19
Figure 7 : Immunomarquage de la protéine de capside sur une biopsie de foie de chimpanzé
infecté par le HCV.................................................................................................................... 21
Figure 8 : Schéma de la maturation de la protéine de capside et de son adressage aux
gouttelettes lipidiques............................................................................................................... 22
Figure 9 : Répartition mondiale des différents sous types du HCV......................................... 31
Figure 10 : Modèle d’entrée du HCV ...................................................................................... 35
Figure 11 : Représentation schématique du cycle infectieux du HCV.....................................38
Figure 12 : Modèle chimère SFV-HCV.................................................................................... 42
Figure 13 : Schéma récapitulatif de la synthèse et la dégradation des lipides ainsi que de leur
régulation. ................................................................................................................................ 47
Figure 14 : Schéma d’une lipoprotéine.................................................................................... 48
Tableau 1 : Classification des lipoprotéines............................................................................ 49
Figure 15 : Représentation schématique de l’assemblage des VLDL ..................................... 51
Figure 16 : Schéma récapitulatif du métabolisme des lipoprotéines....................................... 52
Figure 17 : Structure schématique d’une gouttelette lipidique................................................ 53
Figure 18 : Modèle de biogenèse des gouttelettes lipidiques. ................................................. 57
Figure 19 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes
lipidiques, hypothèse d’une association constante .................................................................. 59
Figure 20 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes
lipidiques, hypothèse d’une dissociation.................................................................................. 60
Figure 21 : Formation des gouttelettes lipidiques et synthèse des VLDL. .............................. 61
Figure 22 : Schéma récapitulatif de l’impact du syndrome d’insulino-résistance sur le
métabolisme lipidique. ............................................................................................................. 63
Figure 23 : Caractères histopathologiques de la stéatose....................................................... 65
Figure 24 : Impact du HCV sur l’insulino-résistance et la stéatose viro-induite.................... 76
8
9
Introduction
10
I) L’hépatite C
A. Découverte
Jusque dans les années 70, les cas d’hépatites post-transfusionnelles rapportées lors d’études
épidémiologiques menées chez l’homme étaient considérés comme la conséquence de deux
agents viraux : le virus de l’hépatite A (HAV) et le virus de l’hépatite B (HBV). Néanmoins,
un nombre important de nouveaux cas d’hépatites n’était pas associé à l’infection par ces
deux virus et furent ainsi nommées hépatites « non A-non B ». En 1989, les avancées
majeures faites en biologie moléculaire, ont permis à l’équipe de Michael Houghton
d’identifier l’agent responsable de ces hépatites: le virus de l’hépatite C (HCV) (Choo et al.,
1989). En 2000, ces découvertes furent récompensées par le Prix Laske pour la recherche
médicale.
B. Epidémiologie
L’infection chronique par le HCV, qui touche entre 130 à 170 millions de personnes dans le
monde soit 3% de la population mondiale, (W.H.O, 1999) est une cause majeure de cancer du
foie ou hépatocarcinome. La prévalence de l’infection varie suivant les régions géographiques
(Figure 1). On distingue ainsi trois zones : une zone d’endémicité élevée (prévalence
supérieure ou égale à 2%) correspondant aux pays en voie de développement tels que certains
pays d’Asie ou d’Afrique, dont l’Egypte où la prévalence la plus forte a été observée avec
22% de la population infectée ; une zone d’endémicité faible (prévalence inférieure à 1%)
regroupant des pays industrialisés tels que certains pays d’Europe du Nord dont le Royaume
Uni et la Scandinavie où les prévalences les plus faibles ont été observées (0,01-0,1%) ; et une
zone d’endémicité moyenne dont la France fait partie avec en moyenne 1,1% de la population
infectée (environ 360 000 personnes en France) (Shepard et al., 2005); (Alter, 2007),
http://www.invs.sante.fr). Dans certains pays, notamment au Japon et en Europe du Sud,
l’infection par la HCV est la cause principale d’hépatocarcinome, identifiée chez plus de 70%
des malades atteints de ce cancer. L’augmentation de l’incidence globale d’hépatocarcinome
observée actuellement dans les pays occidentaux et au Japon est attribuée d’une part à
l’importance du nombre de malades qui ont été infectés par le HCV dans les années 1970 et
11
qui arrivent maintenant à un stade avancé de la maladie, et d’autre part à la meilleure prise en
charge des malades atteints de ces pathologies (Trinchet & Beaugrand, 1999). En France, plus
du tiers des personnes infectées par le HCV ignore son statut sérologique. En 2009 un plan de
lutte sur trois ans a été lancé par le comité stratégique du Programme National Hépatites
Virales, visant notamment à renforcer le dépistage et à améliorer la surveillance et les
connaissances épidémiologiques. Aujourd’hui, un des enjeux majeurs est de développer des
tests de dépistage rapides, peu coûteux et moins invasifs (DeWeerdt, 2011).
Figure 1 : Prévalence mondiale de l’infection par le HCV (Alter, 2007)
C. Modes de transmission
Le HCV se transmet principalement par le sang. Jusqu’au début des années 90, la transfusion
sanguine, ou la transplantation d’organes constituaient les causes principales d’infection.
Avec l’essor en 1992 d’un dépistage efficace et systématique du HCV, le risque de
contamination par voie sanguine a considérablement diminué. De nos jours, d’autres pratiques
sont également à risque telle que l’usage de drogues par voie injectable ou nasale, principal
mode de contamination dans les pays industrialisés (Roudot-Thoraval, 2002). La transmission
nosocomiale par utilisation de matériel mal désinfecté et l’exposition professionnelle
accidentelle ont aussi été décrites. Enfin les transmissions pas voie sexuelle, périnatale ou
familiale ne sont pas clairement définies et restent rares. Dans 20% des cas, le mode de
contamination demeure inconnu.
12
D. Evolution pathologique
1. Hépatite aiguë
Après la contamination par le HCV, et une période d’incubation allant de 4 à 12 semaines,
survient la phase aiguë de l’infection. Dans 80% des cas cette phase est asymptomatique.
Néanmoins une minorité de patients développe des signes cliniques transitoires tels que :
fatigue, nausée, état pseudo grippal, ictère cutanéo-muqueux. Le diagnostic d’hépatite aiguë
est donc rarement établi et repose essentiellement sur la détection du génome viral 1 à 3
semaines après la contamination, ainsi que l’élévation des transaminases sériques. L’hépatite
sévère ou fulminante reste quant à elle rare. La guérison de l’infection aiguë est définie par
l’absence durable de l’ARN viral dans le sang. Environ 15% des sujets infectés vont éliminer
spontanément le virus, mais pour les 85% restants, l’infection va évoluer vers la chronicité.
2. Hépatite chronique
L’infection chronique est définie par la persistance du génome viral dans le sérum plus de six
mois après la phase aiguë. Elle est généralement asymptomatique ou présente des symptômes
peu spécifiques d’une hépatite (fatigue, anorexie, nausée, douleurs) ce qui explique la
difficulté d’établir un diagnostic à ce stade de la maladie. L’orientation clinique repose donc
sur la détection du génome viral, l’apparition d’anticorps dirigés contre le virus et l’élévation
des transaminases dans le sang des personnes infectées. Le diagnostic peut être complété par
une analyse histologique qui va permettre d’évaluer la gravité de l’atteinte hépatique par une
mesure du score d’activité inflammatoire et de lésions du foie (fibrose) (score METAVIR),.
Ce diagnostic établi sur une biopsie de foie, permet de distinguer l’activité inflammatoire
(Score A de 0 à 3) de l’étendue de la fibrose (Score F de 0 à 4) (Bedossa & Poynard, 1996). Il
existe aussi d’autres techniques complémentaires plus récentes et non invasives telles que
l’élastométrie (Fibroscan) (Sandrin et al., 2003) ou l’évaluation des marqueurs sériques de
fibrose (Fibrotest) (Imbert-Bismut et al., 2001). L’hépatocarcinome se développe après 20 à
40 ans de portage chronique du virus, et le risque augmente si les patients développent une
cirrhose ou une fibrose importante liée à cette infection chronique (Figure 2). L’évolution de
la maladie hépatique est en réalité très variable selon les individus (cf paragraphe III) B. 3.
c)). Ce risque peut être majoré si d’éventuels co-facteurs sont associés, tels que l’âge lors de
l’infection, le sexe, la co-infection par le virus de l’hépatite B (HBV), le virus de
l’immunodéficience humaine (HIV) ou une consommation importante d’alcool (Vaquer et al.,
13
1994). Ainsi en France en 2009, les personnes infectées par le HCV étaient principalement
des hommes (62%), significativement plus jeunes (âge médian : 45 ans) que les femmes (âge
médian 52 ans) (http://www.invs.sante.fr). De plus, la cirrhose prolongée et l’hépatocarcinome
liés à l’infection représentent la première cause de transplantation hépatique en France
(Duclos-Vallée et al., 2009).
Figure 2 : Evolution clinique de l’infection par le HCV
E. Thérapies
Plus de 2,4% des décès mondiaux sont dus à des cirrhoses ou des hépatocarcinomes (W.H.O.,
2002) dont une grande partie fait suite à des infections par le HCV ou le HBV. Dans ce
contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques curatives et d’un vaccin
prophylactique se révèlent être un réel enjeu de santé publique. Plusieurs molécules
thérapeutiques sont ainsi déjà disponibles pour les personnes chroniquement infectées par le
HCV, et de nombreuses autres sont en cours de développement.
1. Thérapies actuelles
Les traitements curatifs actuels reposent sur l’association d’interféron α pégylé (IFN-α) et de
la ribavirine. L’interféron est une molécule antivirale qui va conduire à la diminution de la
charge virale, l’induction d’un état antiviral dans les cellules non-infectées, une augmentation
de la lyse des cellules infectées et une inhibition de la fibrogenèse hépatique (Feld &
Hoofnagle, 2005). La pégylation de l’interféron améliore sa biodisponibilité et par conséquent
INFECTION HCV
CIRRHOSE
20%
HEPATOCARCINOME
4 %
HEPATITE AIGUE
Sexe masculinHIV+HBV+
Age > 40 ans
4 à 12semaines
GUERISON
15 % 85 %
HEPATITE CHRONIQUE
Alcool > 50g/j
14
son action antivirale. La ribavirine est une molécule dont le mécanisme d’action contre le
HCV n’est pas clairement défini. La ribavirine n’aurait qu’une faible action antivirale, mais
exercerait plutôt un effet immunomodulateur de l’interféron quand elle y est couplée.
(Pawlotsky, 2005); (Thomas et al., 2010). Le traitement est indiqué chez les porteurs
chroniques présentant une atteinte hépatique modérée (Score Métavir A1F2) et des anomalies
persistantes aux tests virologiques. Il consiste classiquement en l’injection hebdomadaire
d’IFN-α et de ribavirine pendant 24 à 48 semaines, le but étant idéalement de ne plus détecter
l’ARN viral sérique (rémission prolongée). L’efficacité de cette bithérapie n’est pas la même
chez tous les sujets infectés (facteurs liés à l’hôte, à l’avancée de la maladie hépatique et au
virus). C’est un traitement coûteux, et l’apparition d’un certain nombre d’effets secondaires
indésirables (syndrome grippal, nausées, fatigue et dépression) peut entraîner un arrêt de ce
traitement chez certains patients. Il devient donc désormais nécessaire de développer de
nouvelles stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux malades.
2. Thérapies en cours d’expérimentation
Une des stratégie envisagée est l’amélioration de la tolérance du traitement actuel. Deux
molécules font ainsi actuellement l’objet d’une étude clinique de phase III : l’Albuferon-α
(Laboratoire Human Genome Sciences) qui correspond à l’INF-α fusionné à l’albumine
humaine, lui conférant une demie vie plus longue que l’INF-α ; et la viramidine (Laboratoire
Valéant), précurseur de la ribavirine qui a un effet davantage ciblé sur le foie et qui serait
mieux tolérée à dose équivalente car dépourvue d’activité hémolytique. L’autre possibilité est
d’utiliser des inhibiteurs ciblant spécifiquement le HCV, ceci étant possible grâce aux
connaissances acquises ces dernières années sur le cycle viral du HCV (cf paragraphe II) E.)
et sur les différents systèmes d’études du virus (cf paragraphe II) F.). C’est le cas du
Telaprevir (VX-950) (Laboratoire Vertex) et du Boceprevir (SCH 503034) (Laboratoire
Merck) (inhibiteurs de la protéase) actuellement en essai clinique de phase III qui ciblent une
protéine virale à activité protéasique, nécessaire lors de la traduction et la maturation des
différentes protéines virales (cf paragraphe II) C. 2. b) (3)). Ces deux molécules en
combinaison avec le traitement standard semblent augmenter le taux de guérison tout en
réduisant le temps de traitement de moitié chez certaines personnes infectées, mais peuvent
aggraver les effets indésirables observés dans la thérapie standard (Gravitz, 2011); (Rice,
2011). D’autres molécules comme le R7128 (inhibiteur de la polymérase) (Laboratoire Roche
et Pharmasset) sont elles aussi en essai clinique de phase III, et ciblent une autre protéine
15
virale indispensable à la réplication du génome viral (cf paragraphe II) C. 2. b) (6)). De
nouvelles pistes sont actuellement envisagées comme l’utilisation d’antiviraux composés
d’acides nucléiques (oligonucléotides antisens, siRNA) ciblant diverses régions du génome
viral (Randall et al., 2003) (cf paragraphe II) C. 1. a)). Néanmoins, le fort potentiel
d’adaptation du virus conduit souvent à l’émergence de variants résistants aux différents
inhibiteurs et antiviraux. Une des approche alternative proposée est le développement de
multithérapies (Targett-Adams et al., 2011), Actuellement l’étude INFORM-1 est la première
à s’intéresser aux effets potentiellement synergiques d’une association d’un inhibiteur de
protéase et d’un inhibiteur de polymérase (AASLD pour American Association for the Study of
Liver Diseases, 2009). De même, des molécules ciblant les facteurs cellulaires impliqués dans
le cycle viral sont en cours d’essai clinique (EASL pour European Association Study Liver,
2009).
3. Thérapies vaccinales
Du fait du nombre important de personnes infectées par le HCV (3 millions de nouvelles
infections par an (WHO) du coût et de la toxicité des traitements actuellement proposés, la
recherche d’un candidat vaccin contre l’hépatite C s’avère très active. (Houghton &
Abrignani, 2005). Même si plusieurs candidats vaccins ont été proposés montrant des résultats
encourageants chez la souris et le chimpanzé, aucun n’a fait la preuve définitive de son
efficacité chez l’homme. Plusieurs vaccins à visée thérapeutique sont aussi à l’étude en phase
II chez l’homme (Yu & Chiang, 2010). D’autre part, l’utilisation de la vaccination en
complément des thérapies existantes dans l’idée d’améliorer leur efficacité a aussi été
proposée.
16
II) Le virus de l’hépatite C
A. Taxonomie
Le séquençage du HCV a permis de le classer dans la famille des Flaviviridae. Cette famille
regroupe quatre genres dont le genre Flavivirus (composé notamment du virus de la fièvre
jaune (YFV) et du virus de la dengue (DV), pathogènes pour l’homme et l’animal) et le genre
Pestivirus (dont font partie le virus de la peste porcine (CSFV) et le virus de la diarrhée
bovine (BVDV) qui infectent principalement les animaux d’élevage). Les virus hépatotropes
GB classés dans cette famille virale, appartiennent quant à eux au genre Pegivirus (Stapleton
et al., 2010) qui regroupe GBV-A, GBV-C et GBV-D (Epstein et al., 2010). Ces virus
présentent de forte homologie de séquence avec le HCV et peuvent infecter l’homme. Enfin le
genre Hepacivirus comprend le HCV et GBV-B et se distingue des autres genres par
l’organisation des protéines structurales (Choo et al., 1991); (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/ICTVdb/index.htm) (Figure 3).
Figure 3 : Famille des Flaviviridae. En jaune le genre Flavivirus, en bleu le genre Pestivirus, en rouge le genre Hepacivirus et en vert le genre Pegivirus. Le GBV-D récemment découvert n’apparaît pas sur cet arbre (Ferron et al., 2005).
17
B. Structure de la particule virale
Depuis sa découverte en 1989, seule une structure putative du virus a pu être établie, du fait
notamment de la faible quantité de virions circulants dans le sang des patients infectés. Par
analogie avec les autres virus de la famille des Flaviviridae, le HCV est classiquement décrit
comme un virus enveloppé, sphérique, contenant probablement une nucléocapside
icosaédrique d’environ 30nm de diamètre qui renferme le génome viral (Gastaminza et al.,
2010) (Figure 4). D’autre part, une séries d’études sur les sérums de patients infectés a permis
de mettre en évidence plusieurs structures de densité variable contenant le génome viral
(Bradley et al., 1991), (André et al., 2002), (Thomssen et al., 1993). D’après ces données, il
semble que les particules les plus infectieuses aient une densité comprise entre 1,09 et
1,11g/ml (Hijikata et al., 1993a). La faible densité de ces particules virales est liée à leur
association avec des lipoprotéines (André et al., 2002), nommées de ce fait les Lipo-Viro-
Particules (LVP). Cette association reflète l’interaction étroite entre l’assemblage du virus et
la biosynthèse des VLDL (cf paragraphe III) C.).
Figure 4 : Structure de la particule virale (D’après (Popescu & Dubuisson, 2010))
C. Organisation génomique
Le génome du HCV est un ARN simple brin de polarité positive de 9,6kb. Deux phases
ouvertes de lecture (ORF pour Open Reading Frame) ont été identifiées. L’ORF principale
code un polypeptide précurseur d’environ 3000 acides aminés, qui va être maturé de façon co-
et post-traductionnelle pour donner naissances aux protéines structurales (protéine de capside
C et d’enveloppes E1 et E2) et non structurales du HCV (protéines NS2, NS3, NS4A, NS4B,
18
NS5A et NS5B). Cette ORF est entourée de deux régions non-codantes aux extrémités du
génome (5’UTR et 3’UTR). (Figure 5). Le décalage du cadre de lecture au niveau du codon
26(+1) peut aussi conduire à la production d’une protéine additionnelle, la protéine F
(Walewski et al., 2001), (Xu et al., 2001), (Baril & Brakier-Gingras, 2005). Les indications de
longueurs nucléotidiques ou peptidiques sont données en référence à la séquence de la souche
H77 (www.losalamosdatabase)
Figure 5 : Organisation génomique du HCV. Le brin d’ARN positif de 9,6kb est représenté en haut flanqué de ces extrémités non codantes 5’untranslated (5’UTR) et 3’unstranslated (3’UTR). La traduction initiée au niveau de l’IRES donne un polypeptide précurseur qui va être maturé de façon co- et post-traductionnelle (les flèches sur le schéma indiquent les évènements de clivage) pour donner naissance aux protéines struturales (en bleu) et non structurales (en gris). Les tailles des protéines sont indiquées en kD.
1. Les extrémités non codantes
a) L’extrémité 5’ non codante (5’UTR)
La région 5’UTR de l’ARN du HCV correspond aux premiers 341 nucléotides. C’est une
région très conservée et structurée, sans coiffe à son extrémité. Elle consiste en 4 domaines (I
à IV) organisés en tige boucle. Les domaines I et II (nucléotides 1 à 115) sont impliqués dans
la réplication du génome viral (Friebe et al., 2001). Les domaines II, III et IV (nucléotides
116 à 341) constituent le site interne d’entrée du ribosome (IRES pour Internal Ribosome
Entry Site) permettant l’initiation de la traduction de l’ARN viral. Ainsi les fonctions qui lui
sont attribuées et sa grande conservation de séquence, font de cette région une cible clé pour
le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Une étude a ainsi été développée
cellular signal peptidases auto-protease NS2/NS3 cleavage by the NS3-NS4a complex
structural proteins non-structural proteins5’ untranslated
3’untranslated
E1C E2 p7 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b
(U)n30nt
98nt
341nt
CoreRNA & LD interaction
Envelopeproteins
metallo/Cys protéase
&assembly
Ser proteaseNTPasehelicase
NS3 cofacteur
Membranousweb
Phosphoproteinreplication
&assembly
RNA dependantpolymerase
21-23 31-35 70 7kD 23 60 6 27 56-58 68
SPP
Viro-porine
I
IIIRES
III
IV
cellular signal peptidases auto-protease NS2/NS3 cleavage by the NS3-NS4a complex
structural proteins non-structural proteins5’ untranslated
3’untranslated
E1C E2 p7 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b
(U)n30nt
98nt
341nt
CoreRNA & LD interaction
Envelopeproteins
metallo/Cys protéase
&assembly
Ser proteaseNTPasehelicase
NS3 cofacteur
Membranousweb
Phosphoproteinreplication
&assembly
RNA dependantpolymerase
21-23 31-35 70 7kD 23 60 6 27 56-58 68
SPP
Viro-porine
I
IIIRES
III
IV
19
reposant sur l’utilisation de petits ARN interférants inhibant la traduction (Kanda et al.,
2007).
b) L’extrémité 3’ non codante (3’UTR)
La région 3’UTR, de taille variable (entre 210 et 250 nucléotides), est organisée en trois
régions structurées : (i) une région peu conservée d’environ 30 nucléotides comprenant deux
boucles (VSL1 et VSL2), (ii) une région poly U/UC de taille variable et (iii) une région très
(Ploegh, 2007) conservée dite X-Tail constituée de 98 nucléotides arrangés en trois tiges
boucles (SL1, 2 et 3). La région 3’UTR intervient lors de l’initiation de la réplication via sa
région X-Tail et une partie de la région poly U/UC (Kolykhalov et al., 2000),(Yi & Lemon,
2003). Ces deux régions semblent être aussi impliquées dans le maintien de l’infectiosité du
virus in vivo (Kolykhalov et al., 2000). La région 3’UTR est aussi capable d’interagir avec
d’autres protéines cellulaires ce qui permet notamment de stabiliser l’ARN viral, le protégeant
ainsi d’une éventuelle dégradation (Spångberg et al., 2001), et de favoriser la traduction virale
(Ito et al., 1998);(Song et al., 2006).
2. La partie codante
Figure 6 : Structures et associations membranaires des protéines structurales et non structurales du HCV. Les évènements de clivages sont indiqués par les enzymes cellulaires (ciseaux) et les protéases virales (flèches). Les structures tridimensionnelles des protéines sont représentées lorsqu’elles sont connues. (Moradpour et al., 2007)
20
a) Les protéines structurales
(1) La protéine de capside C
La protéine de capside (nucléotides 342-914) est issue du clivage de la partie N-terminale du
polypeptide précurseur donnant une protéine de 23kD (191 aa) très conservée parmi les
différents génotypes du HCV (Bukh et al., 1993). Lors de la maturation de la polyprotéine,
une séquence signal interne située entre les séquences de la protéine de capside et la protéine
E1, adresse le polypeptide naissant à la membrane du réticulum endoplasmique (RE).
L’ectodomaine de E1 est ensuite transloqué dans la lumière du RE, puis une enzyme
cellulaire, la signal peptidase (SP) libère la protéine de capside de E1 et génère une protéine
de capside immature de 191 aa (23 kD) (Hijikata et al., 1991). La maturation de la protéine de
capside fait intervenir une autre enzyme cellulaire : la signal peptide peptidase (SPP)
(Weihofen et al., 2002); (McLauchlan et al., 2002) qui va cliver la séquence signal de E1
produisant ainsi une protéine mature de 176 aa (21 kD) (Hüssy et al., 1996); (Ogino et al.,
2004); (Lemberg & Martoglio, 2002); (Santolini et al., 1994); (Okamoto et al., 2004);
(Okamoto et al., 2008). Des résidus semblent être essentiels au clivage par la SPP : trois
résidus situés dans la séquence signal Ala180, Ser183 et Cys184 ; (McLauchlan et al., 2002);
(Targett-Adams et al., 2008); (Ait-Goughoulte et al., 2006); (Hope et al., 2006), trois résidus
situés dans le domaine hydrophobe Leu139, Val140 et Leu144 ainsi que deux résidus Ile176 et
Phe177 dans la région en amont du site de clivage (Okamoto et al., 2004). Cependant,
l’importance relative de ces résidus dans le clivage pourrait dépendre des paramètres
expérimentaux établis dans les différentes études citées et de résidus situés à distance de la
séquence signal elle-même. De plus le clivage par la SP serait nécessaire pour exposer le site
de clivage par la SPP (Liu et al., 1997); (Lemberg & Martoglio, 2002). La protéine de capside
est retrouvée de façon diffuse dans le cytoplasme, aux membranes du RE, à la surface des
gouttelettes lipidiques (GL) (Barba et al., 1997); (Moriya et al., 1997a); (Hope &
McLauchlan, 2000); (Qiang et al., 2009), et en plus faible proportion dans le noyau (Yasui et
al., 1998) et au niveau des mitochondries (Moriya et al., 1998); (Schwer et al., 2004).
Cependant, ces deux dernières localisation pourraient être liées à des conditions de
surexpression et restent hypothétiques (Figure 7). La protéine de capside est organisée en
trois domaines dont les limites varient selon les études (Hope & McLauchlan, 2000) : le
domaine I (aa 1 à 118) fortement basique, le domaine II (aa 119 à 173-174) hydrophobe et le
domaine III (aa 174-175 à 191) très hydrophobe. Le domaine I contient un motif hélice α /
boucle / hélice α (aa 7 à 17). Il interagit avec l’extrémité 5’ non codante de l’ARN (Santolini
21
et al., 1994) et jouerait un rôle dans l’homo-oligomérisation (Matsumoto et al., 1996) et la
formation de la nucléocapside. L’acide aspartique en position 111 serait impliqué dans la
morphogenèse virale (Blanchard et al., 2003); (Klein et al., 2005). Le domaine II participe à
la maturation et la conformation du domaine I (Boulant et al., 2005). Il est constitué de deux
hélices α (I et II) amphiphiles séparées par une boucle hydrophobe (Boulant et al., 2006) et est
impliqué dans la liaison avec les membranes du RE et les GL (Hope & McLauchlan, 2000).
Le domaine III constitue la séquence signal d’adressage au RE et de clivage C/E1 (Figure 8).
Dans un modèle de pseudo-virions du HCV, il a été montré que la maturation de la protéine
de capside du HCV par la SPP constitue un pré-requis pour l’assemblage de la particule virale
(Ait-Goughoulte et al., 2006). Par ailleurs, il semble que l’adressage de la protéine de capside
aux GL après son clivage par la SPP faciliterait son rapprochement de l’ARN viral pour
former une particule virale infectieuse (Miyanari et al., 2007); (Targett-Adams et al., 2008);
(Shavinskaya et al., 2007) (cf paragraphe III) C. 1.). Ce résultat va bien dans le sens de
travaux, montrant qu’avec d’autres modèles de Flavivirus du genre Pestivirus ou les virus GB,
les particules virales sécrétées par la cellule infectée contiennent une protéine de capside
clivée par la SPP et que ce clivage est nécessaire à l’infectiosité in vivo (Heimann et al.,
2006); (Targett-Adams et al., 2006). De plus c’est la forme mature de la protéine de capside
qui est retrouvée dans le sérum des patients infectés par le HCV (Yasui et al., 1998).
Figure 7 : A et B Immunomarquage de la protéine de capside sur une biopsie de foie de chimpanzé infecté par le HCV (Barba et al., 1997). La protéine de capside (billes d’or 10nm) s’accumule à la surface d’une gouttelette lipidique cytoplasmique (A) ou le long dur réticulum endoplasmique (B), (barre=0,1µm)
A BA BA BA B
22
Figure 8 : Schéma de la maturation de la protéine de capside et de son adressage aux gouttelettes lipidiques Le polypeptide naissant est adressé à la membrane du RE via une séquence signal située entre les séquences de la protéine de capside et la protéine E1. Puis l’enzyme SP libère la protéine de capside de E1 et génère une protéine de capside immature. La maturation de la protéine de capside fait intervenir une autre enzyme, la SPP, qui va cliver la séquence signal de E1 produisant ainsi une protéine mature. Un repliement correct du domaine II est nécessaire pour que la protéine de capside ne soit pas dégradée par le protéasome. La protéine de capside mature est ensuite transférée aux GL (Boulant et al., 2006).
La maturation de la protéine de capside a lieu aux membranes du RE et son adressage aux GL
dépend de plusieurs paramètres :
i) La présence de GL: dans une cellule dépourvue de GL, la protéine de capside a une
localisation cytoplasmique diffuse principalement aux membranes du RE (Hope &
McLauchlan, 2000).
ii) Le clivage par la SPP, essentiel pour la localisation de la protéine de capside à la
surface des GL. En effet c’est la forme mature de la protéine de capside qui est retrouvée à la
surface des GL (Hope & McLauchlan, 2000). De plus dans des cellules produisant un mutant
de la protéine de capside qui n’est pas clivé par la SPP (Val180 Leu183 Val184), celle-ci n’est
pas adressée aux GL et reste localisée aux membranes du RE (McLauchlan et al., 2002); (Ait-
Goughoulte et al., 2006).
iii) Le domaine II de la protéine de capside, impliqué dans l’interaction avec les GL et
la stabilité de la protéine (Hope & McLauchlan, 2000). Un repliement correct de ce domaine
après clivage par la SPP est nécessaire pour que la protéine de capside ne soit pas dégradée
par le protéasome (Boulant et al., 2006) (Figure 8). Le domaine II n’est pas retrouvé dans la
protéine de capside des Pesti- et Flavivirus, mais il est présent dans la séquence de la protéine
de capside du virus GBV-B ainsi que dans une famille de protéines de cellules végétales, les
oléosines, impliquées dans le maintien de structures stockant les lipides (Hope, 2001). Des
23
motifs très conservés au sein de ces protéines semblent jouer un rôle direct dans l’interaction
avec les GL : le motif « nœud Proline » en position 138-143 (P-XXXX-P), où les prolines
sont entourées par des séquences hydrophobes, et le motif YATC en position 164-167 de la
protéine de capside (Hope, 2001). La présence dans le domaine II d’un continuum de résidus
hydrophobes formés par l’hélice I, la boucle et l’hélice II est également importante pour
l’interaction avec les GL (Boulant et al., 2006). De plus le résidu phénylalanine en position
150 jouerait notamment un rôle dans l’adressage de la protéine de capside aux GL et dans la
stabilité de celle-ci (Boulant et al., 2007).
La protéine de capside peut former des homo-oligomères qui vont permettre la formation de
la nucléocapside (Ai et al., 2009). Elle joue aussi un rôle dans la morphogenèse virale et son
interaction avec les GL semble être primordiale dans ce processus (cf paragraphe III) C. 1.)
(Miyanari et al., 2007); (Shavinskaya et al., 2007). Des modifications dans la séquence du
domaine II qui n’altèrent pas l’adressage de la protéine de capside aux GL mais modifient la
nature de l’interaction avec les GL peuvent moduler l’assemblage et la sécrétion viral
(Shavinskaya et al., 2007); (Majeau et al., 2009). La protéine de capside serait aussi capable
de se lier à une protéine appartenant au système ESCRT (pour Endosomal Sorting Complex
Required for Transport) et serait ainsi impliqué dans la production virale (Blanchard et al.,
2003); (Ariumi et al., 2011).
La protéine de capside est capable de moduler un certains nombres d’acteurs du métabolisme
lipidique contribuant ainsi à la pathogénicité de l’infection par la HCV (cf paragraphe III) B.
3. c) (4)). De plus, la protéine de capside interagit avec de nombreux autres partenaires
cellulaires et pourrait ainsi jouer sur les mécanismes impliqués dans l’apoptose, la
prolifération cellulaire, le stress oxydatif et le système immunitaire, ce qui pourrait moduler là
encore la pathogénicité de l’infection par le HCV (McLauchlan, 2000); (Ray & Ray, 2001).
Selon certaines études, la protéine de capside aurait des fonctions pro- ou anti-apoptotique et
l’inhibition de l’apoptose pourrait ainsi intervenir dans la persistance virale (Chung et al.,
2001).
(2) Les protéines d’enveloppe E1 et E2
Les protéines d’enveloppe E1 (nucléotides 915-1490) et E2 (nucléotides 1491-2579) sont des
protéines de 31 à 35 kD (192 aa) et 70 kD (362 à 369 aa) respectivement. Elles sont obtenues
après le clivage de la polyprotéine précurseur par des peptidases cellulaires. Ce sont des
24
protéines transmembranaires constituées d’un large ectodomaine N-terminal et un domaine
transmembranaire unique C-terminal, qui vont s’assembler en hétérodimères non-covalents
E1-E2 grâce à leurs domaines transmembranaires (Op De Beeck et al., 2000). Des séquences
signal présentes dans la partie C-terminale de la protéine de capside et dans le domaine
transmembranaire de E1 sont responsables de la translocation des ectodomaines de E1 et E2
dans la lumière du RE. Lors de la maturation des protéines d’enveloppe l’acquisition de ponts
disulfures intramoléculaires et de glycanes est nécessaire à leur conformation (Dubuisson &
Rice, 1996); (Meunier et al., 1999); (Goffard & Dubuisson, 2003); (Goffard et al., 2005) ;
(Helle et al., 2010). La protéine E1 présente ainsi quatre sites de glycosylation très conservés
et deux autres sites potentiels uniquement présents pour certains génotypes. La protéine E2
compte neuf sites de glycosylation très conservés ainsi que deux autres sites observés
seulement pour certains génotypes. La partie N-terminale de E2 comprend trois régions
hypervariables, la région HVR1 (aa 384-410) de forte variabilité et les régions HVR2 (aa 473-
480) et HVR3 (aa 431-466). La région HVR1, exposée à la surface de E2, pourrait être
impliquée dans l’échappement du virus au système immunitaire de l’hôte (Farci et al., 1996).
Les protéines d’enveloppe sont en effet hautement antigéniques ce qui en fait des cibles
idéales pour la production d’anticorps neutralisants (Law et al., 2008); (Perotti et al., 2008);
(Meunier et al., 2008). Les protéines d’enveloppe semblent intervenir à plusieurs étapes du
cycle viral : lors de l’entrée virale (reconnaissance de la cellule cible, attachement du virus et
fusion membranaire) (cf paragraphe II) E. 1.) et lors de l’assemblage et la sécrétion de
nouvelles particules virales (cf paragraphe II) E. 4.).
b) Les protéines non structurales
(1) La protéine p7
La protéine p7 (nucléotides 2580-2768) est une petite protéine de 7kD (63 aa). Elle est
constituée de deux hélices α transmembranaires hydrophobes (aa 19-32 et 36-58), séparées
par un court fragment hydrophile (aa 33-35). Les extrémités N-terminale et C-terminale sont
orientées vers le milieu extracellulaire, la partie C-terminale servant de peptide signal à la
protéine NS2. La protéine p7 est localisée au niveau des membranes du RE et des
mitochondries (Carrère-Kremer et al., 2002) et ne semble pas faire partie de la particule
virale. Sa fonction reste mal connue et il a été montré qu’elle était capable de s’oligomériser
(Clarke et al., 2006), formant ainsi un pore (une « viroporine ») qui joue le rôle de canal
ionique dans des bicouches lipidiques artificielles (Griffin et al., 2004); (Pavlović et al.,
25
2003). Elle ne semble pas impliquée dans la réplication virale (Lohmann, 1999) mais est
nécessaire pour la production de particules virales in vitro (Jones et al., 2007); (Steinmann et
al., 2007) et in vivo chez le chimpanzé (Sakai et al., 2003). Effectivement, d’une part la
protéine p7 interagirait avec la protéine NS2 et contrôlerait sa topologie membranaire,
régulant de cette façon les interactions de NS2 avec les protéines virales lors des étapes
d’assemblage (Ma et al., 2011). D’autre part, la protéine p7 serait capable de moduler le pH
intracellulaire, sa présence entraînerait alors une diminution de l’acidification intracellulaire
protégeant ainsi les particules virales naissantes et favorisant leur production (Jones et al.,
2007); (Shavinskaya et al., 2007).
(2) La protéine NS2
La protéine NS2 (nucléotides 2769-3419) est une protéine de 23kD et de 217 aa. Elle serait
composée de trois ou quatre domaines transmembranaires. L’extrémité C-terminale, dirigée
vers le cytosol serait capable d’interagir avec l’extrémité N-terminale de NS3 formant ainsi
une protéase à cystéine avec deux sites actifs structurés en deux hélices α et cinq brins ß
(Lorenz et al., 2006), dont l’activité dépend du zinc (Hijikata et al., 1993b). Cette protéase
assure l’auto-clivage entre NS2 et NS3 (Grakoui et al., 1993) et joue ainsi un rôle important
dans la maturation de la polyprotéine, l’infection in vivo (Kolykhalov et al., 2000) et la
réplication in vitro (Welbourn et al., 2005). Elle n’est pas nécessaire à la formation du
complexe de réplication (Lohmann, 1999). Outre son rôle enzymatique, le domaine C-
terminal de la protéine NS2 interviendrait dans l’assemblage viral et lors de la production
virale. De plus des résidus appartenant au premier segment transmembranaire dans le domaine
N-terminal seraient impliqués (Jones et al., 2007); (Jirasko et al., 2008). Le résidu Serine en
position 168 impliqué dans la phosphorylation et la stabilisation de la protéine NS2 (Franck et
al., 2005) serait important pour l’assemblage viral (Jirasko et al., 2008) et la production de
virus infectieux (Yi et al., 2007); (Yi et al., 2009). En effet ce résidu jouerait un rôle à une
étape tardive de l’assemblage viral, en conférant l’infectiosité aux pré-particules virales avant
leur relarguage dans le milieu extracellulaire, la phosphorylation de ce résidu ne serait
néanmoins pas impliquée (Tellinghuisen et al., 2008); (Yi et al., 2009). La protéine NS2
serait aussi capable d’interagir avec la protéine p7 et modulerait les interactions des
glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 avec les protéines NS3 et NS5A se trouvant dans les
complexes de réplication à proximité des GL dans des zones où l’assemblage viral aurait lieu
(Phan et al., 2009); (Ma et al., 2011); (Popescu et al., 2011); (Stapleford & Lindenbach,
26
2010). De plus, La protéine NS2 serait impliquée dans la régulation transcriptionnelle
(Dumoulin et al., 2003) en induisant un stress au niveau du RE (von dem Bussche et al.,
2010), et la persistance virale (Erdtmann, 2003). Enfin NS2 inhiberait la prolifération
cellulaire créant ainsi un environnement favorable à la réplication virale (Yang et al., 2006).
(3) Le complexe NS3/4A
NS3 (nucléotides 3420-5312) est une protéine de 60kD et 631 aa. Elle possède deux
principales fonctions enzymatiques réparties sur les deux extrémités. L’extrémité N-terminale
de NS3 porte une fonction serine protéase qui, en association avec son cofacteur NS4A,
assure le clivage des protéines non structurales en amont de NS3 (NS3/4A, NS4A/4B,
NS4B/5A, NS5A/5B) (Bartenschlager et al., 1995). Ce domaine de NS3 est structuré en deux
parties identiques constituées chacune de feuillets ß orientés de façon antiparallèle encadrant
le site actif de l’enzyme (Miller & Purcell, 1990); (Kim et al., 1996); (Love et al., 1996). NS4A
(nucléotides 5313-5474) est une petite protéine transmembranaire de 6kD (54 aa) nécessaire à
la stabilisation de NS3 (Kim et al., 1996), à l’adressage et au maintien de la protéine à la
membrane du RE (Wölk et al., 2000), la protéine NS3 ne possédant pas de domaine
transmembranaire. L’activité serine protéase est au cœur de la recherche de nouvelles
thérapies antivirales (Raney et al., 2010), et semble impliquée dans l’échappement du virus à
la réponse immunitaire (Gale & Foy, 2005); (Meylan et al., 2005). Le domaine C-terminal de
NS3 renferme un domaine à activité hélicase à ARN ATP-dépendante, qui dépendrait aussi de
l’association avec le cofacteur NS4A (Pang et al., 2002). Ce domaine est structuré en trois
sous domaines (Frick, 2006). Impliquée lors de l’initiation de la réplication, l’activité hélicase
permettrait le déroulement des duplexes ARN/ARN (Tai et al., 1996), et le déplacement des
protéines liées à l’ARN (Lindenbach & Rice, 2005). Les mécanismes de son action restent
néanmoins peu décrits. In vitro, des mutations adaptatives au niveau de l’extrémité N-
terminale du domaine hélicase, ont été identifiées et joueraient un rôle lors des étapes
précoces de l’assemblage viral (Ma et al., 2008b); (Han et al., 2009); (Phan et al., 2009).
Plusieurs arguments attestent d’un rôle du domaine serine protéase de NS3 dans l’oncogénèse
liée au HCV (Levrero, 2006). Là encore l’implication directe de NS3 n’est pas clairement
définie.
27
(4) La protéine NS4B
La protéine NS4B (nucléotides 5475-6257) est une petite protéine de 27kD (261 aa) organisée
en au moins quatre domaines transmembranaires ancrés dans la membrane du RE (Hügle et
al., 2001), en deux hélices α amphiphatiques (AH1 et AH2) au niveau de l’extrémité N-
terminale, capable d’effectuer un cinquième passage transmembranaire après translocation
dans le RE (Lundin et al., 2003); (Gouttenoire et al., 2009a), et probablement en deux hélices
α pour l’extrémité C-terminale (Gouttenoire et al., 2009b). Des résidus au niveau des hélices
α de l’extrémité N-terminale (aa 6 à 29) et C-terminale (aa 229 à 253) seraient déterminants
dans l’association membranaire et la formation de ces complexes de réplication (Elazar et al.,
2004); (Gouttenoire et al., 2009b). De plus, l’implication de NS4B dans
l’hyperphosphorylation de NS5A (Koch & Bartenschlager, 1999); (Neddermann et al., 1999),
la palmitoylation de deux cystéines à l’extrémité C-terminale de NS4B (Yu et al., 2006), et
plus récemment l’interaction entre son extrémité N-terminale et son extrémité C-terminale
(Paul et al., 2011) semblent importantes pour la formation d’un complexe de réplication
fonctionnel. D’autre part, la protéine NS4B est capable d’induire à elle seule des
modifications membranaires, formant un réseau de vésicules membranaires nommé
« membranous web » associé aux complexes de réplication du HCV (Egger et al., 2002);
(Gao et al., 2004). Cependant, les modifications membranaires induites par la protéine NS4B
seule sont différentes de celles observées dans le cadre de l’expression de la polyprotéine
entière (Egger et al., 2002). La formation du « membranous web » (cf paragraphe II) E. 3.)
impliquerait donc d’autres protéines virales tel que le complexe protéique NS3/4A (Egger et
al., 2002). De plus, des différences dans la séquence de NS4B (Blight, 2007) et des mutations
adaptatives identifiées in vitro (Lohmann et al., 2003) moduleraient l’éfficacité de la
réplication. La protéine NS4B jouerait aussi un rôle dans la régulation de la traduction des
protéines virales et de certaines protéines de l’hôte (Blight, 2007) ainsi que dans le
métabolisme lipidique et la stéatose viro-induite (Park et al., 2009), (cf paragraphe III. B. 3.
c) (6)). Enfin la protéine NS4B possèderait un domaine de liaison à l’ARN à son extrémité C-
terminale (Einav et al., 2008) et pourrait interagir avec d’autres protéines virales afin de
moduler l’assemblage viral (Jones et al., 2008).
(5) La protéine NS5A
La protéine NS5A (nucléotides 6258-7601) est une phosphoprotéine qui existe sous deux
formes : phosphorylée (56 kD, 447 aa) ou hyperphosphorylée (58 kD, 459 aa). Elle est
28
composée à son extrémité N-terminale d’une hélice α suivie de trois domaines notés I à III.
L’hélice α est nécessaire à l’ancrage de la protéine NS5A dans les membranes du RE (Brass et
al., 2002), et jouerait un rôle dans l’interaction protéine/protéine indispensable à la formation
d’un complexe de réplication fonctionnel. Le domaine I est structuré en deux sous domaines :
le domaine IA qui renferme un site de liaison à l’ion Zinc au sein d’un motif très conservé, et
le domaine IB. Les domaines I et II seraient impliqués dans la réplication virale, Le domaine I
est capable de s’homodimériser via le domaine IB pour former une gouttière dans laquelle
l’ARN viral pourrait se lier (Tellinghuisen et al., 2005). NS5A peut se lier aux GL via son
domaine DI et cette capacité serait indispensable pour l’adressage du complexe de réplication
et de l’ARN viral aux GL pour favoriser l’assemblage viral (Miyanari et al., 2007); (Appel et
al., 2008) . Le domaine DI pourrait aussi contribuer à la production de particules virales
infectieuses via sa faculté de liaison aux GL (Miyanari et al., 2007) ou par des mécanismes
impliquant des facteurs cellulaires (Amako et al., 2009). Les domaines II et III sont moins
bien caractérisés. Le domaine II et notamment une petite région appelée ISDR (pour
Interferon Sensitivity Determining Region), interviendrait dans la résistance du HCV à
l’interféron α, mais son rôle dans la réplication virale est controversé (Tellinghuisen et al.,
2007); (Appel et al., 2008). Le domaine DIII semble quant à lui jouer un rôle important dans
la production de particules virales infectieuses (Kim et al., 2011) mais par des mécanismes
différents que ceux impliquant le domaine DI (Tellinghuisen et al., 2008). Le domaine DIII ne
serait pas nécessaire pour la liaison aux GL, mais serait responsable de l’interaction de la
protéine NS5A avec la protéine de capside présente à la surface des GL (Shi et al., 2002);
(Appel et al., 2008); (Masaki et al., 2008). Néanmoins il n’est pas établi si ceci se fait de
façon directe ou non. Un cluster de serines appartenant au domaine III de NS5A serait
impliqué dans cette interaction et dans l’interaction de la protéine de capside avec l’ARN viral
(Masaki et al., 2008), mais aussi lors des étapes d’assemblage (Appel et al., 2008) et de la
production virale (Kim et al., 2011).
La protéine NS5A, l’ensemble des protéines non structurales et l’ARN viral sont capables
d’interagir au sein du complexe de réplication (Egger et al., 2002). In vitro, l’apparition de
mutations adaptatives dans la séquence de NS5A favorise la réplication (Blight et al., 2000);
(Krieger et al., 2001); (Lohmann et al., 2001). De plus, l’interaction de NS5A avec la protéine
NS5B, réplicase virale, est importante pour la réplication virale (Shimakami et al., 2004).
La protéine NS5A est capable de moduler son état de phosphorylation via l’apparition de
mutations adaptatives (Evans et al., 2004); (Appel et al., 2005) ou via l’intervention des
protéines NS3, NS4A et 4B (Koch & Bartenschlager, 1999); (Evans et al., 2004); (Appel et
29
al., 2005); (Neddermann et al., 1999); (Jones et al., 2008). Ces études tendent à montrer que
l’hyperphosphorylation de NS5A ne serait pas nécessaire à la réplication virale. Celle-ci
perturberait l’interaction de NS5A avec la protéine cellulaire hVAP-A conduisant de ce fait à
l’inhibition de la réplication virale (Evans et al., 2004). Néanmoins c’est la forme
hyperphosphorylée qui est retrouvée à la surface des GL participant ainsi au recrutement des
autres protéines non structurales du HCV, de l’ARN viral (Miyanari et al., 2007) et à la
production de particules virales (Appel et al., 2005); (Popescu et al., 2011). La protéine
NS5A appartiendrait donc à deux complexes, le complexe de réplication et un complexe
impliqué dans l’assemblage viral, la phosphorylation de NS5A lui permettrait ainsi de passer
d’un complexe à l’autre (Appel et al., 2005); (Popescu et al., 2011). Cependant les résidus
impliqués dans ces phénomènes n’ont pas été clairement identifiés, la phosphorylation d’un
résidu Serine en position 457 appartenant au DIII jouerait un rôle dans la production virale
(Tellinghuisen et al., 2008); (Kim et al., 2011).
La protéine NS5A est capable d’interagir avec d’autres partenaires cellulaires et de moduler
notamment la résistance au traitement par l’interféron α, la croissance cellulaire et l’apoptose
(Macdonald & Harris, 2004). De plus, l’interaction de la protéine NS5A avec la protéine de
capside et son implication dans le métabolisme lipidique pourraient lier la protéine NS5A à la
pathogenèse associée à l’infection par le HCV (un chapitre consacré à cette implication est
développé paragraphe III) B. 3. c) (5)).
(6) La protéine NS5B
La protéine NS5B (nucléotides 7602-9377) est une protéine membranaire de 68 kD (591 aa).
NS5B assure la fonction d’ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp) au sein du complexe
de réplication. L’extrémité C-terminale de NS5B lui permet de s’ancrer à la membrane du RE,
l’ARN polymérase est alors inactive, un changement conformationnel va ensuite permettre de
déconnecter la partie C-terminale et le site actif de l’enzyme : la protéine NS5B adopte une
structure peu flexible dite en « main droite classique »: la « paume » renferme le site
catalytique, les « doigts » et le « pouce » alors repliés autour de la « paume » vont former un
tunnel par lequel l’ARN est amené au site actif (Lesburg et al., 1999). Un autre tunnel permet
l’entrée des rNTP et leur passage vers le site actif (Bressanelli et al., 1999). La liaison de
l’ARN et l’initiation de la réplication sont régulées par l’extrémité 3’ de l’ARN viral, qui
forme une boucle en « épingle à cheveux » hautement flexible. Cette boucle pointe en
direction du site catalytique et permet le bon positionnement de la matrice ARN (Appel,
30
2006). De plus la liaison de GTP au niveau de l’interface entre le « pouce » et les « doigts »
est nécessaire lors de l’initiation de la réplication (Bressanelli et al., 2002). L’activité
enzymatique de NS5B est régulée d’une part via la protéine NS5A (Shirota et al., 2002) et
d’autre part via des facteurs cellulaires tels que la kinase PRK (Kim et al., 2004), et la
cyclophiline B (Watashi et al., 2005). Compte tenu de son rôle primordial dans le cycle viral,
la protéine NS5B reste une cible de choix pour le développement de nouveaux inhibiteurs de
l’activité ARN polymérase (Burton & Everson, 2009); (Watkins et al., 2010).
3. La protéine F ou ARFP
Un décalage du cadre de lecture au codon 26 (+1) peut se produire au cours de la synthèse du
polypeptide précurseur, et conduirait à la synthèse d’une petite protéine de 14kD, la protéine
F (pour Frameshift) (Xu et al., 2001) ou ARFP (pour Alternative Reading Frame Protein)
(Walewski et al., 2001); (Xu et al., 2001); (Baril & Brakier-Gingras, 2005). La taille de cette
protéine varie de 126 à 160 aa en fonction du génotype. Actuellement le rôle de la protéine F
n’est pas clairement établi, elle pourrait avoir des fonctions immunomodulatrices (Fiorucci et
al., 2007), dans la transformation hépatocytaire (Ma et al., 2008a), ou dans l’organisation du
cytosquelette (Tsao et al., 2006), mais ne serait pas nécessaire à la réplication de l’ARN viral
(McMullan et al., 2007); (Vassilaki et al., 2008). Des anticorps anti-protéine F ainsi qu’une
réponse immunitaire ont été mis en évidence chez des porteurs chroniques du HCV, suggérant
que cette protéine est produite lors de l’infection naturelle (Xu et al., 2001).
D. Variabilité génomique
L’ARN polymérase du HCV est une enzyme peu fidèle qui introduit de nombreuses
mutations au cours de la réplication (1,5 à 2.10-3 mutations par nucléotide copié par an), du
fait d’une part d’un défaut d’activité correctrice et d’autre part d’un taux de réplication élevé
(1010 à 1012 virions par jour). La majorité des séquences ainsi générées sont défectives,
néanmoins certaines modifications, transmises au cours de l’évolution, vont subir les
pressions de sélection liées à l’hôte et son environnement et vont participer à l’émergence de
nouveaux variants. Le HCV présente ainsi une diversité génétique importante à la fois au sein
d’un même individu (on parle alors de quasi-espèces) et/ou au sein de la population infectée.
Cette variabilité génétique n’affecte pas les régions du génome de la même façon : les
séquences des extrémités 5’UTR, 3’UTR et celle de la protéine de capside sont les plus
conservées, alors que les séquences de protéines d’enveloppe sont les plus variables. Les
31
analyses phylogénétiques ont permis de classer les variants en 6 génotypes, notés 1 à 6
(Simmonds et al., 2005); (Murphy et al., 2007), qui diffèrent d’entre eux de 30% dans leur
séquence nucléotidique ; ainsi que de nombreux sous types, notés a, b,c,…, divergeant entre
eux d’environ 20% (Pawlotsky, 2003). La répartition des ces différents génotypes varie selon
les régions du globe (Figure 9) De façon générale, les génotypes 1, 2 et 3 sont répartis sur
toute la surface du globe, le génotype 4 est retrouvé principalement en Afrique du Nord et au
Moyen-Orient, le génotype 5 se focalise uniquement en Afrique du Sud, le génotype 6 est
retrouvé à Hong-Kong, en Chine et au Vietnam (Simmonds, 2004). En France, les génotypes
1b et 1a sont retrouvés majoritairement (60 à 65% des individus infectés), suivi par le
génotype 3a (20%) et 4a (10%), les génotypes 2a et 2c sont responsables des cas restants
(Nicolas-Burdin et al., 2007). D’un point de vue clinique, ces génotypes se comportent
différemment aussi bien pour le versant pathologique (cf. paragraphe III) B. 3. c) (1), (2) et
(3)) que pour le versant concernant la réponse au traitement par l’interféron (Chayama &
Hayes, 2011). Le traitement est en effet plus efficace pour les sujets infectés par les génotypes
2 et 3, que pour le génotype 1 tandis que les génotypes 4, 5 et 6 donnent des taux de réponse
intermédiaire (Zeuzem et al, 2004 ; Legrand-Abravanel et al, 2004).
Figure 9 : Répartition mondiale des différents sous types du HCV. Les génotypes 1, 2 et 3 sont répartis sur toute la surface du globe, le génotype 4 est retrouvé principalement en Afrique du Nord et au Moyen-Orient, le génotype 5 se focalise uniquement en Afrique du Sud, le génotype 6 est retrouvé à Hong-Kong, en Chine et au Vietnam (Gravitz, 2011).
32
E. Cycle infectieux
1. Attachement et entrée
L’entrée du HCV dans la cellule est un processus que l’on peut diviser en plusieurs étapes qui
vont mettre en jeu les protéines d’enveloppe virales E1 et E2, ainsi qu’un certain nombre de
facteurs cellulaires. Ces facteurs cellulaires sont de deux types : les facteurs d’attachement,
qui permettent le recrutement et la concentration des virus à la surface des cellules ; et les
récepteurs qui participent à l’entrée virale proprement dite (Burlone & Budkowska, 2009).
a) Les facteurs d’attachement
(1) Les glycosaminoglycanes
De nombreux virus de la famille des Flaviviridae utilisent les glycosaminoglycanes tels que
l’héparane sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate ou l’acide hyaluronique, pour
s’attacher à la cellule cible. Différentes études on montré que l’héparine (analogue aux
héparanes sulfates) et l’héparinase étaient capable d’intervenir dans l’adsorption du HCV
(Barth et al., 2003); (Barth et al., 2006); (Basu et al., 2007); (Morikawa et al., 2007). La
séquence des protéines d’enveloppe impliquée dans cette interaction n’est néanmoins pas
clairement définie.
(2) Les lectines
Ces protéines seraient impliquées dans la liaison la capture et l’élimination des virus
circulants à la surface des cellules (Cambi et al., 2005). Les protéines de type lectines, DC-
SIGN et L-SIGN s’organisent en microdomaines à la surface des cellules dendritiques et des
lymphocytes (DC-SIGN) ou à la membrane des cellules endothéliales sinusoïdales du foie (L-
SIGN) (Cambi et al., 2004); (Cambi et al., 2005). Le HCV pourrait utiliser ces protéines pour
rentrer dans les cellules, en se liant via les résidus sucrés de la glycoprotéine d’enveloppe E2 à
leur extrémité C-terminale (Lozach et al., 2003); (Lozach et al., 2004).
Une autre lectine, le récepteur aux asialoglycoprotéines, a aussi été proposé comme facteur
d’attachement du HCV. Il a été montré dans des cellules d’insectes, que ce récepteur était
capable d’interagir avec les résidus sucrés des protéines d’enveloppe du HCV (Saunier et al.,
2003). Son rôle dans l’entrée virale reste à vérifier.
33
(3) Le rôle des lipoprotéines
Les expériences menées sur les sera de patients infectés par le HCV ont permis de mettre en
évidence que les formes circulantes les plus infectieuses du HCV, les LVP, sont des particules
de faible densité qui résultent de l’association avec les lipoprotéines de faible (LDL) ou de
très faible densité (VLDL) (André et al., 2002). La liaison de ces LVP à des récepteurs
spécifiques des lipoprotéines, favoriserait l’entrée du virus dans la cellule contribuant de ce
fait à son infectiosité (Andréo et al., 2007).
b) Les récepteurs
Dans un second temps les particules virales se lient avec une plus grande affinité à un
récepteur ce qui leur permet de rentrer dans la cellule. Ces récepteurs sont de plusieurs types :
(1) Le récepteur aux LDL
En conditions physiologiques normales, il joue un rôle dans le métabolisme du cholestérol qui
est transporté sous forme de LDL aux cellules hépatiques. Lors d’une infection par le HCV,
ce récepteur pourrait être impliqué dans l’entrée des particules virales associées aux LDL
(Agnello et al., 1999); (André et al., 2002); (Petit et al., 2007).
(2) Le récepteur scavenger SR-BI
SR-BI est un récepteur membranaire présent dans la plupart des cellules, et particulièrement
les cellules hépatiques. C’est un acteur clé du métabolisme lipidique qui lie les différentes
lipoprotéines, il est notamment important dans le transfert des lipides vers la cellule et est
capable de modifier la composition lipidique de la membrane plasmique. C’est le principal
récepteur des lipoprotéines de haute densité (HDL) et peut aussi jouer le rôle de récepteur
pour les LDL et VLDL. SR-BI pourrait alors intervenir dans la liaison des virus associés aux
lipoprotéines et de la cellule (Maillard et al., 2006). Néanmoins, il semble que le HCV puisse
directement se lier à SR-BI par l’intermédiaire de la région HVR1 de la glycoprotéine E2
(Bartosch et al., 2003); (Lavillette et al., 2005). Enfin, SR-BI semble fonctionner de façon
synergique avec un autre facteur, le récepteur CD-81 pour former un « complexe récepteur »
(Kapadia et al., 2007).
34
(3) La tétraspanine CD-81
CD-81 est un récepteur exprimé au sein de tous les tissus, à l’exception des hématies et des
plaquettes. Il est impliqué dans la différenciation cellulaire, l’adhésion et la prolifération
cellulaire, la motilité et la signalisation (Levy & Shoham, 2005). La glycoprotéine E2 du
HCV via sa grande boucle extracellulaire (LER) est capable d’interagir avec CD-81 (Pileri et
al., 1998), des résidus appartenant notamment aux régions hypervariables de E2 seraient
importants pour cette interaction (Roccasecca et al., 2003); (Drummer et al., 2006). Il peut
fonctionner avec d’autres tétraspanines ainsi que des partenaires cellulaires pour former des
« réseaux à tétraspanine » (Levy & Shoham, 2005).
(4) La protéine claudine-1
Claudine-1 est une protéine ubiquitaire exprimée principalement dans le foie et qui intervient
au niveau des jonctions serrées et des jonctions cellule à cellule. Elle pourrait jouer un rôle à
une étape tardive de l’entrée du virus, après la migration latérale des complexes virus-
récepteurs aux jonctions serrées (Evans et al., 2007); (Brazzoli et al., 2008). Des résidus
situés dans la première boucle extracellulaire du récepteur seraient important pour l’entrée
virale, cependant le HCV ne semble pas interagir directement avec claudine-1 (Evans et al.,
2007).
(5) La protéine occludine
L’occludine est une protéine très exprimée dans le foie qui joue un rôle dans les jonctions
serrées (Saitou et al., 1997) de cellule à cellule. Son implication dans le cycle viral du HCV a
été découverte récemment et son rôle exact reste à déterminer (Ploss et al., 2009). Une
interaction avec la glycoprotéine E2 interviendrait tardivement au cours de l’entrée virale et
entraînerait un changement de localisation des jonctions serrées (Benedicto et al., 2008); (Liu
et al., 2009).
c) Modèle d’entrée du virus
L’entrée du virus dans la cellule semble être un processus séquentiel et long qui implique des
facteurs cellulaires et viraux. Les virions circulent en effet sous différentes formes chez les
patients : associé ou non aux lipoprotéines de faible densité; enveloppé ou non. L’ensemble de
ces facteurs rend la mise en place d’un modèle d’entrée virale assez complexe. Néanmoins le
modèle actuellement établi propose que les lectines, les glycosaminoglycanes et le LDL-R
35
facilitent dans un premier temps l’attachement du HCV sur les cellules cibles soit via une
interaction directe avec les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2, soit par l’intermédiaire des
lipoprotéines associées au HCV. Le virus interagit ensuite avec CD-81 qui va agir de façon
coopérative avec SR-BI pour former un « complexe récepteur ». Puis le virus est transféré aux
jonctions serrées où il interagit de façon tardive avec les protéines claudine-1 et occludine. Le
virus est alors endocyté de façon clathrine dépendante (Blanchard et al., 2006), puis
l’acidification de l’endosome entraîne la fusion des glycoprotéines d’enveloppe virale et de la
membrane endosomale (Tscherne et al., 2006); (Lavillette et al., 2007). La libération du
génome viral dans le cytoplasme peut ensuite s’effectuer par décapsidation.
(http://spiral.univ-lyon1.fr/files_m/M5502/WEB/index.html) (Figure 10)
Figure 10 : Modèle d’entrée du HCV (D’après (Popescu & Dubuisson, 2010)). Sur ce schéma, les glycosaminoglycanes (GAGs) ainsi que le récepteur au LDL (LDL-R) facilitent l’attachement du HCV. Puis le virus interagit avec le complexe récepteur formé de SR-BI et CD-8. Le virus est ensuite transféré aux jonctions serrées où il interagit avec les protéines claudine-1 (CLDN1) et occludine (OCLN). Le virus est alors endocyté de façon clathrine dépendante.
2. Traduction et maturation
Une fois l’ARN viral libéré dans le cytoplasme, la traduction débute immédiatement. L’ARN
de polarité positive est directement pris en charge par les ribosomes cellulaires au niveau de
l’IRES à l’extrémité 5’UTR. L’interaction avec l’IRES entraîne le recrutement de facteurs
d’initiation cellulaires. La machinerie de traduction se met alors en place à la membrane du
RE rugueux (RER). La synthèse donne naissance à un polypeptide précurseur de 3000 acides
aminés, ancré dans le RE, qui va être la cible de protéases cellulaires et virales entraînant des
clivages co- et post-traductionnels pour produire les formes matures des protéines du HCV.
Les clivages entre les protéines structurales C/E1, E1/E2 ; E2/p7 et p7/NS2 sont réalisés par
36
des peptidases signal et peptidases de peptide signal cellulaires situées dans la lumière du RE
(cf paragraphe II) C. 2.). La maturation des protéines non structurales a quant à elle lieu grâce
aux activités protéasiques de NS2/3 et NS3/4A. Le domaine protéase de NS2 permet
l’autoclivage NS2/NS3, et l’activité protéase de NS3 et de son cofacteur NS4A réalise les
clivages en cis entre NS3/NS4A, et en trans entreNS4A/4B, NS4B/NS5A et NS5A/NS5B.
3. Réplication
Le mécanisme de la réplication est encore largement méconnu, cependant un modèle a pu être
établi proposant que la réplication du HCV est assurée par un complexe de réplication dans
lequel sont associées les protéines non structurales NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B,
l’ARN viral et des facteurs cellulaires. Cette étape du cycle viral entraîne un remaniement
caractéristique des membranes cellulaires formant une plate forme pour la réplication virale :
le « membranous web » (Gosert et al., 2003); (Moradpour et al., 2003). La protéine NS4B
serait en partie impliquée dans ces remaniements membranaires (Egger et al., 2002); (Gao et
al., 2004). Cet environnement favoriserait les interactions entre les différents partenaires
intervenant dans l’initiation de la réplication. La protéine NS5A via ses propriétés de liaison à
l’ARN, pourrait ainsi recruter l’ARN viral. L’ARN polymérase NS5B reconnaît ensuite la
région X-tail de l’extrémité 3’UTR de la matrice ARN de polarité positive (You & Rice,
2008), et initie ainsi la synthèse du brin complémentaire négatif. La protéine NS3 serait alors
capable de séparer les deux brins d’ARN via son activité hélicase/ NTPase (Tai et al., 1996).
La protéine NS4A permettrait l’ancrage membranaire de NS3 et servirait de cofacteur à NS3
(Pang et al., 2002). Le brin néosynthétisé servirait ensuite de matrice pour la synthèse de
nombreux brins d’ARN de polarité positive. D’autres interactions des protéines virales avec
des facteurs cellulaires et notamment le cytosquelette ont été décrites et semblent nécessaires
à la réplication virale. Ainsi les protéines NS3 et NS5A interagissent avec les filaments
d’actine et les microtubules ce qui favoriserait la mobilité des complexes de réplication (Lai et
al., 2008). Ces derniers résultats restent cependant à confirmer.
4. Assemblage et sécrétion
Par analogie avec les autres virus de la famille des Flaviviridae, un modèle de l’assemblage et
de la sécrétion des néovirions a été proposé. La protéine de capside, associée aux GL au
niveau des membranes du RE est capable d’interagir avec l’ARN viral et la protéine NS5A
qui se trouvent au sein des complexes de réplication (Miyanari et al., 2007). La protéine
37
NS5A pourrait de ce fait appartenir à deux complexes différents : un complexe contenant
NS4B, responsable de la réplication et un complexe contenant la protéine de capside,
responsable de l’assemblage viral (Appel et al., 2008). Des mutations adaptatives dans la
protéine NS5A qui augmentent le titre infectieux sans altérer la réplication virale ont
d’ailleurs été identifiées (Tellinghuisen et al., 2008). En modulant son état de
phosphorylation, la protéine NS5A passerait d’un complexe à l’autre (Popescu et al., 2011). Il
n’est pas encore établi si l’interaction de la protéine de capside avec NS5A s’effectue de
manière directe ou non. Cette interaction est instable et transitoire et il est possible que la
protéine de capside et NS5A interagissent via l’ARN viral, qu’elles sont toutes les deux
capables de lier. Ainsi i) le rapprochement de la protéine NS5A vers les GL portant à leur
surface la protéine de capside serait suffisant pour initier l’assemblage viral (Appel et al.,
2008); (Targett-Adams et al., 2007) mais ii) la protéine NS5A pourrait aussi interagir
directement avec la protéine de capside par l’intermédiaire de son domaine III (Masaki et al.,
2008). (Un chapitre sur les liens étroits entre les protéines de capside, NS5A et les GL lors de
l’assemblage viral est développé au paragraphe III) C. de ce manuscrit). Ensuite, la protéine
de capside en s’associant avec l’ARN viral, peut s’oligomériser entrainant la formation de
nucléocapsides (Kunkel et al., 2001) capables de bourgeonner à la membrane du RE
(Blanchard et al., 2002). Les mécanismes par lesquels les nucléocapsides s’enveloppent sont
encore mal compris : i) la protéine de capside peut se lier aux glycoprotéines d’enveloppe E1
et E2, ce qui permettrait aux nucléocapsides de s’envelopper au niveau des membranes du RE
ou des membranes associées aux GL où la protéine E2 est retrouvée (Miyanari et al., 2007)
ii) la protéine NS2 interagit quant à elle avec la protéine p7 ainsi qu’avec la glycoprotéine
d’enveloppe E2 et pourrait jouer un rôle dans la formation des particules virales en réunissant
les glycoprotéines d’enveloppe et les nucléocapsides naissantes (Yi et al., 2009); (Ma et al.,
2011); (Popescu et al., 2011). La protéine p7 interviendrait aussi probablement en protégeant
les particules virales de l’acidité intracellulaire (cf paragraphe II) C. 2. b) (1)) avant que
celles-ci ne soient sécrétées par exocytose. Le métabolisme lipidique aurait une place
importante lors de la maturation des virions. En effet, il a été montré que les particules virales
sont assemblées sous forme de particules de forte densité (>1,15g/ml) mais qu’elles
acquièrent des éléments (les lipoprotéines) qui leur confèrent une faible densité (<1,14g/ml)
durant leur sécrétion. (Gastaminza et al., 2006); (Lindenbach et al., 2006), ce qui est confirmé
par l’analyse de la densité des virions circulants chez les patients chroniquement infectés par
le HCV (cf paragraphe II) B.). Cette association avec les lipoprotéines pourrait aussi
expliquer le fait que le virus n’ait jamais été visualisé en microscopie électronique.
38
Cependant, selon la cellule hôte dans laquelle les virus sont produits, leur composition en
lipides, leur taille et leur densité sont différentes (Gastaminza et al., 2010); (Merz et al.,
2011). A différentes étapes du cycle infectieux du HCV, le métabolisme lipidique semble
donc être important. Un paragraphe sur cette relation étroite est développé en III) C.
Figure 11 : Représentation schématique du cycle infectieux du HCV (Popescu & Dubuisson, 2010). L’entrée du virus dans la cellule est un processus séquentiel qui aboutit à l’endocytose du HCV (1). L’ARN viral une fois libéré va être traduit et donne naissance à un polypeptide précurseur, ancré dans le RE, qui va être maturé de façon co- et post-traductionnelle pour produire les formes matures des protéines du HCV (2). La réplication du HCV est assurée par un complexe de réplication dans lequel sont associées les protéines non structurales l’ARN viral et des facteurs cellulaires (3). Cette étape du cycle viral est caractérisée par la formation d’une plate forme de réplication, le « membranous web ». L’assemblage viral aurait lieu à la surface des GL associées à la membrane du RE, Le métabolisme lipidique aurait une place importante lors de la maturation et la sécrétion des virions (4).
F. Modèles d’étude
1. Les modèles in vivo
a) Les primates
Expérimentalement, le chimpanzé (Pan troglodyte) est le seul animal à pouvoir être infecté de
façon stable et reproductible par le HCV (Barba et al., 1997); (Wakita et al., 2005);
39
(Lindenbach et al., 2006). Il constitue un modèle animal idéal, proche du modèle humain, qui
a notamment permis l’identification du HCV (Choo et al., 1989). La maladie hépatique
évolue de la même manière que chez l’homme, bien que les signes cliniques soient le plus
souvent atténués, les chimpanzés ne développant pas de cirrhose et/ou de fibrose (Bukh,
2004). Néanmoins, l’utilisation du chimpanzé comme modèle d’étude reste limitée, pour des
raisons éthiques principalement mais aussi du fait de sa rareté et du coût de son entretien
(Grakoui et al., 2001). D’autres primates tels que les tamarins (Sanguinus sp.), les singes
hiboux (Aotus trivirgatus), les ouistitis à toupet blanc (Callithrix jacchus) et la musaraigne
des arbres (Tupaia belangeri chinensis), mammifère proche des primates, se sont aussi révélés
sensibles à l’infection expérimentale par le HCV ou le GBV-B (Schlauder et al., 1995); (Xie
et al., 1998); (Bukh et al., 2001); (Lanford et al., 2003); (Martin et al., 2003), mais ces
modèles restent peu utilisés.
b) Les rongeurs
Les modèles murins et notamment la souris (Mus musculus domesticus) constituent des
modèles moins coûteux et plus facile d’entretien. Deux types de modèles ont été développés :
les souris transgéniques pour certaines protéines virales et les souris possédant un foie
chimérique susceptibles à l’infection par le HCV (foie humanisé). Des souris transgéniques
exprimant spécifiquement dans le foie une ou plusieurs protéines virales du HCV, ont ainsi
permis l’étude de la pathogenèse virale, ces souris développant une stéatose et un
hépatocarcinome (cf paragraphe III) B. c)). Le deuxième modèle fait référence à des souris
immunodéprimées possédant un foie chimérique constitué en partie d’hépatocytes humains
(Mercer et al., 2001); (Bissig et al., 2010). L’infection de ces souris avec des sera de patients
infectés par le HCV induit une virémie durable, similaire à celle observée chez les sujets
atteints et une production de particules virales infectieuses (Lindenbach et al., 2006). Ce
modèle pourra s’avérer utile pour tester de nouveaux agents thérapeutiques (Kneteman et al.,
2006); (Meuleman et al., 2008); (Bissig et al., 2010) mais reste peu utilisé du fait contraintes
dues à sa mise en place. Récemment des souris humanisées avec un système immunitaire
intact et susceptibles à l’infection par le HCV ont été développées et représentent une avancée
majeure pour l’étude de l’entrée virale. Néanmoins le virus ne semble pas se répliquer chez
ces souris et doit donc être améliorer (Dorner et al., 2011); (Dolgin, 2011).
40
2. Les modèles in vitro
a) Les cultures primaires et les lignées immortalisées
Les premiers essais de mise au point d’un système cellulaire d’étude du HCV avaient pour
objectif de reproduire le plus fidèlement l’infection humaine. Le modèle proposé reposait sur
l’utilisation d’hépatocytes isolés de patients chroniquement infectés par le HCV (Ito et al.,
1996) qui, mis en culture étaient capables de répliquer le virus et de produire des particules
infectieuses. Les cultures primaires de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC)
ont aussi été utilisées mais la réplication virale y est faible (Cribier et al., 1995). Cependant
ces systèmes de culture primaire étant peu reproductibles, d’autres essais ont été proposés
dans des lignées cellulaires immortalisées susceptibles à l’infection telles que les lignées de
type hépatique (HepG2, Huh7, PH5CH) et les lignées de lymphocytes T et B (MOLT-4, MT-
2 et Daudi) (Bartenschlager & Lohmann, 2001). Néanmoins là encore, ces cellules ne
permettent pas une forte réplication du virus (Pietschmann et al., 2002).
b) Le modèle réplicon
Ce modèle est basé sur la sélection de cellules où la réplication virale est particulièrement
efficace. Il consiste en un ARN bicistronique, le réplicon, capable de se répliquer de façon
autonome in vitro (Lohmann, 1999). Il est constitué d’une part de la séquence codant un
marqueur de sélection (gène de résistance à la néomycine) placée sous le contrôle de l’IRES
du HCV (premier cistron), et d’autre part de la séquence codant les protéines du HCV,
dépendant de l’IRES du virus de l’encéphalomyocardite (EMCV) (deuxième cistron). Les
premiers modèles mis au point consistaient en des réplicons sous-génomique, portant la
séquence codant les protéines NS2 à NS5B puis NS3 à NS5B (unité minimale de réplication).
Ces réplicons se répliquent de manière efficace dans les cellules hépatocytaires Huh-7, sous
pression de sélection (Lohmann, 1999), les quantités d’ARN viraux produits étant bien
supérieures à celles obtenues avec les modèles précédemment décrits. Cette sélection a permis
l’isolation de sous populations cellulaires permettant une réplication optimale du VHC,
comme les clone Huh-7.5 et Huh-7.5.1 (Blight et al., 2002); (Zhong et al., 2005) (cf
paragraphe II) F. 2. e)). Ces clones se sont ensuite avérés très important lorsqu’ont été établis
les premiers modèles de propagation du HCV in vitro (cf paragraphe II) F. 2. e)). Les hauts
niveaux de réplication obtenus grâce à ces réplicons sous-génomiques ont permis des
avancées importantes quant à la compréhension de la réplication du HCV et l’étude des
41
mécanismes d’action de molécules antivirales. Dans un deuxième temps, des réplicons
génomiques portant la séquence codant pour l’ensemble du génome viral ont été mis au point,
mais ceux-ci n’ont pas permis d’obtenir une production de virus, probablement du fait de la
survenue de mutations adaptatives entrainant un déficit dans l’assemblage viral.
c) Le modèle des virus-like particle (VLP et système SFV)
En l’absence d’un système reproduisant le cycle complet du HCV, des systèmes d’étude des
étapes précoces du cycle viral ont été créés. L’expression en cellules d’insectes d’un
baculovirus portant les séquences des protéines structurales du HCV a permis la production de
pseudo particules virales (VLP) capables de s’auto-assembler mais non sécrétées hors de la
cellule (Baumert et al., 1998). L’utilisation de ce modèle pour étudier l’entrée virale n’est
donc pas idéale. Un autre système d’études a ainsi été mis en place : il s’agit d’un vecteur
dérivant du virus de la forêt de Semliki (SFV) qui permet l’expression des protéines
structurales du HCV (Figure 12A) au sein de lignées cellulaires issues de rein de hamster
(BHK-21). Ce modèle s’est avéré intéressant pour l’étude de la morphogenèse du HCV et la
stéatose viro-induite. Il est en effet possible d’observer au niveau du RE, la formation de GL
liées à l’expression de la protéine de capside du HCV. De plus l’analyse en microscopie
électronique de cellules exprimant cette construction a mis en évidence le bourgeonnement de
pseudo-particules virales d’environ 50nm de diamètre au niveau des membranes du RE
(Figure 12B) (Blanchard et al., 2002), bourgeonnement qui était rendu possible grâce au
clivage par la SPP de la protéine de capside (Ait-Goughoulte et al., 2006). Le
bourgeonnement reste néanmoins incomplet et là encore ne permet pas la production de
particules infectieuses.
42
Figure 12 : Modèle chimère SFV-HCV. A : représentation des génomes des virus SFV et HCV et du modèle chimère SFV-HCV codant les protéines structurales du HCV sous le contrôle du promoteur du virus SFV. B : les flèches indiquent le bourgeonnement de pseudo particules virales dans la lumière du RE de cellules de rein de hamster (BHK-21) exprimant les protéines structurales du HCV en modèle SFV, observées au MET (barre = 100nm) (Blanchard et al., 2002).
d) Le modèle des pseudoparticules virales (HCVpp)
Parallèlement aux VLP, un modèle d’infection simple et reproductible a été développé à partir
de vecteurs rétroviraux. Il consiste en la production dans les cellules embryonnaires humaines
HEK-293T de particules rétrovirales pseudotypées avec les protéines d’enveloppe du HCV
(HCVpp). Ce système repose sur la capacité qu’ont les rétrovirus à incorporer des
glycoprotéines d’enveloppe d’un autre virus (Briggs et al., 2003). Trois vecteurs d’expression
sont utiles à cette production : (i) un vecteur codant les protéines d’enveloppe E1 et E2 du
HCV, (ii) un vecteur codant pour les protéines gag et pol du virus de la leucémie murine
(MLV) ou du VIH, et (iii) un vecteur portant un gène rapporteur (luciférase ou GFP) et des
séquences rétrovirales nécessaires à la production des HCVpp. Les particules rétrovirales
produites portent à leur surface les protéines d’enveloppe E1 et E2 et servent ensuite à infecter
des cellules. L’infectiosité des HCVpp est alors évaluée par la mesure de l’expression du gène
rapporteur. Ce modèle a contribué aux avancées majeures faites sur la compréhension des
mécanismes des étapes précoces de l’entrée virale (Bartosch et al., 2003). Cependant ce
modèle ne permet d’étudier que l’entrée virale mais pas la réplication et l’assemblage du
HCV (Sandrin et al., 2005). Néanmoins il a longtemps été utilisé du fait de l’absence d’un
système de culture du virus complet.
B A
43
e) Le modèle en culture cellulaire (HCVcc)
Ce n’est qu’en 2005, à partir d’un clone cellulaire issu d’un patient japonais atteint d’une
hépatite fulminante (JFH1, génotype 2a), qu’un système de culture du virus complet a été
développé (Wakita et al., 2005). Ce modèle permet la production de particules virales
infectieuses in vitro et in vivo. (HCVcc) (Wakita et al., 2005); (Lindenbach et al., 2005);
(Lindenbach et al., 2006); (Zhong et al., 2005). Bien que ce clone puisse se répliquer dans des
lignées cellulaires autres qu’hépatiques, il semble dépendant de la lignée hépatocytaire Huh-7
et plus particulièrement de ses sous clones Huh-7.5 et Huh-7.5.1 (Lindenbach et al., 2005);
(Bartenschlager & Pietschmann, 2005). Des modèles utilisant des clones d’autres génotypes
ont été décrits, notamment avec des souches de génotype 1a, le plus étudié. Mais ces modèles
se sont révélés peu efficaces dans la production de particules infectieuses (Yi et al., 2006);
(Kato et al., 2007); (Bartenschlager, 2005); (Lindenbach et al., 2006), du fait d’un défaut de la
voie de sécrétion des VLDL dans les cellules Huh-7. Une alternative est la mise en place de
génotypes chimères où une partie du génome du clone JFH1 est remplacé par d’autres
génotypes (Pietschmann et al., 2006). De cette façon, des chimères possédant les séquences
codant de la protéine de capside au début de NS2 de la souche J6 (génotype 2a) ou de la
souche S52 (génotype 3a) fusionné aux séquences codant les protéines non structurales du
clone JFH1 ont été produits. Ces chimères se répliquent efficacement et permettent une
production plus importante de particules virales par rapport à la séquence sauvage JFH1
(Lindenbach et al., 2005); (Gottwein et al., 2007); (Yi et al., 2007).
f) Le modèle HCVpc
Récemment un système plus fidèle à l’infection in vivo a été décrit. Il s’agit d’un modèle en
culture primaire d’hépatocytes humains (Primary cultures of Human adult Hepatocytes PHH)
infectés par des particules HCVcc. Ce système présente l’avantage de produire des particules
virales de faible densité et hautement infectieuses ayant les mêmes propriétés que les
particules produites lors de l’infection naturelle in vivo (Podevin et al., 2010).
44
III) Virus de l’Hépatite C et métabolisme lipidique
Le HCV et le métabolisme lipidique sont étroitement liés et interconnectés. Si le HCV
détourne le métabolisme lipidique à son profit à plusieurs étapes de son cycle viral, il peut
aussi l’influencer et le modifier (Heaton & Randall, 2011).
A. Le métabolisme lipidique
Les lipides sont ingérés par l’organisme principalement sous la forme de triglycérides (TG)
dérivés d’acides gras. Les métabolismes de leur synthèse et de leur dégradation sont contrôlés
par le foie et le tissu adipeux.
1. Synthèse et dégradation lipidique
Les phénomènes décrits dans cette partie sont résumés schématiquement sur la Figure 13.
a) Lipogenèse : synthèse des acides gras
En parallèle de l’apport en lipides alimentaires, la synthèse de novo des lipides à partir du
glucose se déroule essentiellement dans le foie et le tissu adipeux principalement en période
post-prandiale lorsque la glycémie est élevée. La décomposition du glucose lors de la
glycolyse aboutit à la formation de pyruvate qui est capté par les mitochondries où il est
oxydé en acétyl-CoA. L’acétyl-CoA mitochondrial est ensuite pris en charge par un
transporteur puis par l’acétyl-CoA-carboxylase (ACC) qui libère du malonyl-CoA dans le
cytosol. Des composés à deux atomes de carbone sont alors successivement assemblés à
l’aide du complexe enzymatique de la Fatty Acid Synthase (FAS), conduisant à la formation
d’acides gras de 2 à 16 carbones (palmitate). L’élongation des acides gras et leur insaturation
peuvent se poursuivre dans le RE.
b) Synthèse des triglycérides (TG)
Les TG sont des lipides dits « de réserve d’énergie ». Leur synthèse a lieu au niveau du RE
de toutes les cellules de l’organisme et est très importante principalement dans les
entérocytes, les adipocytes et les hépatocytes. La synthèse des TG consiste en une
45
estérification de 3 acides gras avec une molécule de glycérol. Les acides gras sont tout
d’abord activés en acyl-CoA via l’acyl-CoA-synthétase (ACS) ; deux acyl-CoA vont alors
interagir avec le glycérol 3 phosphate issu de la glycolyse pour donner l’acide phosphatidique,
cette réaction étant catalysée par l’acyl transférase. L’acide phosphatidique est ensuite
transformé en diaglycérol (DG) qui va réagir avec un troisième acyl-CoA pour donner un TG.
Cette dernière étape fait intervenir une acyl-CoA diaglycérol transférase (DGAT). En fonction
des besoins énergétiques de la cellule, les TG ainsi formés sont soit stockés au sein de GL (cf
paragraphe III) A. 3.), soit participent à la synthèse des VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b)
(2)) ou sont hydrolysés en acides gras et dirigés vers la ß-oxydation (cf paragraphe III) A. 1.
c)).
c) Métabolisme des lipides
La lipolyse a lieu lorsque la glycémie s’abaisse et que l’organisme est en forte demande
énergétique. Les lipides sont alors dégradés pour fournir de l’énergie. Dans le tissu adipeux,
elle permet l’hydrolyse des TG stockés. Celle-ci est catalysée par l’enzyme HSL (Hormone-
Sensitive Lipase), inhibée par l’insuline dans les conditions physiologiques normales, elle
entraîne une libération d’acides gras libres qui peuvent être utilisés et métabolisés au niveau
hépatique. Les acides gras destinés à être dégradés par la cellule hépatique sont alors
préalablement activés en acyl-CoA par les ACS situées dans la membrane mitochondriale
puis transportés dans la mitochondrie par un composé de la carnitinepalmitoyltransferase I
(CPT I), de la carnitine-acylcarnitine translocase (CAT) et de la carnitine palmitoyltransferase
II (CPT II). La ß-oxydation consiste en un ensemble de cycles réactionnels qui raccourcissent
l’acyl-CoA de deux carbones et libère un acétyl-CoA. Pour les acides gras à très longue
chaine, la ß-oxydation a lieu dans les peroxysomes, cette voie permettant de raccourcir les
acyl-CoA à très longue chaîne, à l’aide d’un complexe enzymatique faisant intervenir
notamment l’acyl-CoA-oxydase (AOX). Ceci permet d’obtenir des acyl-CoA à longue chaîne
qui peuvent ensuite entrer dans la mitochondrie via le système CPT afin de subir une ß-
oxydation complète. En période post-prandiale, la lipolyse est régulée négativement par le
malonyl-CoA, qui, produit lors de la lipogenèse, va inhiber l’activité de la CPT-I.
Il existe une autre voie d’élimination des acides gras au niveau hépatique: elle consiste en leur
estérification en TG et leur sécrétion sous forme de VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)).
46
d) Régulateurs transcriptionnels de la lipogenèse et la lipolyse
Le contrôle de la synthèse et de la dégradation des acides gras est assuré par différents types
de régulateurs transcriptionnels, dont l’activation va dépendre de l’état nutritionnel et
hormonal de l’organisme.
(1) Les protéines de la famille des PPAR
Les PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) sont des facteurs de transcription
dont il existe trois types: PPARα ; PPARδ et PPARγ qui sont exprimés dans le tissu adipeux,
le foie, les muscles et les reins. Dans le foie, PPARγ contrôle l’expression des gènes
impliqués dans la lipogenèse tels que ceux codant pour la FAS et ACC. Son activation par
l’insuline et le glucose favorise ainsi l’accumulation des TG. Les acides gras
intrahépatocytaires peuvent en retour induire l’expression de PPARα qui va stimuler
l’expression des gènes impliqués dans les ß-oxydation peroxysomale et mitochondriale
(Schoonjans et al., 1996); (Dreyer et al., 1992) en activant l’expression des gènes codant
l’ACS responsable de l’activation des acides gras, de l’AOX (peroxysome) et de la CPTI
(mitochondrie) (Brady et al., 1989) responsable de l’entrée des acides gras dans la
mitochondrie.
(2) Le facteur SREBP-1c
Le facteur SREBP-1c appartient à la famille des SREBP (Sterol Regulatory Element Binding
Protein), impliqués dans la régulation des gènes du métabolisme du cholestérol et de la
lipogenèse. L’isoforme SREBP-1c est principalement exprimé dans le foie et le tissu adipeux.
Il est synthétisé sous la forme d’un précurseur lié à la membrane du RE, son activation est
dépendante de l’état nutritionnel. Ainsi, lors d’un apport nutritionnel important, le précurseur
est clivé et la forme mature est transloquée dans le noyau. SREBP-1c va ensuite se lier sur des
éléments de réponse nucléaires spécifiques et induire l’expression d’enzymes telles que
l’ACC et la FAS (Shimano, 2009).
(3) Le facteur ChREBP
ChREBP est un facteur de transcription exprimé essentiellement par le tissu hépatique et le
tissu adipeux qui agit en synergie avec SREBP-1c. Son activation et la translocation nucléaire
qui en découle dépendent du glucose. Il intervient de la même façon que SREBP-1c dans la
47
transcription de gènes impliqués dans la lipogenèse, tels que les gènes codant l’ACC et FAS
(Iizuka et al., 2004); (Iizuka & Horikawa, 2008).
(4) Le récepteur LXR
Le récepteur nucléaire LXR existe sous deux isoformes LXRα, retrouvé dans le foie et le tissu
adipeux, et LXRß, exprimé de façon ubiquitaire. LXR forme un hétérodimère avec RXRα et
est impliqué principalement dans l’homéostasie du cholestérol et de façon plus générale dans
l’homéostasie des acides gras. Le récepteur régule ainsi la transcription des gènes impliqués
dans la lipogenèse, tels que les gènes codant l’ACC et FAS (Joseph et al., 2002) mais aussi
contrôle la transcription des gènes codant SREBP-1c et ChREBP (Liang et al., 2002); (Chen
et al., 2004); (Cha & Repa, 2007).
Figure 13 : Schéma récapitulatif de la synthèse et la dégradation des lipides ainsi que de leur régulation. Les différentes voies représentées sont détaillées dans la partie III) A. 1. de ce manuscrit.
48
2. Le transport des lipides
L’homéostasie des cellules de l’organisme dépend en partie des lipides qu’elles captent dans
le sang. Le transport de ces substances hydrophobes nécessite la formation de particules
présentant des surfaces hydrophiles : les lipoprotéines.
a) Structure et classification
Les lipoprotéines sont des édifices formés d’un cœur lipidique hydrophobe composé de TG et
d’esters de cholestérol, entouré d’une monocouche de phospholipides, de cholestérol libre et
de protéines amphiphiles, les apolipoprotéines qui assurent la liaison entre le cœur
hydrophobe et le milieu sanguin hydrophile (Figure 14). Une classification basée sur les
densités de flottaison de ces particules et donc sur leur contenu en lipides et en apoliprotéines
a permis de définir cinq groupes de lipoprotéines : les chylomicrons, particules composées de
90% de TG, qui ont la densité la plus faible ; les lipoprotéines de très faible densité (VLDL) ;
les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL) ; les lipoprotéines de faible densité (LDL) et
les lipoprotéines de haute densité (HDL) (Tableau 1). Les apolipoprotéines présentes à leur
surface reconnaissent spécifiquement certains récepteurs dans les tissus et assurent aussi la
mobilisation rapide des lipides les composant, en agissant comme des co-facteurs de l’enzyme
responsable du métabolisme des lipides : la lipoprotéine lipase (LPL).
Figure 14 : Schéma d’une lipoprotéine. Elle est formée d’un cœur lipidique composé de TG et d’esters de cholestérol, entouré d’une monocouche de phospholipides, de cholestérol libre et d’apolipoprotéines. (http://homepage.smc.edu/wissmann_paul /anatomy2 textbook /1choles terol.html)
49
Lipoprotéine Densité (g/ml) Diamètre (nm) % protéines % CL % PL % TG Apolipoprotéines
chylomicron 0,93 75-1200 <2 8 7 84 A, B48, C, E
VLDL 0,93-1,006 30-80 10 22 18 50 B100, C, E
IDL 1,006-1,019 27-35 18 29 22 31 B100, C, E
LDL 1,019-1,063 18-27 25 50 21 8 B100
HDL 1,063-1,210 7-12 33 30 29 4 A, C, E
Tableau 1 : Classification des lipoprotéines. Les différentes lipoprotéines sont décrites sur des critères de densité, taille et selon leur composition en lipides et en apolipoprotéines. CL : Cholestérol Libre ; PL : Phospholipides ; TG : Triglycérides.
b) Le métabolisme des lipoprotéines
La formation des lipoprotéines est un processus métabolique dynamique où les lipoprotéines
échangent constamment apolipoprotéines de surface et lipides. Trois voies principales sont
distinguées: la voie exogène, la voie endogène et la voie inverse. (Figure 16)
(1) La voie exogène
Cette voie assure le transport des lipides issus de l’alimentation depuis l’intestin vers le foie,
où ils vont être traités. Elle débute par l’hydrolyse au sein des entérocytes de l’intestin, des
lipides alimentaires qui vont générer des acides gras et du glycérol. Les TG synthétisés à
partir de ces acides gras et du glycérol vont servir à la formation de chylomicrons par
association avec du cholestérol et les apolipoprotéines présentes (ApoB48 et ApoA). Les
chylomicrons sont sécrétés par le pôle basolatéral des entérocytes puis empruntent la voie
lymphatique pour rejoindre la circulation sanguine. Les chylomicrons y échangent alors des
lipides avec d’autres lipoprotéines et s’enrichissent en ApoE et ApoC. La lipolyse des
chylomicrons matures par la LPL fixée à la surface des cellules endothéliales des vaisseaux
sanguins et activée par l’ApoC, entraîne une perte de certaines apoliprotéines de surface, un
appauvrissement en TG et un enrichissement relatif en cholestérol. Des particules résiduelles
de chylomicrons « les chylomicrons rémanants » sont alors générés. Les chylomicrons
rémanants sont ensuite pris en charge par le foie via le récepteur des LDL (LDLR) ou le
récepteur LRP (LDL receptor Related Protein) qui reconnaissent l’ApoE présent à leur
surface, puis métabolisés.
50
(2) La voie endogène : synthèse des VLDL
Cette voie garantit l’apport permanent en TG et cholestérol aux tissus périphériques. Le foie
rassemble les lipides synthétisés ou recyclés, pour former après liaison avec certaines
apolipoprotéines (ApoB100, ApoC), les VLDL. L’assemblage des VLDL se déroule dans le
RE rugueux : au cours de la traduction de l’ApoB100, une partie est transloquée dans le RE
grâce à une protéine présente dans la lumière du RE : la protéine de transfert microsomiale
(MTP). La MTP est une protéine hétérodimèrique formée de deux sous unités, une de 97 kDa
(MTP) et l’autre de 58 kDa (PDI). Elle est aussi responsable du transfert des lipides présents
dans la membrane du RE vers l’ApoB100, empêchant ainsi la dégradation de l’ApoB100
naissante par les voies du protéasome. Une lipoprotéine intermédiaire, la préVLDL, contenant
des TG est ainsi générée, et celle-ci va alors migrer vers un compartiment plus distal de la
voie d’assemblage puis fusionner avec une GL, formée dans le RE lisse, pour donner une
VLDL mature (Shelness & Sellers, 2001) (Figure 15). L’ApoE serait peut être impliquée
dans cette dernière étape, mais les données sont cependant controversées (Mensenkamp et al.,
2001); (Gusarova et al., 2007). Les VLDL sont ensuite secrétées dans la circulation sanguine
où ils sont hydrolysées par la LPL. Les acides gras ainsi libérés sont captés par les tissus
périphériques et seront utilisés comme source d’énergie ou mis en réserve sous la forme de
TG. Des résidus de VLDL, les IDL, sont aussi générés. Ce sont des particules appauvries en
TG et enrichies de façon relative en cholestérol qui vont être captées par le foie via leur
ApoB100 par interaction avec le récepteur aux LDL. Puis en échangeant des lipides et des
apolipoprotéines avec d’autres lipoprotéines, elles sont métabolisées en LDL. Celles-ci sont
prises en charge par le récepteur au LDL présent abondamment au niveau du foie mais aussi
sur la plupart des tissus périphériques, assurant ainsi une source en cholestérol pour les
besoins cellulaires.
51
Figure 15 : Représentation schématique de l’assemblage des VLDL (Shelness & Sellers, 2001). La MTP transfère des lipides présents dans la membrane du RE rugueux vers l’ApoB100 naissante (1, 2). Une lipoprotéine intermédiaire est générée, la préVLDL (3), et va migrer vers un compartiment plus distal de la voie d’assemblage puis fusionner avec une GL formée dans le RE lisse, pour donner une VLDL mature (4, 5 et 6).
(3) La voie inverse : la voie de retour du cholestérol
Elle permet d’éliminer par retour vers le foie, le cholestérol excédentaire présent dans les
tissus périphériques. Les lipoprotéines qui s’en chargent sont les HDL. Ainsi elles vont capter
le cholestérol libre associé aux phospholipides dans les membranes cellulaires grâce au
transporteur ABCA1 (ATP Binding Cassette transporter A1). Les particules HDL natives
(préßHDL) sont des molécules de petite taille et de forme discoïdale. Elles sont synthétisées
principalement par l’intestin, le foie ou pourraient proviennent de la lipolyse des lipoprotéines
riches en TG (chylomicrons et VLDL). La maturation des préßHDL est dépendante de la
lécithine-cholestérol-acyltransférase (LCAT). Présente au sein de ces particules, elle va
assurer un apport en cholestérol estérifié au sein de la particule native. La taille des préßHDL
augmente au fur et à mesure qu’elles s’enrichissent en cholestérol estérifié et en
apolipoprotéines, par échange avec les chylomicrons et les VLDL, évoluant ainsi en particules
HDL3 et HDL2 qui adoptent alors une forme sphérique. La protéine de transfert du
cholestérol estérifié (CETP) peut aussi agir en relais, en échangeant les esters de cholestérol
des HDL contre les TG des VLDL, les LDL et les chylomicrons. Les HDL matures sont alors
captées directement par le foie par l’intermédiaire de leur ApoE ou par l’interaction de leur
ApoA avec le récepteur SR-BI. Le cholestérol est finalement éliminé par la bile ou dégradé en
acides biliaires.
52
Figure 16 : Schéma récapitulatif du métabolisme des lipoprotéines. Les différentes voies représentées sont détaillées dans la partie III) A. 2. de ce manuscrit. CM : chylomicron ; REM : chylomicron rémanant; AG : acides gras ; TG : triglycéride ; CL : cholestérol libre ; CE : cholestérol estérifié ; GLY : glycérol
3. Les gouttelettes lipidiques
La plupart des organismes eucaryotes ont mis en place un système de stockage des lipides
sous la forme de corps gras ou GL dans de nombreux types cellulaires et principalement les
adipocytes du tissu adipeux, mais aussi les cellules hépatiques, les cellules du muscle
squelettique ou les leucocytes.
a) Structure et composition des GL
Les GL adoptent une forme sphérique dont le diamètre varie de 25nm à 100µm. Elles sont
constituées d’un cœur de lipides neutres (triacylglycérol (TAG), diaglycérol (DAG) selon les
types cellulaires et des esters de cholestérol), entouré d’une monocouche de phospholipides
53
dans laquelle s’intègrent ou s’associent du cholestérol libre et des protéines spécifiques
(Murphy & Vance, 1999); (Tauchi-Sato, 2002). Ces protéines sont présentes à la surface et
parfois dans le cœur lipidique des GL (Robenek et al., 2011); elles participent à la formation,
au maintien et à la maturation des GL. (Figure 17)
Figure 17 : Structure schématique d’une gouttelette lipidique (25nm à 100µm) composée d’un cœur de lipides neutres et entourée par une monocouche de phospholipides dans laquelle s’insèrent du cholestérol libre et des protéines (D’après (Fujimoto et al., 2008)).
Les protéines de la famille PAT (Perilipine, ADRP, TIP-47) récemment renommées PLIN
dans les cellules mammifères (Kimmel et al., 2010) sont les protéines majoritairement
retrouvées en surface des GL (Londos et al., 1999); (Miura, 2002). Elles sont
interchangeables à la surface des GL et la présence de chacune d’elle dépend du type
cellulaire et des besoins de la cellule (Bickel et al., 2009). L’ADRP et la perilipine sont
constitutivement présentes à la surface des GL (CPAT : Constitutively TAG-associated PAT
proteins) et réguleraient constamment les réserves de TG en fonction des demandes
énergétiques (Wolins et al., 2006). La perilipine est la protéine majoritaire des GL retrouvées
dans les adipocytes (Greenberg et al., 1991); (Blanchette-Mackie et al., 1995); (Blanchette-
Mackie et al., 1995); (Brown, 2001). Elle participerait au maintien des GL, leur évitant leur
dégradation par les lipases cytosoliques. L’ADRP est exprimée de façon ubiquitaire (Murphy
& Vance, 1999) et serait impliquée dans la formation et la stabilisation des GL ainsi que dans
l’accumulation des TG (Imamura et al., 2002). Elle est présente en grande quantité à la
surface des GL dans les cellules qui n’expriment pas la perilipine (Fujimoto et al., 2004). Elle
joue un rôle dans le maintien du contenu en lipides des GL lors de la lipolyse et dans le
transfert des lipides entre les membranes du RE et les GL. D’autres protéines de la famille
PAT/PLIN sont présentes à la surface des GL de façon réversible (EPAT : Exchangeable
TAG-associated PAT proteins) lorsqu’un stockage rapide des TG est nécessaire (Wolins et
al., 2006): ainsi, la protéine TIP47, exprimée de façon ubiquitaire et la protéine S3-12
25nm à 100µm25nm à 100µm
54
présente principalement dans le tissu adipeux s’accumulent à la surface des GL en réponse à
un stimulus lipogénique ou lipolytique (Wolins et al., 2001); (Wolins et al., 2003);
(Brasaemle, 2004). La protéine OXPAT, exprimée notamment dans le tissu adipeux et le foie
(Wolins et al., 2006), participe quant à elle au maintien du contenu des GL (Dalen et al.,
2007).
Une autre protéine, la séipine, qui se trouve à la jonction entre le RE et les GL, participe au
maintien de la structure et de la taille des GL (Szymanski et al., 2007). De plus des protéines
dérivant du RE comme la calnexine et la protéine BiP (Ploegh, 2007), des protéines
impliquées dans la lipogenèse (Fujimoto et al., 2004) et dans la signalisation cellulaire (Ozeki
et al., 2005) ont aussi été trouvées à la surface des GL. Enfin, les cavéolines (Brown, 2001),
qui dans des conditions physiologiques normales sont plutôt retrouvées à la membrane
plasmique, seraient redirigées à la surface des GL pour favoriser la mise en réserve des lipides
quand leur concentration extracellulaire ou celle du cholestérol deviennent trop importantes.
Les cavéolines ressemblent aux oléosines identifiées chez les plantes (cf paragraphe II) C. 2.
a) (1)). Elles s’associent aux GL via un domaine spécifique. Dans les adipocytes, elles
seraient impliquées dans le maintien de la structure des GL lors de leur croissance en régulant
l’apport de cholestérol libre et de phospholipides au sein de la couche de phospholipides (Le
Lay et al., 2006); (Blouin et al., 2010). Les cavéolines sont aussi retrouvées dans le cœur
lipidique des GL (Robenek et al., 2004), néanmoins leur rôle reste mal connu.
b) Fonction des GL
Tout d’abord identifiées pour leur rôle dans le stockage des lipides, les GL constituent une
réserve d’énergie rapidement mobilisable par l’organisme. Néanmoins il est maintenant admis
que les GL sont des organites extrêmement dynamiques qui pourraient participer, d’après les
données protéomiques, à de nombreuses autres fonctions cellulaires telles que le trafic des
vésicules intracellulaires, (Liu, 2003) et la signalisation cellulaire (Umlauf, 2004); (Ozeki et
al., 2005); (Bartz et al., 2007). Plusieurs protéines de la famille Rab pourraient ainsi interagir
avec les GL. Lorsque la lipolyse est stimulée, la protéine Rab18 est adressée à la surface des
GL ce qui favorise le rapprochement des GL avec les membranes du RE et ainsi le transfert
des lipides (Ozeki et al., 2005). La protéine Rab5 serait quant à elle impliquée dans
l’interaction entre les GL et les endosomes (Liu et al., 2007). Les GL semblent aussi être le
point de convergence des mécanismes de dégradation par le protéasome et l’autophagie
(Fujimoto & Ohsaki, 2006).
55
c) Biogenèse et croissance
(1) Modèles de biogenèse
Le modèle couramment accepté est celui d’une synthèse de TG et d’une formation des GL
concomitantes dans les membranes du RE (Murphy & Vance, 1999). Les lipides en cours de
synthèse s’accumulent dans la membrane du RE puis, lorsque leur nombre dépasse la capacité
que peut retenir la double membrane du RE, les lipides commencent à s’insérer entre les deux
feuillets de la membrane formant un globule lipidique. Les techniques de microscopie
actuelles ne sont pas assez résolutives pour permettrent de voir cette suite d’évènements.
Néanmoins, dans des cellules pour lesquelles les mécanismes de dégradation de l’ApoB sont
inhibés, des GL arborant des ApoB à leur surface ont été observées (croissant ApoB) (Ohsaki
et al., 2008); (Ohsaki et al., 2009). L’apport de lipides au niveau de ces ApoB ce fait via
l’enzyme MTP présente dans les membranes du RE. Les ApoB lipidées non dégradées
s’accumulent alors sur le feuillet interne de la membrane du RE. L’existence de telles GL va
donc dans le sens d’une accumulation de lipides entre les feuillets de la membrane du RE. De
plus, des régions spécialisées du RE associées aux mitochondries (MAM : Membranes
Associées aux Mitochondries) qui concentrent les enzymes responsables de la synthèse des
lipides neutres (DGAT et Acyl-CoA cholestérol acyltransférase ACAT) ont été mises en
évidence (Murphy & Vance, 1999) et auraient une composition en phospholipides différente
du reste de la membrane du RE (Ohsaki et al., 2008). Ces enzymes étant impliquées dans la
synthèse des esters de cholestérol, il a été suggéré que les esters de cholestérol nouvellement
formés pourraient jaillir de ces régions en s’entourant d’une enveloppe de phospholipides
formant ainsi des GL (Chang et al., 2001).
Puis lorsqu’à son tour le globule lipidique contenu entre les feuillets de la membrane du RE
atteint une taille critique (Figure 17):
i) soit il bourgeonnerait de la membrane du RE en emportant avec lui une partie du
feuillet externe, donnant ainsi naissance à une GL indépendante (Ploegh, 2007); (Fujimoto et
al., 2008) (Figure 18 A à E) ; cependant, il est possible que la GL reste physiquement
attachée à la membrane du RE (Goodman, 2008) (Figure 18 E). Un paragraphe sur la relation
étroite qui lie la membrane du RE et les GL est développé dans la suite de ce manuscrit (cf
paragraphe III) A. 3. c) (2)).
56
ii) soit il pourrait se former à partir des deux feuillets de la membrane du RE en
emportant avec lui une partie de la double membrane créant ainsi un transitoirement un pore
au niveau de la membrane (Ploegh, 2007) (Figure 18 F et G). Cette hypothèse permettrait de
comprendre comment la cavéoline, initialement retrouvée au niveau du feuillet interne de la
membrane du RE, pourrait se retrouver dans le cœur des GL (Robenek et al., 2004).
Cependant, le mécanisme d’un tel transfert reste mal compris. D’autre part l’existence d’un tel
dispositif permettrait d’expliquer le fait que des protéines transmembranaires dérivées du RE
telles que la calnexine et BiP se retrouvent à la surface des GL (Ploegh, 2007).
Les protéines de la famille PAT participeraient à la déformation du feuillet externe de la
membrane du RE lorsque la GL bourgeonnerait (Wolins et al., 2006). Ces protéines sont aussi
retrouvées sur la membrane plasmique, ainsi en cas d’apport trop important de lipides dans la
cellule, et lorsque tous les sites pouvant jouer un rôle dans la biogenèse et/ou la croissance des
GL au niveau des membranes du RE seraient saturés. Dans ce cas, la synthèse des GL pourrait
avoir lieu au niveau de la membrane plasmique (Robenek et al., 2009); (Robenek et al.,
2011).
Dans les leucocytes, des GL contenant en leur cœur des ribosomes et d’autres protéines en
plus des lipides ont été identifiées. Ces GL résulteraient d’une compilation des membranes du
RE et d’autres membranes cellulaires, dans lesquelles les lipides se seraient déposés ou
auraient été directement synthétisés (Wan et al., 2007).
57
Figure 18 : Modèle de biogenèse des gouttelettes lipidiques. Schématiquement le feuillet externe de la membrane du RE est représenté en bleu, le feuillet interne, en vert. Les protéines de surface (en rouge et marron) et une protéine transmembranaire (violet) sont aussi figurées. Les lipides s’accumulent entre les feuillets de la membrane du RE formant un globule lipidique (A et B). Lorsqu’il atteint une taille critique : soit le globule bourgeonne de la membrane du RE en emportant avec lui une partie du feuillet externe, donnant ainsi naissance à une GL (C et D) ou ne se détache pas complètement de la membrane du RE (E). Soit il éclot à partir des deux feuillets de la membrane du RE en emportant avec lui une partie de la double membrane créant ainsi un transitoirement un pore au niveau de la membrane et emportant avec lui les protéines associées (F et G).
(2) GL et membranes du RE : une relation étroite ?
Les données actuelles ne nous permettent pas de savoir si les GL sont des organites cellulaires
totalement détachés des membranes du RE ou si elles sont en contact permanent avec le RE. Il
est également possible que ces deux types de GL co-existent. Plusieurs hypothèses ont été
formulées sur les mécanismes par lesquels elles régulent leur contenu en lipides et accroissent
leur taille. Des arguments sont en faveur de l’hypothèse d’une association constante des GL et
58
des membranes du RE (Figure 19): i) le feuillet externe de la membrane du RE serait en
continuité avec la surface des GL (Blanchette-Mackie et al., 1995). De plus, les membranes
du RE et les GL semblent bouger de façon coordonnée (Targett-Adams, 2003) (Figure 19 A);
ii) un autre modèle expliquant la biogenèse et/ou la croissance des GL serait l’apposition des
GL avec des membranes dérivées du RE riches en adipophiline, formant une sorte de
coquetier (le RE) portant un œuf (la GL) qui permettrait un échange constant des lipides et de
l’ADRP (Robenek et al., 2006); (Robenek et al., 2011), mais sans fusion des membranes
(Figure 19 B et C). Lors d’une stimulation entraînant une accumulation de GL, les protéines
de la famille PAT pourraient se réorganiser et s’agréger dans des zones de la membrane
plasmique juxtaposées aux GL Un tel mécanisme pourrait avoir lieu au niveau de la
membrane du RE contribuant ainsi à un transfert constant des lipides du RE aux GL
(Robenek, 2005); (Goodman, 2008); iii) la synthèse des TG pourrait avoir lieu dans ces zones
du RE proches de la surface des GL, ce qui expliquerait comment des GL existantes
pourraient augmenter leur taille via l’apport de TG (Kuerschner et al., 2008). Ceci serait
régulé par la présence des enzymes DGAT1 (aux membranes du RE) et DGAT2 (au niveau
des GL ou d’une partie de la membrane du RE associée aux GL) (Yen et al., 2008). Chez la
levure, il a aussi été mis en évidence que le transport des protéines de la membrane du RE aux
GL et inversement intervient de façon rapide et que cela ne semble pas dépendre de la
température ni nécessiter de l’énergie, ce qui serait en accord avec une association constante
de la membrane du RE et des GL (Jacquier et al., 2011).
59
Figure 19 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes lipidiques, hypothèse d’une association constante (Robenek et al., 2006); (Zehmer et al., 2009) avec (A) ou sans (B et C) fusion des membranes. En A, la surface de la GL est en continuité avec le feuillet externe de la membrane du RE. En B la GL avec des membranes dérivées du RE riches en adipophiline, formant une sorte de coquetier (le RE) portant un œuf (la GL) en C. LDIMP pour Lipid Droplet Integral Membrane Proteins, réfère à des protéines intégrées dans la membrane du RE qui peuvent s’accumuler à la surface des GL.
D’autres arguments sont en faveur d’une dissociation des GL et de la membrane du RE
(Figure 20): i) dans des fractions enrichies en GL, purifiées à partir de cellules hépatiques,
des activités enzymatiques liée à la synthèse des TG telle que celle de l’ACS, ont été
identifiées (Fujimoto et al., 2004). En parallèle, des enzymes clés impliquées dans la synthèse
des phospholipides ont été identifiées à la surface des GL (Guo et al., 2008). Ceci pourrait
expliquer comment des GL lipidiques préexistantes pourraient augmenter leur surface ; ii) les
GL portent à leur surface des protéines de type SNARE impliquées dans les phénomènes de
fusion des GL entre elles (Boström et al., 2007); (Söllner, 2007) mais l’implication de ce
mécanisme dans la croissance des GL reste controversé (Thiele & Spandl, 2008); (Ohsaki et
al., 2009). Deux autres mécanismes ont été proposés pour expliquer la croissance des GL.
Dans un premier cas les GL établiraient des cycles de fusion/fission avec la membrane du RE
pour se fournir en lipides (Zehmer et al., 2009); (Fujimoto et al., 2008), dans un second cas
des vésicules de transport spécifiques des lipides pourraient fournir les lipides et des protéines
de la membrane du RE aux GL (Fujimoto et al., 2008); (Guo et al., 2008);(Beller et al.,
2008). Ces mécanismes impliqueraient cependant la mise en place d’un système d’hémifusion
A
B C
A
B C
60
entre une double membrane (RE ou transporteurs spécifiques) et une simple membrane (GL),
un tel modèle reste donc hypothétique (Murphy et al., 2009).
Figure 20 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes lipidiques, hypothèse d’une dissociation (Zehmer et al., 2009). Les GL établiraient des cycles de fusion/fission avec la membrane du RE pour se fournir en lipides.
(3) GL : des organites dynamiques
Les GL sont des organites très dynamiques qui semblent interagir étroitement avec le réseau
de microtubules qui jouerait alors un rôle dans le maintien de l’association des GL au RE
(Luckenbill & Cohen, 1966) et/ou dans l’établissement des cycles de fusion/fission avec les
membranes du RE (Fujimoto et al., 2008). Certaines GL semblent en effet capables de se
déplacer le long des microtubules via la protéine de transport dynéine (Targett-Adams, 2003);
(Boulant et al., 2008). De plus le rapprochement des GL via le réseau de microtubules
pourrait contribuer à la formation et/ou fusion des GL entre elles (Bostrom, 2005);
(Andersson et al., 2006), mais cette implication des microtubules reste néanmoins
controversée (Cheng et al., 2009). Enfin la dynéine pourrait être impliquée dans la biogenèse
des GL, les mécanismes restent cependant méconnus (Andersson et al., 2006).
Par ailleurs, des interactions entre les GL et les mitochondries, les peroxisomes, les
phagosomes, ainsi que les endosomes (cf paragraphe III) A. 3. b)) ont aussi été identifiées,
confirmant que les GL sont des organites non pas restreints au stockage des lipides mais aussi
impliqués dans de nombreux processus cellulaires.
d) GL et synthèse des VLDL
La présence accrue de TG dans le foie conduit soit à leur stockage sous forme de GL soit à
leur sécrétion sous forme de VLDL. Les VLDL sont formés préférentiellement à partir des
lipides contenus dans les GL cytoplasmiques plutôt que ceux du milieu extracellulaire ou ceux
nouvellement synthétisés par la cellule (Gibbons et al., 2000). Les GL seraient donc
61
mobilisées dans des régions du RE spécialisées dans la production des VLDL (Targett-
Adams, 2003) ce qui irait en faveur des mécanismes de fusion/fission des GL cytoplasmiques
avec les membranes du RE. Ainsi les enzymes DGAT2, ACAT2 et la phospholipase D sont
utilisées à la fois pour la synthèse des lipides contenus dans les GL et pour ceux des VLDL
(Buhman et al., 2000); (Ohsaki et al., 2008). L’enzyme MTP est aussi impliquée dans la
formation des GL à partir des membranes du RE (Olofsson et al., 1999). Néanmoins, les
mécanismes de transfert des lipides des GL vers les VLDL restent mal compris. Une
hypothèse serait que la mobilisation des GL aux membranes du RE fournirait des TG à la
MTP contribuant ainsi à la formation des VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)) (Figure 21).
Figure 21 : Formation des gouttelettes lipidiques et synthèse des VLDL. L’accumulation de lipides entre les feuillets de la membrane du RE va entraîner la formation de GL. Les lipides contenus dans GL peuvent aussi être recyclés à la membrane du RE et contribuer à la formation des VLDL (Ohsaki et al., 2008).
B. Syndrome métabolique associé au HCV
1. Données cliniques
Les expériences menées sur les sera de patients infectés par le HCV ou in vivo chez le
chimpanzé ont permis de mettre en évidence que les formes circulantes du HCV ayant la plus
forte infectivité spécifique, les LVP, sont des particules de faible densité qui résultent de
l’association des lipoprotéines de très faible densité (VLDL) portant à leur surface l’ApoB,
l’ApoE et l’ApoCI avec la nucléocapside virale (André et al., 2002); (Meunier et al., 2008).
Le HCV est capable d’interagir directement avec le métabolisme glucidique et lipidique.
L’infection chronique par le HCV est ainsi souvent associée à une insulino-résistance, un
diabète de type 2 et une stéatose hépatique. Dans le sérum des patients chroniquement infectés
on constate aussi une baisse du cholestérol circulant et des concentrations d’ApoB (Hofer et
al., 2002); (Poynard et al., 2003); (Siagris et al., 2006); (Serfaty et al., 2001); (Wu et al.,
62
2010) ainsi qu’une plus faible concentration en TG (Siagris et al., 2005); (Marzouk et al.,
2007); (Dai et al., 2008). Lors d’une infection par un génotype 3 du HCV, la stéatose est plus
sévère et les diminutions en cholestérol (Hofer et al., 2002); (Poynard et al., 2003); (Grassi et
al., 2005); (Siagris et al., 2006), TG (Poynard et al., 2003) et ApoB circulants (Serfaty et al.,
2001) semblent s’accentuer. Néanmoins la concentration en TG ne semblerait pas être un bon
indicateur du profil lipidique des patients infectés par le HCV, les données étant controversées
à ce sujet (Wu et al., 2010); (Ramcharran et al., 2011).
2. L’insulino-résistance et le diabète de type 2
a) Insulino-résistance métabolique
Dans des conditions physiologiques normales, en période post prandiale, l’insuline sécrétée
par le pancréas assure l’utilisation et la mise en réserve des substrats énergétique glucidiques
et lipidiques, par fixation à son récepteur spécifique notamment dans les cellules du foie et du
tissu adipeux. Le récepteur à l’insuline possède une activité catalytique Tyrosine Kinase, la
fixation de l’insuline à son récepteur entraîne l’autophosphorylation de celui-ci. Le récepteur
ainsi activé est à son tour responsable de la phosphorylation, au niveau de leurs résidus
Tyrosine, des protéines substrats du récepteur: les IRS (Insulin Receptor Substrate)
impliquées dans la voie de transduction du signal. L’insuline augmente ainsi l’entrée du
glucose dans les cellules et stimule sa conversion en acides gras en vue de le stocker (cf
paragraphe III) A. 1. a)). Parallèlement, elle inhibe la lipolyse des TG et ainsi la libération
d’acides gras libres dans la circulation sanguine (cf paragraphe III) A. 1. c)).
Une altération de la voie de signalisation de l’insuline est observée chez les personnes obèses
et/ou présentant une insulino-résistance pouvant amener au développement d’un diabète
insulino-résistant (diabète non insulino-dépendant ou diabète de type 2). L’état d’insulino-
résistance se traduit i) au sein du tissu adipeux par une augmentation de la lipolyse, l’insuline
n’étant plus capable d’inhiber la HSL (Lewis et al., 2002) (cf paragraphe III) A. 1. c)) ii) au
niveau périphérique par une hyperinsulémie et une hyperglycémie qui vont favoriser la
lipogenèse hépatique en stimulant l’activation du facteur de transcription SREBP-1c via
l’hyperinsulémie (Shimomura et al., 1999); (Stoeckman & Towle, 2002), du facteur ChREBP
via l’hyperglycémie (Yamashita et al., 2001) et en augmentant l’expression du facteur PPARγ
(hyperinsulémie et hyperglycémie) (Zhang et al., 2006) comme il a été montré dans plusieurs
63
modèles murins (cf paragraphe III) A. 1. d)). Ces paramètres vont ainsi contribuer de façon
concomitante à l’augmentation d’acides gras et de TG dans le foie (Figure 22).
Figure 22 : Schéma récapitulatif de l’impact du syndrome d’insulino-résistance sur le métabolisme lipidique. Les différentes voies représentées sont schématisées en rouge et détaillées dans la partie III) B. 2. a).
b) Insulino-résistance viro-induite
Le diabète de type 2 est une complication fréquente des maladies hépatiques néanmoins
plusieurs études cliniques ont établi un lien entre l’infection par la HCV et la perturbation du
métabolisme du glucose dans la survenue d’une résistance à l’insuline et d’un diabète de type
2 (Allison et al., 1994); (Hung et al., 2011). Ainsi, l’infection par le HCV est associée à un
risque plus élevé de développer une résistance à l’insuline (Yoneda et al., 2007). Cependant,
cet effet semble dépendre du génotype et pourrait être lié à la quantité d’ARN du HCV (Hui et
al., 2003); (Moucari et al., 2008). L’infection par le HCV est susceptible d’accroître la
survenue d’un diabète de type 2 dans une population présentant des facteurs de risque (IMC
élevé, âge) (Mehta et al., 2003) ou non (Wang et al., 2007). De plus, suite à une thérapie anti
64
virale efficace amenant à l’élimination du HCV, la sensibilité à l’insuline est restaurée, et
l’apparition de diabète de type 2 est moins fréquente (Kawaguchi et al., 2007); (Romero-
Gómez, 2006); (Romero-Gómez et al., 2008).
La protéine de capside du HCV pourrait être incriminée dans l’apparition d’une insulino-
résistance hépatique soit i) indirectement via la stimulation de la sécrétion de la cytokine pro-
inflammatoire TNFα qui va activer des Serine/Thréonine kinases qui vont phosphoryler les
IRS sur des résidus Serines et/ou Thréonine. Cette phosphorylation s’opposant à celle des
résidus Tyrosines par le récepteur à l’insuline, les IRS ne sont alors plus capables de se lier au
récepteur à l’insuline interférant ainsi avec la voie de signalisation de l’insuline (génotype 1 et
2) (Aytug et al., 2003); (Shintani et al., 2004); (Pazienza et al., 2007). De plus la protéine de
capside (génotype 3a) serait capable d’induire la formation de microARNs pouvant interférer
avec l’expression de la phosphatase and tensin homolog (PTEN) (PTEN a été identifié comme
un gène suppresseur de tumeur qui est souvent muté dans l’hépatocarninome). Cette
diminution de l’expression de la protéine PTEN pourrait en retour entraîner une baisse
d’expression des IRS (Clément et al., 2011) ii) directement en favorisant la dégradation par le
protéasome des IRS (génotype 1b) (Kawaguchi et al., 2004), (génotype 3) (Pazienza et al.,
2007); (Pazienza et al., 2010). Cependant, in vivo, chez l’homme, c’est la voie indirecte
entraînant des taux de TNFα élevés qui serait privilégiée. En effet, des concentrations
importantes de TNFα ont été constatées chez les patients atteints d’hépatite chronique C
(Larrea et al., 1996); (Valenti et al., 2005). Les protéines NS5A et NS5B (NS5B de génotype
1b) peuvent aussi, en augmentant la production de TNFα, participer au développement de
l’insulino-résistance (Choi et al., 2006). De plus d’autres protéines virales telles que NS3 et
NS5A (NS5A de génotype 1b) peuvent contribuer à l’apparition d’un syndrome d’insulino-
résistance via l’induction d’un stress oxydatif (Bureau, 2001); (Gong et al., 2001);(Christen et
al., 2007); (Bernsmeier et al., 2008); (Mitsuyoshi et al., 2008). En parallèle l’insulino-
résistance contribue à une baisse d’efficacité du traitement antiviral (Romero-Gómez et al.,
2005).
3. La stéatose hépatique
a) Histologie
La stéatose est une lésion histologique du foie caractérisée par l’accumulation de lipides (TG)
dans les hépatocytes, sous forme de GL. En fonction de la taille et de la morphologie des GL,
65
on distingue la stéatose macrovésiculaire (les GL fusionnent et forment une grosse vacuole
repoussant le noyau de l’hépatocyte en périphérie), ou la stéatose microvésiculaire (les GL ne
fusionnent pas et restent en périphérie du noyau hépatocytaire) qui sont liées à des altérations
différentes du métabolisme lipidique mais peuvent néanmoins coexister (Hwang & Lee,
2011). La stéatose peut être diffuse ou systématisée. L’examen histologique de la biopsie du
foie permet d’apprécier les lésions de la stéatose : aspect, densité, topographie. Le degré de
sévérité de la stéatose est évalué de façon semi-quantitative par un examen
anatomopathologique de la surface du lobule hépatique touché par la stéatose, permettant
ainsi d’évaluer le pourcentage d’hépatocytes atteints. Classiquement on distingue la stéatose
légère, modérée et sévère (Brunt et al., 1999). Cependant, aucune classification telle que
celles qui existent pour quantifier les lésions du foie de type fibrose (cf paragraphe I) D. 2.)
n’a été décrite à ce jour. La stéatose hépatique pourrait constituer un facteur de risque de
l’évolution de l’atteinte hépatique vers une fibrose et après plusieurs années pourrait conduire
au développement d’une cirrhose et d’un cancer du foie (cf. paragraphe III) B. 3) c) (3)).
(Figure 23)
Figure 23 : Caractères histopathologiques de la stéatose (observation dans des biopsies de foies humains). Stéatose macrovésiculaire (A), les GL fusionnent et forment une grosse vacuole repoussant le noyau de l’hépatocyte en périphérie ; stéatose microvésiculaire (B), les GL ne fusionnent pas et restent en périphérie du noyau hépatocytaire (Reddy & Rao, 2006).
b) Stéatose métabolique
La stéatose hépatique peut avoir diverses étiologies : la consommation d’alcool, une surcharge
pondérale, un diabète, ou d’autres dérèglements métaboliques (comme c’est le cas lors de
l’abetalipoprotéinémie (mutation du gène codant la MTP), de l’hypobetaloprotéinémie
familiale (mutation du gène codant l’ApoB), ou de la maladie d’Anderson (appelée aussi
maladie de rétention des chylomicrons) caractérisée par un défaut de sécrétion des VLDL; ou
66
en présence de lipodystrophies familiales pour lesquelles il existe un défaut de dépôt des TG
ou bien encore dans des maladies liées à un problème de stockage des lipides, du cholestérol
estérifié associées à une diminution de l’hydrolyse des TG hépatiques, ou lors ses troubles de
la β-oxidation des acides gras… (Hooper et al., 2011). Ces facteurs vont avoir pour
conséquence un déséquilibre de l’homéostasie lipidique hépatique et une présence accrue de
TG dans le foie. Les mécanismes de cette accumulation de TG sont souvent liés à une
insulino-résistance sous jacente, qui entraîne des bouleversements dans les mécanismes
d’assemblage et/ou de sécrétion des VLDL, et/ou de la ß-oxydation mitochondriale.
(1) Insulino-résistance : cause ou conséquence ?
La contribution du syndrome d’insulino-résistance dans le développement d’une stéatose
métabolique a été décrite dans plusieurs modèles murins. Un des facteurs impliqués dans
l’accumulation de TG dans le foie est SREBP-1c, fortement activé en cas d’hyperinsulémie
qui conduit à une augmentation de la lipogenèse (cf paragraphe III) A. 1. d)). Une
augmentation de la concentration en TG entraînant l’apparition d’une stéatose a ainsi été
observée dans le foie souris surexprimant la forme active de SREBP-1c (Shimano et al.,
1997); (Bécard et al., 2001) ou chez des souris obèses (ob/ob) présentant des concentrations
similaires en SREBP-1c (Shimomura et al., 1999). Chez ces souris ob/ob, l’expression du
facteur ChREBP est aussi augmentée et pourrait potentialiser l’effet de SREBP-1c dans
l’apparition d’une stéatose sévère (Dentin et al., 2006). Enfin, le facteur PPARγ, activé en
réaction à l’insulino-résistance, pourrait de la même façon contribuer au développement d’une
stéatose : en effet, chez les souris ob/ob, l’expression de PPARγ est augmentée, l’inactivation
chez ces souris du gène codant pour PPARγ, entraîne la diminution de l’accumulation de TG
au niveau du foie (Matsusue et al., 2003). Cependant de façon surprenante, il a été montré que
l’expression du facteur SREBP-1 n’est pas modifiée dans le foie de patients atteints de
cirrhose ou présentant un hépatocarcinome (Wu et al., 2010).
Cependant, l’accumulation excessive de TG dans le foie est à l’origine de l’apparition d’une
insulino-résistance hépatique. Les mécanismes sous jacents impliquent un défaut de la voie de
signalisation de l’insuline soit i) via l’activation de l’isoforme spécifique de la Protéine
Kinase C (PKCε) qui va se lier au récepteur à l’insuline et inhiber son activité kinase (Samuel
et al., 2007), soit ii) via l’activation de voies entraînant des phosphorylations des résidus
Serine et/ou Thréonine au détriment des résidus Tyrosine au niveau des IRS, comme c’est le
67
cas lors encore lors d’un stress du RE (Ozcan et al., 2004). In vivo dans des foies de patients
présentant de la stéatose, la protéine perilipine s’accumule à la surface des GL (alors que dans
les hépatocytes on retrouve plutôt ADRP et TIP47) (Straub et al., 2008). Elle pourrait ainsi
jouer un rôle protecteur contre la lipolyse et favoriserait l’insulino-résistance.
(2) Assemblage et sécrétion des VLDL
Une concentration importante de TG dans le foie, comme c’est le cas lors d’une insulino-
résistance, ne conduit pas forcément à leur accumulation et au développement d’une stéatose.
En effet pour compenser cette augmentation, les TG en excès peuvent être excrétés hors de la
cellule sous la forme de VLDL. D’une part, l’augmentation de TG disponibles favorise la
lipidation par la MTP de l’ApoB100 qui n’est alors plus dégradée contribuant de ce fait à une
synthèse accrue de VLDL. D’autre part, l’hyperinsulémie consécutive à l’insulino-résistance
entraîne une augmentation de la synthèse d’ApoB100 et une diminution de sa dégradation
(Blasiole et al., 2007). Néanmoins l’activation de la voie de sécrétion des VLDL ne serait pas
suffisante pour compenser à elle seule l’apport important de TG, les TG auraient tendance à
s’accumuler plutôt qu’à être excrétés contribuant ainsi au développement d’une stéatose. De
plus, une baisse de l’assemblage et de la sécrétion des VLDL pourrait aussi contribuer à
l’accumulation de TG au sein du foie. Ainsi chez des personnes atteintes de stéato-hépatite,
(atteinte plus sévère que la simple stéatose, elle correspond à une stéatose associée à une
inflammation et des lésions hépatiques), il a été mis en évidence qu’une diminution de la
quantité d’ApoB100 nécessaire à la synthèse des VLDL pouvait intervenir dans l’apparition
d’une stéatose et dans le développement d’une stéato-hépatite (Charlton et al., 2002). De
même, une stéatose survient chez des personnes atteintes d’hypobetaliprotéinémie (déficit en
ApoB) (Serfaty et al., 2001).
(3) ß-oxydation mitochondriale
Chez les personnes atteintes de stéato-hépatite ainsi que dans le modèle de souris obèses
(ob/ob), non seulement la lipogenèse mais aussi la ß-oxydation mitochondriale sont
augmentées (Sanyal et al., 2001); (Brady et al., 1985), alors qu’une diminution serait
logiquement attendue du fait d’une concentration intracellulaire élevée de malonyl-CoA (cf
paragraphe III) A. 1. c)). Les mécanismes reliant l’augmentation de la lipogenèse et celle de
la ß-oxydation mitochondriale sont mal compris mais pourraient faire intervenir le facteur
PPARα. Effectivement, l’afflux d’acides gras intrahépatocytaires lors d’une lipogenèse
accrue, ou chez les souris obèses (ob/ob) entraîne une augmentation de l’activation de PPARα
68
(Memon et al., 2000). Cette augmentation d’expression de PPARα pourrait expliquer la
synthèse plus importante de la CPT-I (cf paragraphe III) A. 1. c) et d) (1)) (Brady et al.,
1985); (Brady et al., 1989) observée chez ces souris qui contribuerait alors à l’augmentation
de la ß-oxydation mitochondriale. L’intérêt de la mise en place d’un tel mécanisme reste là
encore assez flou. D’un côté l’activation la lipolyse via l’augmentation de la ß-oxydation
mitochondriale pourrait lutter contre l’accumulation de TG dans le foie. D’un autre côté,
l’augmentation de la ß-oxydation mitochondriale, en favorisant la production d’espèces super-
réactives de l’oxygène (ROS pour Reactive Oxygen Species), serait impliquée dans
l’induction d’un stress oxydatif conduisant au développement d’une stéato-hépatite (Sanyal et
al., 2001).
c) Stéatose viro-induite
La stéatose est souvent retrouvée dans les maladies chroniques du foie. Elle est retrouvée chez
40 % à 86% des porteurs chroniques du virus de l’hépatite C (Asselah, 2006) et dépend de
facteurs propres à l’hôte tels que la consommation d’alcool, le surpoids ou bien encore la
présence d’un diabète de type 2. La stéatose trouve la plupart du temps son origine dans un
dérèglement du métabolisme lipidique. Cependant, même lorsque toutes ces causes possibles
peuvent être exclues, un nombre important de patients atteints d’hépatite C chronique (40%
environ) présente une stéatose, suggérant que le virus de l’hépatite C serait capable à lui seul
d’induire une stéatose hépatique : la stéatose viro-induite.
(1) Variabilité génotypique et stéatose
Stéatose métabolique et virale peuvent coexister chez un même individu, néanmoins plusieurs
études sur des patients atteints d’hépatite C chronique ont montré que l’infection par un
génotype 3 était associée significativement et directement avec la survenue d’une stéatose.
Ainsi 73% des patients infectés par un génotype 3 présentent une stéatose contre 50% des
patients infectés par un autre génotype (Asselah, 2006). L’apparition d’une stéatose chez les
individus infectés par un génotype 3 serait induite directement par le HCV tandis que la
stéatose observée chez les individus infectés par les autres génotypes serait liée à des facteurs
de risques métaboliques. De plus, la stéatose est souvent plus sévère chez les individus
infectés par un génotype 3. Chez de tel sujets, le degré de sévérité est corrélé à la quantité
d’ARN viral présent dans le foie ou le sérum (Rubbia-Brandt et al., 2000); (Adinolfi et al.,
2001), et la stéatose diminue ou disparaît totalement après un traitement anti-viral efficace,
69
(Rubbia-Brandt et al., 2000); (Kumar et al., 2002); (Poynard et al., 2003). La stéatose
réapparaît cependant en cas de rechute (Rubbia-Brandt et al., 2001).
(2) Stéatose et polymorphismes génétiques chez l’hôte
Chez les porteurs chroniques du HCV, en plus des facteurs viraux, des polymorphismes
génétiques semblent être associés au développement d’une stéatose hépatique. Les études
menées à ce jour tendent à montrer que dans la plupart des cas, les gènes de l’hôte influent sur
le développement de la stéatose d’une façon dépendante du génotype du virus infectieux.
Ainsi des polymorphismes du gène codant la PPARγ (cf paragraphe III) A. 1. d) (1)) ainsi que
le gène interleukine-28B (IL-28B) (qui code pour l’interféron λ3 (INF-λ3) impliqué dans la
réponse au traitement contre le HCV) seraient liés au risque d’apparition d’une stéatose
hépatique et ceci préférentiellement chez les personnes infectées par un génotype non-3 (Cai
et al., 2011) (les mécanismes n’étant pas connus). De la même façon, un polymorphisme dans
le gène codant la Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3 ou
adiponutrin) (son rôle reste à déterminer mais elle semblerait agir dans l’hydrolyse des TG)
serait associé à un risque plus élevé de stéatose chez des individus infectés par un génotype
non-3 (Sookoian et al., 2009); (Cai et al., 2011). De plus, un polymorphisme du gène codant
la MTP (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)) serait lié à la survenue d’une stéatose sévère,
cependant les données sont controversées quant à la relation avec le génotype viral
(Mirandola et al., 2009); (Zampino et al., 2008); (Cai et al., 2011). Un polymorphisme du
gène codant l’ApoE semble quant à lui associé à une atteinte hépatique légère et protégerait
contre des dommages plus sévères dus à l’infection par le HCV (Wozniak et al., 2002).
(3) Stéatose et évolution de la maladie
La plupart des études transversales et longitudinales menées sur la durée et la vitesse de
progression de l’infection par le HCV chez des patients chroniquement infectés par le HCV,
estiment que l’apparition d’une fibrose fait suite à 20 à 40 ans de portage chronique du virus.
Néanmoins la plupart du temps les patients étudiés n’étaient pas représentatifs de la
population de patients chroniquement infectés par l’hépatite C. L’évolution de la maladie
hépatique est en réalité très variable selon les individus et dépend de nombreux facteurs liés à
l’hôte, son environnement et au virus. Ainsi l’âge au moment de l’infection, le sexe masculin,
une forte consommation d’alcool et la coinfection avec le VIH ou le VHB sont associés à la
progression de la maladie. Le surpoids, le diabète de type 2, la stéatose et le HCV lui même
70
seraient des facteurs de l’évolution de la maladie vers la fibrose (Everhart et al., 2009).
Certaines études ont montré que la fibrose pouvait se développer indépendamment de la
survenue d’une stéatose chez des patients chroniquement infectés par le HCV (Poynard et al.,
2001); (Asselah et al., 2003); (Leandro et al., 2006), alors que d’autres ont montré qu’il y
avait une association entre les deux (Hourigan et al., 1999); (Adinolfi et al., 2001).
Néanmoins les relations de cause à effet ne sont pas clairement établies. La stéatose ne
pourrait être qu’un marqueur de l’évolution vers la fibrose et non pas une cause. De plus chez
les patients atteints d’hépatite C chronique, stéatose métabolique et virale peuvent coexister et
jouer un rôle dans l’évolution vers la fibrose: la question de savoir si la présence d’une
stéatose affecte la progression de la maladie liée à l’infection par le HCV (effet synergique)
ou si elle contribue à la sévérité de l’infection HCV impliquée dans le développement d’une
stéatose virale (effet additif), reste largement débattue. La stéatose viro-induite semble être un
facteur prépondérant de l’évolution de la maladie vers le stade fibrose mais uniquement pour
des patients infectés par certains génotypes du HCV (Asselah, 2006). Ainsi chez les patients
chroniquement infectés par un génotype 1, la stéatose est significativement associée à une
fibrose avancée (Leandro et al., 2006). La stéatose observée lors d’une infection par un
génotype 2 n’est pas directement associée à la fibrose (Leandro et al., 2006). Enfin, chez les
patients infectés par un génotype 3, qui présentent une stéatose plus sévère, la relation entre la
stéatose viro-induite et la progression de la maladie au stade fibrose reste controversée
(Bochud et al., 2009): en effet des études montrent que la stéatose induite par un génotype 3
serait associée au développement d’une fibrose (Westin et al., 2002); (Monto et al., 2002);
(Castéra et al., 2003); (Rubbia-Brandt, 2004) ou ne serait au contraire pas corrélée à
l’apparition d’une fibrose (Leandro et al., 2006) ou à une vitesse de progression plus rapide de
la fibrose (Bochud et al., 2009). L’insulino-résistance métabolique est un facteur de risque de
l’apparition de la stéatose (cf. paragraphe III) B. 3. b) (1)), au même titre que l’insulino-
résistance viro-induite (Clément et al., 2011). De la même façon, l’insulino-résistance peut
contribuer de manière indépendante au développement d’une fibrose chez les personnes
chroniquement infectées par le HCV (Hui et al., 2003); (Kawaguchi et al., 2004); (Moucari et
al., 2008). L’implication de la stéatose dans l’apparition de l’hépatocarcinome reste elle aussi
controversée (Ohata et al., 2003); (Kumar et al., 2005); (Pekow et al., 2007); (Wu et al.,
2010). Enfin le polymorphisme du gène codant la PNPLA3 est non seulement associé à un
risque plus élevé de développer une stéatose (cf paragraphe III) B. 3. c) (2)) mais aussi une
susceptibilité plus importante pour l’apparition d’une fibrose (Sookoian & Pirola, 2011) .
71
La plupart des études menées à ce jour montrent que l’infection chronique par un génotype 3
est associée à une stéatose plus sévère. Ceci suggère un rôle direct de certaines protéines
virales dans la survenue de la stéatose. Ces interactions sont représentées sur la Figure 24.
(4) Le rôle de la protéine de capside
i) Interaction avec les GL
Il a été montré dans des modèles de souris transgéniques que l’expression de la protéine de
capside du HCV (génotype 1b) induit une stéatose hépatique (Moriya et al., 1997b); (Moriya
et al., 1998); (Lerat et al., 2002) et un hépatocarcinome (Moriya et al., 1998); (Lerat et al.,
2002). Des études in vitro ont montré que la protéine de capside se localisait à la surface des
GL dans plusieurs lignées cellulaires et aussi dans des biopsies de foies de chimpanzés
infectés et dans le foie de souris transgénique (Hope, 2001); (Qiang et al., 2009); (Barba et
al., 1997); (Moriya et al., 1997a) (cf paragraphe II) C. 2. a) (1)). In vitro la protéine de
capside est capable d’induire une augmentation des GL et cet effet semble encore majoré avec
une protéine de capside de génotype 3 (Abid et al., 2005); (Hourioux et al., 2007); (Piodi et
al., 2008); (Jhaveri et al., 2008); (Jhaveri et al., 2009); (Clément et al., 2011). Le rôle précis
de cette association demeure mal connu mais la stéatose semble résulter d’un effet direct de la
protéine de capside sur le métabolisme lipidique (Roingeard & Hourioux, 2008). En effet il
semble que la protéine de capside agisse à différents niveaux : lors de la synthèse de novo des
lipides, lors de l’élimination des acides gras ou bien encore lors de la sécrétion des
lipoprotéines.
ii) Augmentation de la lipogenèse
Chez le chimpanzé infecté par un HCV de génotype 1a, plusieurs protéines impliquées dans la
lipogenèse sont surexprimées et ceci ferait intervenir les SREBP (Su et al., 2002). La protéine
de capside est ainsi capable d’interagir avec plusieurs enzymes impliquées dans la lipogenèse.
Les protéines de capsides de génotype 1b et 3a activent SREBP-1 (Kim et al., 2007); (Waris
et al., 2007); (Jackel-Cram et al., 2007) qui va à son tour réguler la transcription de l’enzyme
FAS (Jackel-Cram et al., 2007). La protéine de capside de génotype 3a potentialise cette
activation et le résidu phénylalanine en position 164 (dans le domaine de liaison aux GL)
semble jouer un rôle primordial (Jackel-Cram et al., 2007). Dans des cellules infectées par la
souche JFH1 l’expression des enzymes FAS et ACC (Yang et al., 2008); (Waris et al., 2007)
est augmentée. Néanmoins in vivo chez l’homme, aucun lien direct entre l’activation des
72
SREBP et/ou de l’enzyme FAS et la stéatose n’a été établi (McPherson et al., 2008); (Ryan et
al., 2011), en effet de façon surprenante la sévérité de la stéatose serait ici associée à une
diminution d’expression du facteur SREBP-1c (McPherson et al., 2008). Les gènes impliqués
dans le métabolisme lipidique sont régulés de façon positive ou négative, ceci semble
dépendre du génotype du virus. Il a été montré que la protéine de capside (génotype 1b)
pouvait augmenter l’expression de PPARγ ce qui contribuait à l’activation de gènes impliqués
dans la lipogénèse (Kim et al., 2007), mais dans le cas de cellules exprimant une protéine de
capside de génotype 3a, il y avait une réduction du facteur PPARγ (De Gottardi et al., 2006).
La protéine de capside n’interagit pas directement avec les SREBP. La modulation de
l’activité des SREBP et notamment de SREBP-1c pourrait dépendre de l’activation par la
protéine de capside de la liaison du complexe LXR-RXRα avec le promoteur du gène codant
SREBP-1c (cf paragraphe III) A. 1. d)) et de la présence au niveau nucléaire d’un activateur
du protéasome, PA28γ (Moriishi et al., 2007).
L’alignement de près de 300 séquences de capside du HCV a montré la présence de résidus
spécifiques du génotype 3, par rapport aux autres génotypes du HCV. L’un de ces résidus (Y
en position 164, substituée en F dans les séquences de génotype 3) se situe dans le domaine II
de la protéine de capside, qui joue un rôle important dans l’association de la protéine avec les
GL (Hourioux et al., 2007). Un mutant Y164F de la protéine de capside de génotype 1a a été
exprimé dans le modèle d’expression SFV en cellules BHK-21 (cf paragraphe II) F. 2. c)). En
microscopie confocale et ME, la formation de « clusters » périnucléaires de GL a pu être
visualisé dans les cellules transfectées avec les constructions exprimant une protéine de
capside sauvage ou mutée. Avec ce modèle et une méthode morphométrique originale sur
coupes de ME, pour déterminer la quantité de GL au sein des cellules exprimant la protéine de
capside, il a été montré que la quantité de GL était plus importante dans des cellules qui
exprimaient la protéine de capside portant un résidu spécifique de génotype 3, par rapport à
des cellules exprimant la protéine de capside sauvage (génotype 1a) (Hourioux et al., 2007).
Ces résultats montraient que la stéatose viro-induite et sa majoration en fonction du génotype
pouvaient être modélisées in vitro.
Dans le même temps, un travail récent a montré que la protéine de capside de génotype 3a
induit in vitro dans la lignée hépatocytaire humaine Huh7 une accumulation lipidique
cytoplasmique nettement supérieure à celle occasionnée par les génotypes 1b et 3h, eux-
mêmes plus stéatogènes que les génotypes 2a, 4h et 5a (Abid et al., 2005). Dans ce travail, les
séquences utilisées ont été amplifiées et clonées à partir de prélèvements de plusieurs patients,
73
infectés chroniquement par différents génotypes. Lorsque les auteurs ont cherché à étudier par
mutagenèse dirigée le rôle de phénylalanine en position 164 dans ce phénomène de stéatose in
vitro, ils n'ont pas observé de variation imputable à ce résidu, ce qui constituait une différence
avec le modèle du vecteur SFV en cellules BHK-21. Il faut cependant noter que l'approche
méthodologique utilisée dans ce travail est différente, les auteurs basant leur quantification
des GL sur le pourcentage de cellules positives en GL et sur un dosage intracellulaire des
triglycérides.
iii) Diminution de la dégradation des acides gras
Chez le chimpanzé infecté par un virus de génotype 1a, dans les foies de patients infectés par
différents génotypes du HCV, dans un modèle de souris transgénique ou in vitro dans des
cellules exprimant la protéine de capside de génotype 1b, on observe une baisse d’expression
de PPARα, facteur impliqué dans les β-oxydations mitochondriale et peroxysomale (Su et al.,
2002); (Dharancy et al., 2005);(Yamaguchi et al., 2005) ce qui a pour conséquence de limiter
la dégradation des acides gras. Cette diminution est plus importante dans le cas d’infections
par un génotype 3 (De Gottardi et al., 2006). La protéine de capside de génotype 1b est quant
à elle capable d’interagir, in vitro et dans un modèle de souris transgénique, avec le domaine
de liaison à l’ADN du facteur RXRα qui peut former un hétérodimère avec PPARα, activant
ainsi l’expression des gènes portant un élément de réponse à RXRα et/ou à PPARα (Tsutsumi
et al., 2002). De plus, des souris transgéniques exprimant la protéine de capside (génotype 1b)
et une forme constitutivement active de PPARα développent une stéatose (Tanaka et al.,
2008). En général, l’activation de PPARα, n’est pas associée à une majoration de la stéatose,
mais en corrélation avec l’induction d’un stress oxydatif par la protéine de capside cela
pourrait contribuer au développement de l’hépatocarcinome (Tanaka et al., 2008).
iv) Diminution de la sécrétion des lipoprotéines
Dans les sera des patients chroniquement infectés par le HCV et présentant une stéatose, de
faible concentration en cholestérol (hypocholestérolémie) et en ApoB circulante
(hypobetalipoprotéinémie) sont observées. De plus, chez les patients infectés par un génotype
3, la stéatose est directement corrélée à cette hypoβlipoprotéinémie (Serfaty et al., 2001), ou à
la diminution de la quantité d’ARNm codant pour la MTP (Mirandola et al., 2006). Dans un
modèle de souris transgénique exprimant la protéine de capside (génotype 1b), l’activité de la
MTP est réduite mais pas son taux d’expression. Cependant, la MTP n’est alors plus capable
74
de transférer les TG, entraînant ainsi une baisse de la formation et de la sécrétion des VLDL
(PERLEMUTER et al., 2002), ce qui pourrait expliquer l’accumulation intrahépatocytaire des
TG. Les mécanismes par lesquels la protéine de capside modifie l’activité de la MTP ne sont
pas élucidés. La protéine de capside n’interagit pas directement avec l’ApoB ou la MTP, une
hypothèse serait que la protéine de capside en interagissant avec les GL ou avec les lipides
contenus dans la membrane du RE, empêche la MTP de se lier sur ces mêmes lipides,
empêchant ainsi le transfert des TG vers la lumière du RE et/ou vers l’ApoB (PERLEMUTER
et al., 2002). En contre partie, la protéine de capside (génotype 1b et 1a) interagit in vivo et in
vitro avec l’ApoAII, composante des HDL (Barba et al., 1997); (Sabile et al., 1999);
(PERLEMUTER et al., 2002). Cette association semble limiter l’effet inhibiteur de la
protéine de capside sur la MTP, en dirigeant la protéine de capside hors de la cellule.
v) Induction d’un stress oxydatif
La protéine de capside est capable d’induire un stress oxydatif dans le foie de souris
transgénique sans pour autant qu’une stéatose ne se développe (Moriya et al., 2001); (Koike,
2009), mais cela pourrait contribuer au développement de l’hépatocarcinome. En effet la
protéine de capside semble augmenter in vitro et in vivo la production d’espèces super-
réactives de l’oxygène (ROS) et parallèlement elle diminuerait les mécanismes antioxydants
ce qui contribuerait en partie à l’établissement de sévères lésions hépatiques (Okuda et al.,
2002); (PERLEMUTER et al., 2002); (Koike, 2009). Les mécanismes de cette augmentation
de la synthèse des ROS ne sont pas encore clairement définis. Ils sembleraient liés à la faculté
de la protéine de capside de s’associer directement aux mitochondries (Moriya et al., 1998);
(Schwer et al., 2004) et d’entraîner des dysfonctionnements de la chaîne de transport des
électrons et/ou de modifier de façon indirecte la perméabilité membranaire des mitochondries
entraînant le relarguage de molécules pro-apoptotiques (Korenaga, 2005); (Okuda et al.,
2002); (Machida et al., 2006). De plus, la production de ROS pourrait à son tour déstabiliser
le transport des électrons dans la mitochondrie potentialisant ainsi l’effet de la protéine de
capside (Okuda et al., 2002).
L’induction d’un stress oxydatif lié à l’expression de la protéine de capside, peut aussi
entraîner le clivage et la phosphorylation des facteurs de transcription SREBP. Ce phénomène
semble dépendre du génotype (génotype 3a) et pourrait jouer un rôle direct dans le
développement d’une stéatose (Waris et al., 2007).
75
(5) Le rôle de la protéine NS5A
Une étude récente a montré que la protéine NS5A de certains génotypes du HCV serait
capable d’induire une stéatose in vivo (Wang et al., 2009). Cependant, très peu de choses sont
encore connues sur les mécanismes par lesquels la protéine NS5A participerait à
l’établissement de la stéatose. Des études suggèrent que la protéine NS5A et le métabolisme
lipidique sont fortement liés. En effet, la protéine NS5A colocalise in vitro avec la protéine de
capside à la surface des GL (Shi et al., 2002); (Miyanari et al., 2007) et pourrait moduler les
gènes du métabolisme lipidique, via son interaction in vitro et in vivo avec l’apolipoprotéine
ApoAI, l’ApoB et l’ApoE (Shi et al., 2002); (Domitrovich et al., 2005); (Benga et al., 2010)
et in vitro avec PPARγ (Kim et al., 2009). De plus, la protéine NS5A induit un stress aux
membranes du RE qui pourrait stimuler la production de ROS par la mitochondrie (Gong et
al., 2001); (Dionisio et al., 2009) et ainsi contribuer à l’apparition de lésions hépatiques.
(6) Le rôle des autres protéines du HCV
La protéine NS4B (génotype 3a et 1b) (Waris et al., 2007); (Park et al., 2009), et la protéine
NS2 (génotype 1a) (Oem et al., 2008) peuvent induire le clivage des SREBPs dans des
cellules infectées par le HCV, indiquant un rôle possible dans la synthèse de novo des acides
gras. NS4B peut aussi induire une accumulation de GL in vitro et activer tout comme NS2
l’expression de FAS (Park et al., 2009); (Oem et al., 2008). Les protéines non structurales
seraient aussi impliquées dans une baisse d’activité de la MTP et de son promoteur ainsi
qu’une diminution de l’expression de son ARNm (Domitrovich et al., 2005) entraînant une
baisse de sécrétion des lipoprotéines et favorisant ainsi les mécanismes de stéatose. Enfin, la
protéine NS3, via l’activation d’une enzyme oxydase (Nox 2), contribue à l’apparition de
ROS. Il s’agit d’un mécanisme différent de celui mis en place lors de l’expression des
protéines de capside et NS5A, qui va favoriser l’établissement de lésions hépatiques (Bureau,
2001). La protéine E1 participerait aussi à l’induction d’un stress oxydatif, les mécanismes
restent cependant mal compris (Machida et al., 2006).
76
Figure 24 : Impact du HCV sur l’insulino-résistance et la stéatose viro-induite. ROS : Reactive Oxygen Species. Le rôle direct de certaines protéines virales dans l’insulino-résistance et/ou la survenue de la stéatose est schématisé par les flèches vertes. Les mécanismes d’action sont détaillés dans la partie III) B. de ce manuscrit.
ROS
ROS
ROS
77
C. Cycle viral du HCV et métabolisme lipidique : modèle
La relation étroite et complexe qui semble lier le HCV au métabolisme lipidique comme il a
pu être constaté dans la deuxième partie de ce manuscrit n’est pas une simple coïncidence. Ce
dernier chapitre fait écho à la première partie de cette thèse. Il tente de mettre en lumière le
profit que semble tirer le HCV du métabolisme lipidique dans l’établissement de son cycle
viral et propose un modèle où les GL sont au cœur de l’assemblage viral.
1. Protéine de capside et accumulation de GL
Par différents mécanismes, certaines protéines virales telle que la protéine de capside
contribuent à l’établissement et au maintien d’une stéatose dans les hépatocytes infectés par le
HCV. Cette accumulation de GL n’est pas restreinte à l’infection par le HCV et est d’ailleurs
nécessaire lors de la multiplication de Chlamydia trachomatis (Kumar et al., 2006) et lors du
cycle viral du virus de la Dengue (Samsa et al., 2009), les GL semblent aussi jouer un rôle
important lors de la multiplication du Rotavirus (Cheung et al., 2010). De plus, il a été montré
que la protéine de capside du GBV-B se localise aussi à la surface des GL (Hope, 2001).
Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer la suite d’événements conduisant à
l’association entre la protéine de capside du HCV et les GL. Ainsi, la protéine de capside
pourrait diffuser le long du RE jusqu’à ce qu’elle rencontre une GL apposée ou attachée à la
membrane du RE. D’une part, la protéine de capside serait capable d’interagir avec l’enzyme
DGAT1 située dans des domaines spécifiques du RE impliqués dans la genèse des GL
(Herker et al., 2010). D’autre part, le domaine D2 de la protéine de capside ayant une plus
forte affinité pour la surface des GL, cela favoriserait le transfert de la protéine des
membranes du RE aux GL (Targett-Adams, 2003); (Boulant et al., 2006). Puis, au fur et à
mesure que la protéine de capside est produite aux membranes du RE, elle s’accumulerait à la
surface des GL d’abord à un site unique puis de façon progressive sur toute la surface
(Boulant et al., 2007). L’établissement de cette plate-forme d’assemblage semble avoir un
impact majeur dans le cycle viral du HCV. En effet, il a été montré que des modifications
dans la séquence du domaine D2 qui n’altèrent pas l’adressage de la protéine de capside aux
GL mais modifient la nature de l’interaction avec les GL peuvent moduler l’assemblage et la
sécrétion viral (Shavinskaya et al., 2007). La protéine de capside associée aux GL serait alors
capable de recruter les protéines non structurales, l’ARN viral et les complexes de réplication
78
aux membranes associées aux GL (Miyanari et al., 2007); (Herker et al., 2010). Les protéines
non structurales pourraient alors contribuer à la production de virus infectieux soit
indirectement en créant un microenvironnement adapté autour des GL, soit directement en
participant à la formation des complexes de réplication (Jirasko et al., 2010). De cette façon,
l’adressage de la protéine de capside et d’une des protéines non structurales (NS5A) aux GL
mais aussi l’interaction de ces deux protéines à la surface des GL sont importants pour la
production de particules virales (Masaki et al., 2008).
2. Protéine NS5A, GL et assemblage viral
La protéine NS5A semble être la protéine structurale la plus interconnectée avec le
métabolisme lipidique. Il a été montré que la protéine NS5A en s’associant aux GL
déstabiliserait la réplicase NS5B ce qui entraînerait le détournement de la protéine NS5A et
de l’ARN viral en faveur des mécanismes d’assemblage (Miyanari et al., 2007); (Masaki et
al., 2008); (Tellinghuisen et al., 2008). De plus, la protéine NS5A au sein des complexes de
réplication peut interagir de façon indirecte avec l’ApoE. Ceci permettrait le recrutement de
l’ApoE à la surface des GL riches en protéine de capside et serait important lors de
l’assemblage viral (Jones & McLauchlan, 2010); (Benga et al., 2010). Ainsi la protéine NS5A
présente sur la plate-forme de GL, participerait au recrutement des autres protéines non
structurales et de l’ARN viral (Miyanari et al., 2007). Il a été proposé que les ARN
nouvellement synthétisés accrochés à NS5A seraient relâchés des membranes du complexe de
réplication, et pourraient être capturés par la protéine de capside capable d’interagir avec le
domaine III de NS5A à la surface des GL ou aux membranes associées aux GL. Les ARN
viraux seraient alors encapsidés et l’assemblage viral aurait lieu dans ce microenvironnement
(Appel et al., 2008); (Masaki et al., 2008).
3. GL et enveloppement des nucléocapsides
Une fois la nucléocapside formée, celle-ci doit être enveloppée. Des mécanismes impliquant
les GL, la protéine de capside et/ou la protéine NS2 ont été évoqués (cf paragraphe II) E. 4.),
cependant cette étape reste peu décrite. Les protéines d’enveloppe E1 et E2 sont synthétisées
aux membranes du RE et la protéine E2 est localisée aux membranes du RE associées aux GL
(Miyanari et al., 2007). De plus, la protéine de capside peut se lier aux glycoprotéines
d’enveloppe E1 et E2. Ainsi, les nucléocapsides formées à la surface des GL
s’envelopperaient en bourgeonnant des membranes du RE ou des membranes du RE accolées
79
aux GL où la protéine E2 est retrouvée (Blanchard et al., 2002); (Roingeard et al., 2004);
(Appel et al., 2008); (Miyanari et al., 2007). Il a été proposé que les glycoprotéines E1 et E2
pourraient diffuser le long des membranes du RE lisse jusqu’à un site de formation de GL.
Les protéines E1 et E2 seraient alors transférées à la GL naissante, puis celle ci irait alors
fusionner dans un compartiment plus distal de la voie de sécrétion avec la lipoprotéine
intermédiaire de la voie de synthèse des VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)) (Icard et al.,
2009). Néanmoins l’implication de ce modèle dans l’enveloppement des nucléocapsides n’est
pas discutée.
4. VLDL et sécrétion des particules virales
Plusieurs arguments sont en faveur d’une production des particules virales dépendante de la
voie de sécrétion des VLDL (Huang et al., 2007); (Gastaminza et al., 2007). Néanmoins il
existe une controverse entre les données in vitro et in vivo dans le rôle attribué aux différents
composants de cette voie de synthèse du fait notamment d’un défaut de sécrétion des VLDL
dans les cellules Huh7. Ainsi la composition en lipides et donc la taille et la densité des
virions dépend de la cellule hôte dans laquelle le virus est produit (Gastaminza et al., 2010);
(Merz et al., 2011). Les études in vitro ont permis d’établir que l’ApoB et la MTP (Huang et
al., 2007); (Gastaminza et al., 2007) seraient nécessaires à la production de particules virales
infectieuses. De plus, l’ApoE (Chang et al., 2007) et son interaction de la protéine NS5A
(Benga et al., 2010) seraient non seulement importantes lors des étapes d’assemblage mais
aussi lors de la sécrétion de particules virales. Les virions ainsi produits ont une composition
en lipides unique dans le monde viral et proche de celles des VLDL (Merz et al., 2011). Enfin
la sécrétion des particules virales associées aux VLDL permettrait de favoriser l’entrée du
virus dans d’autres cellules en détournant certains récepteurs des lipoprotéines (cf paragraphe
II) E. 1. b) et c)).
Récemment un modèle où les GL semblent être la plate-forme centrale de
l’assemblage viral a ainsi été proposé (Boulant et al., 2008). Dans ce modèle, la protéine de
capside serait capable de déplacer de façon progressive une protéine de la famille PAT/PLIN,
l’ADRP, de la surface des GL, entraînant ainsi une redistribution des GL en zone
périnucléaire. La redistribution complète des GL a lieu quand la protéine de capside recouvre
entièrement la surface des GL. Les GL sont redistribuées au niveau des membranes du RE qui
80
entourent alors partiellement la GL pour former une structure (cf paragraphe III) A. 3. c) (2))
qui faciliterait le transfert des composants viraux entre le RE et les GL. L’accumulation des
GL en zone périnucléaire pourrait alors concentrer la protéine de capside avec les sites de
réplication qui contiennent les ARN nouvellement synthétisés et les protéines non structurales
favorisant ainsi les mécanismes d’assemblage viral. Par ailleurs, l’accumulation des GL dans
ces mêmes zones pourrait aussi faciliter la sécrétion des particules virales nouvellement
synthétisées.
81
Objectifs du travail
82
Les études fondamentales actuelles sur les GL suggèrent que ces organites sont
extrêmement dynamiques, mais les mécanismes de leur trafic intracellulaire sont encore
inconnus. Une partie de mon travail de thèse a consisté à mieux comprendre les mécanismes
régissant la relocalisation des GL induite par la protéine de capside du HCV. La mise en place
d’une telle plate-forme lipidique pourrait permettre de favoriser le contact entre la protéine de
capside du virus présente à la surface des GL, et l’ARN viral présent au sein d’un réseau
multi-membranaires portant les complexes de réplication, à proximité du réseau de GL. La
relocalisation des GL interviendrait lors des étapes précoces de l’assemblage viral donnant
ainsi lieu à la formation des nucléocapsides. Pour mieux étudier ce phénomène, nous avons
utilisé le système in vitro dérivé du SFV pour comparer la quantité et la localisation
subcellulaire des GL dans des cellules exprimant une protéine de capside mature ou
immature. Ce travail a montré que les protéines de capside mature ou immature étaient toutes
les deux capables d’augmenter le nombre de GL dans les cellules par rapport à une protéine
contrôle, mais que la protéine mature était capable d’amplifier ce phénomène par rapport à la
protéine immature. Par ailleurs, seule la protéine de capside mature était capable d’entourer
les GL et de les redistribuer en zone périnucléaire. Une analyse morphologique en 3D
montrait clairement que les GL ne se regroupent pas autour des centrosomes comme cela
avait été suggéré dans une récente étude, mais que les GL seraient plutôt synthétisées de novo
au niveau de membranes du RE riches en protéine de capside. Ces travaux permettent
d’apporter des éléments nouveaux, à la fois sur la dynamique des GL au sein d’une cellule et
sur la compréhension des mécanismes impliqués dans la stéatose viro-induite.
Ils ont fait l’objet d’une publication originale: Depla M, Uzbekov R, Hourioux C,
Blanchard E, Le Gouge A, Gillet L, Roingeard P., Ultrastructural and quantitative analysis
of the lipid droplet clustering induced by the hepatitis C virus core protein, Cell Mol Life Sci.
2010 Sep;67(18):3151-61.
Ils ont également permis la réalisation d’une review qui prolonge la discussion concernant
l’impact de ce travail sur la compréhension de la biogenèse et de la dynamique des GL :
Roingeard P, Depla M. The birth and life of lipid droplets : learning from the hepatitis C
virus, Biol Cell 2011 May; 103 (5): 223-231.
Une évolution très importante et indispensable des travaux de l’équipe sur les
interactions HCV/GL in vitro était de les compléter par une approche bio-clinique. Nous
83
avons ainsi initié une étude avec les cliniciens hépatologues des principaux Centres
Hospitaliers de la Région Centre, et le Centre d’Investigation Clinique (CIC) INSERM 0202
du CHRU de Tours dans le cadre d’un projet « Recherche Translationnelle » INSERM-
DHOS. Même si plusieurs études cliniques ont indiqué un lien entre l’infection par un
génotype 3 du HCV et la sévérité de la stéatose, l’impact du génotype viral sur la stéatose
hépatique reste encore débattu. Le fait qu’une stéatose hépatique chez un sujet chroniquement
infecté par le HCV soit vraisemblablement due à des facteurs viraux et à des facteurs
métaboliques propres à l’hôte compliquent la détermination d’un tel lien. Par ailleurs, aucune
de ces études n’a été basée sur une véritable étude morphométrique des GL dans les biopsies
hépatiques des patients chroniquement infectés. Un aspect novateur de notre étude était donc
d’adapter l’analyse morphométrique des GL que nous avions mise au point sur des modèles
cellulaires et publiée récemment dans GUT à des biopsies hépatiques de patients infectés
chroniquement par le HCV sans facteur de risques de stéatose métabolique. Les effectifs
prévus de l’étude étaient 15 patients infectés par un HCV de génotype 3 et 15 patients infectés
par un HCV d’un autre génotype. Cependant, devant la difficulté d’inclusion de patients
infectés par un génotype 3, pour lesquels la réalisation d’une biopsie hépatique dans le cadre
de leur suivi médical est de moins en moins justifié, seuls 12 patients infectés par un HCV de
génotype 3 ont pu être inclus dans l’étude. Au delà de la comparaison de l’intensité de la
stéatose chez ces patients en fonction du génotype, notre étude prévoyait également
d’analyser les séquences des virus qui auraient pu être associées à une stéatose sévère.
Le bilan de ce travail montre que chez un groupe de patients, certes restreint mais pour
lesquels toute suspicion de stéatose métabolique et de consommation excessive d’alcool ont
été éliminées, on ne retrouve pas de lien entre l’infection par le génotype 3 et l’intensité de la
stéatose. Aucune association n’a été établie entre la sévérité de la stéatose et la nature du
génotype ainsi que la présence de résidus particuliers dans la séquence des protéines de
capside et NS5A des virus qui infectaient ces patients. Ceci ne remet pas en cause le fait que
le HCV peut être impliqué dans la genèse de cette stéatose, voir même que certains résidus
spécifiques de génotypes pourraient être impliqués dans l’intensité de cette stéatose, par
rapport à ce qui a pu être observé dans des modèles in vitro. Cependant, notre étude suggère
que ces éléments auraient un rôle minoritaires in vivo, et que des facteurs propres à l’hôte
prédomineraient pour déterminer l’intensité de la stéatose.
84
Cette étude bio-clinique a fait l’objet de la rédaction d’un manuscrit, actuellement soumis
pour publication : Depla M, d’Alteroche L, Le Gouge A, Moreau A, Hourioux H,
Meunier J-C, Gaillard J, de Muret A, Bacq Y, Kazemi F, Avargues A, Roch E, Piver E,
Gaudy-Graffin C, Giraudeau B, Roingeard P. Viral diversity in chronic carriers of
hepatitis C virus has a low impact on liver steatosis.
85
Résultats & Discussion
86
I) Etude in vitro des regroupements de gouttelettes
lipidiques induits par le virus de l’hépatite C. Impact
sur la biogenèse des gouttelettes lipidiques
Article 1
Ultrastructural and quantitative analysis of the lipid droplet
clustering induced by the hepatitis C virus core protein
Marion DEPLA, Rustem UZBEKOV, Christophe HOURIOUX, Emmanuelle BLANCHARD,
Amélie LE GOUGE, Ludovic GILLET, Phillippe ROINGEARD
Publié en 2010 dans Cellular and Molecular Life Sciences
RESEARCH ARTICLE
Ultrastructural and quantitative analysis of the lipid dropletclustering induced by hepatitis C virus core protein
Marion Depla • Rustem Uzbekov • Christophe Hourioux •
Emmanuelle Blanchard • Amelie Le Gouge •
Ludovic Gillet • Philippe Roingeard
Received: 18 February 2010 / Revised: 1 April 2010 / Accepted: 8 April 2010
Ó Springer Basel AG 2010
Abstract Hepatitis C virus (HCV) release is linked to the
formation of lipid droplet (LD) clusters in the perinuclear
area of infected cells, induced by the core protein. We used
electron microscopy (EM) to monitor and compare the
number and size of LD in cells producing the mature and
immature forms of the HCV core protein, and 3D EM to
reconstruct whole cells producing the mature core protein.
Only the mature protein coated the LD and induced their
clustering and emergence from endoplasmic reticulum
membranes enriched in this protein. We found no particular
association between LD clusters and the centrosome in
reconstructed cells. The LD clustering induced by the
mature core protein was associated with an increase in LD
synthesis potentially due, at least in part, to the ability of
this protein to coat the LD. These observations provide
useful information for further studies of the mechanisms
involved in HCV-induced steatosis.
Keywords HCV � Lipid droplet � Steatosis �
Electron microscopy � 3D reconstruction
Abbreviations
HCV Hepatitis C virus
ER Endoplasmic reticulum
SPP Signal peptide peptidase
SFV Semliki forest virus
EM Electron microscopy
b-Gal b-Galactosidase
WT Wild-type
Introduction
Hepatitis C virus (HCV), a member of the Flaviviridae
family, is a major cause of chronic liver disease, infecting
an estimated 170 million people worldwide [1]. The
spectrum of severity of the liver disease associated with
HCV is broad and the rate of progression to advanced
fibrosis and cirrhosis is highly variable. This rate seems to
depend on many host-related cofactors, such as age at
infection, sex, alcohol consumption, being overweight and
co-infections with hepatitis B virus or human immunode-
ficiency virus [2]. Retrospective studies have shown that
advanced fibrosis is associated with the presence and
severity of liver steatosis, characterised by the deposition
of triglycerides in the liver [3, 4]. There is, therefore,
considerable interest in dissecting the mechanisms of ste-
atosis in HCV infection, particularly in relation to other
metabolic disturbances. Steatosis is frequent in hepatitis C
patients. Indeed, before the advent of serological testing,
the presence of fatty acids in the liver was widely con-
sidered to be suggestive of a diagnosis of non-A, non-B
Electronic supplementary material The online version of thisarticle (doi:10.1007/s00018-010-0373-z) contains supplementarymaterial, which is available to authorized users.
M. Depla � R. Uzbekov � C. Hourioux � E. Blanchard �
P. Roingeard (&)
INSERM U966, Faculte de Medecine, Universite Francois
Rabelais, CHRU de Tours, 10 boulevard Tonnelle,
37032 Tours Cedex, France
e-mail: roingeard@med.univ-tours.fr
A. Le Gouge
INSERM CIC 0202, Universite Francois Rabelais,
CHRU de Tours, Tours Cedex, France
L. Gillet
INSERM U921, Universite Francois Rabelais,
CHRU de Tours, Tours Cedex, France
Cell. Mol. Life Sci.
DOI 10.1007/s00018-010-0373-z Cellular and Molecular Life Sciences
hepatitis [5]. Steatosis depends on both viral and host
factors. Virus-induced steatosis is mostly reported in
patients infected with HCV genotype 3, in whom fat
accumulation is correlated with HCV replication in the
serum [3] and liver [6], and is resolved by successful
antiviral treatment [7, 8], strongly suggesting that specific
viral products are involved in the fat deposition. By con-
trast, most cases of mild steatosis in patients infected with
genotypes other than 3 seem to have a metabolic patho-
genesis, with being overweight identified as the most
significant clinical correlate [3]. This type of steatosis tends
to be associated with a lower likelihood of virological
response to antiviral drugs [9] and frequently persists in
patients responding to antiviral treatment, consistent with
HCV playing no major role in its pathogenesis [8, 9]. Both
types of steatosis (viral and metabolic) may co-exist in at
least some chronic hepatitis C patients, although steatosis is
more likely to be predominantly viral in origin in patients
infected with genotype 3 viruses and predominantly met-
abolic in patients infected with viruses of other genotypes.
The HCV genome consists of a positive-sense, single-
stranded RNA molecule of 9.6 kb [10]. Translation of the
genome generates a polyprotein of approximately 3,000
amino acids, which is cleaved by a combination of viral
and cellular proteases to produce the mature structural and
non-structural proteins. The structural protein involved in
nucleocapsid assembly—the core protein—has been shown
to induce steatosis in two lines of transgenic mice [11, 12].
HCV core protein production is associated with multiple
changes in lipogenic gene expression [13–16] and lipo-
genic proteins activity [17, 18], and also has effects on
mitochondrial oxidative function [19–21]. In vitro studies
on various cell lines rapidly established that the HCV core
protein was located at the surface of lipid droplets acting as
intracellular storage sites for triglycerides and cholesterol
esters [22–25]. Moreover, HCV core has been shown to be
present on lipid droplets in liver biopsy specimens from
infected chimpanzees [23]. These observations raise the
intriguing possibility that this particular localisation is
somehow linked to liver steatosis [26]. Recent fundamental
research studies made possible by the isolation of a virus
strain (JFH-1, Japanese Fulminant Hepatitis clone 1) pro-
ducing infectious HCV from tissue culture cells have
demonstrated that the initiation of nascent virions assembly
and production takes place at lipid droplets [27]. Indeed,
attachment of the HCV core protein to lipid droplets is
linked to the release of infectious progeny virions from
infected cells. This release is accompanied by the redis-
tribution of lipid droplets within infected cells, with the
clustering of these lipid droplets in the perinuclear area
[28]. This redistribution requires only the mature HCV core
protein, generated by cleavage with two cellular enzymes:
signal peptidase and signal peptide peptidase (SPP). The
first of these enzymes releases the core protein from the
polyprotein targeted to the endoplasmic reticulum (ER)
membrane, generating an immature form of the core pro-
tein that contains the signal peptide [29]. Complete
processing of the protein requires further proteolysis by
SPP, which cleaves within the signal peptide. This second
cleavage event is essential for the trafficking of the core
protein to the lipid droplet [29]. The redistribution of lipid
droplets induced by the mature HCV core protein depends
on the microtubule network and is thought to increase the
likelihood of interaction between the core protein and the
site of HCV RNA replication within a network of mem-
branes in the perinuclear area [28]. Thus, the association of
the HCV core protein with lipid droplets seems to play a
central role in both HCV pathogenesis and morphogenesis,
suggesting that virus-induced steatosis may be essential for
the viral life cycle.
We have previously established a cellular model based
on HCV core protein production in which lipid droplets
accumulate and cluster in the perinuclear area of the
transfected cells [30]. Using this model, together with a new
method for monitoring the number and size of lipid droplets
in transfected cells, we demonstrated that the production of
a core protein bearing residues specific to HCV genotype 3
was associated with a higher amount of lipid droplets than
the production of a wild-type (WT) core protein of geno-
type 1 [30]. Thus, our cellular model seems to mimic, in
vitro, virus-induced steatosis and its genotype-specific
influence. In this study, we used this model to compare the
amount of intracellular lipid droplets in cells producing
immature and mature HCV core proteins. We also analysed
the clustering of lipid droplets induced by the mature HCV
core protein, by 3D electron microscopy, and considered
the implication of these observations for the potential
mechanisms underlying HCV-induced steatosis.
Materials and methods
Insertion of the HCV core sequences into Semilki forest
virus (SFV) vectors and site-directed mutagenesis
to generate an HCV core mutant not cleaved by SPP
The HCV core 1a construct was obtained from our previ-
ously described [31] genotype 1a cDNA clone (Dj6.4;
Genbank accession number AF529293) containing the
C-E1–E2 coding sequence. The WT core construct was
amplified by PCR, using PfuTurbo DNA polymerase
(Stratagene, La Jolla, CA, USA) with primers flanked by
BamH1 sites, as previously reported [32]. Site-directed
mutagenesis within the C-terminal core signal sequence
was performed with antisense primers leading to (1) the
generation of a triple mutant VLV180-3-4 (Fig. 1a) and (2)
M. Depla et al.
the insertion of a stop codon at the 30 end of the core
protein-coding region [33]. This particular mutant has been
shown to be resistant to SPP cleavage [33]. The sequences
encoding the WT and mutated core proteins were inserted
separately into the polylinker BamH1 site of the expression
vector pSFV1 (Life Technologies, Rockville, MD, USA).
DNA sequencing was used to check that the original
sequence was conserved in both constructs and that the
VLV180-3-4 mutations were correctly introduced in the
mutant.
Cell culture and transfection with RNA
Baby hamster kidney cells (BHK-21) were cultured and
electroporated with recombinant SFV RNA encoding the
HCV WT or VLV180-3-4 core protein, as previously
described [30, 33]. Briefly, cells were cultured at 37°C in
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) supple-
mented with 5% foetal calf serum and 8% tryptose
phosphate. For recombinant RNA synthesis, the various
pSFV1 constructs were linearised by digestion at the SpeI
restriction site downstream from the 30 non-coding region
of the SFV replicon. Transcription was then carried out in
vitro with SP6 RNA polymerase, making use of the SP6
promoter located upstream from the 50 extremity of the
SFV replicon, as recommended by the manufacturer
(Invitrogen). As a control, we synthesised a recombinant
RNA encoding b-galactosidase (b-Gal). For transfection,
10 9 106 cells were mixed with 5 lg of recombinant SFV
RNA and electroporated by a single pulse at 350 V,
750 mF (Easyject One; Eurogentec). Cells were cultured
for 16 h following electroporation, as our previous studies
have shown that the major morphological events associated
with HCV structural protein production occur during this
period in this system [30, 33]. All experiments other than
confocal microscopy studies of the subcellular distribution
of core proteins were conducted with BHK-21 cells. For
these confocal microscopy studies, we transfected the
human hepatocellular carcinoma cell line FLC4 under
similar conditions. The lower efficiency of the SFV vectors
in these cells resulted in the production of smaller amounts
of protein than in BHK-21 cells, allowing a more precise
analysis of the subcellular distribution of proteins and an
analysis of co-localisation with lipids [30, 33].
Western blotting
Transfected BHK-21 cells were treated with a lysis buffer
containing 1% NP-40, 140 mM NaCl, 100 mM Tris–HCl
pH 8, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl
sulphate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 lg/ml
aprotinin and 2 lg/ml leupeptin. Samples were then sepa-
rated by SDS-PAGE in 15% polyacrylamide gels and the
resulting bands were transferred to a polyvinylidene
difluoride membrane. The membrane was blocked by
incubation in 0.05% (vol/vol) Tween 20 in phosphate
buffered saline (PBS) supplemented with 2% (wt/vol)
skimmed milk powder (PBS-T). Membranes were incu-
bated with the human monoclonal anti-HCV core B12F8
antibody (gift of Dr M. Mondelli) diluted 1:500 in PBS-T,
washed and incubated with a horseradish peroxidase-con-
jugated anti-human antibody diluted 1:5,000 in PBS-T.
Antibody binding was detected by enhanced chemilumi-
nescence (ECL Plus; Amersham Bioscience).
Fig. 1 Analysis of HCV core protein production and core-E1 signal
peptide processing. a Signal sequences of the two HCV core proteins
used in this study: the wild-type (WT) protein and the VLV180-3-4
mutant. The transmembrane region of the signal sequence at the core-
E1 junction is boxed. b Production of the WT and VLV180-3-4 mutant
core proteins in BHK-21 cells, and analysis of HCV core protein
processing by SDS-PAGE and western blotting. The WT core protein
was fully cleaved by SPP, appearing at 21 kDa, whereas the
VLV180-3-4 mutant core protein remained uncleaved, resulting in
detection of the p23 kDa form of the core protein. Cells producing
b-gal were used as a control and an anti-actin antibody was used to
normalise the western blot. c Immunofluorescence of WT and
VLV180-3-4 core proteins, combined with Nile Red staining of lipid
droplets in FLC4 cells. Lipid droplets were evenly distributed
throughout the cytoplasm of cells producing b-gal (negative control).
Significant clusters of lipid droplets co-localised with core protein
were observed in the perinuclear area of cells transfected with the WT
core construct, but not in cells producing the VLV180-3-4 mutant core
HCV-induced lipid droplet clustering
Confocal microscopy
Transfected FLC4 cells were cultured on glass coverslips
for 16 h and were then fixed by incubation for 30 min in
4% paraformaldehyde in PBS at room temperature. The
reaction was quenched and the cells were permeabilised
by incubation for 30 min in 0.05% saponin-0.2% bovine
serum albumin (BSA) in PBS. HCV core proteins were
detected by incubating the cells for 30 min with
the mouse monoclonal anti-HCV core antibody C7-50
(Abcam, Cambridge, MA, USA), diluted 1:100 in
permeabilisation buffer. The cells were then washed and
incubated with a secondary anti-mouse antibody coupled
to Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR,
USA), diluted 1:1,000 in permeabilisation buffer. For
lipid staining, the cells were treated with Nile Red
(Sigma-Aldrich), diluted 1:1,000 (from a 1 mg/ml stock
solution in acetone) in permeabilisation buffer, during
incubation with the secondary antibody. Confocal
microscopy was performed with an Olympus Fluoview
500 instrument.
Electron microscopy and immuno-electron microscopy
For standard electron microscopy (EM), transfected BHK-
21 cells were fixed by incubation for 48 h in 4% parafor-
maldehyde and 1% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate
buffer (pH 7.2) and postfixed by incubation for 1 h with
2% osmium tetroxide (Electron Microscopy Science, Hat-
field, PA, USA). They were dehydrated in a graded series
of ethanol solutions, cleared in propylene oxide, and
embedded in Epon resin (Sigma), which was allowed to
polymerise for 48 h at 60°C. Ultrathin sections were cut,
stained with 5% uranyl acetate, 5% lead citrate, and placed
on EM grids coated with collodion. The sections were then
observed with a Jeol 1230 transmission electron micro-
scope (Tokyo, Japan) connected to a Gatan digital camera
driven by Digital Micrograph software (Gatan, Pleasanton,
CA, USA) for image acquisition and analysis. For immuno-
EM, transfected BHK-21 cells were fixed by incubation in
a solution containing 4% paraformaldehyde in 0.1 M
phosphate buffer (pH 7.2) for 16 h. The cells were col-
lected by centrifugation and the cell pellet was then
dehydrated in a graded series of ethanol solutions at
-20°C, using an automatic freezing substitution system
(AFS; Leica), and embedded in London resin white
(Electron Microscopy Science). The resin was allowed to
polymerise at -25°C, under UV light, for 72 h. Ultrathin
sections were cut and blocked by incubation with 1%
fraction V bovine serum albumin (BSA; Sigma) in PBS.
They were then incubated with anti-HCV core C7-50
monoclonal antibody diluted 1:50 in PBS supplemented
with 1% BSA, washed and incubated with goat anti-mouse
antibodies conjugated to 15 nm gold particles (British
Biocell International, Cardiff, UK) diluted 1:40 in PBS
supplemented with 0.1% BSA. We used conjugated goat
secondary antibodies without prior incubation with pri-
mary antibody to check that the reaction was specific.
Ultrathin sections were stained and observed as described
above.
Lipid droplet quantification and statistical analysis
We used our recently established method for morphometric
analysis of the lipid droplets encountered in cells [30].
Briefly, for each construct (b-Gal, WT core, VLV180-3-4
core mutant), the number and diameter (in lm) of lipid
droplets were determined on the computer screen for 100
consecutive EM (standard) sections of the transfected
BHK-21 cells. Lipid droplet diameter was converted into
an area in lm2. By summing these areas, we were able to
determine the cumulative lipid droplet area, in lm2, for
each cell section. Lipid droplet areas in 100 consecutive
EM sections of the transfected cells seemed to follow
mixed distributions. Indeed, the probability of observing a
null area (discrete component of the distribution) was non-
null, whereas a probability density function existed for all
non-zero values of cumulative areas (continuous compo-
nent of the distribution). We therefore categorised the
variable before carrying out statistical tests. Based on
Sturges’ rule, we defined seven classes of cumulative lipid
droplet area (0, 0–0.25, 0.25–0.5, 0.5–1, 1–1.5, 1.5–2 and
2–4 lm2), thereby defining an ordinal variable. Constructs
were compared by chi-squared test for trend taking into
account the ordinal nature of the newly created variables.
We also considered the proportion of cell sections with null
area which were compared by a chi-squared test. Data were
analysed with SAS 9.1 software.
Triglyceride quantification
Ten millions of BHK-21 cells transfected with recombinant
SFV RNA encoding the HCV WT, VLV180-3-4 core
protein or b-galactosidase were collected in 1 mL of PBS.
Total lipids extraction was performed using a method
adapted from Folch et al. [34]. Briefly 3 mL of a 2:1
chloroform–methanol (v/v) mixture and 1 mL water were
added to 1 mL of cell suspension. After homogenisation
and centrifugation the resulting mixture separated into two
phases. The lower phase containing total lipids was col-
lected, then evaporated, and lipids were dissolved in
isopropanol. Triglyceride concentration was then measured
by enzymatic reaction using the colorimetric kit TG PAP
150 (BioMerieux, Marcy l’Etoile, France). Data were dis-
played with the b-galactosidase as control (test/control
ratio of the optic density values).
M. Depla et al.
Three-dimensional (3D) reconstruction analysis
of whole cells producing the WT HCV core protein
We have recently described the use of serial EM sections
for the 3D reconstruction of large cellular microdomains in
cells producing the HCV core protein [35]. This previous
study demonstrated that the budding of the HCV-like
particles formed by self-assembly of the HCV core protein
was initiated mostly at ER membranes closely associated
with lipid droplets [34]. In this study, we used a similar
approach to reconstruct several whole BHK-21 cells pro-
ducing the WT HCV core protein. Briefly, we resized our
Epon blocks to cut a ribbon of serial ultrathin sections
(75 nm thick) of transfected cells. EM grids were stained as
described above, and electron micrographs were collected
with a digital camera for the same region of cells in each of
the series of sections. Photoshop software was used to align
image stacks for these serial EM sections. As the electron
beam distorts ultrathin sections slightly, it was necessary to
align the images based on the position of specific structures
of interest. Contours were carefully drawn with IMOD
software [36] through the same specific cellular structures
on different serial sections. These structures included the
plasma membrane, nuclear envelope, lipid droplets and
centrosome. The contours from a stack of serial sections
were then arranged into objects with IMOD. Using the
IMODmesh feature of IMOD, we then joined the contours
of each object to form a 3D model. Nine cells were ana-
lysed thoroughly to determine the subcellular distribution
of their lipid droplets. A lipid droplet cluster was defined as
at least three droplets grouped together, with the individual
droplets of the cluster separated by less than the mean
diameter of a lipid droplet (i.e. 0.5 lm). A lipid droplet
cluster was considered to be closely associated with a
centrosome if at least one lipid droplet from the cluster was
less than 1.5 lm from the nearest centriole.
Results
Expression and processing of HCV WT core
and VLV180-3-4 core mutant proteins
Sixteen hours after transfection with the constructs
encoding HCV core proteins or the b-gal control, the cells
were harvested and lysed for western blot analysis
(Fig. 1b). Consistent with our previous findings [30–33],
the WT core protein encoded by the Dj6.4 sequence
appeared to be fully cleaved by SPP, leading to the
detection of a p21 protein, whereas the VLV180-3-4 core
mutant remained uncleaved, resulting in the detection of a
p23 form of the core protein. We used Image J software for
gel analysis to quantify the WT and mutant core proteins in
the scanned blot and found that these two proteins were
present in similar amounts.
Colocalisation of HCV core proteins with lipid droplets
Nile Red labelling in cells transfected with the b-gal con-
struct showed that lipid droplets were evenly distributed
throughout the cytoplasm (Fig. 1c). Transfection with the
WT core construct induced the clustering of large lipid
droplets in the perinuclear area, as previously reported for
our model [30, 33] and for other in vitro cellular models
[28]. The surface of these droplets was strongly stained for
HCV core protein, as previously described in these models
[28, 30, 33]. Transfection with the VLV180-3-4 core
mutant construct did not induce lipid droplet clustering,
and this mutant core protein displayed only a weak asso-
ciation with lipids, which were evenly distributed
throughout the cytoplasm, as previously described [33].
Similar results were obtained when the experiment was
repeated and for analyses of large numbers of cells (only
one cell is shown for each construct in Fig. 1c, to show the
colocalisation of HCV core proteins and lipid droplets as
clearly as possible).
Electron microscopy and immuno-electron microscopy
Standard electron microscopy showed that the ultrastruc-
tural changes observed in cells transfected with
recombinant SFV vectors encoding the WT core protein
were consistent with our previous findings [30, 33], with
the clustering of large lipid droplets in the perinuclear area
(Fig. 2, top). These lipid droplet clusters were systemati-
cally surrounded by convoluted ER membranes rich in
HCV-like particles budding towards the lumen of this
convoluted ER compartment, as previously described
(Fig. 2) [35]. Transfection with b-Gal RNA had no effect
on ER morphology, with linear ER membranes evenly
distributed throughout the cytoplasm (not shown).
Immuno-electron microscopy on freeze-substituted cells
producing the WT core protein showed that the surface of
the clustered lipid droplets and their surrounding ER
membranes stained strongly positive for HCV core protein
(Fig. 2, bottom). Standard electron microscopy in cells
transfected with the recombinant SFV RNA encoding the
VLV180-3-4 core mutant revealed multiple layers of dense
ER membranes, as previously described [33] (Fig. 2, top).
It has been suggested that this particular mutant, which is
not processed by SPP and thus remains anchored in the ER
membrane by its transmembrane sequence signal, induces
these multi-layered ER membranes by protein–protein
interaction [33]. This hypothesis was recently confirmed by
another group [37]. Immuno-electron microscopy on
freeze-substituted cells producing this mutant showed that
HCV-induced lipid droplet clustering
these multi-layered ER membranes were strongly positive
for HCV core protein (Fig. 2, bottom).
Lipid droplet quantification
We determined the cumulative area covered by lipid
droplets for 100 consecutive cell sections, for each con-
struct, studied in random order (Fig. 3). The cumulative
area of the lipid droplets was higher for both core proteins
than for the control protein b-gal (p\ 0.0001 for the WT
core protein; p = 0.0029 for the VLV180-3-4 core mutant).
This cumulative area was greater for the WT core protein
than for the VLV180-3-4 mutant core protein, although this
difference was of low significance (p = 0.0634). However,
the proportion of cell sections with null areas (thick lines in
0) was lower with the WT core protein than with the VLV
180/3/4 core mutant protein (respectively, 35 vs 56%,
p = 0.003).
Triglyceride quantification
We measured the total amount of triglycerides in cells
transfected with the various constructions, using a com-
mercially available colorimetric assay. Triglyceride
accumulation in cell producing the VLV180-3-4 core
mutant or the WT core protein was about 1.5-fold and
2.0-fold with respect to the control b-galactosidase protein,
respectively (Fig. 4).
3D reconstruction analysis of whole cells producing
the WT HCV core protein
Nine cells producing the WT core protein and containing at
least one lipid droplet cluster were fully reconstructed in
3D with our method based on serial EM sections (between
150 and 180 sections for a typical cell). We considered a
lipid droplet cluster to have formed when three of more
Fig. 2 Electron micrographs of ultrathin sections of BHK-21 cells
producing the WT core or VLV180-3-4 core mutant protein studied by
regular EM (upper image) or freeze substitution and immunogold
labelling with a monoclonal anti-HCV core (lower image). Cells
producing the WT core protein contained convoluted ER membranes
surrounding clusters of lipid droplets (LD). These convoluted
membranes surrounding the droplets and the surface of the droplets
themselves stained strongly for the HCV core by immunogold
labelling. Cells producing the VLV180-3-4 core mutant contained
abundant electron-dense, multi-layered structures formed by the
interaction of multiple ER membranes (see also the inset correspond-
ing to an enlargement of the area indicated by the arrow). These
multi-layered ER membranes were strongly positive for the HCV core
protein on immunogold labelling. No gold labelling was detected at
the surface of the lipid droplets in these cells. All these structures
were specific to the HCV core protein, as none of these modifications
or immunogold labelling was detected in cells producing b-gal (data
not shown). Scale bars 0.5 lm in all micrographs
M. Depla et al.
lipid droplets were found in close proximity (less than the
mean lipid droplet diameter, 0.5 lm, apart). We observed
1–4 lipid droplet clusters per cell in these nine cells and
analysed 20 lipid droplet clusters in total. A lipid droplet
cluster was considered to be associated with a centrosome
when at least one of the lipid droplets of the cluster was
found to be located less than 1.5 lm from the nearest
centriole. Only 4 out of these 20 lipid droplet clusters
observed were associated with a centrosome. In the cases in
which only one lipid droplet cluster per cell was observed,
the lipid droplet cluster concerned was never associated
with the centrosome. Figure 5 illustrates a typical cell with
a single large lipid droplet cluster, in which the centrosome
is opposite the lipid droplet cluster within the cytoplasm
(see also the QuickTime movie of the 3D reconstruction of
this cell in the electronic supplementary material, which
illustrates the spatial distribution of these different organ-
elles within the cell).
Discussion
A recent study assessing the spatial dispersion of lipid
droplets through the cytoplasm by confocal microscopy
demonstrated that these organelles group together in clus-
ters in the perinuclear area of HCV-infected cells [28].
Disruption of the microtubule network or the microinjec-
tion of dynein antibodies prevent the formation of these
Fig. 3 Quantification of the
cumulative area covered by
lipid droplets in sections of
BHK-21 cells producing the
WT core protein, the
VLV180-3-4 core mutant or the
b-galactosidase control protein.
The cumulative area covered by
lipid droplets per cell section (in
lm2) was determined on 100
consecutive cell sections for
each protein. The cumulative
lipid droplet area was
categorised into seven classes:
0, 0–0.25, 0.25–0.5, 0.5–1,
1–1.5, 1.5–2 and 2–4 lm2. The
probability distributions were
mixed distributions. The thick
line in 0 indicates the frequency
of null areas, whereas non-null
areas are presented as
histograms. The chi-squared test
associated with the comparison
of the WT core with the
VLV180-3-4 core mutant or
b-galactosidase yielded p values
of 0.0634 and\0.0001,
respectively. The chi-squared
test associated with the
comparison of VLV180-3-4 core
mutant with b-galactosidase
yielded a p value of 0.0029
HCV-induced lipid droplet clustering
clusters, which are thought to occur specifically around the
centrosome. The authors of this previous study interpreted
these results as indicating a global redistribution of the pre-
existing lipid droplets following HCV infection, through
the trafficking of these organelles along the microtubule
network and towards the centrosome. This phenomenon
was observed in the hepatoma cell line Huh7 infected with
the complete virus (the JFH-1 strain), and also in Huh7
cells producing only the mature HCV core protein of var-
ious genotypes [28]. An immature core protein (i.e. not
cleaved by SPP) did not induce these specific clusters in the
Huh7 cells and the lipid droplets therefore remained dis-
persed through the cytoplasm. This previous study was
based on a system of core protein production from an SFV
vector, resulting in the rapid induction of these lipid droplet
clusters in 16 h, rather than 3 days required in cells
infected with the complete virion [28]. To investigate this
phenomenon further, we used here SFV vectors to produce
the mature and immature core proteins in the BHK-21 cell
line. This cell line was chosen for the high percentage of
transfected cells (near 100%) reached after electroporation,
allowing a better analysis of the changes induced by the
core proteins in the lipid droplets amount. Moreover, this
cell line has been previously shown to accumulate tri-
glycerides in cytoplasmic lipid droplets [38]. We used
different EM approaches such as immuno-EM, 3D recon-
structions and EM for lipid droplet quantification. EM has
been shown to be a more appropriate method than light
microscopy for quantifying the lipid droplets within cells
[35], and 3D EM reconstructions gave a more precise
subcellular localisation of centrosomes and lipid droplets.
Our morphometric analysis of lipid droplets in cells
transfected with the various constructs clearly shows that
HCV core protein production is associated with a larger
cumulative area being covered by lipid droplets. This
greater area was observed for both the mature (WT) and
immature (uncleaved mutant) forms of the HCV core
protein. This was also supported by the quantification of
the triglycerides in the transfected cells, showing an
increase in triglyceride synthesis in cells producing the WT
and mutant core proteins, as compared to the b-galactosi-
dase control protein. Thus, the various mechanisms
potentially involved in core-induced steatosis, including
Fig. 4 Triglyceride quantification in BHK-21 cells producing the
WT core protein, the VLV180-3-4 core mutant, or the b-galactosidase
control protein, using a commercially available assay (Biomerieux).
Data are displayed with the b-galactosidase as control (test/control
ratio of the optic density values), and are mean ± standard deviations
of four independent quantifications
Fig. 5 Three-dimensional reconstruction of a BHK-21 cell producing
the WT core protein. a Typical single ultrathin section of this cell,
showing its centrosome (arrow and enlargement in the inset) distant
from the cluster of lipid droplets (LD). Bars 2 lm. b Four different
views of the reconstruction of this cell obtained with IMOD software
and a total of 145 serial ultrathin (60–70 nm thick) EM sections,
showing the plasma membrane (light green), the nucleus (purple), the
centrosome (light purple and arrow) and the lipid droplets (yellow).
The cluster of lipid droplets is located in a cellular domain opposite to
the centrosome (arrows). A QuickTime movie of this 3D reconstruc-
tion is also provided in the electronic supplemental material
M. Depla et al.
lipogenic gene expression [13–16], the modulation of
lipogenic protein functions [17, 18], and effects on mito-
chondrial oxidative function [19–21] may also potentially
be induced by an uncleaved HCV core protein. Both
mature and immature core proteins have been shown to be
involved in upregulation of the fatty acid synthetase (FAS)
gene promoter [39]. Our results suggest that the change in
the distribution of lipid droplets observed in cells produc-
ing the mature core protein is not due simply to the
redistribution of the pre-existing droplets. This redistribu-
tion seems instead to be associated with the synthesis of
new lipid droplets, due to the direct lipogenic effects of the
HCV core protein. Further support for this interpretation is
also provided by our 3D reconstructions of whole cells
producing the mature core protein. These 3D reconstruc-
tions show that clusters of lipid droplets do not specifically
arise close to the centrosome. The precise localisation of
the lipid droplets clusters and centrosomes possible with
this EM approach and the use of serial ultrathin sections is
not consistent with the formation of these clusters by the
simple migration of pre-existing droplets towards the
centrosome. Again, our 3D EM analysis is more consistent
with the de novo synthesis of lipid droplets at the site of
cluster formation.
It remains unclear how triglycerides and other neutral
lipids are packaged into cytosolic droplets. Several
hypotheses have been proposed concerning nascent lipid
droplet formation [39–42]. According to the most widely
supported of these hypotheses, lipids accumulate between
the two leaflets of the ER membrane, gradually taking on a
globular shape and then being pinched off from the ER to
become independent lipid droplets surrounded by a single,
ER-derived, monolayer membrane [40–43]. However,
neither nascent lipid droplets nor lipid deposition in the ER
membrane has ever been visualised, due to technical con-
straints and the extremely rapid nature of this phenomenon,
which takes place over the course of a few minutes [44].
Nevertheless, it has been suggested that the proteins of the
PAT (perilipin-adipophilin-Tip47) family, which coat the
lipid droplets, may be involved in this mechanism [45]. All
PAT proteins have similar sequences and can bind to the
surface of intracellular lipid droplets, either constitutively
or in response to metabolic stimuli, such as an increased in
lipid flux into or out of lipid droplets [46]. Each PAT
protein has a unique tissue distribution, subcellular locali-
sation and lipid-binding properties consistent with each of
these proteins playing a unique role in triglyceride man-
agement [47]. These proteins are exchangeable at the
surface of the lipid droplets in various conditions, and these
exchanges regulate the storage of lipids within the cell [45,
46]. It has been suggested that PAT family proteins not
only coat the droplets but actually order triglyceride
packaging, by managing the interface between the droplet
and the cytosol and contributing to membrane curvature
and the pinching off of the lipid droplet [45]. It has been
shown that the mature HCV core displaces adipophilin
from the surface of the lipid droplet [28]. Thus, in cells
producing the mature HCV core protein, lipid droplets may
emerge from the ER membranes in which the core protein
is synthesised, due to a specific role of the mature core
protein in lipid droplet morphogenesis. This may also
explain how the HCV core protein replaces adipophilin at
the surface of the lipid droplet. Immuno-EM observations,
such as that shown for the mature/WT core protein in
Fig. 2 support this model. Indeed, the lipid droplets seem to
emerge from ER membranes rich in HCV core protein.
Similar findings were obtained if the experiment was
repeated and for large numbers of cells. It is indeed diffi-
cult to believe that lipid droplets dispersed throughout the
cytoplasm would move specifically towards these areas
with a core-rich ER membrane. It seems more likely that
these lipid droplets surrounded by the HCV core protein
bud from these specific ER domains enriched in core
protein. So, what makes this phenomenon possible? Recent
studies have suggested that lipid droplets are extremely
dynamic organelles that may undergo repeated cycles of
fusion and fission with the ER membrane, thereby accu-
mulating or regressing within the confines of ER
membranes [40, 41, 43, 47]. Lipids may then diffuse lat-
erally in the ER towards the nascent lipid droplets [43].
This movement of lipid droplet may make it possible to
deliver lipids to various membrane organelles in the cell for
lipid exchange [48]. The fusion and fission of lipid droplets
is probably favoured by the mobility of these organelles
along the microtubule network [41, 48]. This could concern
the radial, centrosome-attached microtubules and also the
whole network of non-centrosomal microtubules. Thus,
this mobility would account for the prevention of lipid
droplet clustering in response to HCV core protein fol-
lowing disruption of the microtubule network or the
microinjection of antibodies against motor proteins such as
dynein [28].
Cells producing the WT/mature core protein contained
larger amounts of lipid droplets than cells producing the
immature/uncleaved mutant core protein. The reason for
this difference is unknown, but it may be due to the ability
of the mature core protein to localise at the surface of the
lipid droplets, contributing to the morphogenesis of these
organelles. Indeed, the overexpression of various members
of the PAT family, such as adipophilin and perilipin, is
associated with an expansion of the pool of lipid droplets
within the cell [49–51]. The HCV mature core protein
present at the surface of the lipid droplet may exert an
additional effect through specific lipid interaction,
increasing the number and/or size of lipid droplets within
the cell, or by inducing the fusion of many small and
HCV-induced lipid droplet clustering
invisible lipid droplets forming large, more visible drop-
lets. Alternatively, the mature core protein may induce a
higher amount of triglyceride synthesis, as suggested by
our intracellular triglyceride quantification. However, all
these mechanisms may act together to induce the accu-
mulation of lipid droplets in clusters seen in cells
producing the WT HCV core protein, the fusion of nascent
or existing lipid droplets to form larger droplets remaining
a matter of debate [52].
In conclusion, we have shown that the clustering of lipid
droplets induced by the HCV core protein does not result
from a simple redistribution of pre-existing organelles.
Instead, the HCV core protein seems to induce the de novo
synthesis of lipid droplets in the perinuclear area of the
cell. These results provide some insight into how HCV
‘‘hijacks’’ these organelles for its own life cycle. They also
shed light on the mechanisms of lipid droplet morpho-
genesis and dynamic, which have remained poorly
understood. Furthermore, our study demonstrates that the
formation of these clusters by the HCV core protein is
associated with a major increase in the cumulative area
covered by lipid droplets. This increase may be due to the
intrinsic properties of the core protein (mature or imma-
ture) and its interaction with various molecules involved in
the lipid metabolism, but may also be due in part to the
ability of the mature core protein to coat the nascent lipid
droplets. These results should help to guide future studies
of the mechanisms involved in the pathogenesis of HCV-
induced liver steatosis.
Acknowledgment This work was supported by a grant INSERM-
DHOS « Virosteatose ». M.D. was supported by a fellowship from
the INSERM and Region Centre. We thank Dr Mario Mondelli
(Istituto di Clinica delle Malattie Infettive, Pavia, Italy) for providing
us with the monoclonal B12F8 anti-HCV core reagent. We thank
Sylvie Trassard and Fabienne Arcanger for technical assistance. We
thank Bruno Giraudeau, Eric Piver and Pierre Besson for helpful
discussions and feedback on this work. Our data were obtained with
the assistance of the RIO Electron Microscopy Facility of Francois
Rabelais University.
References
1. Alter MJ, Mast EE, Moyer LA, Margolis HS (1998) Hepatitis C.
Infect Dis Clin North Am 12:13–26
2. Asselah T, Rubbia-Brandt L, Marcellin P, Negro F (2006) Stea-
tosis in chronic hepatitis C: why does it really matter? Gut
55:123–130
3. Adinolfi LE, Gambardella M, Andreana A, Tripodi MF, Utili R,
Ruggiero G (2001) Steatosis accelerates the progression of liver
damage of chronic hepatitis C patients and correlates with spe-
cific HCV genotype and visceral obesity. Hepatology 33:1358–
1364
4. Rubbia-Brandt L, Fabris P, Paganin S, Leandro G, Male PJ,
Giostra E, Carlotto A, Bozzola L, Smedile A, Negro F (2004)
Steatosis affects chronic hepatitis C progression in a genotype-
specific way. Gut 53:406–412
5. Goodman ZD, Ishak KG (1995) Histopathology of hepatitis C
virus infection. Semin Liver Dis 15:70–81
6. Monto A, Alonzo J, Watson JJ, Grunfeld C, Wright TL (2002)
Steatosis in chronic hepatitis C: relative contributions of obesity,
diabetes mellitus, and alcohol. Hepatology 36:729–736
7. Castera L, Hezode C, Roudot-Thoraval F, Lonjon I, Zafrani ES,
Pawlotsky JM, Dhumeaux D (2004) Effect of antiviral treatment
on evolution of liver steatosis in patients with chronic hepatitis C:
indirect evidence of a role of hepatitis C virus genotype 3 in
steatosis. Gut 53:420–424
8. Kumar D, Farrell GC, Fung C, George J (2002) Hepatitis C virus
genotype 3 is cytopathic to hepatocytes: reversal of hepatic steatosis
after sustained therapeutic response. Hepatology 36:1266–1272
9. Poynard T, Ratziu V, McHutchison J, Manns M, Goodman Z,
Zeuzem S, Younossi Z, Albrecht J (2003) Effect of treatment
with peginterferon or interferon alfa-2b and ribavirin on steatosis
in patients infected with hepatitis C. Hepatology 38:75–85
10. Moradpour D, Penin F, Rice CM (2007) Replication of hepatitis
C virus. Nat Rev Microbiol 5:453–463
11. Moriya K, Yotsuyanagi H, Shintani Y, Fujie H, Ishibashi K,
Matsuura Y, Miyamura T, Koike K (1997) Hepatitis C virus core
protein induces hepatic steatosis in transgenic mice. J Gen Virol
78:1527–1531
12. Moriya K, Fujie H, Shintani Y, Yotsuyanagi H, Tsutsumi T,
Ishibashi K, Matsuura Y, Kimura S, Miyamura T, Koike K
(1998) The core protein of hepatitis C virus induces hepatocel-
lular carcinoma in transgenic mice. Nat Med 4:1065–1067
13. Dharancy S, Malapel M, Perlemuter G, Roskams T, Cheng Y,
Dubuquoy L, Podevin P, Conti F, Canva V, Philippe D, Gambiez
L, Mathurin P, Paris JC, Schoonjans K, Calmus Y, Pol S, Auwerx
J, Desreumaux P (2005) Impaired expression of the peroxisome
proliferator-activated receptor alpha during hepatitis C virus
infection. Gastroenterology 128:334–342
14. Tanaka N, Moriya K, Kiyosawa K, Koike K, Gonzalez FJ,
Aoyama T (2008) PPARalpha activation is essential for HCV
core protein-induced hepatic steatosis and hepatocellular carci-
noma in mice. J Clin Invest 118:683–694
15. Waris G, Felmlee DJ, Negro F, Siddiqui A (2007) Hepatitis C
virus induces proteolytic cleavage of sterol regulatory element
binding proteins and stimulates their phosphorylation via oxida-
tive stress. J Virol 81:8122–8130
16. Kim KH, Hong SP, Kim K, Park MJ, Kim KJ, Cheong J (2007)
HCV core protein induces hepatic lipid accumulation by acti-
vating SREBP1 and PPARgamma. Biochem Biophys Res
Commun 355:883–888
17. Yamaguchi A, Tazuma S, Nishioka T, Ohishi W, Hyogo H,
Nomura S, Chayama K (2005) Hepatitis C virus core protein
modulates fatty acid metabolism and thereby causes lipid accu-
mulation in the liver. Dig Dis Sci 50:1361–1371
18. Perlemuter G, Sabile A, Letterton P, Vona G, Topilco A, Chretien
Y, Koike K, Pessayre D, Chapman J, Barba G, Brechot C.
Hepatitis C virus core protein inhibits microsomal triglyceride
transfer protein activity and very low density lipoprotein secre-
tion: a model of viral-related steatosis. FASEB J 16: 185-194
19. Okuda M, Li K, Beard MR, Showalter LA, Scholle F, Lemon
SM, Weinman SA (2002) Mitochondrial injury, oxidative stress,
and antioxidant gene expression are induced by hepatitis C virus
core protein. Gastroenterology 122:366–375
20. Korenaga M, Wang T, Li Y, Showalter LA, Chan T, Sun J,
Weinman SA (2005) Hepatitis C virus core protein inhibits
mitochondrial electron transport and increases reactive oxygen
species (ROS) production. J Biol Chem 280:37481–37488
21. Machida K, Cheng KT, Lai CK, Jeng KS, Sung VM, Lai MM
(2006) Hepatitis C virus triggers mitochondrial permeability
M. Depla et al.
transition with production of reactive oxygen species, leading to
DNA damage and STAT3 activation. J Virol 80:7199–7207
22. Moradpour D, Englert C, Wakita T, Wands JR (1996) Charac-
terization of cell lines allowing tightly regulated expression of
hepatitis C virus core protein. Virology 222:51–63
23. Barba G, Harper F, Harada T, Kohara M, Goulinet S, Matsuura
Y, Eder G, Schaff Z, Chapman MJ, Miyamura T, Brechot C
(1997) Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic
localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc
Natl Acad Sci USA 94:1200–1205
24. Hope RG, McLauchlan J (2000) Sequence motifs required for
lipid droplet association and protein stability are unique to the
hepatitis C virus core protein. J Gen Virol 81:1913–1925
25. Shi ST, Polyak SJ, Tu H, Taylor DR, Gretch DR, Lai MM (2002)
Hepatitis C virus NS5a colocalizes with the core protein on lipid
droplets and interacts with apolipoproteins. Virology 292:198–
210
26. Roingeard P, Hourioux C (2008) Hepatitis C virus core protein,
lipid droplets and steatosis. J Viral Hepat 15:157–164
27. Miyanari Y, Atsuzawa K, Usuda N, Watashi K, Hishiki T, Zayas
M, Bartenschlager R, Wakita T, Hijikata M, Shimotohno K
(2007) The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C
virus production. Nat Cell Biol 9:1089–1097
28. Boulant S, Douglas MW, Moody L, Budkowska A, Targett-
Adams P, McLauchlan J (2008) Hepatitis C virus core protein
induces lipid droplet redistribution in a microtubule and dynein-
dependent manner. Traffic 9:1268–1282
29. McLauchlan J, Lemberg MK, Hope G, Martoglio B (2002) In-
tramembrane proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus
core protein to lipid droplets. EMBO J 21:3980–3988
30. Hourioux C, Patient R, Morin A, Blanchard E, Moreau A,
Trassard S, Giraudeau B, Roingeard P (2007) The genotype
3-specific hepatitis C virus core protein residue phenylalanine
164 increases steatosis in an in vitro cellular model. Gut 56:1302–
1308
31. Blanchard E, Brand D, Trassard S, Goudeau A, Roingeard P
(2002) Hepatitis C virus-like particle morphogenesis. J Virol
76:4073–4079
32. Blanchard E, Hourioux C, Brand D, Ait-Goughoulte M, Moreau
A, Trassard S, Sizaret PY, Dubois F, Roingeard P (2003) Hep-
atitis C virus-like particle budding: role of the core protein and
importance of its Asp111. J Virol 77:10131–10138
33. Ait-Goughoulte M, Hourioux C, Patient R, Trassard S, Brand D,
Roingeard P (2006) Core protein cleavage by signal peptide
peptidase is required for hepatitis C virus-like particle assembly.
J Gen Virol 87:855–860
34. Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH (1957) A simple method for
the isolation and purification of total lipids from animal tissues.
J Biol Chem 226:497–509
35. Roingeard P, Hourioux C, Blanchard E, Prensier G (2008) Hep-
atitis C virus budding at lipid droplet-associated ER membrane
visualized by 3D electron microscopy. Histochem Cell Biol
130:561–566
36. Kremer JR, Mastronarde DN, McIntosh JR (1996) Computer
visualization of three-dimensional image data using IMOD.
J Struct Biol 116:71–76
37. Ai LS, Lee YW, Chen SS (2009) Characterization of hepatitis C
virus core protein multimerization and membrane envelopment:
revelation of a cascade of core-membrane interactions. J Virol
83:9923–9939
38. Kasurinen J (1992) A novel fluorescent fatty acid, 5-methyl-bdy-
3-dodecanoic acid, is a potential probe in lipid transport studies
by incorporating selectively to lipid classes of BHK cells. Bio-
chem Biophys Res Commun 187:1594–1601
39. Jackel-Cram C, Babiuk LA, Qiang L (2007) Up-regulation of
fatty acid synthase promoter by hepatitis C virus core protein:
genotype-3a core has a stronger effect than genotype-1b core.
J Hepatol 6:999–1008
40. Ohsaki Y, Cheng J, Suzuki M, Shinohara Y, Fujita A, Fujimoto T
(2009) Biogenesis of cytoplasmic lipid droplets: from the lipid
ester globule in the membrane to the visible structure. Biochim
Biophys Acta 1791:399–407
41. Fujimoto T, Ohsaki Y, Cheng J, Suzuki M, Shinohara Y (2008)
Lipid droplets: a classic organelle with new outfits. Histochem
Cell Biol 130:263–279
42. Thiele C, Spandl J (2008) Cell biology of lipid droplets. Curr
Opin Cell Biol 20:378–385
43. Walther TC, Farese RV Jr (2009) The life of lipid droplets.
Biochim Biophys Acta 1791:459–466
44. Kuerschner L, Moessinger C, Thiele C (2008) Imaging of lipid
biosynthesis: how a neutral lipid enters lipid droplets. Traffic
9:338–352
45. Wolins NE, Brasaemle DL, Bickel PE (2006) A proposed model
of fat packaging by exchangeable lipid droplet proteins. FEBS
Lett 580:5484–5491
46. Bickel PE, Tansey JT, Welte MA (2009) PAT proteins, an
ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid
stores. Biochim Biophys Acta 1791:419–440
47. Goodman JM (2008) The gregarious lipid droplet. J Biol Chem
283:28005–28009
48. Zehmer JK, Huang Y, Peng G, Pu J, Anderson RG, Liu P (2009)
A role for lipid droplets in inter-membrane lipid traffic. Proteo-
mics 9:914–921
49. Imamura M, Inoguchi T, Ikuyama S, Taniguchi S, Kobayashi K,
Nakashima N, Nawata H (2002) ADRP stimulates lipid accu-
mulation and lipid droplet formation in murine fibroblasts. Am J
Physiol Endocrinol Metab 283:775–783
50. Fukushima M, Enjoji M, Kohjima M, Sugimoto R, Ohta S, Kotoh
K, Kuniyoshi M, Kobayashi K, Imamura M, Inoguchi T, Naka-
muta M, Nawata H (2005) Adipose differentiation related protein
induces lipid accumulation and lipid droplet formation in hepatic
stellate cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim 41:321–324
51. Listenberger LL, Ostermeyer-Fay AG, Goldberg EB, Brown WJ,
Brown DA (2007) Adipocyte differentiation-related protein
reduces the lipid droplet association of adipose triglyceride lipase
and slows triacylglycerol turnover. J Lipid Res 48:2751–2761
52. Cheng J, Fujita A, Ohsaki Y, Suzuki M, Shinohara Y, Fujimoto T
(2010) Quantitative electron microscopy shows uniform incor-
poration of triglycerides into existing lipid droplets. Histochem
Cell Biol 132:281–291
HCV-induced lipid droplet clustering
98
Article 2
The birth and life of lipid droplets: learning from the hepatitis
C virus
Phillippe ROINGEARD and Marion DEPLA
Publié en 2011 dans Biology of the Cell
Biol. Cell (2011) 103, 223–231 (Printed in Great Britain) doi:10.1042/BC20100119 Scientiae forum
Models and Speculations
The birth and life of lipid droplets:learning from the hepatitisC virusPhilippe Roingeard1 and Marion Depla
INSERM U966, Universite Francois Rabelais and CHRU de Tours, 10 Boulevard Tonnelle, 37032 Tours, France
LDs (lipid droplets) are probably the least well-characterized cellular organelles. Having long been considered simple
lipid storage depots, they are now considered to be dynamic organelles involved in many biological processes.
However, most of the mechanisms driving LDs biogenesis, growth and intracellular movement remain largely
unknown. As for other cellular mechanisms deciphered through the study of viral models, HCV (hepatitis C virus) is
an original and relevant model for investigations of the birth and life of these organelles. Recent studies in this model
have raised the hypothesis that the HCV core protein induces the redistribution of LDs through the regression and
regeneration of these organelles in specific intracellular domains.
IntroductionCytoplasmic LDs (lipid droplets) are intracellular
structures that store neutral lipids. Until recently,
they were classified into the same category as glyco-
gen granules, as simple inert storage sites for energy,
increasing and decreasing as a function of metabolic
energy requirements. However, considerable interest
has recently been focused on LDs as dynamic organ-
elles at the hub of lipid exchanges between intra-
cellular compartments and energy metabolism (Mar-
tin and Parton, 2006; Murphy et al., 2009). Major
findings highlighting the dynamic nature of LDs
include the identification of key proteins involved
in LD biology and the discovery of differences in
the protein and lipid compositions of LDs in differ-
ent cell types and physiological states (Bickel et al.,
2009). There is also increasing evidence to suggest
that LDs interact dynamically with other membrane-
bound organelles, including the ER (endoplasmic
1To whom correspondence should be addressed at: Laboratoire de BiologieCellulaire, INSERM U966, Faculte de Medecine, Universite Francois Rabelais,10 Boulevard Tonnelle, 37032 Tours, France (emailroingeard@med.univ-tours.fr).Key words: endoplasmic reticulum (ER), hepatitis C virus (HCV), lipid droplet(LD), organelle dynamics.Abbreviations used: ADRP, adipose differentiation-related protein; BHK-21cell, baby-hamster kidney-21 cell; DGAT1, diacylglycerol acyltransferase-1;DGAT2, diacylglycerol acyltransferase-2; ER, endoplasmic reticulum; HCV,hepatitis C virus; LD, lipid droplet; NS, non-structural; SP, signal peptidase;SPP, signal peptide peptidase; TEM, transmission electron microscopy.
reticulum), mitochondria, endosomes, peroxisomes
and the plasma membrane, probably as a means
of providing these organelles with neutral lipids
and phospholipids (Goodman, 2008; Murphy et al.,
2009). More intriguingly, LDs have also been shown
to have a number of unexpected functions such as
constituting a protective reservoir for unfolded pro-
teins or other compounds unrelated to lipids to pre-
vent harmful interactions with other cell components
(Ohsaki et al., 2006; Welte, 2007).
However, despite rapid progress in LD research, the
mechanisms underlying the formation and dynam-
ics of LDs remain elusive. Recent studies on HCV
(hepatitis C virus), an important human pathogen,
have demonstrated that HCV uses LDs as a platform
for viral assembly (Miyanari et al., 2007). This phe-
nomenon is linked to the ability of the HCV core pro-
tein to induce the redistribution of LDs, through the
clustering of these organelles in the perinuclear area
(Boulant et al., 2008; Depla et al., 2010). Many other
cellular mechanisms have already been deciphered by
studying viruses, and HCV may be a relevant model
for elucidating the birth and life of LDs.
LD morphology and compositionAlthough best known for their role in lipid stor-
age in mammalian adipocytes in adipose tissue, LDs
are present in almost all eukaryotic cells, including
www.biolcell.org | Volume 103 (5) | Pages 223–231 223
Bio
log
y o
f th
e C
ell
ww
w.b
iolc
ell
.org
P. Roingeard and M. Depla
yeasts, and even in some prokaryotes. Unlike vesicular
organelles, the aqueous contents of which are enclosed
by a phospholipid bilayer, LDs consist of a highly hy-
drophobic lipid core surrounded by a phospholipid
monolayer (Murphy and Vance, 1999; Tauchi-Sato
et al., 2002). On TEM (transmission electron mi-
croscopy) analysis of conventional ultrathin sections,
LDs are visible as spherical structures with a highly
homogeneous content (Figure 1A).
LDs store neutral lipids, predominantly triacylgly-
cerols and sterol esters. These substances are crucial
for the cell. Triacylglycerols are the principle com-
pounds used for energy storage, and both triacylgly-
cerols and sterol esters serve as reservoirs of membrane
lipid components. Adipocytes contain mostly tri-
acylglycerols, whereas macrophages contain mostly
sterol esters. Ether-linked glycerolipids also account
for 10–20 % of the lipids in several cultured cell
lines (Bartz et al., 2007a). The phospholipids form-
ing the monolayer, with their inward-pointing acyl
chains, are essentially very similar to those found
in the ER (Bartz et al., 2007a). However, differ-
ent proteins are present on the surface of LDs. Per-
ilipin, which is found in adipose tissues, is one of the
best-studied proteins associated with LDs (Greenberg
et al., 1991). Perilipin stabilizes the LDs and is
also essential for lipolysis, becoming highly phos-
phorylated upon adrenergic stimulation, thereby at-
tracting hormone-sensitive lipase to the LD (Sztalryd
et al., 2003). However, perilipin belongs to a larger
family of animal LD-binding proteins, all contain-
ing the PAT domain, named after the three founding
members of this family: perilipin, adipophilin [or
ADRP (adipose differentiation-related protein)] and
TIP47 (tail interacting protein of 47 kDa). More re-
cently, a new nomenclature leading to the name of
PLIN proteins has been established for the mam-
malian PAT-proteins (Kimmel et al., 2010). Each
PAT/PLIN protein has unique tissue and subcellu-
lar distributions, and LD-binding properties consist-
ent with a unique role in LD content management
(Goodman, 2008). Some of these proteins are ex-
changeable at the surface of LDs in various condi-
tions and regulate the storage of lipids within the cell
(Wolins et al., 2006; Bickel et al., 2009). Individual
cells may also contain subsets of LDs with different
populations of PAT/PLIN proteins, varying with size,
age and the level of metabolic activity (Wolins et al.,
2006; Brasaemle, 2007; Digel et al., 2010).
LDs have been subject to many proteomic studies
in recent years (Bartz et al., 2007b; Hodges and Wu,
2010). These studies unexpectedly picked up pro-
teins regulating trafficking pathways, such as mem-
bers of both the Rab and ARF (ADP-ribosylation
factor) families of small GTPases, caveolin and other
proteins thought to be specific for vesicle-docking
events in exocytosis pathways. Of the potentially
LD-associated Rab proteins, only a limited number
have been examined in detail in the context of the
LD. However, Rab18 has received particular atten-
tion because it shows specific regulated localization to
the surface of LDs (Ozeki et al., 2005; Martin et al.,
2005). The identification of these proteins on LDs
provides evidence for a role for LDs in communica-
tions between organelles (Zehmer et al., 2009a). In
addition, motor proteins, such as dynein and kinesin,
have been identified in some LDs, suggesting the pos-
sible movement of these structures on microtubules
during the transfer of molecules to various organelles
(Zehmer et al., 2009a).
LD formationThere is considerable evidence to indicate that LDs
are derived from the ER. TEM studies have revealed
that LDs are tightly associated with the ER mem-
brane (Figure 1B), and proteomic studies of LDs isol-
ated from various cell lines have revealed the pres-
ence of many ER proteins (Liu et al., 2004; Bra-
saemle et al., 2004; Wan et al., 2007). It has been
suggested that LDs associated closely with the ER,
with the ER membrane forming a structure resem-
bling an egg cup and holding the LD, which re-
sembles an egg (Robenek et al., 2006). However,
the prevailing model for LD formation involves the
emergence of LDs from the ER lipid bilayer as a
lens-shaped mass of neutral lipids that then buds
off from the cytoplasmic face of the bilayer to form
a droplet within the cytoplasm (Brasaemle, 2007;
Wolins et al., 2006). It has been suggested that ex-
changeable PAT/PLIN proteins curve the ER mem-
brane to mediate this budding, acting as coatamer-
like proteins (Wolins et al., 2006). This model is
attractive because it accounts for the phospholipid
monolayer surrounding LDs and localizes the birth-
place of LDs to the organelle in which the enzymes
mediating neutral lipid synthesis are found on bio-
chemical analysis. Moreover, DGAT2 (diacylglycerol
224 C© The Authors Journal compilation C© 2011 Portland Press Limited
Lipid droplets in HCV infection Scientiae forum
Figure 1 Three-dimensional reconstruction from serial ultrathin sections of a subcellular domain containing LDs
(A) Sample of one (central) TEM ultrathin section of this subcellular domain, showing the LDs (yellow), ER (light blue) and
mitochondria (brown). (B) View of a full reconstruction, using the same colour code, of this subcellular domain corresponding to
15 serial TEM ultrathin (60–70 nm) sections, showing that all LDs are tightly bound to smooth ER membranes. The LDs shown in
these TEM photographs are from BHK-21 cells (baby-hamster kidney-21 cells), and the cellular microdomain was reconstructed
with IMOD software, as described elsewhere (Roingeard et al., 2008; Depla et al., 2010). Scale bar: 1 µm. A QuickTime movie of
this 3D reconstruction is also provided as Supplementary material at http://www.biolcell.org/boc/103/boc1030223add.htm.
acyltransferase-2), a key enzyme involved in triacyl-
glycerol synthesis, is found in areas in which LD
are tightly associated with the ER, under conditions
promoting LD formation (Kuerschner et al., 2008).
There is some evidence to suggest that LDs never
leave the ER, instead constituting specialized re-
gions of the ER. TEM studies have frequently shown
continuity between the cytosolic leaflet of the ER
and the boundary leaflet of the LDs (Blanchette-
Mackie et al., 1995). Moreover, three-dimensional
reconstructions of large cellular domains have shown
that LDs are invariably intimately linked to the ER
compartment (Figure 1B; see also the Supplement-
ary QuickTime movie of a three-dimensional recon-
struction of such large microdomain, at http://www.
biolcell.org/boc/103/boc1030223add.htm). This no-
tion that LDs are specialized regions of the ER is
attractive because this organization would provide
a simple mechanism for the exchange of lipids
and proteins between these two compartments.
For example, during metabolic stress requiring
the rapid hydrolysis of esterified fatty acids and the
release of non-esterified fatty acids, the leaflet must
rapidly shrink. Continuity with the ER would make
it possible for this compartment to act as a sink for
these leaflet components (Goodman, 2008). Altern-
atively, there is evidence to suggest that the traf-
ficking of membrane-derived vesicles may connect
the ER with LDs that have been fully released from
the ER membrane (Farese and Walther, 2009). How-
ever, this model cannot account for the fusion of ves-
icles surrounded by a bilayer membrane with the
monolayer surrounding LDs. In addition, many of
the proteins identified in the LD proteome are pre-
dicted to have multiple membrane spans and it is
difficult to imagine them arranged in a single leaf-
let surrounding a hydrophobic core of neutral lip-
ids (Goodman, 2009). These observations suggest
that these proteins are more likely to be present
in specialized ER membranes tightly bound to the
LD that could be separated from the bulk ER dur-
ing fractionation, thus being purified with the LD.
However, this model remains speculative and caution
should be employed when using it as a basis for other
hypotheses.
LD growth and mobilizationLD size varies tremendously, from a diameter of
only 50–100 nm to a diameter of 100 µm in white
adipocytes. LD can also clearly grow in size. It is
www.biolcell.org | Volume 103 (5) | Pages 223–231 225
P. Roingeard and M. Depla
possible that LDs expand as single organelles, like in-
flated balloons. If LDs remain physically attached to
the ER, proteins and newly synthesized lipids could
diffuse laterally into the LDs. If LDs are fully de-
tached from the ER, these proteins and lipids must be
transported to the LDs in vesicles, although the topo-
logical problems arising from the fusion of a vesicular
bilayer membrane with the monolayer membrane at
the surface of LD suggest that this is unlikely. Al-
ternatively, the neutral lipids in the LD core may be
produced locally by enzymes such as DGAT2, which
is present on the surface of LDs (Kuerschner et al.,
2008). However, any such increase in the volume of
neutral lipids would need to be matched by a cor-
responding increase in the synthesis of phospholipids
at the surface of LDs. The recent demonstration that
key enzymes required for phospholipid synthesis are
present at the LD surface provides support for this
potential mechanism (Guo et al., 2008).
The fusion of several smaller LDs to form lar-
ger LDs may also contribute to LD growth (Guo
et al., 2008), and models in which SNARE (soluble
N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein-attach-
ment protein receptor) proteins and motor proteins
are involved in LD fusion have been proposed (An-
dersson et al., 2006; Bostrom et al., 2007; Olofsson
et al., 2008; Ducharme and Bickel, 2008). However,
due to the extremely low frequency of this phe-
nomenon in live imaging, LD fusion remains a con-
troversial subject (Thiele and Spandl, 2008; Farese
and Walther, 2009; Cheng et al., 2009; Murphy
et al., 2010). Indeed, it has been pointed out that LD
fusion is not observed in situations in which
LD are densely packed such that there are obvious
signs of mechanical strain, with LDs being pressed
against each other (Thiele and Spandl, 2008). This
is remarkable, given that LDs have only a monolayer
membrane, and so their fusion would therefore re-
quire only one simple step. It has also been argued
that the small amount of protein recovered from LD
preparations is consistent with the absence of a dense
coverage of proteins with anti-fusion activities on the
surface of LDs (Thiele and Spandl, 2008). It there-
fore seems possible that the composition of the LD
monolayer may contribute to the inhibition of spon-
taneous fusion. Moreover, LD fusion would generate
a large excess of phospholipids originating from the
surface of the small original LDs, and it is unclear as
to how the large LD formed by fusion could simul-
taneously adjust its phospholipid monolayer (Ohsaki
et al., 2009).
LDs not only grow but also shrink through lipoly-
sis induced by the lipases present at the LD surface.
The proteins of the PAT/PLIN family play a key role
in the organization and regulation of this process
(Brasaemle, 2007). More recently, it has been shown
that autophagy induced by nutrient deprivation
(Singh et al., 2009) or dengue virus infection (Heaton
and Randall, 2010) may also regulate the mobil-
ization of lipids from LDs. In adipocytes, it has
been suggested that LDs may undergo fission dur-
ing lipolysis. This would greatly increase the sur-
face area of LDs, improving the access of lipases to
the neutral-lipid core (Marcinkiewicz et al., 2006).
However, this increase in surface area would re-
quire more surface phospholipids and the mechan-
ism by which this could be achieved remains un-
clear. It therefore appears most likely that LDs are
never completely severed from the ER, instead re-
maining permanently connected to the outer leaf-
let of the ER membrane. Pioneer TEM observa-
tions have suggested that LDs accumulate or regress
within the confines of ER membranes (Blanchette-
Mackie et al., 1995). More recent studies have also
provided support for this model by demonstrating
experimentally that LDs are formed from and re-
gress to the ER as part of a cyclic process that does
not involve trafficking through the secretory pathway
(Zehmer et al., 2009b).
Intracellular movements of LDsLive imaging has shown that LDs move around
the cytoplasm in many cells. In some cases, the
distribution of the entire population of LDs in
cells may change dramatically within a few hours
(Welte, 2009). This mobility seems to involve mostly
microtubule-based transport. The pharmacological
disruption of microtubules typically prevents this
movement of LDs, whereas the disruption of actin
filaments has little effect. Moreover, cytoplasmic
dynein, a minus end-directed microtubule motor, is
often physically associated with LDs, and the func-
tional inactivation of dynein prevents LDs from mov-
ing within the cell in various models (Welte, 2009).
Although it is tempting to speculate that these
changes are due to LDs moving along the micro-
tubules from one location in the cell to another, as
suggested by some movies, other interpretations have
226 C© The Authors Journal compilation C© 2011 Portland Press Limited
Lipid droplets in HCV infection Scientiae forum
been considered. It has also been suggested (Welte,
2009) that LDs may not move as a unit, instead re-
gressing and being regenerated at their destination.
The requirement of dynein as a co-factor for the form-
ation of a nascent LD is consistent with this hypo-
thesis (Andersson et al., 2006). This process would
involve lipids from shrinking LDs diffusing laterally
through the expansive ER network to form new LDs
elsewhere in the cell (Murphy et al., 2009; Welte,
2009).
The HCV modelHCV infection is rapidly becoming a major global
health issue, with more than 130 million people in-
fected worldwide (Alter, 2007). Of those exposed to
HCV, 80 % become chronically infected, and at least
30 % of carriers go on to develop severe liver diseases
such as cirrhosis and liver carcinoma. There is cur-
rently no vaccine to prevent new infections and the
efficacy of current therapies remains limited. In recent
years, the impact of HCV infection on lipid metabol-
ism and in particular the development of a liver ste-
atosis has emerged as a clinically important topic
in liver diseases (Roingeard and Hourioux, 2008;
Piver et al., 2010). HCV has a positive-sense, single-
stranded RNA genome encoding a single polypro-
tein that is both co- and post-translationally cleaved
at the ER membrane by host or viral proteases to
generate several proteins (Moradpour et al., 2007).
The N-terminal component of the polyprotein en-
codes the structural proteins: the core protein, which
forms the viral capsid, and the two envelope proteins
that surround the capsid to form the virion. The C-
terminal region of the polyprotein contains the NS
(non-structural) proteins involved in the formation of
replication complexes for the synthesis of viral RNA
(Moradpour et al., 2007).
Many years before a tissue culture system for produ-
cing infectious HCV in vitro had been developed, the
HCV core protein was reported to be associated with
the surface of LDs (Moradpour et al., 1996; Barba
et al., 1997). This association is dependent on the
release of the protein from the polyprotein by two
different cellular proteases: SP (signal peptidase) and
SPP (signal peptide peptidase) (McLauchlan et al.,
2002). SP cleaves the polyprotein at the C-terminus
of a signal peptide between the core and envelope
proteins, producing an immature form of the core
protein that is unable to associate with LDs. The
second cleavage, by SPP, occurs within the signal pep-
tide and generates the mature form of the protein,
which is then transported towards the LD surface
(McLauchlan et al., 2002). During this trafficking
step, the HCV core protein remains attached to the
ER cytosolic monolayer membrane and then to the
monolayer membrane surrounding the LD, through
its C-terminal domain, which probably interacts in-
plane with these membranes (McLauchlan, 2009a).
Following the long-awaited successful propagation of
an HCV strain in cultured hepatic Huh7 cells, it has
recently been shown that LDs are directly involved in
the production of infectious HCV particles (Miyanari
et al., 2007). This study demonstrated that the HCV
core protein on LDs recruits NS proteins and rep-
licated RNA to LD-associated membranes, and that
this structural arrangement plays a crucial role in the
formation of infectious viruses. Disruption of the as-
sociation of HCV core protein with LDs was found
to cause a defect in the localization of HCV RNA
and NS proteins to regions surrounding LDs, thereby
preventing infectious virus assembly (Miyanari et al.,
2007; Boulant et al., 2007). Further investigations of
this infectious HCV system demonstrated that HCV
core protein initially attached to a discrete site on
LDs after processing by SPP, subsequently coating
the entire LD (Boulant et al., 2007). This observa-
tion suggested that there might be a defined loading
site for the core protein, probably at points of con-
tact between LDs and the ER membrane (Boulant
et al., 2007). More recently, it has been demonstrated
that a key enzyme involved in triacylglycerol syn-
thesis, the DGAT1 (diacylglycerol acyltransferase-
1), is involved in the HCV infectious cycle. Both
DGAT1 and DGAT2 are ER resident enzymes that
catalyse the final step in triacylglycerol biosynthesis
and are essential in LD biogenesis, but only DGAT2
remains associated with the LDs. Recent studies have
demonstrated that DGAT1 interacts with the HCV
core protein and promotes its traffic to the surface of
DGAT1-generated LDs (Herker et al., 2010). It re-
mains unclear as to why HCV targets LDs, but this
targeting may be linked to the contribution of these
LDs to the formation of VLDLs (very-low-density
lipoproteins) in hepatocytes, as the viruses circulating
in chronically infected patients are associated with
lipoproteins (Andre et al., 2002; Icard et al., 2009;
McLauchlan, 2009b).
www.biolcell.org | Volume 103 (5) | Pages 223–231 227
P. Roingeard and M. Depla
Figure 2 HCV core production induces the relocalization, within a few hours, of LDs to perinuclear areas
(A) On conventional TEM, these clustered LDs are connected to the convoluted electron-dense ER membrane (arrows).
(B) Freeze substitution TEM and immuno-gold labelling with a specific monoclonal antibody shows the presence of a large
amount of HCV core protein in these convoluted ER membranes linked to LDs (arrows) and the membranes surrounding LDs.
The LDs shown on these photomicrographs are from BHK-21 cells (see Depla et al., 2010 for details of the materials and methods
used). Scale bars: 1 µm (A), 0.5 µm (B).
Nevertheless, one of the key elements underlying
the production of infectious virions is the modific-
ation of LD distribution within cells by HCV core
protein, such that LDs tend to aggregate in the per-
inuclear area (Boulant et al., 2008; Roingeard et al.,
2008). This redistribution of LDs may lead to the
close apposition of LDs with sites of viral RNA
replication containing newly synthesized viral gen-
omes and the NS proteins (Boulant et al., 2008).
HCV RNA is replicated at perinuclear ER-derived
membranes known as the membranous web (Morad-
pour et al., 2003), and the clustering of LDs around
these membranes is thought to increase the like-
lihood of interaction between the HCV core pro-
tein and the newly synthesized RNA, thereby pro-
moting genome packaging, the first step in virus
assembly. Light microscopy studies demonstrated
that the LD clustering induced by the HCV core
protein was blocked by disrupting the microtu-
bule network or impairing dynein function (Boulant
et al., 2008; Lyn et al., 2010). The authors naturally
interpreted these results as indicating a redistri-
bution of the pre-existing LDs through the traf-
ficking of these organelles along the microtubule
network and towards the centrosome. However, ana-
lyses of this phenomenon by conventional or three-
dimensional TEM have shown that the aggregating
LDs are much larger than the pre-existing LDs, and
do not preferentially cluster in the centrosome area
(Depla et al., 2010). In addition, aggregated LDs
have been shown to emerge from ER membranes
rich in HCV core protein (Depla et al., 2010; Fig-
ure 2). This suggests that these aggregated LDs sur-
rounded by the HCV core protein budded from spe-
cific ER membranes enriched in HCV core protein,
consistent with the LD regression/regeneration hy-
pothesis outlined above (Figure 3). Indeed, it seems
unlikely that LDs dispersed throughout the cyto-
plasm would move specifically towards these areas
with a core-rich ER membrane. It remains unclear
as to whether the HCV core protein is actively in-
volved in lipid mobilization, membrane curvature
and LD budding, as suggested for PAT/PLIN proteins
(Wolins et al., 2006; Listenberger et al., 2007). How-
ever, the HCV core protein has been shown to displace
ADRP, like other exchangeable PAT/PLIN proteins
(Boulant et al., 2008). Although some studies have
suggested that the same LD may experience a gradual
exchange of PAT/PLIN proteins (Wolins et al., 2005),
the LD regression/regeneration hypothesis would also
228 C© The Authors Journal compilation C© 2011 Portland Press Limited
Lipid droplets in HCV infection Scientiae forum
Figure 3 Possible mechanisms of LD redistribution induced by the HCV core protein
LDs that have initially emerged from the ER bilayer as a lens-shape mass of neutral lipids remain attached to the ER mem-
brane to form a round structure surrounded by a phospholipid monolayer containing PAT/PLIN proteins. These LDs dispersed
throughout the cell could regress towards ER membranes and regenerate in distant-specific ER membrane domains enriched
in HCV core protein. The HCV core protein may contribute to curve the ER membrane to mediate the LD budding. The LD
regression/regeneration hypothesis provides a comprehensive model accounting for the replacement of a host cell PAT/PLIN
protein by the HCV core protein at the surface of newly synthesized LDs. The structures depicted in this model are not drawn to
scale.
provide a comprehensive model accounting for the
replacement of ADRP by the HCV core protein
in newly synthesized LDs (Figure 3). Interestingly,
LD clustering has also been observed in other cellu-
lar models, without HCV infection. In some cases,
the degree of LD clustering seemed to depend on the
metabolic state, with lipolysis counteracting cluster-
ing (Marcinkiewicz et al., 2006). In the yeast model,
the absence of seipin, an LD-associated protein, res-
ulted in LD clustering (Szymanski et al., 2007). In
contrast, overexpression of various PAT/PLIN pro-
teins may also lead to LD clustering (Targett-Adams
et al., 2003; Listenberger et al., 2007). Altogether,
these results suggest that the replacement of a given
LD-associated protein by one or other LD-associated
protein could induce this intracellular relocalization
of LDs. This reinforces the hypothesis that, follow-
ing their biogenesis, LDs remain tethered to the
ER membrane, allowing the exchange of proteins
between the LD surface to occur.
Conclusion and perspectivesIntracellular LDs have gone from being largely ig-
nored as static cytoplasmic inclusions to being act-
ively studied as dynamic organelles regulating not
only cellular lipid storage but also lipid exchange
with various organelles. However, several funda-
mental questions about the biology of LDs remain
unanswered. In particular, we still know little about
the process by which they are formed. The HCV
core protein, which seems able to induce the rapid
regression and regeneration of cytoplasmic LDs, is a
potentially valuable model for the visualization of LD
morphogenesis by correlative fluorescence/electron
microscopy during the first few minutes of LD form-
ation. We need to determine whether the regression
and regeneration of LDs that seems to be induced
by the HCV core protein is a widespread mech-
anism of LD motion also occurring in other con-
texts. It should be remembered that movies provided
as supplementary material of several published
www.biolcell.org | Volume 103 (5) | Pages 223–231 229
P. Roingeard and M. Depla
manuscripts have shown that at least some LDs re-
mained intact throughout the period of movement
between regions of the cells (Targett-Adams et al.,
2003; Digel et al., 2010). Future investigation should
help to explain the highly regulated, integrated
and strongly compartmentalized cellular network of
metabolism, signalling and trafficking leading to LD
formation and degradation.
FundingResearch on HCV and LD interactions in our laborat-
ory was supported by grants from INSERM-DHOS
and Ligue Contre le Cancer (Comite du Loir et Cher
& Comite de l’Ille et Vilaine). M.D. was supported
by a Ph.D. fellowship provided by INSERM, Region
Centre and the Fondation pour la Recherche Medicale
(FRM). Our TEM photographs are obtained with the
assistance of the RIO EM Facility of Francois Rabelais
University.
ReferencesAlter, M.J. (2007) Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J.
Gastroenterol. 13, 2436–2441
Andersson, L., Bostrom, P., Ericson, J., Rutberg, M., Magnusson, B.,
Marchesan, D., Ruiz, M., Asp, L., Huang, P., Frohman, M.A. et al.
(2006) PLD1 and ERK2 regulate cytosolic lipid droplet formation.
J. Cell Sci. 119, 2246–2257
Andre, P., Komurian-Pradel, F., Deforges, S., Perret, M., Berland,
J. L., Sodoyer, M., Pol, S., Brechot, C., Paranhos-Baccala, G. and
Lotteau, V. (2002) Characterization of low- and very-low-density
hepatitis C virus RNA-containing particles. J. Virol. 76, 6919–6928
Barba, G., Harper, F., Harada, T., Kohara, M., Goulinet, S.,
Matsuura, Y., Eder, G., Schaff, Z., Chapman, M. J., Miyamura, T.
and Brechot, C. (1997) Hepatitis C virus core protein shows a
cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage
droplets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1200–1205
Bartz, R., Li, W., Venables, B., Zehmer, J.K., Roth, M.R., Welti, R.,
Anderson, R.G.W., Liu, P. and Chapman, K.D. (2007a) Lipidomics
reveals that adiposomes store ether lipids and mediate
phospholipid traffic. J. Lipid Res. 48, 837–847
Bartz, R., Zehmer, J.K., Zhu, M., Chen, Y., Serrero, G., Zhao, Y. and
Liu, P. (2007b) Dynamic activity of lipid droplets: protein
phosphorylation and GTP-mediated protein translocation.
J. Proteome Res. 6, 3256–3265
Bickel, P.E., Tansey, J.T. and Welte, M.A. (2009) PAT proteins, an
ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid
stores. Biochim. Biophys. Acta 1791, 419–440
Blanchette-Mackie, E.J., Dwyer, N.K., Barber, T., Coxey, R.A.,
Takeda, T., Rondinone, C.M., Theodorakis, J.L., Greenberg, A.S.
and Londos, C. (1995) Perilipin is located on the surface layer of
intracellular lipid droplets in adipocytes. J. Lipid Res. 36,
1211–1226
Bostrom, P., Andersson, L., Rutberg, M., Perman, J., Lidberg, U.,
Johansson, B.R., Fernandez-Rodriguez, J., Ericson, J., Nilsson, T.,
Boren, J. and Olofsson, S.O. (2007) SNARE proteins mediate
fusion between cytosolic lipid droplets and are implicated in insulin
sensitivity. Nat. Cell Biol. 9, 1286–1293
Boulant, S., Targett-Adams, P. and McLauchlan, J. (2007) Disrupting
the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets
correlates with a loss in production of infectious virus. J. Gen. Virol.
88, 2204–2213
Boulant, S., Douglas, M.W., Moody, L., Budkowska, A.,
Targett-Adams, P. and McLauchlan, J. (2008) Hepatitis C virus core
protein induces lipid droplet redistribution in a microtubule- and
dynein-dependent manner. Traffic 9, 1268–1282
Brasaemle, D.L. (2007) The perilipin family of structural lipid droplet
proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.
J. Lipid Res. 48, 2547–2559
Brasaemle, D.L., Dolios, G., Shapiro, L. and Wang, R. (2004)
Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of
basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem.
279, 46835–46842
Cheng, J., Fujita, A., Ohsaki, Y., Suzuki, M., Shinohara, Y. and
Fujimoto, T. (2009) Quantitative electron microscopy shows
uniform incorporation of triglycerides into existing lipid droplets.
Histochem. Cell Biol. 132, 281–291
Depla, M., Uzbekov, R., Hourioux, C., Blanchard, E., Le Gouge, A.,
Gillet, L. and Roingeard, P. (2010) Ultrastructural and quantitative
analysis of the lipid droplet clustering induced by hepatitis C virus
core protein. Cell. Mol. Life Sci. 67, 3151–3161
Digel, M., Ehehalt, R. and Fullekrug, J. (2010) Lipid droplets
lighting up: insights from live microscopy. FEBS Lett. 584,
2168–2175
Ducharme, N.A. and Bickel, P.E. (2008) Lipid droplets in lipogenesis
and lipolysis. Endocrinology 149, 942–949
Farese, R.V. and Walther, T.C. (2009) Lipid droplets finally get a little
R-E-S-P-E-C-T. Cell 139, 855–860
Goodman, J.M. (2008) The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem.
283, 28005–28009
Goodman, J.M. (2009) Demonstrated and inferred metabolism
associated with cytosolic lipid droplets. J. Lipid Res. 50,
2148–2156
Greenberg, A.S., Egan, J.J., Wek, S.A., Garty, N.B.,
Blanchette-Mackie, E.J. and Londos, C. (1991) Perilipin, a major
hormonally regulated adipocyte-specific phosphoprotein
associated with the periphery of lipid storage droplets. J. Biol.
Chem. 266, 11341–11346
Guo, Y., Walther, T.C., Rao, M., Stuurman, N., Goshima, G.,
Terayama, K., Wong, J.S., Vale, R.D., Walter, P. and Farese, R.V.
(2008) Functional genomic screen reveals genes
involved in lipid-droplet formation and utilization. Nature 453,
657–661
Heaton, N.S. and Randall, G. (2010) Dengue virus-induced
autophagy regulates lipid metabolism. Cell Host Microbe 8,
422–432
Herker, E., Harris, C., Hernandez, C., Carpentier, A., Kaehlcke, K.,
Rosenberg, A.R., Farese, R.V. and Ott, M. (2010) Efficient hepatitis
C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.
Nat. Med. 16, 1295–1298
Hodges, B.D.M. and Wu, C.C. (2010) Proteomic insights into an
expanded cellular role for cytoplasmic lipid droplets. J. Lipid Res.
51, 262–273
Icard, V., Diaz, O., Scholtes, C., Perrin-Cocon, L., Ramiere, C.,
Bartenschlager, R., Penin, F., Lotteau, V. and Andre, P. (2009)
Secretion of hepatitis C virus envelope glycoproteins depends on
assembly of apolipoprotein B positive lipoproteins. PLoS ONE 4,
e4233
Kimmel, A.R., Brasaemle, D.L., McAndrew-Hill, M., Sztalryd, C. and
Londos, C. (2010) Adoption of perilipin as a unifying nomenclature
for the mammalian PAT-family of intracellular lipid storage droplet
proteins. J. Lipid. Res. 51, 468–471
Kuerschner, L., Moessinger, C. and Thiele, C. (2008) Imaging of lipid
biosynthesis: how a neutral lipid enters lipid droplets. Traffic 9,
338–352
Listenberger, L.L., Ostermeyer-Fay, A.G., Goldberg, E.B., Brown, W.J.
and Brown, D.A. (2007) Adipocyte differentiation-related protein
reduces the lipid droplet association of adipose triglyceride lipase
and slows triacylglycerol turnover. J. Lipid Res. 48, 2751–2761
Liu, P., Ying, Y., Zhao, Y., Mundy, D.I., Zhu, M. and Anderson, R.G.W.
(2004) Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be
metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem.
279, 3787–3792
230 C© The Authors Journal compilation C© 2011 Portland Press Limited
Lipid droplets in HCV infection Scientiae forum
Lyn, R.K., Kennedy, D.C., Stolow, A., Ridsdale, A. and Pezacki, J.P.
(2010) Dynamics of lipid droplets induced by the hepatitis C virus
core protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 339, 518–524
Marcinkiewicz, A., Gauthier, D., Garcia, A. and Brasaemle, D.L. (2006)
The phosphorylation of serine 492 of perilipin a directs lipid droplet
fragmentation and dispersion. J. Biol. Chem. 281, 11901–11909
Martin, S. and Parton, R.G. (2006) Lipid droplets: a unified view of a
dynamic organelle. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 373–378
Martin, S., Driessen, K., Nixon, S.J., Zerial, M. and Parton, R.G.
(2005) Regulated localization of Rab18 to lipid droplets: effect of
lipolytic stimulation and inhibition of lipid droplet catabolism.
J. Biol. Chem. 280, 42325–42335
McLauchlan, J. (2009a) Lipid droplets and hepatitis C virus infection.
Biochim. Biophys. Acta 1791, 552–559
McLauchlan, J. (2009b) Hepatitis C virus: viral proteins on the move.
Biochem. Soc. Trans. 37, 986–990
McLauchlan, J., Lemberg, M.K., Hope, G. and Martoglio, B. (2002)
Intramembrane proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus
core protein to lipid droplets. EMBO J. 21, 3980–3988
Miyanari, Y., Atsuzawa, K., Usuda, N., Watashi, K., Hishiki, T., Zayas,
M., Bartenschlager, R., Wakita, T., Hijikata, M. and Shimotohno, K.
(2007) The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C
virus production. Nat. Cell Biol. 9, 1089–1097
Moradpour, D., Englert, C., Wakita, T. and Wands, J.R. (1996)
Characterization of cell lines allowing tightly regulated expression
of hepatitis C virus core protein. Virology 222, 51–63
Moradpour, D., Gosert, R., Egger, D., Penin, F., Blum, H.E. and Bienz,
K. (2003) Membrane association of hepatitis C virus nonstructural
proteins and identification of the membrane alteration that harbors
the viral replication complex. Antiviral Res. 60, 103–109
Moradpour, D., Penin, F. and Rice, C.M. (2007) Replication of
hepatitis C virus. Nat. Rev. Microbiol. 5, 453–463
Murphy, D.J. and Vance, J. (1999) Mechanisms of lipid-body
formation. Trends Biochem. Sci. 24, 109–115
Murphy, S., Martin, S. and Parton, R.G. (2009) Lipid droplet-organelle
interactions; sharing the fats. Biochim. Biophys. Acta 1791,
441–447
Murphy, S., Martin, S. and Parton, R.G. (2010) Quantitative analysis
of lipid droplets fusion: inefficient steady state fusion but rapid
stimulation by chemical fusogens. PLoS One 5, e15030
Ohsaki, Y., Cheng, J., Fujita, A., Tokumoto, T. and Fujimoto, T. (2006)
Cytoplasmic lipid droplets are sites of convergence of proteasomal
and autophagic degradation of apolipoprotein B. Mol. Biol. Cell 17,
2674–2683
Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Shinohara, Y., Fujita, A. and
Fujimoto, T. (2009) Biogenesis of cytoplasmic lipid droplets: from
the lipid ester globule in the membrane to the visible structure.
Biochim. Biophys. Acta 1791, 399–407
Olofsson, S., Bostrom, P., Andersson, L., Rutberg, M., Levin, M.,
Perman, J. and Boren, J. (2008) Triglyceride containing lipid
droplets and lipid droplet-associated proteins. Curr. Opin. Lipidol.
19, 441–447
Ozeki, S., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H. and
Fujimoto, T. (2005) Rab18 localizes to lipid droplets and induces
their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived
membrane. J. Cell. Sci. 118, 2601–2611
Piver, E., Roingeard, P. and Pages, J. (2010) The cell biology of
hepatitis C virus (HCV) lipid addiction: molecular mechanisms and
its potential importance in the clinic. Int. J. Biochem. Cell Biol. 42,
869–879
Robenek, H., Hofnagel, O., Buers, I., Robenek, M.J., Troyer, D. and
Severs, N.J. (2006) Adipophilin-enriched domains in the ER
membrane are sites of lipid droplet biogenesis. J. Cell. Sci. 119,
4215–4224
Roingeard, P. and Hourioux, C. (2008) Hepatitis C virus core protein,
lipid droplets and steatosis. J. Viral Hepat. 15, 157–164
Roingeard, P., Hourioux, C., Blanchard, E. and Prensier, G. (2008)
Hepatitis C virus budding at lipid droplet-associated ER membrane
visualized by 3D electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130,
561–566
Singh, R., Kaushik, S., Wang, Y., Xiang, Y., Novak, I., Komatsu, M.,
Tanaka, K., Cuervo, A.M. and Czaja, M.J. (2009) Autophagy
regulates lipid metabolism. Nature 458, 1131–1135
Sztalryd, C., Xu, G., Dorward, H., Tansey, J.T., Contreras, J.A.,
Kimmel, A.R. and Londos, C. (2003) Perilipin A is essential for the
translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic
activation. J. Cell Biol. 161, 1093–1103
Szymanski, K., Binns, D., Bartz, R., Grishin, N.V., Li, W.-P., Argawal,
A.K., Garg, A., Anderson, R.G.W. and Goodman, J.M. (2007) The
lipodystrophy protein seipin is found at endoplasmic reticulum lipid
droplet junctions and is important for droplet morphology. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20890–20895
Targett-Adams, P., Chambers, D., Gledhill, S., Hope, G., Coy, J.F.,
Girod, A. and McLauchlan, J. (2003) Live cell analysis and targeting
of the lipid droplet-binding adipocyte differentiation-related
protein. J. Biol. Chem. 278, 15598–16007
Tauchi-Sato, K., Ozeki, S., Houjou, T., Taguchi, R. and Fujimoto, T.
(2002) The surface of lipid droplets is a phospholipid monolayer
with a unique fatty acid composition. J. Biol. Chem. 277,
44507–44512
Thiele, C. and Spandl, J. (2008) Cell biology of lipid droplets. Curr.
Opin. Cell Biol. 20, 378–385
Wan, H., Melo, R.C.N., Jin, Z., Dvorak, A.M. and Weller, P.F. (2007)
Roles and origins of leukocyte lipid bodies: proteomic and
ultrastructural studies. FASEB J. 21, 167–178
Welte, M.A. (2007) Proteins under new management: lipid droplets
deliver. Trends Cell Biol. 17, 363–369
Welte, M.A. (2009) Fat on the move: intracellular motion of lipid
droplets. Biochem. Soc. Trans. 37, 991–996
Wolins, N.E., Quaynor, B.K., Schoenfish, M.J., Tzekov, A. and
Bickel, P.E. (2005) S3-12, adipophilin, and TIP47 package lipid in
adipocytes. J. Biol. Chem. 280, 19146–19155
Wolins, N.E., Brasaemle, D.L. and Bickel, P.E. (2006) A proposed
model of fat packaging by exchangeable lipid droplet proteins.
FEBS Lett. 580, 5484–5491
Zehmer, J.K., Huang, Y., Peng, G., Pu, J., Anderson, R.G.W. and
Liu, P. (2009a) A role for lipid droplets in inter-membrane lipid
traffic. Proteomics 9, 914–921
Zehmer, J.K., Bartz, R., Bisel, B., Liu, P., Seemann, J. and Anderson,
R.G.W. (2009b) Targeting sequences of UBXD8 and AAM-B reveal
that the ER has a direct role in the emergence and regression of
lipid droplets. J. Cell Sci. 122, 3694–3702
Received 7 October 2010/7 March 2011; accepted 9 March 2011
Published on the Internet 7 April 2011, doi:10.1042/BC20100119
www.biolcell.org | Volume 103 (5) | Pages 223–231 231
Discussion
Récemment, il a été montré in vitro dans des cellules infectées par le HCV que
l’association de la protéine de capside du HCV aux GL est liée à la production de virus et à
l’accumulation des GL en zone périnucléaire (Boulant et al., 2008). Cette accumulation des
GL du cytoplasme vers les zones périnucléaires dépend du réseau de microtubules et n’est
observée qu’avec la protéine de capside mature c’est à dire après son clivage par deux
enzymes cellulaires : la SP qui libère la protéine de capside de la polyprotéine et la dirige (via
sa séquence signal) vers le RE, et la SPP qui permet à la protéine de capside de s’associer aux
GL. Les auteurs proposaient alors un modèle dans lequel la relocalisation des GL favoriserait
le contact entre la protéine de capside du virus, présente autour des GL, et l’ARN viral,
présent au niveau d’un « membranous web » périnucléaire, lors de l’assemblage viral
(Boulant et al., 2008). Cette étude suggérait que la localisation périnucléaire des GL se
formait par une simple relocalisation des GL migrant le long des microtubules et se
concentrant autour du centrosome.
Un des objectifs de nos travaux était donc d’avancer dans la compréhension des
mécanismes fondamentaux régissant la relocalisation de GL induites par la protéine de
capside. Pour étudier ce phénomène, nous disposions du modèle in vitro dérivé du SFV et
d’une méthode morphométrique originale d’analyse des GL sur coupes de microscopie
électronique déjà validés au sein du laboratoire (Ait-Goughoulte et al., 2006); (Hourioux et
al., 2007).
Dans un premier temps, il s’agissait de comparer la quantité et la localisation
subcellulaire des GL dans des cellules exprimant une protéine de capside mature ou
immature, ainsi qu’une protéine contrôle. De cette façon, nous avons montré que les protéines
de capside mature ou immature étaient toutes les deux capables d’augmenter le nombre de GL
dans les cellules par rapport à une protéine contrôle, mais que la protéine mature pouvait
amplifier ce phénomène par rapport à la protéine immature. Néanmoins, seule la protéine de
capside mature était capable d’entourer les GL et de les relocaliser en zone périnucléaire
(Depla et al., 2010). Le rôle précis de cette association reste mal connu mais la protéine de
capside semblerait agir de façon directe sur le métabolisme lipidique : durant la synthèse de
novo des lipides (Su et al., 2002); (Kim et al., 2007); (Waris et al., 2007); (Jackel-Cram et al.,
2007); (Yang et al., 2008), lors de l’élimination des acides gras (Su et al., 2002); (Dharancy et
109
al., 2005); (Tanaka et al., 2008) ou lors de la sécrétion des lipoprotéines (PERLEMUTER et
al., 2002). Nos résultats ont confirmé cette idée puisque les cellules exprimant les protéines de
capside mature ou immature induisaient une synthèse de TG plus importante que des cellules
exprimant la protéine contrôle (Depla et al., 2010). Il avait d’ailleurs été montré que les
protéines de capside mature et immature pouvaient toutes les deux réguler positivement le
promoteur du gène codant l’enzyme FAS impliquée dans la synthèse des TG (Jackel-Cram et
al., 2007).
Dans un second temps, une analyse morphologique en 3D montrait clairement que les
GL ne se regroupent pas autour des centrosomes, mais suggérait que les GL étaient localisées
au niveau des zones de la membrane du RE riches en protéine de capside (Depla et al., 2010).
Les études fondamentales sur les GL qui ont été présentées dans l’introduction de ce
manuscrit (cf paragraphe III) A. 3.) suggèrent que ces organites sont extrêmement
dynamiques, seulement les mécanismes de leur biogenèse et de leur trafic intracellulaire sont
encore mal compris. Depuis la publication de la revue de Murphy et Vance en 1999 (Murphy
& Vance, 1999), le modèle couramment exposé voudrait qu’une accumulation trop importante
de lipides que ne saurait retenir la membrane du RE entraînerait une déformation de celle-ci
aboutissant à l’émergence d’une GL. Néanmoins, à ce jour aucune technique de microscopie
ne s’est révélée adaptée ou assez résolutive pour visualiser cette suite d’événements
vraisemblablement très rapide (Kuerschner et al., 2008). De plus il n’est toujours pas connu si
la GL est capable de s’individualiser ou bien si elle reste physiquement attachée à la
membrane du RE (Zehmer et al., 2009); (Fujimoto et al., 2008). L’analyse des protéines à la
surface des GL pourrait nous permettre de réponde à cette question.
En effet, les GL, organites dits « de réserve» constituent un stock permanent d’énergie
pour les besoins cellulaires. A la surface des GL, on retrouve de façon constitutive les
protéines de la famille PAT/PLIN (Kimmel et al., 2010) qui ont chacune un rôle précis dans
le maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des GL. Ces protéines sont échangeables
à la surface des GL et leur composition varie en fonction des besoins cellulaires (Bickel et al.,
2009). Elles agiraient aussi lors de la genèse des GL en mobilisant les lipides et en favorisant
les mécanismes contribuant au bourgeonnement des GL (Wolins et al., 2006). Nos résultats
nous amènent à proposer le modèle in vitro de l’infection par le HCV et particulièrement
l’expression de la protéine de capside comme base pour étudier les mécanismes impliqués
dans la biogenèse et la croissance des GL. En effet, dans des cellules exprimant la protéine de
capside, les GL sont regroupées dans des zones de la membrane du RE riches en protéine de
110
capside. Celle-ci s’accumule à la surface des GL et peut remplacer une des protéines de la
famille PAT/PLIN : l’ADRP, à la surface des GL. Nous proposons que la protéine de capside
mature pourrait à son tour jouer un rôle équivalent à celui d’une protéine de la famille
PAT/PLIN et agir sur la morphogenèse des GL. Ainsi les GL portant à leur surface la protéine
de capside du HCV pourraient provenir et émerger des zones de la membrane du RE riches en
protéine de capside et y rester regroupées.
Dans la première partie de ce projet nous avons donc confirmé les données in vitro
publiées par notre équipe et par d’autres sur la capacité de la protéine de capside à induire une
relocalisation des GL. De plus nous avons montré que cette relocalisation était accompagnée
d’une synthèse de novo de GL puisque nous avons observé un nombre plus important de GL
dans des cellules exprimant la protéine de capside mature. Nous pensons que cette synthèse de
novo pourrait en partie s’expliquer par les propriétés de liaison de la protéine de capside
mature aux GL qui contribue ainsi à la morphogenèse des GL, et d’autre part par la capacité
de la protéine de capside mature à moduler le métabolisme lipidique comme en témoigne la
synthèse plus importante de TG dans des cellules qui expriment cette protéine. Nos
observations en microscopie électronique et en modèle 3D nous ont permis dans la seconde
partie de ce travail de suggérer que la synthèse de novo mise en évidence in vitro pouvait
avoir lieu dans des zones de la membrane du RE riches en protéine de capside mature. En
effet, il est difficile de penser qu’il y ait une simple redistribution des GL dispersées dans le
cytoplasme spécifiquement au niveau des zones de la membrane du RE riches en protéine de
capside. Un modèle où les GL seraient constamment dans des cycles de fusion/fission avec la
membrane du RE vient ainsi appuyer notre hypothèse : dans ce modèle les GL pourraient
régresser et émerger de façon dynamique ce qui permettrait d’établir des échanges constants
de lipides avec les membranes cellulaires d’autres organelles (Fujimoto et al., 2008); (Zehmer
et al., 2009). Le réseau de microtubules, comme il a déjà été suggéré (Boulant et al., 2008)
pourrait avoir un rôle crucial dans la motilité des GL et donc dans le dynamisme de ces
échanges.
Nos travaux nous ont ainsi amené à proposer un modèle (Roingeard & Depla, 2011)
où l’expression de la protéine de capside du VHC pourrait induire une régression des GL au
niveau des membranes du RE assortie d’une reformation de ces GL au niveau de domaines
membranaires du RE où la protéine de capside du HCV serait synthétisée en quantité
importante. Ce modèle de régression/régénération des GL induit par la protéine de capside
pourrait aussi expliquer dans les travaux publiés par Boulant et al, (Boulant et al., 2008)
111
comment l’ADRP à la surface des GL pourrait être remplacée, lorsque la GL régresse, par la
protéine de capside mature, lorsque la GL émerge. Cet échange d’une protéine de la famille
PAT/PLIN par une autre ou par la protéine de capside du HCV pourrait aussi
indépendamment contribuer à la relocalisation intracellulaire des GL comme il a déjà été
montré dans d’autres modèles sans qu’il y ait infection par le HCV (Marcinkiewicz, 2006);
(Targett-Adams, 2003); (Listenberger et al., 2007). Ce modèle vient appuyer ce qui avait été
proposé par Zehmer et al (Zehmer et al., 2009) qui était en faveur d’une association constante
entre les GL nouvellement formées et la membrane du RE. L’établissement d’une telle
association permettrait d’une part une rapide mobilisation des GL induite par la protéine de
capside du HCV lors de l’infection virale (régression), d’autre part un échange constant de
lipides et de protéines entre ces deux entités lors de la régénération. Dans le cas de l’infection
par le HCV, cette régénération serait accompagnée d’une synthèse de novo de TG et de GL.
112
II) Étude bio-clinique VIRO-STÉATOSE : impact de
la variabilité du virus de l’hépatite C sur la stéatose
hépatique
Article 3
Viral diversity in chronic carriers of hepatitis C virus has a
low impact on liver steatosis
Marion Depla, Louis d’Alteroche, Amélie Le Gouge, Alain Moreau, Christophe Hourioux,
Jean-Christophe Meunier, Julien Gaillard, Anne de Muret, Yannick Bacq, Farhad Kazemi,
Aurélie Avargues, Emmanuelle Roch, Eric Piver, Catherine Gaudy-Graffin, Bruno
Giraudeau, Philippe Roingeard
Soumis pour publication
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 1
Viral diversity in chronic carriers of hepatitis C virus has
a low impact on liver steatosis
Marion Depla,1 Louis d’Alteroche,
1, 2 Amélie Le Gouge,
3Alain Moreau,
1
Christophe Hourioux,1, 4, 5
Jean-Christophe Meunier,1 Julien Gaillard,
5
Anne de Muret,6 Yannick Bacq,
2 Farhad Kazemi,
7 Aurélie Avargues,
3
Emmanuelle Roch,1 Eric Piver,
1, 8 Catherine Gaudy-Graffin,
1, 9 Bruno
Giraudeau,3 Philippe Roingeard
1, 4, 5
1INSERM U966, Université François Rabelais and CHRU de Tours, France
2Service d’Hépatogastroentérologie, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours, France
3INSERM CIC 0202, Université François Rabelais and CHRU de Tours, France
4Unité de Biologie Cellulaire, Hôpital Bretonneau, CHRU de Tours, France
5Plate-Forme des Microscopies, PPF ASB, Université François Rabelais, Tours, France
6Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours, France
7Service d’Hépatogastroentérologie, Centre Hospitalier de Blois, France
8Service de Biochmie, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours, France
9Service de Bactériologie-Virologie, Hôpital Bretonneau, CHRU de Tours, France
Running Head: HCV diversity and steatosis
Word count : 3974
Correspondence to: Philippe Roingeard, INSERM U966, Université François Rabelais,
Faculté de Médecine, 10 boulevard Tonnellé, 37032 Tours Cedex, France.
Tel: (33) 2 34 37 96 46; Fax: (33) 2 47 47 82 07; email: roingeard@med.univ-tours.fr
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 2
ABSTRACT (235 words)
Background and objective: Most clinical studies suggest that the prevalence and severity of
liver steatosis are higher in patients infected with hepatitis C virus (HCV) genotype 3 than in
patients infected with other genotypes. This may reflect the diversity and intrinsic properties
specific to genotype 3 virus proteins. We analyzed the possible association of particular
residues of the HCV core and NS5A proteins known to dysregulate lipid metabolism with
severity of steatosis in the livers of patients chronically infected with HCV.
Methods: We used transmission electron microscopy to quantify liver steatosis precisely in a
group of 27 patients, 12 of whom were infected with a genotype 3 virus, the other 15 being
infected with viruses of other genotypes. We determined the area covered by lipid droplets in
their liver tissue and analyzed the diversity of the core and NS5A regions encoded by the viral
variants circulating in these patients.
Results: The area covered by lipid droplets did not differ significantly between patients
infected with viruses of genotype 3 or another genotype. The core and NS5A protein
sequences of the viral variants circulating in patients with mild or severe steatosis were evenly
distributed throughout the phylogenic trees established with all the collected sequences.
Conclusion: Individual host factors seem to play a much greater role than viral factors in the
development of severe steatosis in patients chronically infected with HCV, including those
infected with a genotype 3 virus.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 3
SUMMARY BOX
Significance of this study
What is already known about this subject?
- HCV genotype 3 seems to induce more severe steatosis than other genotypes in vivo, but
underlying mechanisms remain unclear.
- Conflicting results have been published concerning the ability of genotype 3 core protein to
increase lipid droplet accumulation in vitro.
What are the new findings?
- There is no association between genotype 3 and steatosis frequency and intensity.
- There are no core and NS5A protein residues associated with more severe steatosis.
How might it impact on clinical practice in the foreseeable future?
- Individual host factors seem to play a greater role than viral factors in the development of
severe steatosis in HCV-infected patients, including those infected with a genotype 3 virus.
- We now need to identify these individual host factors.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 4
INTRODUCTION
Hepatitis C virus (HCV), which infects 130 million people worldwide, is a major cause of
liver disease. The liver injury induced by HCV results in chronic hepatitis, fibrosis and,
eventually, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Progression towards these end-
stage liver diseases is influenced by several cofactors including sex (progression more likely
in men), age at infection, excessive alcohol consumption, obesity and co-infection with the
hepatitis B virus (HBV) or the human immunodeficiency virus (HIV).1-4
Moreover,
retrospective studies have reported an association between the presence and severity of
steatosis in chronic HCV infection and advanced fibrosis.5-8
Steatosis is characterised by
triglyceride deposition in the liver and is probably related to host metabolic and viral factors.
The HCV core protein is known to deregulate a large number of genes involved in lipid
metabolism.9-16
In cell culture, HCV core protein associates with lipid droplets and induces
the clustering of these lipid storage organelles.17-20
This clustering of the lipid droplets, which
play an important role in the viral life cycle,18, 20
results from the de novo synthesis of lipid
droplets in infected cells, rather than the simple subcellular redistribution of these
organelles.17
The HCV NS5A protein has also recently been shown to modulate various genes
involved in lipid metabolism,21-25
and to accumulate on the surface of lipid droplets in cell
culture.21
Nonetheless, the molecular mechanisms leading to HCV-induced steatosis are not
clearly understood. The HCV RNA genome displays considerable diversity, both within and
between isolates, and three levels of classification have been adopted, grouping viral
sequences into six genotypes, several dozen subtypes and intra-isolate variants.26, 27
Several
clinical studies have demonstrated that the prevalence and severity of steatosis are higher in
patients infected with genotype 3 HCV than in patients infected with other genotypes, 1, 5, 28-32
suggesting that one or more viral proteins may play a direct role in triggering steatosis.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 5
However, conflicting conclusions have been drawn from in vitro studies on the role of
specific residues of the HCV-genotype 3 core protein in steatosis.19, 33, 34
Nevertheless, the
method used to quantify lipid droplet accumulation differed between studies, potentially
accounting for these discrepancies. In previous investigations on cultured cells producing
various wild-type or mutated HCV core proteins, we established an original method for
quantifying steatosis by transmission electron microscopy (TEM).17, 19
We investigated the
impact of HCV diversity on the severity of steatosis, by applying this method to the analysis
of liver biopsy specimens from chronic HCV carriers with viruses of genotype 3 or other
genotypes. We aimed to quantify precisely the accumulation of lipid droplets in liver tissues.
We also determined the sequence of the core and NS5A proteins of the viruses infecting these
patients, with the aim of assessing the correlation between specific amino-acid residues and
steatosis severity.
METHODS
Patients
HCV-infected patients were recruited from two hospitals in the Loire Valley (Tours, Blois) on
the basis of the following criteria: (i) known chronic HCV infection; (ii) never treated or with
antiviral treatment failure resulting in no further treatment for at least 11 months; (iii) known
genotype of the infecting virus, previously evaluated with the VERSANT HCV Genotype
Assay (LiPA, Bayer); (iv) age between 18 and 75 years; (v) need for histological monitoring
of the liver, justifying liver biopsy. We excluded patients with metabolic causes of steatosis,
by applying the following exclusion criteria: (i) presence of a metabolic syndrome,
characterised by a waist ≥ 94 cm (male)/≥ 80 cm (female), and at least two of the following
criteria: triglycerides >1.7 mmol/l or treated for hypertriglyceridaemia, HDL-cholesterol
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 6
<1.03 mmol/l (male)/ <1.29 mmol/l (female), systolic blood pressure ≥ 130 mmHg/diastolic
blood pressure ≥ 85 mmHg or treated arterial hypertension, sugar concentration in a fasting
blood sample ≥ 5.6mmol/l or treated diabetes; (ii) suspected associated hepatic disease
(Wilson’s diseases, alpha1-antitrypsin deficiency, haemochromatosis, autoimmune hepatitis);
(iii) alcohol consumption > 2 glasses / day in the three months preceding liver biopsy; (iv)
HIV or HBV coinfection; (v) “by pass” gastrointestinal gastroplasty, parenteral nutrition,
extensive resection of the small intestine, intestinal bacterial overgrowth; (vi) drug treatment
potentially inducing or interfering with liver steatosis.
Twenty-seven patients were included in this study: 12 patients infected with HCV
genotype 3 and 15 patients infected with HCV of another genotype (14 genotype 1 and 1
genotype 5). Serum viral load (IU/ml) was determined, and other blood tests, including
ALAT, ASAT, �GT and alkaline phosphatase concentration (IU/l) determinations, were also
carried out at the time of liver biopsy.
The study was approved by the local institutional review board and all patients
provided written informed consent.
Steatosis quantification in liver biopsy specimens
Liver biopsies were examined blind to patient information by a pathologist (A.d.M), for
routine histological diagnosis. To this end, a slice of at least 15 mm of each liver biopsy
specimen was fixed in formalin and embedded in paraffin. Sections were cut and stained with
haematoxylin-eosin-safran. Fibrosis and activity were graded on the basis of METAVIR
scores. For comparison with TEM results, steatosis was also routinely graded as grade 0 (0%
hepatocytes with fat), grade 1 (<20% hepatocytes with fat), grade 2 (20-50% hepatocytes with
fat), grade 3 (>50% hepatocytes with fat).
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 7
The remainder of each liver biopsy specimen (at least 5 mm) was fixed by incubation
for 48 h in 4% paraformaldehyde and 1% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2),
and post-fixed by incubation for 1 h with 2% osmium tetroxide, for steatosis quantification by
TEM. Samples were dehydrated in a graded series of ethanol solutions, cleared in propylene
oxide and embedded in Epon resin, which was allowed to polymerise for 48 h at 60°C.
Ultrathin sections (70 nm) were cut with a Reichert ultramicrotome (Heidelberg, Germany),
stained with 5 % uranyl acetate 5 % lead citrate, and placed on EM grids. The sections were
then observed with a Jeol 1230 transmission electron microscope (Tokyo, Japan) connected to
a Gatan digital camera driven by Digital Micrograph software (Gatan, Pleasanton, CA), for
image acquisition and analysis. Lipid droplets in these liver biopsy specimens were quantified
with a modified version of a method originally developed for their quantification in cultured
cells.19
Slides were analysed blind to information about the patient. Lipid droplets diameter
was determined on the computer screen for five consecutive squares (5000 µm2 each) of two
independent TEM grids (representing the analysis of 10 different areas of 5000 µm2 of hepatic
tissue, for each biopsy). Lipid droplet diameter was then converted into a disk area in µm2.
The areas covered by the lipid droplets partially superimposed by a TEM grid bar were
specifically determined with the Image J program (National Institute of Health, USA). By
summing these areas, we were able to determine the cumulative lipid droplet area in µm2 per
TEM grid square. For each biopsy, we summed the areas in the 10 squares analyzed.
Statistical analysis of the cumulative lipid droplet areas determined by TEM
Samples from the patients were classified as infected with a genotype 3 virus or with a virus
of another genotype (3 or non-3). The differences between these groups were assessed with
Fisher’s exact tests for qualitative variables and Wilcoxon tests for quantitative variables.
Cumulative lipid droplet areas were compared between the two groups, in a non-parametric
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 8
Wilcoxon test. The correlation between the results obtained by TEM and classification by the
pathologist during routine histopathological diagnosis was assessed by calculating
Spearman’s rank correlation coefficient with a 95% confidence interval. Data were analysed
with SAS 9.2 and R software.�
RNA extraction, cDNA synthesis and amplification
RNA was extracted from 140 µl of serum with the QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) and
stored at -80°C until processing. For the amplification of core and NS5A coding regions, RT-
PCR was performed for 50 min with the Superscript III First Strand Synthesis System
(Invitrogen), using 8 µl of the extracted RNA and 2 µM custom primers designed based on
information in the HCV sequence database of the Los Alamos National Laboratory
(http://hcv.lanl.gov). Amplification was performed with the Platinium PCR Supermix High
Fidelity DNA polymerase (Invitrogen) by simple PCR (core region) or nested PCR (NS5A
region), with the custom primers and hybridisation temperatures reported in Table 1.
Cloning and sequence analysis
PCR products were purified according the manufacturer’s instructions (Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System, Promega) and inserted into the pGEMT vector (Promega). We
selected about 20 colonies after the transformation of chemically competent E. coli bacteria.
Plasmid DNA was isolated with the Nucleospin Plasmid DNA kit (Macherey Nagel) and
screened by restriction digestion. Five to 18 clones per patient were generated for each region
(mean : 9 for the core region and 13 for the NS5A region). Core and NS5A quasispecies
variant sequences were determined with the BigDye Terminator® v3.1 Cycle Sequencing kit
(Applied Biosystems), on an ABI PRISM 3100 machine (Applied Biosystems). BioEdit was
used for the comparison of amino-acid sequences.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 9
Phylogenetic analysis
Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted with MEGA (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) 5 software.35
Analysis was based on the maximum
likelihood method. Using the substitution rate for each amino-acid over time, as described by
Jones, Taylor and Thornton (1992), we estimated the likelihood (bootstrap value > 75%) of
the position and length of the branches of the tree. An evolutionary distance of 0.01
corresponded to 10 mutations per 1000 residues. We carried out a phylogenetic analysis of the
NS5A region to confirm genotype identification by the VERSANT HCV Genotype Assay
(see above).
RESULTS
General characteristics of the patients at the time of liver biopsy
Patients were assigned to one of two groups on the basis of viral genotype (3 or non-3). The
patients infected with HCV genotype 3 did not differ from those infected with HCV of other
genotypes in terms of sex ratio, age, BMI, duration of infection, source of infection, alcohol
intake, ALAT, ASAT and alkaline phosphatase concentrations, glycaemia, viral load or
METAVIR score (Table 2). However, patients infected with a genotype 3 virus had lower
serum cholesterol, TG and �GT concentrations than patients infected with viruses of other
genotypes (Table 2). The difference in serum cholesterol concentrations between patients
infected with genotype 3 viruses and those infected with viruses of other genotypes has
already been described,1, 36-37
but the impact of HCV genotype on TG level remains unclear.
38, 39
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 10
Steatosis quantification by TEM and analysis
The area covered by lipid droplets in 10 different areas of 5000 µm2 of hepatic tissue (50,000
µm2 in total) was determined by TEM for each liver biopsy specimen. Figure 1 shows lipid
droplets on ultrathin sections from the liver biopsy specimens of three different patients with
representative profiles. A box plot was generated for the analysis of these cumulative lipid
droplet areas as a function of viral genotype (Figure 2). We found no significant difference in
median cumulative droplet area between the two groups (see the horizontal dark line in each
box): 5461.1[2165.2; 10027.9] for the genotype 3 group, versus 3538.7[2184.6; 4984.4] for
the genotype non 3 group (p=0.581). However, the cumulative lipid droplet areas of the
patients infected with genotype 3 viruses were much more variable than those of patients
infected with viruses of other genotypes (Figure 2).
The quantification of lipid droplets by TEM was compared with the results of steatosis
assessment during routine histopathological analysis of the liver biopsy specimen. With a
Spearman’s rank correlation coefficient of 0.87 [0.73; 0.94], the histopathological grade of
steatosis was strongly correlated with the cumulative lipid droplet area obtained by TEM. The
slight differences observed were accounted for by the detection, by TEM, of the accumulation
of small lipid droplets (microsteatosis) in some patients considered not to have steatosis in
routine histopathological assessments (data not shown).
Analysis of the HCV core and NS5A protein sequences as a function of steatosis severity
We investigated the involvement of HCV core and NS5A protein residues in steatosis
severity, in an analysis on a restricted number of patients: those with severe liver steatosis,
with a lipid droplet area of more than 10,000 µm2 on TEM (6 patients: 3 infected with a
genotype 3 virus, 2 infected with a genotype 1 virus and 1 infected with a genotype 5 virus);
and those with very little or no steatosis, characterised by a lipid droplet area of less than
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 11
1,000µm2 on TEM (5 patients: 3 infected with a genotype 1 virus and 2 infected with a
genotype 3 virus).
For the entire core region, we observed no association of particular amino-acid
residues or motifs with severe steatosis. For example, Figure 3 shows the alignment of the
HCV core protein domains 2 (D2) and 3 (D3) of the consensus sequence determined for the
11 patients. HCV core protein D2 (residues 119-173) and D3 (residues 174-191) are known to
be important for the association of the protein with the surface of the lipid droplet, and some
key residues have been shown, in vitro, to increase lipid droplet accumulation in cultured
cells.19, 34
Residues highly specific for genotype 3 strains, such as the phenylalanine residue in
position 164, were found in all genotype 3 viruses, but the presence of this particular residue
was not associated with steatosis severity (Figure 3), despite the demonstration of
involvement in steatosis for this residue in vitro.19
Similarly, the 182LI186 and 182FV186
motifs, which have also been shown to be associated with higher levels of lipid droplet
accumulation in in vitro models,34
were not associated with severe steatosis in our patients
(Figure 3).
We established a phylogenetic tree with the core protein sequences of all variants
found in the 11 patients. The sequences clustered according to genotype (Figure 4A), with one
group for the genotype 1 sequences (14 patients), one group for the genotype 3 sequences (12
patients) and an isolated sequence for genotype 5 (1 patient). Due to the high degree of core
sequence conservation within the various genotypes, clones from the same patient did not
necessarily cluster, instead mixing with those from other patients. Thus, clusters were found
for only seven patients, for whom diversity within the various clones is indicated by the
triangle at the top of the branch. Patients with little or no (green) and severe (red) steatosis
were evenly distributed over this phylogenic tree, with no particular branch of the phylogenic
tree associated with severe steatosis.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 12
For the NS5A region, the alignment of consensus sequences from the 11 patients
showed that no particular amino acid or motif was associated with severe steatosis (data not
shown). We then constructed phylogenetic trees with the sequences of all the variants found
in these patients. As for the core protein, the distribution of the variants between the three
groups depended on genotype (Figure 4B). NS5A protein sequences were highly
heterogeneous and we were therefore able to evaluate diversity for each patient (triangles at
the end of each branch). However, patients with little or no steatosis (green) and those with
severe (red) steatosis were again even distributed over the phylogenic tree, indicating a lack of
association between any particular branch of the phylogenic tree and severe steatosis.
DISCUSSION
The mechanisms leading to liver steatosis in chronic hepatitis C are difficult to decipher,
probably due to the existence of two different entities: (i) steatosis with common causes, such
as obesity, diabetes mellitus or alcohol intake, (ii) steatosis without known risk factors,
presumably at least partly related to the viral infection.40
Steatosis seems to be mostly (but
probably not exclusively) virus-induced in infections with genotype 3 viruses, whereas it is
principally associated with host factors in infections with viruses of other genotypes. We
designed this study to investigate this question with a small number of patients, due to
restrictive criteria of inclusion, but with precise quantification of lipid droplet accumulation
in the liver tissue of patients infected with viruses of genotype 3 and viruses of other
genotypes. In tissue fixed with formalin and embedded in paraffin for sectioning for routine
histological diagnosis, the lipid droplets fuse and seem to form holes, deformed to various
extents, in tissue sections.41
Steatosis is evaluated by determining the percentage of
hepatocytes presenting this pattern. This routine evaluation of steatosis was performed in our
study, but we set up, in parallel, an original method for determining, by TEM, the cumulative
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 13
area covered by lipid droplets in liver biopsy specimens from our patients. The main
advantage of TEM was that it enabled us to detect the accumulation of small lipid droplets
(microsteatosis) in some patients considered not to have steatosis in routine histopathological
diagnosis. However, overall, there was a good correlation between the results obtained with
the two approaches. Using this original technique, we were able to show that the cumulative
area covered by lipid droplets in the livers of patients infected with viruses of genotype 3 did
not differ significantly from that in the livers of patients infected with viruses of other
genotypes. These results differ from those of many other studies showing that infection with
genotype 3 viruses is more frequently associated with severe steatosis,1, 5, 28-32
but are
consistent with several studies showing that this link is not statistically significant.32, 36
Serum
cholesterol concentration was lower in patients infected with genotype 3 viruses than in
patients infected with viruses of other genotypes, as reported in other studies,1, 31, 36, 37
and this
was not due to differences in the demographic profiles of the patients. Lower serum
cholesterol concentrations have been found in patients infected with various HCV genotypes,
probably due to a global deficit in lipid and lipoprotein metabolism induced by HCV that
might be exacerbated in patients infected with genotype 3 viruses.42
However, this lower
serum cholesterol concentration in patients infected with genotype 3 viruses was not
correlated with more severe steatosis in our study.
The mechanisms by which viral proteins affect the development of genotype-3-
specific steatosis remain hypothetical. The HCV core protein accumulates at the surface of
lipid droplets in vitro and in vivo,43, 44
and has been shown to induce steatosis in the livers of
transgenic mice,45-47
and to deregulate a large number of genes involved in lipid metabolism.
9-16 This protein has therefore been the main focus of interest of many investigators. Several
in vitro studies have shown that the core protein from genotype 3 strains interacts specifically
with lipid metabolism. Early experiments based on the production of HCV core proteins from
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 14
viruses of different genotypes showed that all core proteins induced triglyceride
accumulation, but that the genotype 3 core protein enhanced this phenomenon.48
In particular,
it strongly induced fatty acid synthase (FAS), an enzyme required for intracellular triglyceride
production, in a sterol response element binding protein 1 (SREBP1)–dependent manner.15
HCV core protein has been shown to induce the cleavage of sterol regulatory element binding
proteins and their phosphorylation, by triggering oxidative stress, leading to fatty acid
synthesis, and this phenomenon is genotype-dependent.14
It has recently been demonstrated
that the phosphatase and tensin homologue (PTEN) is downregulated by a genotype 3 core
protein, via a mechanism involving a microRNA-dependent blockade of PTEN mRNA
translation, whereas a genotype 1 core protein has no effect.49
The functional differences
between genotype 1 and 3 core proteins are probably related to differences in amino-acid
sequences, although these sequences are very similar. However, single amino-acid differences
between these proteins may modulate local folds, stability and interactions with host cell
proteins. Domain 2 of the core protein (amino acids 119-173) has been implicated in lipid
droplet association.18,50-53
Within this domain, the Y164F mutation of a genotype 1 core
protein, resulting in the incorporation of a residue highly specific for genotype 3 strains, has
been shown to increase lipid droplet accumulation in vitro, in cellular models.19
This
particular mutant has also been implicated in the stronger FAS activation observed with the
genotype 3 core protein than with the genotype 1 core protein.15
One group has also reported
a possible link between the polymorphism in domain 3 (amino acids 174-191) of the genotype
3 core protein and steatosis.34, 54
The FV or LI combination of residues at positions 182 and
186 in viral sequences (as opposed to FI) was found to be associated with the presence of
severe intrahepatic steatosis in patients. The in vitro production of core proteins with these
steatosis-associated polymorphisms increased intracellular lipid levels over those obtained
with non steatosis-associated core isolates.34, 54
However, the presence of these particular
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 15
residues was not correlated with severe steatosis in our patients. We identified no particular
amino-acid residues or motifs within the entire core sequences that could be considered to be
associated with severe steatosis. Furthermore, careful analysis of all collected core sequences
in a phylogenic tree showed an absence of correlation between a particular branch and the
steatosis status of the patients. These results are consistent with those of Piodi et al.33
, who
found no difference between the genes encoding the core proteins of genotype 3 viruses
between patients with and without steatosis. However, as Piodi et al. showed that the HCV
core protein of genotype 3 strains was able to induce the formation of larger lipid droplets in
vitro than genotype 1,33
we also analysed individual lipid droplet diameter and surface on
liver biopsy specimens. Again, we found no significant difference between genotype 3 and the
other genotypes (p=0.92; data not shown).
It has recently been shown that the HCV NS5A protein co-localises with the core
protein on lipid droplets55, 56
and interacts with apolipoprotein (Apo) A1, ApoB and ApoE21,
22, 25 and with peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ).
24 Furthermore, the NS5A
protein has recently been shown to induce steatosis in a transgenic mouse model.23
We
therefore analyzed the NS5A sequences of the multiple variants circulating in our patients.
The considerable variability of the NS5A region complicated the analysis of sequence
alignment (data not shown). However, we found no amino-acid differences between patients
with little or no steatosis and those with severe steatosis. Finally, an analysis of all the
collected N5A sequences in a phylogenic tree showed no correlation between any particular
branch and the steatosis status of the patients.
Overall, our study shows that core and NS5A protein variability in HCV genotypes
and strains has little effect on the severity of steatosis in chronic HCV carriers. In particular,
the effects of the genotype 3 core protein identified in experiments carried out in vitro15, 19, 34,
48, 49, 54 seem to be much milder in vivo, in conditions in which host factors may have a much
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 16
stronger effect on the severity of steatosis. This is consistent with the lack of a direct
relationship in vivo between steatosis and the presence of HCV proteins within steatotic
hepatocytes.36
Furthermore, the specific induction of higher SREBP1 levels by a genotype 3
core protein in vitro15
was not confirmed in a recent analysis of gene expression in the livers
of human patients infected with HCV of various genotypes.57, 58
Our study is consistent with
the findings of Piodi et al.,33
suggesting that in patients infected with a genotype 3 virus
individual host factors play a greater role in the development of liver steatosis than viral
factors, contrary to the conclusions of most of the clinical studies that have previously
addressed this question. Interestingly, a body of new data has emerged, suggesting that the
polymorphism of various genes, including PPARγ, IL-28B, adiponutrin and microsomal
triglyceride transfer protein (MTP), may influence the development of more severe steatosis
in chronic carriers of HCV.59-63
We may also hypothesise that an indirect factor, such as
alcohol consumption, which some patients might find it difficult to acknowledge, has
contributed in previous studies for a difference between patients infected with genotype 3
viruses and with viruses of other genotypes. Indeed, epidemiological studies in Western
Europe, including France in particular, have shown that alcohol abuse is frequently observed
in patients with a history of intravenous drug use (IVDU)64, 65
and that genotype 3 infection is
frequently found in patients with a history of IVDU.66
In conclusion, our study suggests that individual host factors seem to play a greater
role than viral factors in the development of severe steatosis in patients chronically infected
with HCV, including those infected with genotype 3 viruses.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 17
Acknowledgement We thank Fabienne Arcanger, Julie Léger, Marie-Paule Regner and
Juliette Rousseau for technical assistance. We thank Frédéric Dubois, Nathalie Juteau and
Pierre-Ivan Raynal for helpful discussions and feedback on this work. Our data were obtained
with the assistance of the RIO Electron Microscopy Facility of François Rabelais University.
Funding This work was supported by grants from INSERM-DHOS « Recherche
Translationnelle : Virostéatose » and by the Ligue Contre le Cancer (Loir et Cher and Ile et
Vilaine). M.D. was supported by a fellowship from INSERM-Région Centre and the
Fondation pour la Recherche Médicale.
Competing interest None.
Ethics approval This study was conducted with the approval of the Institutional Review
Board of the Tours University Hospital (CPP), France.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 18
Table 1 Sequences of the primers used and conditions for RT-PCR amplification of the
core and NS5A protein-coding regions
_____________________________________________________________________
Primer Sequence
CORE sense 5' CGG ATC CCT TGT GGT ACT GCC TGA TAG GG 3'
CORE Gen 1 antisense 5' GGG ATC CTT AGB GAC CAG TTC ATC ATC ATA TCC CA 3'
CORE Gen 3 antisense 5' AGG ATC CTT ACC AAT TCA TCA TCA TAT CCC AAG C 3'
NS5A Gen 1 out sense 5' CAG TGG ATG AAC CGG CTR ATA 3'
NS5A Gen 1 out antisense 5' TGT GGT GAC GTA GCA ACG AGT TGC T 3'
NS5A Gen 1 in sense 5' TCC GGT TCC TGG CTA AGR GA 3'
NS5A Gen 1 in antisense 5' CAG GAG TAA GAC ATT GAG CAG CAC 3'
NS5A Gen 3 out sense 5' CAC TAT GTT CCC GAG AGC G 3'
NS5A Gen 3 out antisense 5' CGA AGG TAA CCT TCT TCT GAC G 3'
NS5A Gen 3 in sense 5' GCG GTT ACA CCA GTG GAT CAA TG 3'
NS5A Gen 3 in antisense 5' GTG TTA TCA TGG CGC CCG TCC 3'
NS5A Gen 5 out sense 5' CAC TAC GTG CCC GAG ACG GAC GC 3'
NS5A Gen 5 out antisense 5' CAA AAG TGA CCT TTT TCT GCC T 3'
NS5A Gen 5 in sense 5' GAG GCT CCA CAC GTG GAT CGG TG 3'
NS5A Gen 5 in antisense 5' GGG TGA TGA GCG CCC CCG TCC 3'
___________________________________________________________________________
PCR first round
primers
T°C
hybridisation
PCR second round
primers
T°C
hybridisation
CORE sense none CORE Genotype 1/5
CORE Gen 1 antisense 55
none none
CORE sense none CORE Genotype 3
CORE Gen 3 antisense 55
none none
NS5A Gen 1 out sense NS5A Gen 1 in sense NS5A Genotype 1
NS5A Gen 1 out antisense 49 or 55
NS5A Gen 1 in antisense 49 or 55
NS5A Gen 3 out sense NS5A Gen 3 in sense NS5A Genotype 3
NS5A Gen 3 out antisense 57
NS5A Gen 3 in antisense 59
NS5A Gen 5 out sense NS5A Gen 5 in sense NS5A Genotype 5
NS5A Gen 5 out antisense 46
NS5A Gen 5 in antisense 57
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 19
Table 2 Demographic, biochemical and histopathological characteristics of the patients
___________________________________________________________________________
Genotype 3 Genotype non 3 p-value
n=12 n=15
Male (%) 8 (66.7) 8 (53.3) NS
Age (median) 49.0 [47.0; 50.5] 51.0 [48.0; 61.0] NS
BMI (median) 22.9 [21.2; 24.8] 24.7 [21.4; 26.1] NS
Duration of infection (median) 28.5 [20.5; 31.5]a 29.0 [24.0; 31.0]
b NS
Source of infection (%) NS
Drug addiction 6 (50.0) 5 (33.3)
Transfusion 2 (16.7) 6 (40.0)
Other 2 (16.7) 2 (13.3)
Unknown 2 (16.7) 2 (13.3)
Alcohol intake (%) NS
0 glass/day 10 (83.3) 11 (73.3)
1-2 glass/day 2 (16.7) 4 (26.6)
Biochemical data (median)
ALAT (IU/l) 120.0 [49.5; 144.5] 79.0 [54.0; 111.0] NS
ASAT (IU/l) 71.0 [40.5; 92.5] 54.0 [40.0; 94.0] NS
GGT (IU/l) 71.5 [43.0; 103.5] 130.0 [99.0; 233.0] 0.012
Alkaline phosphatase 69.5 [61.0; 95.5] 81.0 [64.0; 108.0] NS
Total cholesterol (mmol/l) 3.9 [3.3; 4.0] 4.8 [4.4; 5.7] 0.0002
Glycaemia (mmol/l) 5.0 [4.7; 5.6] 5.4 [4.8; 5.8] NS
Triglyceridaemia (mmol/l) 0.74 [0.62; 1.13] 1.36 [1.14; 1.67] 0.004
Viral load (log) 6.1 [5.8; 6.5] 6.2 [5.8; 6.6] NS
METAVIR Score (%) NS
A1F1 3 (25.0) 3 (20.0)
A1F2 1 (8.3) 1 (6.7)
A1F4 1 (8.3) 0 (0.0)
A2F1 2 (16.7) 3 (20.0)
A2F2 1 (8.3) 3 (20.0)
A2F3 3 (25.0) 3 (20.0)
A2F4 0 (0.0) 2 (13.3)
A3F4 1 (8.3) 0 (0.0)
__________________________________________________________________________aData missing for 4 patients
bData missing for 2 patients
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 20
Figure Legends
Figure 1. TEM observation of representative liver biopsy specimens from three patients
chronically infected with HCV. The liver in A shows a small number of small lipid droplets
(arrows) and was found to have a lipid droplet area < 1000 µm2
per 50,000 µm2
of tissue. The
liver in B has extremely large lipid droplets (LD) and was found to have a lipid droplet area >
10,000 µm2
per 50,000 µm2
of tissue. The TEM photograph in C shows a high magnification
of an individual hepatocyte with several large lipid droplets (LD), taken from a liver biopsy
specimen considered intermediate to the other two in terms of steatosis severity. Scale bars:
20 µm in A and B; 2 µm in C.
Figure 2. Comparative analysis of the cumulative lipid droplet areas determined by TEM on
liver biopsy specimens from patients infected with genotype 3 viruses and viruses of other
genotypes, in µm2. Cumulative lipid droplet areas were summed for all patients with genotype
3 infection (left boxplot) and for patients infected with viruses of other genotypes (right
boxplot). Boxplots show the median lipid droplet area (horizontal black line), the 25th
and the
75th
percentile. Dot plots indicate the extreme values of cumulative lipid droplet area. There
was no significant difference between the two groups (5461.1[2165.2; 10027.9] for the
genotype 3 group versus 3538.7[2184.6; 4984.4] for the non-3 group, p=0.581).
Figure 3. Alignment of amino acids 119-191 of the core protein consensus sequences from 5
patients with little or no steatosis (in green) and 6 patients with severe steatosis (in red). The 5
patients in with little or no steatosis had a lipid droplet area < 1000 µm2
per 50,000 µm2
of
liver tissue. The 6 patients with severe steatosis had a lipid droplet area > 10,000 µm2
per
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 21
50,000 µm2
of tissue. Patients infected with genotype 3 strains are indicated with an asterisk
(*) and such patients are present in both groups. The residues at each position are indicated
with the single-letter amino-acid code. Amino acids identical to the first sequence are
indicated by a dot. The positions of the residues shown in previous studies to increase lipid
droplet accumulation in vitro, in cultured cells, are indicated in red. No association was found
between a particular amino-acid residue or motif and the presence of severe steatosis.
Figure 4. Phylogenic trees for the core (A) and NS5A (B) protein sequences of all variants
identified in the 27 patients included in the study. The 5 patients in green had a lipid droplet
area < 1000 µm2
per 50,000 µm2
of liver tissue. The 6 patients in red had a lipid droplet area
> 10,000 µm2
per 50,000 µm2
of tissue. The remaining 16 patients, with steatosis of
intermediate severity, are shown in black. Diversity in individual patients is represented by a
triangle at the top of the branches, with the magnitude of the diversity observed increasing
with the area of the triange. Bootstrap values exceeding 75% are shown (numbers in dark
blue). Scale bars indicate evolutionary distance (0.01 indicates 10 mutations for every 1000
residues). Patients are grouped according to viral genotype. Patients with little or no stenosis
(green) and those with severe (red) steatosis are evenly distributed over these phylogenic
trees, with no particular branch displaying an association with severe steatosis.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 22
REFERENCES
1. Poynard T, Ratziu V, McHutchison J, et al. Effect of treatment with peginterferon or
interferon alfa-2b and ribavirin on steatosis in patients infected with hepatitis C.
Hepatology 2003;38:75–85.
2. Hourigan LF, Macdonald GA, Purdie D, et al. Fibrosis in chronic hepatitis C correlates
significantly with body mass index and steatosis. Hepatology 1999;29:1215–9.
3. Zarski JP, Bohn B, Bastie A, et al. Characteristics of patients with dual infection by
hepatitis B and C viruses. J Hepatol 1998;28:27–33.
4. Benhamou Y, Bochet M, Di Martino V, et al. Liver fibrosis progression in human
immunodeficiency virus and hepatitis C virus coinfected patients. The Multivirc Group.
Hepatology 1999;30:1054–8.
5. Adinolfi LE, Gambardella M, Andreana A, et al. Steatosis accelerates the progression of
liver damage of chronic hepatitis C patients and correlates with specific HCV genotype
and visceral obesity. Hepatology 2001;33:1358–64.
6. Westin J, Nordlinder H, Lagging M, et al. Steatosis accelerates fibrosis development
over time in hepatitis C virus genotype 3 infected patients. J Hepatol 2002;37:837–42.
7. Monto A, Alonzo J, Watson JJ, et al. Steatosis in chronic hepatitis C: relative
contributions of obesity, diabetes mellitus, and alcohol. Hepatology 2002;36:729–36.
8. Rubbia-Brandt L, Fabris P, Paganin S, et al. Steatosis affects chronic hepatitis C
progression in a genotype-specific way. Gut 2004;53:406–12.
9. Su AI, Pezacki JP, Wodicka L, et al. Genomic analysis of the host response to hepatitis C
virus infection. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:15669–74.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 23
10. Tsutsumi T, Suzuki T, Shimoike T, et al. Interaction of hepatitis C virus core protein
with retinoid X receptor alpha modulates its transcriptional activity. Hepatology
2002;35:937–46.
11. Dharancy S, Malapel M, Perlemuter G, et al. Impaired expression of the peroxisome
proliferator-activated receptor alpha during hepatitis C virus infection. Gastroenterology
2005;128:334–42.
12. De Gottardi A, Pazienza V, Pugnale P, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor
alpha and gamma mRNA levels are reduced in chronic hepatitis C with steatosis and
genotype 3 infection. Aliment Pharmacol Ther 2006;23:107–14.
13. Kim KH, Hong SP, Kim K, et al. HCV core protein induces hepatic lipid accumulation
by activating SREBP1 and PPARgamma. Biochem Biophys Res Commun 2007;355:883–
8.
14. Waris G, Felmlee DJ, Negro F, et al. Hepatitis C virus induces proteolytic cleavage of
sterol regulatory element binding proteins and stimulates their phosphorylation via
oxidative stress. J Virol 2007;81:8122–30.
15. Jackel-Cram C, Babiuk LA, Liu Q. Up-regulation of fatty acid synthase promoter by
hepatitis C virus core protein: genotype-3a core has a stronger effect than genotype-1b
core. J Hepatol 2007;46:999–1008.
16. Moriishi K, Mochizuki R, Moriya K, et al. Critical role of PA28-gamma in hepatitis C
virus-associated steatogenesis and hepatocarcinogenesis. Proc Nat Acad Sci USA
2007;104:1661.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 24
17. Depla M, Uzbekov R, Hourioux C, et al. Ultrastructural and quantitative analysis of the
lipid droplet clustering induced by hepatitis C virus core protein. Cell Mol Life Sci
2010;67:3151–61.
18. Boulant S, Targett-Adams P, McLauchlan J. Disrupting the association of hepatitis C
virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious
virus. J Gen Virol 2007;88:2204–13.
19. Hourioux C, Patient R, Morin A, et al. The genotype 3-specific hepatitis C virus core
protein residue phenylalanine 164 increases steatosis in an in vitro cellular model. Gut
2007;56:1302–8.
20. Boulant S, Douglas MW, Moody L, et al. Hepatitis C virus core protein induces lipid
droplet redistribution in a microtubule- and dynein-dependent manner. Traffic
2008;9:1268–82.
21. Shi ST, Polyak SJ, Tu H, et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein
on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology 2002;292:198–210.
22. Domitrovich AM, Felmlee DJ, Siddiqui A. Hepatitis C virus nonstructural proteins
inhibit apolipoprotein B100 secretion. J Biol Chem 2005;280:39802–8.
23. Wang A-G, Lee D-S, Moon H-B, et al. Non-structural 5A protein of hepatitis C virus
induces a range of liver pathology in transgenic mice. J Pathol 2009;219:253–62.
24. Kim K, Kim KH, Ha E, et al. Hepatitis C virus NS5A protein increases hepatic lipid
accumulation via induction of activation and expression of PPARgamma. FEBS Let
2009;583:2720–6.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 25
25. Benga WJ, Krieger SE, Dimitrova M, et al. Apolipoprotein E interacts with hepatitis C
virus nonstructural protein 5A and determines assembly of infectious particles.
Hepatology 2010;51:43-53.
26. Simmonds P, Bukh J, Combet C, et al. Consensus proposals for a unified system of
nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology 2005;42:962–73.
27. Murphy DG, Willems B, Deschênes M, et al. Use of sequence analysis of the NS5B
region for routine genotyping of hepatitis C virus with reference to C/E1 and 5’
untranslated region sequences. J Clin Microbiol 2007;45:1102–12.
28. Mihm S, Fayyazi A, Hartmann H, et al. Analysis of histopathological manifestations of
chronic hepatitis C virus infection with respect to virus genotype. Hepatology
1997;25:735–9.
29. Rubbia-Brandt L, Quadri R, Abid K, et al. Hepatocyte steatosis is a cytopathic effect of
hepatitis C virus genotype 3. J Hepatol 2000;33:106–15.
30. Rubbia-Brandt L, Leandro G, Spahr L, et al. Liver steatosis in chronic hepatitis C: a
morphological sign suggesting infection with HCV genotype 3. Histopathology
2001;39:119–24.
31. Hofer H, Bankl HC, Wrba F, et al. Hepatocellular fat accumulation and low serum
cholesterol in patients infected with HCV-3a. Am J Gastroenterol 2002;97:2880–5.
32. Kumar D, Farrell GC, Fung C, et al. Hepatitis C virus genotype 3 is cytopathic to
hepatocytes: Reversal of hepatic steatosis after sustained therapeutic response.
Hepatology 2002;36:1266–72.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 26
33. Piodi A, Chouteau P, Lerat H, et al. Morphological changes in intracellular lipid droplets
induced by different hepatitis C virus genotype core sequences and relationship with
steatosis. Hepatology 2008;48:16–27.
34. Jhaveri R, McHutchison J, Patel K, et al. Specific polymorphisms in hepatitis C virus
genotype 3 core protein associated with intracellular lipid accumulation. J Infect Dis
2008;197:283–91.
35. Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics
analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony
methods. Mol Biol Evol 2011. doi:10.1093/molbev/msr121
36. Grassi A, Ballardini G, Susca M, et al. HCV liver infection and liver steatosis: evidence
for indirect mechanisms in genotype 3? Aliment Pharmacol Ther 2005;22 Suppl 2:79–82.
37. Siagris D, Christofidou M, Theocharis GJ, et al. Serum lipid pattern in chronic hepatitis
C: histological and virological correlations. J Viral Hepat 2006;13:56–61.
38. Wu J-M, Skill NJ, Maluccio MA. Evidence of aberrant lipid metabolism in hepatitis C
and hepatocellular carcinoma. HPB (Oxford) 2010;12:625–36.
39. Ramcharran D, Wahed AS, Conjeevaram HS, et al. Serum lipids and their associations
with viral levels and liver disease severity in a treatment-naïve chronic hepatitis C type 1-
infected cohort. J Viral Hepat 2011;18:e144–52.
40. Asselah T, Rubbia-Brandt L, Marcellin P, Negro F. Steatosis in chronic hepatitis C: why
does it really matter? Gut 2006;55:123–30.
41. Fujimoto T, Ohsaki Y, Cheng J, et al. Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.
Histochem Cell Biol 2008;130:263–79.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 27
42. Piver E, Roingeard P, Pagès J-C. The cell biology of hepatitis C virus (HCV) lipid
addiction: molecular mechanisms and its potential importance in the clinic. Int J Biochem
Cell Biol 2010;42:869–79.
43. Barba G, Harper F, Harada T, et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic
localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Nat Acad Sci USA
1997;94:1200.
44. Qiang G, Yang L, Witek R, et al. Recombinant adenoviruses expressing steatosis-
associated hepatitis C virus genotype 3 core protein produce intracellular lipid
accumulation in cultured and primary hepatocytes. Virus Res 2009;139:127–30.
45. Moriya K, Yotsuyanagi H, Shintani Y, et al. Hepatitis C virus core protein induces
hepatic steatosis in transgenic mice. J Gen Virol 1997;78:1527.
46. Moriya K, Fujie H, Shintani Y, et al. The core protein of hepatitis C virus induces
hepatocellular carcinoma in transgenic mice. Nat Med 1998;4:1065–7.
47. Lerat H, Honda M, Beard MR, et al. Steatosis and liver cancer in transgenic mice
expressing the structural and nonstructural proteins of hepatitis c virus. Gastroenterology
2002;122:352–65.
48. Abid K, Pazienza V, de Gottardi A, et al. An in vitro model of hepatitis C virus genotype
3a-associated triglycerides accumulation. J Hepatol 2005;42:744–51.
49. Clément S, Peyrou M, Sanchez-Pareja A, et al. Downregulation of PTEN and IRS-1 by
HCV 3a core protein triggers the formation of large lipid droplets in hepatocytes.
Hepatology 2011; 54:38-49.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 28
50. Hope RG, McLauchlan J. Sequence motifs required for lipid droplet association and
protein stability are unique to the hepatitis C virus core protein. J Gen Virol
2000;81:1913–25.
51. Hope RG, Murphy DJ, McLauchlan J. The domains required to direct core proteins of
hepatitis C virus and GB virus-B to lipid droplets share common features with plant
oleosin proteins. J Biol Chem 2001;277:4261–70.
52. Boulant S, Montserret R, Hope RG, et al. Structural determinants that target the hepatitis
C virus core protein to lipid droplets. J Biol Chem 2006;281:22236–47.
53. Shavinskaya A, Boulant S, Penin F, et al. The lipid droplet binding domain of hepatitis C
virus core protein is a major determinant for efficient virus assembly. J Biol Chem
2007;282:37158–69.
54. Jhaveri R, Qiang G, Diehl AM. Domain 3 of hepatitis C virus core protein is sufficient
for intracellular lipid accumulation. J Infect Dis 2009;200:1781–8.
55. Miyanari Y, Atsuzawa K, Usuda N, et al. The lipid droplet is an important organelle for
hepatitis C virus production. Nat Cell Biol 2007;9:1089–97.
56. Appel N, Zayas M, Miller S, et al. Essential role of domain III of nonstructural protein
5A for hepatitis C virus infectious particle assembly. PLoS Pathog 2008;4:e1000035.
57. McPherson S, Jonsson JR, Barrie HD, et al. Investigation of the role of SREBP-1c in the
pathogenesis of HCV-related steatosis. J Hepatol 2008;49:1046–54.
58. Ryan MC, Desmond PV, Slavin JL, et al. Expression of genes involved in lipogenesis is
not increased in patients with HCV genotype 3 in human liver. J Viral Hepat 2011;18:53–
60.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 29
59. Cai T, Dufour J-F, Muellhaupt B, et al. Viral genotype-specific role of PNPLA3,
PPARG, MTTP, and IL28B in hepatitis C virus-associated steatosis. J Hepatol 2011.
doi:10.1016/j.jhep.2010.12.020
60. Sookoian S, Castaño GO, Burgueño AL, et al. A nonsynonymous gene variant in the
adiponutrin gene is associated with nonalcoholic fatty liver disease severity. J Lipid Res
2009;50:2111–6.
61. Sookoian S, Pirola CJ. Meta-analysis of the influence of I148M variant of patatin-like
phospholipase domain containing 3 gene (PNPLA3) on the susceptibility and histological
severity of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2011;53:1883–94.
62. Mirandola S, Osterreicher CH, Marcolongo M, et al. Microsomal triglyceride transfer
protein polymorphism (-493G/T) is associated with hepatic steatosis in patients with
chronic hepatitis C. Liver Int 2009;29:557–65.
63. Zampino R, Ingrosso D, Durante-Mangoni E, et al. Microsomal triglyceride transfer
protein (MTP) -493G/T gene polymorphism contributes to fat liver accumulation in HCV
genotype 3 infected patients. J Viral Hepat 2008;15:740–6.
64. Nalpas B, Thiers V, Pol S, et al. Hepatitis C viremia and anti-HCV antibodies in
alcoholics. J Hepatol 1992;14:381–4.
65. Verbaan H, Andersson K, Eriksson S. Intravenous drug abuse--the major route of
hepatitis C virus transmission among alcohol-dependent individuals? Scand J
Gastroenterol 1993;28:714–8.
Depla et al. HCV diversity and steatosis page 30
66. Pawlotsky JM, Tsakiris L, Roudot-Thoraval F, et al. Relationship between hepatitis C
virus genotypes and sources of infection in patients with chronic hepatitis C. J Infect Dis
1995;171:1607–10.
20µm 20µm
A B
C
LD
LD
Fig
ure
1
Cumulative lipid droplet area per patient
Gen
oty
pe
Fig
ure
2
120 130 140 150 160 170 180 190
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.
P01 VGKVIDTLTCGLADLMGYIPFVGAPLGGVARALAHGVRVVEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCLTIPASA
P06 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IH..AS
P13 L..........F........L.......A..........L.................V..........V....
P16 L..........F........L.......A..........L............................V....
P23 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IN..AS
P12 L...................L.......A..........L.................................
P14 L..........F........L..G.V.............L...................I........V....
P17 L..........F........L.......A..........L............................V....
P20 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IH..AS
P24 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IH..AS
P26 L..........F........L....V............AL...I.F.....................IN..AS
*
*
*
*
*
Fig
ure
3
P01
99
80
90
9286
84
92
92
89
P0378
858686
86
P06
86
91
P26
94 P2586
85
86
8299
P14
98
89
0.01
Core
Genotype 1
P01
P02
P03
P04
P05
P07
P08
P11
P12
P13
P15
P16
P17
P18
Genotype 3
P06
P09
P10
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
P27
Genotype 5
Figure 4A
NS5A
93
92
819582 86 1
00
100
10
0
100
99
100
100
88
95
100
85
10
0
99
959
3
9092
98100
100
100
0.01
0.01
P03
P14
P12P01
Genotype 1
Genotype 3
Genotype 5
P1593
P16
92
P11
81
P08
95
P0282
P17
P07
86
P05
100
P04
P18
P13100
100
95
P09
85
P06
100
99
P22
9593
90
P2592
P21
P23 98
100
100
100
P27
P09
85
100
P19
99
P22
95
P20
93
P26
90
P2592
P21
P23 98
P10
100
P24
100
100
P27
0.01
Figure 4B
Discussion
La stéatose hépatique est consécutive à une accumulation excessive et anormale de
lipides dans le foie. Elle peut avoir différentes origines liées à des problèmes
comportementaux (obésité, alcoolisme) ; des maladies relatives à des troubles du métabolisme
ou des infection virales comme c’est le cas lors de l’infection chronique par le virus de
l’hépatite C. On distingue ainsi la stéatose d’origine métabolique et la stéatose sans facteurs
de risque connus, probablement d’origine virale (Asselah, 2006). Cependant, au cours de
l’infection par le HCV, il est difficile de mettre en évidence de façon tranchée si les
mécanismes sous jacents au développement de la stéatose hépatique impliquent des troubles
métaboliques ou sont dus à la seule infection virale. La plupart des études menées à ce jour
ont établi que la stéatose est principalement, mais pas exclusivement, induite par le virus lors
d’infections par un génotype 3; alors qu’elle serait associée aux facteurs liés à l’hôte dans le
cas d’infections par d’autres génotypes du HCV.
L’intérêt de l’étude bio-clinique que nous proposions était donc d’essayer de
discriminer réellement la part imputable au virus dans la survenue d’une stéatose sur une
cohorte restreinte de patients infectés par un génotype 3 versus d’autres génotypes que nous
avions sélectionné selon des critères précis pour se soustraire au mieux de toute stéatose
métabolique.
Nous avons mis au point une technique en microscopie électronique à transmission
(MET) qui nous a permis tout d’abord de quantifier finement la stéatose sur des coupes
ultrafines de biopsies de patients, en parallèle de la graduation classique établie par
l’anatomopathologiste en microscopie optique sur des coupes fines de ces mêmes biopsies. La
quantification de la stéatose en MET a pour avantage de chiffrer précisément (µm2) la surface
occupée par les GL sur une surface donnée de tissu, alors que la graduation classique évalue
un pourcentage d’hépatocytes atteints qui présentent de la stéatose macro et/ou
microvésiculaire. Même si l’analyse quantitative en MET se fait sur une zone plus restreinte
de tissu hépatique par rapport à l’évaluation classique, elle est plus résolutive et peut détecter
de très petites GL (micro-stéatose) chez des patients pour lesquels le diagnostic
anatomopathologique aurait conclu à une absence de stéatose. Néanmoins la zone de tissu
étudiée n’est pas toujours représentative de la biopsie réalisée et peut varier d’une coupe à
l’autre. Ceci pourrait aussi expliquer les disparités entre l’analyse anatomopathologique et la
quantification en MET tout comme les méthodes de préparation et de fixation des coupes de
149
biopsies qui diffèrent d’une technique à l’autre. Ainsi, les préparations pour l’observation en
MET permettent de mieux conserver l’ultrastructure et le corps lipidique des GL que la
méthode employée durant la graduation par l’anatomopathologiste qui a tendance à ne laisser
qu’un espace vide et déformé à la place du corps lipidique (Fujimoto et al., 2008). Lors de
l’analyse de biopsies de foies présentant de la stéatose avec des GL de taille importante nous
avons constaté une des limites de la technique en MET. Effectivement une forte proportion
des GL était coupée par les bords du carreau de grille d’observation rendant leur surface
difficile à évaluer par la technique que nous avions mise au point. Ainsi la surface occupée
par ces GL a été mesurée grâce au logiciel Image J qui nous permet de délimiter précisément
les limites de la surface à évaluer. Malgré les contraintes liées aux deux techniques, nous
avons obtenu une corrélation forte entre l’évaluation classique et la quantification en MET
(coefficient de corrélation : 0,87 [0,73 ; 0,94]). Ceci nous a permis de montrer que la surface
cumulée occupée par les GL au sein du tissu hépatique des patients infectés par un génotype 3
n’était pas significativement différente de celle des patients infectés par d’autres génotypes
(non 3). Ces résultats vont à l’encontre de ce qui est couramment admis et de nombreuses
études montrant que l’infection par un génotype 3 était plus souvent associée à la survenue
d’une stéatose sévère (Mihm et al., 1997); (Rubbia-Brandt et al., 2000); (Rubbia-Brandt et
al., 2001); (Hofer et al., 2002); (Adinolfi et al., 2001); (Poynard et al., 2003) mais va dans le
sens de quelques études montrant que la sévérité de la stéatose n’était pas sytématiquement
associée à l’infection par le génotype 3 (Kumar et al., 2002); (Grassi et al., 2005). Nous avons
aussi cherché à déterminer si il y avait une différence dans les données démographiques,
cliniques et histopathologiques (autres que la stéatose) entre les patients de génotype 3 et ceux
d’autres génotypes. Ainsi nous avons constaté que les patients infectés par un génotype 3
avaient des concentrations sériques en cholestérol plus faibles que les patients infectés par
d’autres génotypes comme il avait déjà été rapporté par d’autres (Poynard et al., 2003);
(Hofer et al., 2002); (Grassi et al., 2005); (Siagris et al., 2006), et que ceci n’était pas dû à des
différences démographiques entre les patients. La baisse des concentrations sériques en
cholestérol est connue lors d’infections par le génotype 3 et par d’autres génotypes du HCV et
serait probablement due à un défaut du métabolisme des lipides et/ou des lipoprotéines. De
plus, cette diminution pourrait être amplifiée dans le cas d’infections par un génotype 3 (Piver
et al., 2010). Néanmoins, dans notre étude la baisse de concentration en cholestérol observée
chez les patients de génotype 3 ne semble pas être associée à une sévérité particulière de la
stéatose chez ces mêmes patients.
150
Si il est admis que la stéatose peut avoir une origine en partie virale, les mécanismes
sous jacents et notamment le rôle que joueraient les différentes protéines virales dans
l’établissement de la stéatose reste mal compris. Le HCV peut influencer et détouner le
métabolisme lipidique à son profit. La protéine de capside du HCV est une des mieux
caractérisée quant à son influence sur ce métabolisme. En effet il a été montré qu’elle
s’accumulait à la surface des GL in vitro et in vivo (Barba et al., 1997); (Poynard et al.,
2003); (Qiang et al., 2009), qu’elle était capable à elle seule d’induire une stéatose dans des
modèles de souris transgéniques (Moriya et al., 1997b); (Moriya et al., 1998); (Lerat et al.,
2002) et qu’elle dérégulait plusieurs gènes impliqués dans le métabolisme lipidique (Su et al.,
2002); (Tsutsumi et al., 2002); (Dharancy et al., 2005); (De Gottardi et al., 2006); (Kim et al.,
2007); (Waris et al., 2007); (Jackel-Cram et al., 2007); (Moriishi et al., 2007). Compte tenu
de l’ensemble de ces données, de nombreuses études se sont penchées sur le rôle de la
protéine de capside dans l’établissement de la stéatose. Ainsi il a été montré que la protéine de
capside de génotype 3 était capable d’interagir spécifiquement avec le métabolisme lipidique
à différents niveaux, lors de la synthèse de novo des TG ou lors de la dégradation des acides
gras.
Les protéines de capside des différents génotypes du HCV sont toutes capables d’induire in
vitro une accumulation de TG mais la protéine de capside de génotype 3 semble potentialiser
ce phénomène (Abid et al., 2005). Effectivement, elle pourrait d’une part activer le facteur
SREBP-1 qui va à son tour réguler la transcription de l’enzyme FAS impliquée dans la
synthèse de novo des TG (Jackel-Cram et al., 2007). D’autre part, elle pourrait générer un
stress oxydatif qui serait à l’origine de l’activation des SREBP qui moduleraient en retour la
voie de synthèse des TG (Waris et al., 2007). Elle pourrait aussi interférer avec expression du
facteur PPARα, ce qui limiterait la dégradation des acides gras et contribuerait alors à
l’accumulation de TG (De Gottardi et al., 2006). De plus la protéine de capside pourrait
entraîner une baisse d’expression des éléments de réponse à l’insuline (IRS) en interférant
avec l’expression de la PTEN (Clément et al., 2011) ou agirait directement en favorisant la
dégradation par le protéasome des IRS (Pazienza et al., 2007); (Pazienza et al., 2010). Ceci
aurait pour conséquence le développement d’une insulino-résistance hépatique qui pourrait à
son tour participer à l’établissement et/ou à l’évolution de la stéatose.
Aux vues de ces données et compte tenu du fait que les séquences des protéines de capsides
sont très conservées d’un génotype à l’autre, il est difficile de comprendre comment la
protéine de capside de génotype 3 puisse agir différemment des protéines de capsides des
151
autres génotypes. Néanmoins, il a été suggéré qu’un ou plusieurs changements dans la
séquence d’acides aminés pouvaient avoir un impact sur la conformation, la stabilité et/ou les
interactions avec les protéines cellulaires de l’hôte (Hourioux et al., 2007); (Piodi et al.,
2008). La protéine de capside du HCV est structurée en trois domaines (I, II et III). Si le
domaine I ne semble pas interférer avec le métabolisme lipidique, les domaines II et III
seraient directement impliqués dans l’accumulation de TG. Le domaine II (aa 119 à 174) de la
protéine de capside s’avère particulièrement intéressant du fait de son rôle dans l’association
aux GL (Hope & McLauchlan, 2000); (Hope, 2001); (Boulant et al., 2006); (Shavinskaya et
al., 2007); (Boulant et al., 2007). Il a d’ailleurs été montré au sein de notre équipe, qu’une
protéine de capside de génotype 1 portant un résidu spécifique de génotype 3 en position 164
(Y164F) était capable d’augmenter l’accumulation de GL in vitro (Hourioux et al., 2007).
Parallèlement, une étude montrait que ce mutant induisait une plus forte activation de
l’enzyme FAS comparée à la protéine de capside de génotype 1 (Jackel-Cram et al., 2007). Le
domaine III (aa 175 à 191) de la protéine de capside pourrait aussi être incriminé dans cette
accumulation de TG. Ainsi une équipe a mis en évidence que deux polymorphismes en
position 182 et 186 (FV et LI à la place de FI) étaient liés à la présence d’une stéatose sévère
chez des patients infectés par un génotype 3, et que l’expression in vitro de ces protéines de
capsides clonées à partir du virus qui infectait le patient conduisait à une augmentation du
niveau de lipides (Jhaveri et al., 2008); (Jhaveri et al., 2009). Dans la cohorte de patients que
nous avons établie, la présence de ces résidus dans la séquence de la protéine de capside des
virus circulants chez les patients n’est pas associée à une stéatose sévère. Par ailleurs aucun
résidu spécifique ni motifs dans la séquence de la protéine de capside ne se sont révélés être
corrélés à la présence d’une stéatose forte in vivo. Ces observations ont été confirmées par la
construction d’un arbre phylogénique réalisé sur l’ensemble des clones obtenus pour chaque
patient. Sur cet arbre il était possible de voir que les branches se formaient selon le génotype
des patients et non selon la présence d’une stéatose sévère. Nos résultats viennent ainsi
conforter l’étude publiée par Piodi et al, (Piodi et al., 2008) où aucune différence n’avait été
observée dans les séquences des protéines de capsides des virus qui infectaient les patients
présentant une stéatose sévère ou peu/pas de stéatose. Néanmoins les protéines de capside
clonées à partir des virus circulants chez ces patients, quelque soit le génotype, avaient la
capacité d’induire une accumulation de GL lorsqu’elles étaient exprimées in vitro, même si in
vivo chez le patient aucune stéatose n’était observée (Piodi et al., 2008). De plus, il avait été
montré que les GL avaient une taille plus importante dans des cellules exprimant la protéine
de capside de patients infectés par un génotype 3, par rapport à un génotype 1 (Piodi et al.,
152
2008). Nous avons voulu vérifier, avec le matériel clinique dont nous disposions, la
pertinence de ces observations faites en modèle in vitro. Ainsi nous avons évalué le diamètre
individuel de GL sur des coupes semi fines des biopsies de foies des patients en parallèle des
coupes ultrafines réalisées pour la quantification en MET. Les coupes semi-fines (0,5µm) ont
été réalisées comme suit : après inclusion dans de la résine Epon les fractions de biopsies sont
coupées au microtome (Reichert) puis colorées au bleu de toluidine pour une observation avec
un microscope optique relié à une caméra (Nikon). Ainsi le diamètre individuel (µm) et la
surface (µm2) de 100 GL consécutives ont été déterminés pour chaque patient avec le
programme Nikon NIS-Element (Nikon). Nous avons décidé d’évaluer cette surface
individuelle sur les coupes semi-fines plutôt que sur les coupes ultrafines pour se soustraire du
problème que nous rencontrions pour évaluer le diamètre des GL coupées par un des bords du
carreau de grille de microscopie. Nous n’avons cependant pas choisi de quantifier la stéatose
avec cette technique sur coupes semi-fines qui ne nous permettait pas une quantification
précise, les GL de taille inférieure à 1,5µm n’étant pas clairement visualisables. Bien que la
surface médiane individuelle des GL chez les patients infectés par un génotype 3 (19,4[8.0 ;
47.7] µm2) était légèrement plus élevée que celle de personnes infectées par un autre génotype
(16,1[6.2 ; 50.7] µm2), ce résultat n'était pas significativement différent entre les deux groupes
(p = 0,92).
La protéine de capside du HCV même si elle reste la mieux caractérisée, n’est pas la seule à
interférer avec le métabolisme lipidique. Ainsi, la protéine NS5A colocalise in vitro avec la
protéine de capside à la surface des GL (Miyanari et al., 2007); (Appel et al., 2008) et
interagit notamment avec l’ApoA1, l’ApoB et l’ApoE (Shi et al., 2002); (Domitrovich et al.,
2005); (Benga et al., 2010) ainsi qu’avec le facteur PPARγ (Kim et al., 2009). En parallèle de
l’analyse des séquences de la protéine de capside des variants circulant chez les patients, nous
avons trouvé pertinent de réaliser cette même étude pour la protéine NS5A. Contrairement à
la protéine de capside, la protéine NS5A présente une grande variabilité de séquences, rendant
l’alignement de séquences difficile. Néanmoins, de la même façon, nous avons établi un arbre
phylogénique à partir des séquences des clones de l’ensemble des patients. Là encore nous
n’avons pas mis en évidence de corrélation entre la formation d’une branche particulière et la
sévérité de la stéatose observée in vivo.
153
Conclusions & Perspectives
154
Lors de l’infection chronique par le HCV, ce virus au tropisme hépatique va détourner
à son profit le métabolisme de la cellule hôte et notamment le métabolisme lipidique très actif
au niveau du foie. Ainsi l’infection chronique in vivo est caractérisée dans plus de la moitié
des cas par une accumulation excessive de lipides sous forme de GL dans les hépatocytes
induisant la stéatose hépatique. Chez l’individu chroniquement infecté, deux types de stéatose
peuvent ainsi coexister : la stéatose métabolique et la stéatose virale. La part réellement
imputable au virus dans l’établissement de la stéatose reste donc très difficile à évaluer. En
outre, le rôle précis, direct ou indirect des différentes protéines virales dans l’établissement
des plates formes de réplication, d’assemblage et de sécrétion des particules virales reste
encore à déterminer. L’accumulation de GL qui est observée in vivo et dans de nombreux
modèles cellulaires in vitro semble être au cœur des mécanismes d’assemblage de la particule
virale. Ainsi, à travers deux approches, une étude fondamentale in vitro et une étude clinique
in vivo, nous avons voulu comprendre comment le HCV pouvait induire une telle
accumulation de GL et étudier l’impact de la variabilité du virus sur l’intensité de ce
phénomène.
Pour répondre à ces questions nous avons donc développé dans la première partie de
mon travail de thèse un projet fondamental in vitro qui a pu être mis en place rapidement
grâce à un outil d’expression de la protéine de capside du HCV en modèle cellulaire (modèle
SFV) avec lequel il était possible de mimer la stéatose viro-induite et sa majoration en
fonction du génotype. Il s’agissait alors d’utiliser ce modèle pour comprendre le rôle de la
protéine de capside dans l’induction de la stéatose viro-induite, en quantifiant les GL dans des
cellules exprimant une protéine de capside mature ou immature, et en analysant finement les
phénomènes de regroupement des GL induits par la protéine de capside mature.
La conclusion principale qu’apporte cette étude est que dans les cellules exprimant la
protéine de capside mature, le regroupement des GL ne s’explique pas par une simple
redistribution de GL préexistantes mais plutôt par une synthèse de novo de GL dans les zones
à la périphérie du noyau. Ces travaux permettent donc d’apporter des éléments nouveaux et
originaux, d’une part sur la dynamique des GL au sein d’une cellule, et d’autre part sur la
façon dont le HCV détourne les GL à son profit et met en place des phénomènes impliqués
dans la stéatose viro-induite.
Concernant les informations apportées sur la dynamique des GL au sein d’une cellule,
il serait maintenant pertinent de confirmer notre modèle de régression/régénération des GL en
réalisant une cinétique en temps réel de la formation des GL induites par la protéine de
155
capside. Tout récemment, une équipe canadienne a mis au point une approche microscopique
combinant la microscopie confocale bi-photon, la microscopie Raman et le contraste
interférentiel différentiel (Lyn et al., 2010) pour étudier ce phénomène en dynamique. Même
si cette approche a permis de visualiser une redistribution des GL dans la cellule exprimant la
protéine de capside, il est difficile d’en conclure si ce regroupement se fait par un trafic
individuel des GL ou par notre hypothèse de regression/régenération, voire une combinaison
des deux phénomènes. Cependant, les auteurs de ce travail ont utilisé un vecteur d’expression
différent du nôtre, et il pourrait être pertinent d’étudier nos cellules transfectées avec un
vecteur SFV par leur technique. Dans des travaux précedemment réalisés au sein de notre
équipe sur différents modèles viraux, il a été démontré que ce vecteur d’expression SFV n’est
pas associé à une surexpression particulière par rapport à un vecteur d’expression plus
classique, mais que par contre il induit une expression beaucoup plus rapide des protéines
d’intérêt. Cette particularité permet de visualiser des phénomènes qui n’ont jamais pu être
visualiés avec d’autres vecteurs d’expression (Patient et al., 2007). Pour cette raison, nous
avons également tenté d’utiliser les propriétés bien particulières de notre modèle pour
visualiser la biogenèse des GL, qui représente une étape encore largement méconnue.
L’hypothèse couramment admise est celle d’une accumulation de lipides entre les feuillets de
la membrane du RE, même si aucune équipe n’a réussi à visualiser un tel phénomène. Ainsi,
afin de comprendre cette étape précoce de la formation des GL, nous avons réalisé une
cinétique heure par heure de la formation des regroupements de GL induits par la protéine de
capside, lors de son expression in vitro en modèle SFV. Cependant, il ne nous a pas été
permis de visualiser l’accumulation de lipides entre les feuillets de la membrane du RE. Ceci
peut s’expliquer par le manque de résolution de la technique, par la rapidité de ces
évènements ou tout simplement par la faible probabilité de réaliser une coupe cellulaire
ultrafine sur le site même de cette accumulation.
D’autre part notre travail a permis de conforter l’idée du rôle direct de la protéine de
capside (mature ou immature) dans l’accumulation in vitro des GL ainsi que dans la
modulation du métabolisme lipidique contribuant à la synthèse de novo de GL. Nous avons
aussi pu constater l’effet supplémentaire que semble avoir la protéine de capside mature du
fait de sa capacité de liaison aux GL. Ces travaux confirment donc qu’au moins une des
protéines du HCV a bien un effet direct dans l’induction de la stéatose hépatique.
La deuxième partie de mon projet de thèse s’inscrivait donc dans la continuité de ce
travail in vitro et visait à vérifier l’impact de la variabilité du HCV et notamment de ses
156
protéines virales, sur la stéatose viro-induite in vivo. Nous disposions pour répondre à cette
question d’un groupe de patients chroniquement infectés par différents génotypes du HCV,
pour lesquels toute cause de stéatose métabolique avaient été exclue. Notre étude a montré
que la variabilité qui est plus ou moins observable au sein des protéines de capside et NS5A
des virus infectant ces patients semble avoir un effet mineur sur la sévérité de la stéatose
hépatique. Les effets imputables à la protéine de capside de génotype 3 qui ont pu être
observés in vitro (Abid et al., 2005); (Hourioux et al., 2007); (Jackel-Cram et al., 2007);
(Jhaveri et al., 2008); (Jhaveri et al., 2009); (Clément et al., 2011) semblent donc avoir peu
d’impact in vivo. Ainsi, lors de l’infection in vivo, les facteurs de l’hôte pourraient prédominer
dans la détermination du degré de stéatose. Plusieurs données viennent par ailleurs étayer une
telle hypothèse. Une étude a montré que la stéatose observée in vivo dans les hépatocytes ne
semble pas liée à la présence des protéines du HCV dans ces mêmes hépatocytes, comme on
aurait pu s’y attendre si la stéatose résultait d’un effet direct des protéines du HCV (Grassi et
al., 2005). Plus récemment, il a été mis en évidence que l’expression du facteur SREBP1
n’était pas augmentée dans le foie de patients infectés par différents génotypes du HCV
(McPherson et al., 2008); (Ryan et al., 2011), alors qu’une telle augmentation avait été
constatée lors d’expériences in vitro avec la protéine de capside de génotype 3 (Jackel-Cram
et al., 2007). De ce fait, de plus en plus d’études s’intéressent aux facteurs génétiques liés à
l’hôte qui pourraient contribuer au développement d’une stéatose plus sévère chez les porteurs
chroniques du HCV. Les études menées à ce jour tendent à montrer que dans la plupart des
cas, les gènes de l’hôte influent sur le développement de la stéatose d’une façon qui dépend
du génotype du virus. Ainsi des polymorphismes du gène codant la PPARγ, le gène IL-28B
(Cai et al., 2011), la PNLPLA3 (Sookoian et al., 2009); (Cai et al., 2011), la MTP (Mirandola
et al., 2009); (Zampino et al., 2008); (Cai et al., 2011) ont été mis en évidence et seraient liés
à un risque plus important d’apparition d’une stéatose hépatique lors de l’infection. Au
contraire un polymorphisme dans le gène codant l’ApoE serait associé à une atteinte
hépatique légère et protégerait contre des dommages plus sévères (Wozniak et al., 2002) (cf
paragraphe III) B. 3. c) (2)). Le groupe de patients dont nous disposons est certes restreint
mais constitue un groupe de choix pour déterminer l’impact direct de ces polymorphismes
puisque la majeure partie des facteurs liés au développement d’une stéatose métabolique ont
été écartés. Dans la suite de ce travail, il serait donc pertinent d’étudier le polymorphisme de
ces différents gènes et de chercher une éventuelle association avec la présence ou l’absence de
stéatose chez ces patients.
157
Par ailleurs, le matériel clinique original que nous avons récolté nous donnera
l’opportunité de mieux comprendre le lien entre la présence de la protéine de capside à la
surface des GL et la production de virus in vivo. En effet, la relation entre la sévérité de la
stéatose et la charge virale reste controversée (Rubbia-Brandt et al., 2000); (Adinolfi et al.,
2001); (Grassi et al., 2005). Ainsi l’étude de Grassi et al, montrait que dans une cohorte de
patients infectés par le HCV, la présence de stéatose dans les hépatocytes n’était pas liée à la
présence des protéines virales dans ces mêmes cellules (Grassi et al., 2005). De plus, même si
il est établi que la protéine de capside s’accumule à la surface des GL in vitro et in vivo, les
données in vivo restent rares (Barba et al., 1997); (Moriya et al., 1997a). Néanmoins, dans le
foie de souris transgéniques exprimant la protéine de capside en quantité équivalente à celle
retrouvée dans le sérum de patients chroniquement infectés, la sévérité de la stéatose semble
liée au niveau d’expression de la protéine de capside (Moriya et al., 1998); (Moriya et al.,
2001). Les données obtenus in vitro montrent aussi maintenant clairement que les GL
constituent une sorte de plate-forme pour l’assemblage viral. Pour toutes ces raisons, nous
envisageons donc de réaliser une étude originale visant à établir un parallèle entre la charge
virale de quelques patients de notre étude présentant une stéatose sévère ou modérée et la
quantité de protéines de capside du HCV à la surface des GL observées dans les biopsies de
foie en ME, à l’aide d’un immuno-marquage (immuno-gold) avec des anticorps spécifiques
dirigés contre la protéine de capside. Notre laboratoire a mis au point cette technique
d’immuno-gold in vitro dans des cellules infectées par la souche JFH1. Nous nous proposons
d’appliquer cette technique aux biopsies de patients de notre étude. A notre connaissance, ce
type d’investigation n’a jamais été réalisé. Nous pensons effectuer des semi-quantifications de
la protéine de capside à la surface des GL (par comptage des billes d’or) et voir si le nombre
de billes d’or (représentatif de la quantité de capside en surface des GL) peut être corrélé à la
charge virale.
Les résultats fondamentaux et biocliniques que nous présentons au travers de cette
thèse illustrent la difficulté d’évaluer la part liée au virus et celle liée à des facteurs de l’hôte
dans l’induction d’une stéatose hépatique chez les patients chroniquement infectés par le
HCV. Les données in vitro suggèrent que le virus joue un rôle direct dans l’induction d’une
stéatose, notamment par les propriétés de sa protéine de capside, et que la variabilité du virus
peut avoir un impact sur l’intensité de cette stéatose. Notre étude bioclinique suggère que la
variabilité du virus semble avoir un rôle beaucoup plus modéré in vivo. Ainsi, chez les
patients chroniquement infectés par le HCV, les facteurs de l’hôte joueraient un rôle majeur
158
pour moduler le dégré de la stéatose associée au virus et de prochaines études seront
nécessaires pour établir la nature de ces facteurs.
159
Bibliographie
160
A
Abid, K., Pazienza, V., de Gottardi, A., Rubbia-Brandt, L., Conne, B., Pugnale, P.,
Rossi, C., Mangia, A. & Negro, F. (2005). An in vitro model of hepatitis C virus
genotype 3a-associated triglycerides accumulation. Journal of hepatology 42, 744–
751.
Adinolfi, L. E., Gambardella, M., Andreana, A., Tri podi, M., Utili, R. & Ruggiero, G.
(2001). Steatosis accelerates the progression of liver damage of chronic hepatitis C
patients and correlates with specific HCV genotype and visceral obesity. Hepatology
33, 1358–1364.
Agnello, V., Abel, G., Elfahal, M., Knight, G. B. & Zhang, Q. X. (1999). Hepatitis C virus
and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor. Proc
Natl Acad Sci U S A 96, 12766-12771.
Ait-Goughoulte, M., Hourioux, C., Patient, R., Trassard, S., Brand, D. & Roingeard, P.
(2006). Core protein cleavage by signal peptide peptidase is required for hepatitis C
virus-like particle assembly. Journal of general virology 87, 855.
Ai, L.-S., Lee, Y.-W. & Chen, S. S.-L. (2009). Characterization of hepatitis C virus core
protein multimerization and membrane envelopment: revelation of a cascade of core-
membrane interactions. J Virol 83, 9923-9939.
Allison, M. E., Wreghitt, T., Palmer, C. R. & Alexander, G. J. (1994). Evidence for a link
between hepatitis C virus infection and diabetes mellitus in a cirrhotic population. J
Hepatol 21, 1135-1139.
Alter, M. J. (2007). Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol 13,
2436-2441.
Amako, Y., Sarkeshik, A., Hotta, H., Yates, J., 3rd & Siddiqui, A. (2009). Role of
oxysterol binding protein in hepatitis C virus infection. J Virol 83, 9237-9246.
Andersson, L., Bostr\öm, P., Ericson, J., Rutberg, M., Magnusson, B., Marchesan, D.,
Ruiz, M., Asp, L., Huang, P., & other authors. (2006). PLD1 and ERK2 regulate
cytosolic lipid droplet formation. Journal of cell science 119, 2246.
Andréo, U., Maillard, P., Kalinina, O., Walic, M., Meurs, E., Martinot, M., Marcellin, P.
& Budkowska, A. (2007). Lipoprotein lipase mediates hepatitis C virus (HCV) cell
entry and inhibits HCV infection. Cell Microbiol 9, 2445-2456.
161
André, P., Komurian-Pradel, F., Deforges, S., Perret, M., Berland, J. L., Sodoyer, M.,
Pol, S., Bréchot, C., Paranhos-Baccalà, G. & Lotteau, V. (2002). Characterization
of low- and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles. J Virol 76,
6919-6928.
Appel, N. (2006). From Structure to Function: New Insights into Hepatitis C Virus RNA
Replication. Journal of Biological Chemistry 281, 9833-9836.
Appel, N., Pietschmann, T. & Bartenschlager, R. (2005). Mutational analysis of hepatitis C
virus nonstructural protein 5A: potential role of differential phosphorylation in RNA
replication and identification of a genetically flexible domain. Journal of virology 79,
3187.
Appel, N., Zayas, M., Miller, S., Krijnse-Locker, J., Schaller, T., Friebe, P., Kallis, S.,
Engel, U. & Bartenschlager, R. (2008). Essential Role of Domain III of
Nonstructural Protein 5A for Hepatitis C Virus Infectious Particle Assembly. PLoS
Pathogens 4, e1000035(D. Moradpour, Ed.).
Ariumi, Y., Kuroki, M., Maki, M., Ikeda, M., Dansak o, H., Wakita, T. & Kato, N.
(2011). The ESCRT system is required for hepatitis C virus production. PLoS ONE 6,
e14517.
Asselah, T. (2006). STEATOSIS IN CHRONIC HEPATITIS C: WHY DOES IT REALLY
MATTER? Gut 55, 123-130.
Asselah, T., Boyer, N., Guimont, M.-C., Cazals-Hatem, D., Tubach, F., Nahon, K.,
Daïkha, H., Vidaud, D., Martinot, M., & other authors. (2003). Liver fibrosis is not
associated with steatosis but with necroinflammation in French patients with chronic
hepatitis C. Gut 52, 1638-1643.
Aytug, S., Reich, D., Sapiro, L. E., Bernstein, D. & Begum, N. (2003). Impaired IRS-
1/PI3-kinase signaling in patients with HCV: a mechanism for increased prevalence of
type 2 diabetes. Hepatology 38, 1384-1392.
B
Barba, G., Harper, F., Harada, T., Kohara, M., Goulinet, S., Matsuura, Y., Eder, G.,
Schaff, Z., Chapman, M. J., & other authors. (1997). Hepatitis C virus core protein
shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94,
1200.
162
Baril, M. & Brakier-Gingras, L. (2005). Translation of the F protein of hepatitis C virus is
initiated at a non-AUG codon in a +1 reading frame relative to the polyprotein.
Nucleic Acids Res 33, 1474-1486.
Bartenschlager, R. & Lohmann, V. (2001). Novel cell culture systems for the hepatitis C
virus. Antiviral Res 52, 1-17.
Bartenschlager, R., Lohmann, V., Wilkinson, T. & Koch, J. O. (1995). Complex
formation between the NS3 serine-type proteinase of the hepatitis C virus and NS4A
and its importance for polyprotein maturation. J Virol 69, 7519-7528.
Bartenschlager, R. (2005). The hepatitis C virus replicon system: from basic research to
clinical application. J Hepatol 43, 210-216.
Bartenschlager, R. & Pietschmann, T. (2005). Efficient hepatitis C virus cell culture
system: what a difference the host cell makes. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9739-
9740.
Barth, H., Schafer, C., Adah, M. I., Zhang, F., Linhardt, R. J., Toyoda, H., Kinoshita-
Toyoda, A., Toida, T., Van Kuppevelt, T. H., & other authors. (2003). Cellular
binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan
sulfate. J Biol Chem 278, 41003-41012.
Barth, H., Schnober, E. K., Zhang, F., Linhardt, R. J., Depla, E., Boson, B., Cosset, F.-
L., Patel, A. H., Blum, H. E. & Baumert, T. F. (2006). Viral and cellular
determinants of the hepatitis C virus envelope-heparan sulfate interaction. J Virol 80,
10579-10590.
Bartosch, B., Vitelli, A., Granier, C., Goujon, C., Dubuisson, J., Pascale, S., Scarselli, E.,
Cortese, R., Nicosia, A. & Cosset, F.-L. (2003). Cell entry of hepatitis C virus
requires a set of co-receptors that include the CD81 tetraspanin and the SR-B1
scavenger receptor. J Biol Chem 278, 41624-41630.
Bartz, R., Zehmer, J. K., Zhu, M., Chen, Y., Serrero, G., Zhao, Y. & Liu, P. (2007).
Dynamic activity of lipid droplets: protein phosphorylation and GTP-mediated protein
translocation. J Proteome Res 6, 3256-3265.
Basu, A., Kanda, T., Beyene, A., Saito, K., Meyer, K. & Ray, R. (2007). Sulfated
homologues of heparin inhibit hepatitis C virus entry into mammalian cells. J Virol
81, 3933-3941.
Baumert, T. F., Ito, S., Wong, D. T. & Liang, T. J. (1998). Hepatitis C virus structural
proteins assemble into viruslike particles in insect cells. J Virol 72, 3827-3836.
163
Bécard, D., Hainault, I., Azzout-Marniche, D., Bertry-Coussot, L., Ferré, P. & Foufelle,
F. (2001). Adenovirus-mediated overexpression of sterol regulatory element binding
protein-1c mimics insulin effects on hepatic gene expression and glucose homeostasis
in diabetic mice. Diabetes 50, 2425-2430.
Bedossa, P. & Poynard, T. (1996). An algorithm for the grading of activity in chronic
hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group. Hepatology 24, 289-293.
Beller, M., Sztalryd, C., Southall, N., Bell, M., J\äckle, H., Auld, D. S. & Oliver, B.
(2008). COPI complex is a regulator of lipid homeostasis. PLoS biology 6, e292.
Benedicto, I., Molina-Jiménez, F., Barreiro, O., Maldonado-Rodríguez, A., Prieto, J.,
Moreno-Otero, R., Aldabe, R., López-Cabrera, M. & Majano, P. L. (2008).
Hepatitis C virus envelope components alter localization of hepatocyte tight junction-
associated proteins and promote occludin retention in the endoplasmic reticulum.
Hepatology 48, 1044-1053.
Benga, W. J. A., Krieger, S. E., Dimitrova, M., Zeisel, M. B., Parnot, M., Lupberger, J.,
Hildt, E., Luo, G., McLauchlan, J., & other authors. (2010). Apolipoprotein E
interacts with hepatitis C virus nonstructural protein 5A and determines assembly of
infectious particles. Hepatology 51, 43-53.
Bernsmeier, C., Duong, F. H. T., Christen, V., Pugnale, P., Negro, F., Terracciano, L. &
Heim, M. H. (2008). Virus-induced over-expression of protein phosphatase 2A
inhibits insulin signalling in chronic hepatitis C. J Hepatol 49, 429-440.
Bickel, P. E., Tansey, J. T. & Welte, M. A. (2009). PAT proteins, an ancient family of lipid
droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1791, 419–440.
Bissig, K.-D., Wieland, S. F., Tran, P., Isogawa, M., Le, T. T., Chisari, F. V. & Verma, I.
M. (2010). Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus
infection and treatment. J Clin Invest 120, 924-930.
Blanchard, E., Brand, D., Trassard, S., Goudeau, A. & Roingeard, P. (2002). Hepatitis C
virus-like particle morphogenesis. Journal of virology 76, 4073.
Blanchard, E., Hourioux, C., Brand, D., Ait-Goughoulte, M., Moreau, A., Trassard, S.,
Sizaret, P. Y., Dubois, F. & Roingeard, P. (2003). Hepatitis C virus-like particle
budding: role of the core protein and importance of its Asp111. Journal of virology 77,
10131.
164
Blanchard, E., Belouzard, S., Goueslain, L., Wakita, T., Dubuisson, J., Wychowski, C. &
Rouillé, Y. (2006). Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated endocytosis.
J Virol 80, 6964-6972.
Blanchette-Mackie, E. J., Dwyer, N. K., Barber, T., Coxey, R. A., Takeda, T.,
Rondinone, C. M., Theodorakis, J. L., Greenberg, A. S. & Londos, C. (1995).
Perilipin is located on the surface layer of intracellular lipid droplets in adipocytes.
Journal of lipid research 36, 1211.
Blasiole, D. A., Davis, R. A. & Attie, A. D. (2007). The physiological and molecular
regulation of lipoprotein assembly and secretion. Mol BioSyst 3, 608.
Blight, K. J., Kolykhalov, A. A. & Rice, C. M. (2000). Efficient initiation of HCV RNA
replication in cell culture. Science 290, 1972-1974.
Blight, K. J. (2007). Allelic variation in the hepatitis C virus NS4B protein dramatically
influences RNA replication. J Virol 81, 5724-5736.
Blight, K. J., McKeating, J. A. & Rice, C. M. (2002). Highly permissive cell lines for
subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J Virol 76, 13001-13014.
Blouin, C. M., Le Lay, S., Eberl, A., Köfeler, H. C., Guerrera, I. C., Klein, C., Le
Liepvre, X., Lasnier, F., Bourron, O., & other authors. (2010). Lipid droplet
analysis in caveolin-deficient adipocytes: alterations in surface phospholipid
composition and maturation defects. J Lipid Res 51, 945-956.
Bochud, P.-Y., Cai, T., Overbeck, K., Bochud, M., Dufour, J.-F., Müllhaupt, B.,
Borovicka, J., Heim, M., Moradpour, D., & other authors. (2009). Genotype 3 is
associated with accelerated fibrosis progression in chronic hepatitis C. J Hepatol 51,
655-666.
Bostrom, P. (2005). Cytosolic Lipid Droplets Increase in Size by Microtubule-Dependent
Complex Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 25, 1945-
1951.
Boström, P., Andersson, L., Rutberg, M., Perman, J., Lidberg, U., Johansson, B. R.,
Fernandez-Rodriguez, J., Ericson, J., Nilsson, T., & other authors. (2007).
SNARE proteins mediate fusion between cytosolic lipid droplets and are implicated in
insulin sensitivity. Nat Cell Biol 9, 1286-1293.
Boulant, S., Vanbelle, C., Ebel, C., Penin, F. & Lavergne, J.-P. (2005). Hepatitis C virus
core protein is a dimeric alpha-helical protein exhibiting membrane protein features. J
Virol 79, 11353-11365.
165
Boulant, S., Montserret, R., Hope, R. G., Ratinier, M., Targett-Adams, P., Lavergne, J.-
P., Penin, F. & McLauchlan, J. (2006). Structural determinants that target the
hepatitis C virus core protein to lipid droplets. J Biol Chem 281, 22236-22247.
Boulant, S., Targett-Adams, P. & McLauchlan, J. (2007). Disrupting the association of
hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of
infectious virus. J Gen Virol 88, 2204-2213.
Boulant, S., Douglas, M. W., Moody, L., Budkowska, A., Targett-Adams, P. &
McLauchlan, J. (2008). Hepatitis C Virus Core Protein Induces Lipid Droplet
Redistribution in a Microtubule- and Dynein-Dependent Manner. Traffic 9, 1268-
1282.
Bradley, D., McCaustland, K., Krawczynski, K., Spelbring, J., Humphrey, C. & Cook,
E. H. (1991). Hepatitis C virus: buoyant density of the factor VIII-derived isolate in
sucrose. J Med Virol 34, 206-208.
Brady, L. J., Brady, P. S., Romsos, D. R. & Hoppel, C. L. (1985). Elevated hepatic
mitochondrial and peroxisomal oxidative capacities in fed and starved adult obese
(ob/ob) mice. Biochem J 231, 439-444.
Brady, P. S., Marine, K. A., Brady, L. J. & Ramsay, R. R. (1989). Co-ordinate induction
of hepatic mitochondrial and peroxisomal carnitine acyltransferase synthesis by diet
and drugs. Biochem J 260, 93-100.
Brasaemle, D. L. (2004). Proteomic Analysis of Proteins Associated with Lipid Droplets of
Basal and Lipolytically Stimulated 3T3-L1 Adipocytes. Journal of Biological
Chemistry 279, 46835-46842.
Brass, V., Bieck, E., Montserret, R., Wölk, B., Hellings, J. A., Blum, H. E., Penin, F. &
Moradpour, D. (2002). An amino-terminal amphipathic alpha-helix mediates
membrane association of the hepatitis C virus nonstructural protein 5A. J Biol Chem
277, 8130-8139.
Brazzoli, M., Bianchi, A., Filippini, S., Weiner, A., Zhu, Q., Pizza, M. & Crotta, S.
(2008). CD81 is a central regulator of cellular events required for hepatitis C virus
infection of human hepatocytes. J Virol 82, 8316-8329.
Bressanelli, S., Tomei, L., Roussel, A., Incitti, I., Vitale, R. L., Mathieu, M., De
Francesco, R. & Rey, F. A. (1999). Crystal structure of the RNA-dependent RNA
polymerase of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13034-13039.
166
Bressanelli, S., Tomei, L., Rey, F. A. & De Francesco, R. (2002). Structural analysis of the
hepatitis C virus RNA polymerase in complex with ribonucleotides. Journal of
virology 76, 3482.
Briggs, J. A. G., Wilk, T. & Fuller, S. D. (2003). Do lipid rafts mediate virus assembly and
pseudotyping? J Gen Virol 84, 757-768.
Brown, D. A. (2001). Lipid droplets: proteins floating on a pool of fat. Curr Biol 11, R446-
449.
Brunt, E. M., Janney, C. G., Di Bisceglie, A. M., Neuschwander-Tetri, B. A. & Bacon, B.
R. (1999). Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the
histological lesions. Am J Gastroenterol 94, 2467-2474.
Buhman, K. K., Accad, M., Novak, S., Choi, R. S., Wong, J. S., Hamilton, R. L., Turley,
S. & Farese, R. V., Jr. (2000). Resistance to diet-induced hypercholesterolemia and
gallstone formation in ACAT2-deficient mice. Nat Med 6, 1341-1347.
Bukh, J., Apgar, C. L., Govindarajan, S. & Purcell, R. H. (2001). Host range studies of
GB virus-B hepatitis agent, the closest relative of hepatitis C virus, in New World
monkeys and chimpanzees. J Med Virol 65, 694-697.
Bukh, J., Purcell, R. H. & Miller, R. H. (1993). At least 12 genotypes of hepatitis C virus
predicted by sequence analysis of the putative E1 gene of isolates collected
worldwide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 90, 8234.
Bukh, J. (2004). A critical role for the chimpanzee model in the study of hepatitis C.
Hepatology 39, 1469-1475.
Bureau, C. (2001). Nonstructural 3 Protein of Hepatitis C Virus Triggers an Oxidative Burst
in Human Monocytes via Activation of NADPH Oxidase. Journal of Biological
Chemistry 276, 23077-23083.
Burlone, M. E. & Budkowska, A. (2009). Hepatitis C virus cell entry: role of lipoproteins
and cellular receptors. J Gen Virol 90, 1055-1070.
Burton, J. R., Jr & Everson, G. T. (2009). HCV NS5B polymerase inhibitors. Clin Liver
Dis 13, 453-465.
von dem Bussche, A., Machida, R., Li, K., Loevinsohn, G., Khander, A., Wang, J.,
Wakita, T., Wands, J. R. & Li, J. (2010). Hepatitis C virus NS2 protein triggers
endoplasmic reticulum stress and suppresses its own viral replication. J Hepatol 53,
797-804.
167
C
Cai, T., Dufour, J.-F., Muellhaupt, B., Gerlach, T., Heim, M., Moradpour, D., Cerny, A.,
Malinverni, R., Kaddai, V., & other authors . (2011). Viral genotype-specific role of
PNPLA3, PPARG, MTTP, and IL28B in hepatitis C virus-associated steatosis. J
Hepatol.
Cambi, A., de Lange, F., van Maarseveen, N. M., Nijhuis, M., Joosten, B., van Dijk, E.
M. H. P., de Bakker, B. I., Fransen, J. A. M., Bovee-Geurts, P. H. M., & other
authors. (2004). Microdomains of the C-type lectin DC-SIGN are portals for virus
entry into dendritic cells. J Cell Biol 164, 145-155.
Cambi, A., Koopman, M. & Figdor, C. G. (2005). How C-type lectins detect pathogens.
Cell Microbiol 7, 481-488.
Carrère-Kremer, S., Montpellier-Pala, C., Cocquerel, L., Wychowski, C., Penin, F. &
Dubuisson, J. (2002). Subcellular localization and topology of the p7 polypeptide of
hepatitis C virus. J Virol 76, 3720-3730.
Castéra, L., Hézode, C., Roudot-Thoraval, F., Bastie, A., Zafrani, E.-S., Pawlotsky, J.-M.
& Dhumeaux, D. (2003). Worsening of steatosis is an independent factor of fibrosis
progression in untreated patients with chronic hepatitis C and paired liver biopsies.
Gut 52, 288-292.
Chang, K.-S., Jiang, J., Cai, Z. & Luo, G. (2007). Human apolipoprotein e is required for
infectivity and production of hepatitis C virus in cell culture. J Virol 81, 13783-13793.
Chang, T. Y., Chang, C. C., Lu, X. & Lin, S. (2001). Catalysis of ACAT may be completed
within the plane of the membrane: a working hypothesis. J Lipid Res 42, 1933-1938.
Charlton, M., Sreekumar, R., Rasmussen, D., Lindor, K. & Nair, K. S. (2002).
Apolipoprotein synthesis in nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 35, 898-904.
Cha, J.-Y. & Repa, J. J. (2007). The liver X receptor (LXR) and hepatic lipogenesis. The
carbohydrate-response element-binding protein is a target gene of LXR. J Biol Chem
282, 743-751.
Chayama, K. & Hayes, C. N. (2011). Hepatitis C virus: How genetic variability affects
pathobiology of disease. J Gastroenterol Hepatol 26 Suppl 1, 83-95.
Cheng, J., Fujita, A., Ohsaki, Y., Suzuki, M., Shinohara, Y. & Fujimoto, T. (2009).
Quantitative electron microscopy shows uniform incorporation of triglycerides into
existing lipid droplets. Histochem Cell Biol 132, 281-291.
168
Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L. & Brown, M. S. (2004). Central role for liver
X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of
fatty acid synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 11245-11250.
Cheung, W., Gill, M., Esposito, A., Kaminski, C. F., Courousse, N., Chwetzoff, S.,
Trugnan, G., Keshavan, N., Lever, A. & Desselberger, U. (2010). Rotaviruses
Associate with Cellular Lipid Droplet Components To Replicate in Viroplasms, and
Compounds Disrupting or Blocking Lipid Droplets Inhibit Viroplasm Formation and
Viral Replication. Journal of Virology 84, 6782-6798.
Choi, S.-H., Park, K.-J., Ahn, B.-Y., Jung, G., Lai, M. M. C. & Hwang, S. B. (2006).
Hepatitis C virus nonstructural 5B protein regulates tumor necrosis factor alpha
signaling through effects on cellular IkappaB kinase. Mol Cell Biol 26, 3048-3059.
Choo, Q. L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W. & Houghton, M.
(1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral
hepatitis genome. Science 244, 359-362.
Choo, Q. L., Richman, K. H., Han, J. H., Berger, K., Lee, C., Dong, C., Gallegos, C.,
Coit, D., Medina-Selby, R. & Barr, P. J. (1991). Genetic organization and diversity
of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 2451-2455.
Christen, V., Treves, S., Duong, F. H. T. & Heim, M. H. (2007). Activation of endoplasmic
reticulum stress response by hepatitis viruses up-regulates protein phosphatase 2A.
Hepatology 46, 558-565.
Chung, Y. M., Park, K. J., Choi, S. Y., Hwang, S. B. & Lee, S. Y. (2001). Hepatitis C virus
core protein potentiates TNF-alpha-induced NF-kappaB activation through TRAF2-
IKKbeta-dependent pathway. Biochem Biophys Res Commun 284, 15-19.
Clarke, D., Griffin, S., Beales, L., Gelais, C. S., Burgess, S., Harris, M. & Rowlands, D.
(2006). Evidence for the formation of a heptameric ion channel complex by the
hepatitis C virus p7 protein in vitro. J Biol Chem 281, 37057-37068.
Clément, S., Peyrou, M., Sanchez-Pareja, A., Bourgoin, L., Ramadori, P., Suter, D.,
Vinciguerra, M., Guilloux, K., Pascarella, S., & other authors. (2011).
Downregulation of PTEN and IRS-1 by HCV 3a core protein triggers the formation of
large lipid droplets in hepatocytes. Hepatology.
Cribier, B., Schmitt, C., Bingen, A., Kirn, A. & Keller, F. (1995). In vitro infection of
peripheral blood mononuclear cells by hepatitis C virus. J Gen Virol 76 ( Pt 10),
2485-2491.
169
D
Dai, C.-Y., Chuang, W.-L., Ho, C.-K., Hsieh, M.-Y., Huang, J.-F., Lee, L.-P., Hou, N.-J.,
Lin, Z.-Y., Chen, S.-C., & other authors. (2008). Associations between hepatitis C
viremia and low serum triglyceride and cholesterol levels: a community-based study. J
Hepatol 49, 9-16.
Dalen, K. T., Dahl, T., Holter, E., Arntsen, B., Londos, C., Sztalryd, C. & Nebb, H. I.
(2007). LSDP5 is a PAT protein specifically expressed in fatty acid oxidizing tissues.
Biochim Biophys Acta 1771, 210-227.
Dentin, R., Benhamed, F., Hainault, I., Fauveau, V., Foufelle, F., Dyck, J. R. B., Girard,
J. & Postic, C. (2006). Liver-specific inhibition of ChREBP improves hepatic
steatosis and insulin resistance in ob/ob mice. Diabetes 55, 2159-2170.
Depla, M., Uzbekov, R., Hourioux, C., Blanchard, E., Gouge, A., Gillet, L. & Roingeard,
P. (2010). Ultrastructural and quantitative analysis of the lipid droplet clustering
induced by hepatitis C virus core protein. Cell Mol Life Sci 67, 3151-3161.
DeWeerdt, S. (2011). Diagnostics: A testing journey. Nature 474, S20-S21.
Dharancy, S., Malapel, M., Perlemuter, G., Roskams, T., Cheng, Y., Dubuquoy, L.,
Podevin, P., Conti, F., Canva, V., & other authors. (2005). Impaired expression of
the peroxisome proliferator-activated receptor alpha during hepatitis C virus infection.
Gastroenterology 128, 334-342.
Dionisio, N., Garcia-Mediavilla, M. V., Sanchez-Campos, S., Majano, P. L., Benedicto,
I., Rosado, J. A., Salido, G. M. & Gonzalez-Gallego, J. (2009). Hepatitis C virus
NS5A and core proteins induce oxidative stress-mediated calcium signalling
alterations in hepatocytes. J Hepatol 50, 872-882.
Dolgin, E. (2011). Research technique: The murine candidate. Nature 474, S14-S15.
Domitrovich, A. M., Felmlee, D. J. & Siddiqui, A. (2005). Hepatitis C virus nonstructural
proteins inhibit apolipoprotein B100 secretion. J Biol Chem 280, 39802-39808.
Dorner, M., Horwitz, J. A., Robbins, J. B., Barry, W. T., Feng, Q., Mu, K., Jones, C. T.,
Schoggins, J. W., Catanese, M. T., & other authors. (2011). A genetically
humanized mouse model for hepatitis C virus infection. Nature 474, 208-211.
Dreyer, C., Krey, G., Keller, H., Givel, F., Helftenbein, G. & Wahli, W. (1992). Control of
the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone
receptors. Cell 68, 879-887.
170
Drummer, H. E., Boo, I., Maerz, A. L. & Poumbourios, P. (2006). A conserved Gly436-
Trp-Leu-Ala-Gly-Leu-Phe-Tyr motif in hepatitis C virus glycoprotein E2 is a
determinant of CD81 binding and viral entry. J Virol 80, 7844-7853.
Dubuisson, J. & Rice, C. M. (1996). Hepatitis C virus glycoprotein folding: disulfide bond
formation and association with calnexin. J Virol 70, 778-786.
Duclos-Vallée, J.-C., Roche, B. & Samuel, D. (2009). [Liver transplantation in patients with
hepatitis B virus, hepatitis C virus, or human immunodeficiency virus]. Presse Med
38, 1281-1289.
Dumoulin, F. L., von dem Bussche, A., Li, J., Khamzina, L., Wands, J. R., Sauerbruch,
T. & Spengler, U. (2003). Hepatitis C virus NS2 protein inhibits gene expression
from different cellular and viral promoters in hepatic and nonhepatic cell lines.
Virology 305, 260-266.
E
Egger, D., Wolk, B., Gosert, R., Bianchi, L., Blum, H. E., Moradpour, D. & Bienz, K.
(2002). Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations
including a candidate viral replication complex. Journal of virology 76, 5974.
Einav, S., Gerber, D., Bryson, P. D., Sklan, E. H., Elazar, M., Maerkl, S. J., Glenn, J. S.
& Quake, S. R. (2008). Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological
inhibitors by microfluidic affinity analysis. Nat Biotechnol 26, 1019-1027.
Elazar, M., Liu, P., Rice, C. M. & Glenn, J. S. (2004). An N-terminal amphipathic helix in
hepatitis C virus (HCV) NS4B mediates membrane association, correct localization of
replication complex proteins, and HCV RNA replication. Journal of virology 78,
11393.
Epstein, J. H., Quan, P.-L., Briese, T., Street, C., Jabado, O., Conlan, S., Ali Khan, S.,
Verdugo, D., Hossain, M. J., & other authors. (2010). Identification of GBV-D, a
novel GB-like flavivirus from old world frugivorous bats (Pteropus giganteus) in
Bangladesh. PLoS Pathog 6, e1000972.
Erdtmann, L. (2003). The Hepatitis C Virus NS2 Protein Is an Inhibitor of CIDE-B-induced
Apoptosis. Journal of Biological Chemistry 278, 18256-18264.
Evans, M. J., Rice, C. M. & Goff, S. P. (2004). Phosphorylation of hepatitis C virus
nonstructural protein 5A modulates its protein interactions and viral RNA replication.
Proc Natl Acad Sci U S A 101, 13038-13043.
171
Evans, M. J., von Hahn, T., Tscherne, D. M., Syder, A. J., Panis, M., Wölk, B.,
Hatziioannou, T., McKeating, J. A., Bieniasz, P. D. & Rice, C. M. (2007). Claudin-
1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature 446, 801-
805.
Everhart, J. E., Lok, A. S., Kim, H.-Y., Morgan, T. R., Lindsay, K. L., Chung, R. T.,
Bonkovsky, H. L. & Ghany, M. G. (2009). Weight-related effects on disease
progression in the hepatitis C antiviral long-term treatment against cirrhosis trial.
Gastroenterology 137, 549-557.
F
Farci, P., Shimoda, A., Wong, D., Cabezon, T., De Gioannis, D., Strazzera, A., Shimizu,
Y., Shapiro, M., Alter, H. J. & Purcell, R. H. (1996). Prevention of hepatitis C virus
infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of
the envelope 2 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 15394-15399.
Feld, J. J. & Hoofnagle, J. H. (2005). Mechanism of action of interferon and ribavirin in
treatment of hepatitis C. Nature 436, 967-972.
Ferron, F., Bussetta, C., Dutartre, H. & Canard, B. (2005). The modeled structure of the
RNA dependent RNA polymerase of GBV-C virus suggests a role for motif E in
Flaviviridae RNA polymerases. BMC Bioinformatics 6, 255.
Fiorucci, M., Boulant, S., Fournillier, A., Abraham, J. D., Lavergne, J. P., Paranhos-
Baccala, G., Inchauspé, G. & Bain, C. (2007). Expression of the alternative reading
frame protein of Hepatitis C virus induces cytokines involved in hepatic injuries. J
Gen Virol 88, 1149-1162.
Franck, N., Le Seyec, J., Guguen-Guillouzo, C. & Erdtmann, L. (2005). Hepatitis C virus
NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted for degradation
to the proteasome. J Virol 79, 2700-2708.
Frick, D. N., Chapter 7. 37 pages. Editions Seng-Lai Tan. Hepatitis C Virures: Genomes and
Molecular Biology. Norfolk (UK). Horizon Bioscience (2006).
Friebe, P., Lohmann, V., Krieger, N. & Bartenschlager, R. (2001). Sequences in the 5’
nontranslated region of hepatitis C virus required for RNA replication. J Virol 75,
12047-12057.
Fujimoto, T. & Ohsaki, Y. (2006). Cytoplasmic lipid droplets: rediscovery of an old
structure as a unique platform. Ann N Y Acad Sci 1086, 104-115.
172
Fujimoto, T., Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M. & Shinohara, Y. (2008). Lipid droplets: a
classic organelle with new outfits. Histochem Cell Biol 130, 263-279.
Fujimoto, Y., Itabe, H., Sakai, J., Makita, M., Noda, J., Mori, M., Higashi, Y., Kojima, S.
& Takano, T. (2004). Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched
fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochimica et Biophysica
Acta (BBA)-Molecular Cell Research 1644, 47–59.
G
Gale, M., Jr & Foy, E. M. (2005). Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus.
Nature 436, 939-945.
Gao, L., Aizaki, H., He, J.-W. & Lai, M. M. C. (2004). Interactions between viral
nonstructural proteins and host protein hVAP-33 mediate the formation of hepatitis C
virus RNA replication complex on lipid raft. J Virol 78, 3480-3488.
Gastaminza, P., Cheng, G., Wieland, S., Zhong, J., Liao, W. & Chisari, F. V. (2007).
Cellular Determinants of Hepatitis C Virus Assembly, Maturation, Degradation, and
Secretion. Journal of Virology 82, 2120-2129.
Gastaminza, P., Kapadia, S. B. & Chisari, F. V. (2006). Differential biophysical properties
of infectious intracellular and secreted hepatitis C virus particles. J Virol 80, 11074-
11081.
Gastaminza, P., Dryden, K. A., Boyd, B., Wood, M. R., Law, M., Yeager, M. & Chisari,
F. V. (2010). Ultrastructural and biophysical characterization of hepatitis C virus
particles produced in cell culture. J Virol 84, 10999-11009.
Gibbons, G. F., Islam, K. & Pease, R. J. (2000). Mobilisation of triacylglycerol stores.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1483, 37–
57.
Goffard, A. & Dubuisson, J. (2003). Glycosylation of hepatitis C virus envelope proteins.
Biochimie 85, 295-301.
Goffard, A., Callens, N., Bartosch, B., Wychowski, C., Cosset, F.-L., Montpellier, C. &
Dubuisson, J. (2005). Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus
envelope glycoproteins. J Virol 79, 8400-8409.
Gong, G., Waris, G., Tanveer, R. & Siddiqui, A. (2001). Human hepatitis C virus NS5A
protein alters intracellular calcium levels, induces oxidative stress, and activates
STAT-3 and NF-kappa B. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9599-9604.
173
Goodman, J. M. (2008). The Gregarious Lipid Droplet. Journal of Biological Chemistry 283,
28005-28009.
Gosert, R., Egger, D., Lohmann, V., Bartenschlager, R., Blum, H. E., Bienz, K. &
Moradpour, D. (2003). Identification of the hepatitis C virus RNA replication
complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons. Journal of virology 77, 5487.
De Gottardi, A., Pazienza, V., Pugnale, P., Bruttin, F., RUBBIA-BRANDT, L., JUGE-
AUBRY, C., Meier, C. A., Hadengue, A. & Negro, F. (2006). Peroxisome
proliferator-activated receptor-$\alpha$ and-$\gamma$ mRNA levels are reduced in
chronic hepatitis C with steatosis and genotype 3 infection. Alimentary pharmacology
& therapeutics 23, 107–114.
Gottwein, J. M., Scheel, T. K. H., Hoegh, A. M., Lademann, J. B., Eugen-Olsen, J.,
Lisby, G. & Bukh, J. (2007). Robust hepatitis C genotype 3a cell culture releasing
adapted intergenotypic 3a/2a (S52/JFH1) viruses. Gastroenterology 133, 1614–1626.
Gouttenoire, J., Castet, V., Montserret, R., Arora, N., Raussens, V., Ruysschaert, J.-M.,
Diesis, E., Blum, H. E., Penin, F. & Moradpour, D. (2009a). Identification of a
Novel Determinant for Membrane Association in Hepatitis C Virus Nonstructural
Protein 4B. Journal of Virology 83, 6257-6268.
Gouttenoire, J., Montserret, R., Kennel, A., Penin, F. & Moradpour, D. (2009b). An
Amphipathic -Helix at the C Terminus of Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 4B
Mediates Membrane Association. Journal of Virology 83, 11378-11384.
Grakoui, A., McCourt, D. W., Wychowski, C., Feinstone, S. M. & Rice, C. M. (1993). A
second hepatitis C virus-encoded proteinase. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 10583-
10587.
Grakoui, A., Hanson, H. L. & Rice, C. M. (2001). Bad time for Bonzo? Experimental
models of hepatitis C virus infection, replication, and pathogenesis. Hepatology 33,
489-495.
Grassi, A., Ballardini, G., Susca, M., Bianchini, F., Bonoli, S., Bianchi, F. B. & Lenzi, M.
(2005). HCV liver infection and liver steatosis: evidence for indirect mechanisms in
genotype 3? Aliment Pharmacol Ther 22 Suppl 2, 79-82.
Gravitz, L. (2011). Introduction: A smouldering public-health crisis. Nature 474, S2-S4.
Greenberg, A. S., Egan, J. J., Wek, S. A., Garty, N. B., Blanchette-Mackie, E. J. &
Londos, C. (1991). Perilipin, a major hormonally regulated adipocyte-specific
phosphoprotein associated with the periphery of lipid storage droplets. J Biol Chem
266, 11341-11346.
174
Griffin, S. D. C., Harvey, R., Clarke, D. S., Barclay, W. S., Harris, M. & Rowlands, D. J.
(2004). A conserved basic loop in hepatitis C virus p7 protein is required for
amantadine-sensitive ion channel activity in mammalian cells but is dispensable for
localization to mitochondria. J Gen Virol 85, 451-461.
Guo, Y., Walther, T. C., Rao, M., Stuurman, N., Goshima, G., Terayama, K., Wong, J.
S., Vale, R. D., Walter, P. & Farese, R. V. (2008). Functional genomic screen
reveals genes involved in lipid-droplet formation and utilization. Nature 453, 657-661.
Gusarova, V., Seo, J., Sullivan, M. L., Watkins, S. C., Brodsky, J. L. & Fisher, E. A.
(2007). Golgi-associated maturation of very low density lipoproteins involves
conformational changes in apolipoprotein B, but is not dependent on apolipoprotein E.
J Biol Chem 282, 19453-19462.
H
Han, Q., Xu, C., Wu, C., Zhu, W., Yang, R. & Chen, X. (2009). Compensatory mutations
in NS3 and NS5A proteins enhance the virus production capability of hepatitis C
reporter virus. Virus Research 145, 63–73.
Heaton, N. S. & Randall, G. (2011). Multifaceted roles for lipids in viral infection. Trends
Microbiol.
Heimann, M., Sosa, G. R., Martoglio, B., Thiel, H. J. & Rumenapf, T. (2006). Core
protein of pestiviruses is processed at the C terminus by signal peptide peptidase.
Journal of virology 80, 1915.
Helle, F., Vieyres, G., Elkrief, L., Popescu, C.-I., Wychowski, C., Descamps, V.,
Castelain, S., Roingeard, P., Duverlie, G. & Dubuisson, J. (2010). Role of N-linked
glycans in the functions of hepatitis C virus envelope proteins incorporated into
infectious virions. J Virol 84, 11905-11915.
Herker, E., Harris, C., Hernandez, C., Carpentier, A., Kaehlcke, K., Rosenberg, A. R.,
Farese, R. V. & Ott, M. (2010). Efficient hepatitis C virus particle formation requires
diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med 16, 1295-1298.
Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M. & Shimotohno, K. (1991). Gene
mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro
processing analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 5547-5551.
Hijikata, M., Shimizu, Y. K., Kato, H., Iwamoto, A. , Shih, J. W., Alter, H. J., Purcell, R.
H. & Yoshikura, H. (1993a). Equilibrium centrifugation studies of hepatitis C virus:
evidence for circulating immune complexes. J Virol 67, 1953-1958.
175
Hijikata, M., Mizushima, H., Akagi, T., Mori, S., K akiuchi, N., Kato, N., Tanaka, T.,
Kimura, K. & Shimotohno, K. (1993b). Two distinct proteinase activities required
for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis C virus. J
Virol 67, 4665-4675.
Hofer, H., Bankl, H. C., Wrba, F., Steindl-Munda, P., Peck-Radosavljevic, M.,
Osterreicher, C., Mueller, C., Gangl, A. & Ferenci, P. (2002). Hepatocellular fat
accumulation and low serum cholesterol in patients infected with HCV-3a. Am J
Gastroenterol 97, 2880-2885.
Hooper, A. J., Adams, L. A. & Burnett, J. R. (2011). Genetic determinants of hepatic
steatosis in man. J Lipid Res 52, 593-617.
Hope, R. G. & McLauchlan, J. (2000). Sequence motifs required for lipid droplet
association and protein stability are unique to the hepatitis C virus core protein. J Gen
Virol 81, 1913-1925.
Hope, R. G., McElwee, M. J. & McLauchlan, J. (2006). Efficient cleavage by signal
peptide peptidase requires residues within the signal peptide between the core and E1
proteins of hepatitis C virus strain J1. J Gen Virol 87, 623-627.
Hope, R. G. (2001). The Domains Required to Direct Core Proteins of Hepatitis C Virus and
GB Virus-B to Lipid Droplets Share Common Features with Plant Oleosin Proteins.
Journal of Biological Chemistry 277, 4261-4270.
Houghton, M. & Abrignani, S. (2005). Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus.
Nature 436, 961-966.
Hourigan, L. F., Macdonald, G. A., Purdie, D., Whitehall, V. H., Shorthouse, C.,
Clouston, A. & Powell, E. E. (1999). Fibrosis in chronic hepatitis C correlates
significantly with body mass index and steatosis. Hepatology 29, 1215-1219.
Hourioux, C., Patient, R., Morin, A., Blanchard, E., Moreau, A., Trassard, S.,
Giraudeau, B. & Roingeard, P. (2007). The genotype 3-specific hepatitis C virus
core protein residue phenylalanine 164 increases steatosis in an in vitro cellular model.
Gut 56, 1302-1308.
Huang, H., Sun, F., Owen, D. M., Li, W., Chen, Y., Gale, M., Jr & Ye, J. (2007). Hepatitis
C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of
very low-density lipoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 5848-5853.
Hügle, T., Fehrmann, F., Bieck, E., Kohara, M., Kräusslich, H. G., Rice, C. M., Blum, H.
E. & Moradpour, D. (2001). The hepatitis C virus nonstructural protein 4B is an
integral endoplasmic reticulum membrane protein. Virology 284, 70-81.
176
Hui, J. M., Kench, J. G., Chitturi, S., Sud, A., Farrell, G. C., Byth, K., Hall, P., Khan, M.
& George, J. (2003). Long-term outcomes of cirrhosis in nonalcoholic steatohepatitis
compared with hepatitis C. Hepatology 38, 420-427.
Hung, C.-H., Lee, C.-M. & Lu, S.-N. (2011). Hepatitis C virus-associated insulin resistance:
pathogenic mechanisms and clinical implications. Expert Rev Anti Infect Ther 9, 525-
533.
Hüssy, P., Langen, H., Mous, J. & Jacobsen, H. (1996). Hepatitis C virus core protein:
carboxy-terminal boundaries of two processed species suggest cleavage by a signal
peptide peptidase. Virology 224, 93-104.
Hwang, S.-J. & Lee, S.-D. (2011). Hepatic steatosis and hepatitis C: Still unhappy
bedfellows? J Gastroenterol Hepatol 26 Suppl 1, 96-101.
I
Icard, V., Diaz, O., Scholtes, C., Perrin-Cocon, L., Ramière, C., Bartenschlager, R.,
Penin, F., Lotteau, V. & André, P. (2009). Secretion of Hepatitis C Virus Envelope
Glycoproteins Depends on Assembly of Apolipoprotein B Positive Lipoproteins. PLoS
ONE 4, e4233(B. Lindenbach, Ed.).
Iizuka, K. & Horikawa, Y. (2008). ChREBP: a glucose-activated transcription factor
involved in the development of metabolic syndrome. Endocr J 55, 617-624.
Iizuka, K., Bruick, R. K., Liang, G., Horton, J. D. & Uyeda, K. (2004). Deficiency of
carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) reduces lipogenesis as well
as glycolysis. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7281-7286.
Imamura, M., Inoguchi, T., Ikuyama, S., Taniguchi, S., Kobayashi, K., Nakashima, N. &
Nawata, H. (2002). ADRP stimulates lipid accumulation and lipid droplet formation
in murine fibroblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab 283, E775-783.
Imbert-Bismut, F., Ratziu, V., Pieroni, L., Charlotte, F., Benhamou, Y. & Poynard, T.
(2001). Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus
infection: a prospective study. Lancet 357, 1069-1075.
Ito, T., Mukaigawa, J., Zuo, J., Hirabayashi, Y., Mitamura, K. & Yasui, K. (1996).
Cultivation of hepatitis C virus in primary hepatocyte culture from patients with
chronic hepatitis C results in release of high titre infectious virus. J Gen Virol 77 ( Pt
5), 1043-1054.
177
Ito, T., Tahara, S. M. & Lai, M. M. (1998). The 3’-untranslated region of hepatitis C virus
RNA enhances translation from an internal ribosomal entry site. J Virol 72, 8789-
8796.
J
Jackel-Cram, C., Babiuk, L. A. & Liu, Q. (2007). Up-regulation of fatty acid synthase
promoter by hepatitis C virus core protein: genotype-3a core has a stronger effect than
genotype-1b core. Journal of hepatology 46, 999–1008.
Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F. & Schneiter, R. (2011).
Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in
Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci 124, 2424-2437.
Jhaveri, R., McHutchison, J., Patel, K., Qiang, G. & Diehl, A. M. (2008). Specific
Polymorphisms in Hepatitis C Virus Genotype 3 Core Protein Associated with
Intracellular Lipid Accumulation. J INFECT DIS 197, 283-291.
Jhaveri, R., Qiang, G. & Diehl, A. M. (2009). Domain 3 of hepatitis C virus core protein is
sufficient for intracellular lipid accumulation. J Infect Dis 200, 1781-1788.
Jirasko, V., Montserret, R., Appel, N., Janvier, A., Eustachi, L., Brohm, C., Steinmann,
E., Pietschmann, T., Penin, F. & Bartenschlager, R. (2008). Structural and
Functional Characterization of Nonstructural Protein 2 for Its Role in Hepatitis C
Virus Assembly. Journal of Biological Chemistry 283, 28546-28562.
Jirasko, V., Montserret, R., Lee, J. Y., Gouttenoire, J., Moradpour, D., Penin, F. &
Bartenschlager, R. (2010). Structural and functional studies of nonstructural protein
2 of the hepatitis C virus reveal its key role as organizer of virion assembly. PLoS
Pathog 6, e1001233.
Jones, C. T., Murray, C. L., Eastman, D. K., Tassello, J. & Rice, C. M. (2007). Hepatitis
C Virus p7 and NS2 Proteins Are Essential for Production of Infectious Virus. Journal
of Virology 81, 8374-8383.
Jones, D. M. & McLauchlan, J. (2010). Hepatitis C Virus: Assembly and Release of Virus
Particles. Journal of Biological Chemistry 285, 22733-22739.
Jones, D. M., Patel, A. H., Targett-Adams, P. & McLauchlan, J. (2008). The Hepatitis C
Virus NS4B Protein Can trans-Complement Viral RNA Replication and Modulates
Production of Infectious Virus. Journal of Virology 83, 2163-2177.
Joseph, S. B., Laffitte, B. A., Patel, P. H., Watson, M. A., Matsukuma, K. E., Walczak,
R., Collins, J. L., Osborne, T. F. & Tontonoz, P. (2002). Direct and indirect
178
mechanisms for regulation of fatty acid synthase gene expression by liver X receptors.
J Biol Chem 277, 11019-11025.
K
Kanda, T., Steele, R., Ray, R. & Ray, R. B. (2007). Small interfering RNA targeted to
hepatitis C virus 5’ nontranslated region exerts potent antiviral effect. J Virol 81, 669-
676.
Kapadia, S. B., Barth, H., Baumert, T., McKeating, J. A. & Chisari, F. V. (2007).
Initiation of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity
between CD81 and scavenger receptor B type I. J Virol 81, 374-383.
Kato, T., Matsumura, T., Heller, T., Saito, S., Sapp, R. K., Murthy, K., Wakita, T. &
Liang, T. J. (2007). Production of infectious hepatitis C virus of various genotypes in
cell cultures. J Virol 81, 4405-4411.
Kawaguchi, T., Yoshida, T., Harada, M., Hisamoto, T., Nagao, Y., Ide, T., Taniguchi, E.,
Kumemura, H., Hanada, S., & other authors. (2004). Hepatitis C virus down-
regulates insulin receptor substrates 1 and 2 through up-regulation of suppressor of
cytokine signaling 3. Am J Pathol 165, 1499-1508.
Kawaguchi, T., Ide, T., Taniguchi, E., Hirano, E., Itou, M., Sumie, S., Nagao, Y.,
Yanagimoto, C., Hanada, S., & other authors. (2007). Clearance of HCV improves
insulin resistance, beta-cell function, and hepatic expression of insulin receptor
substrate 1 and 2. Am J Gastroenterol 102, 570-576.
Kimmel, A. R., Brasaemle, D. L., McAndrews-Hill, M., Sztalryd, C. & Londos, C.
(2010). Adoption of PERILIPIN as a unifying nomenclature for the mammalian PAT-
family of intracellular lipid storage droplet proteins. J Lipid Res 51, 468-471.
Kim, J. L., Morgenstern, K. A., Lin, C., Fox, T., Dwyer, M. D., Landro, J. A., Chambers,
S. P., Markland, W., Lepre, C. A., & other authors. (1996). Crystal structure of the
hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor
peptide. Cell 87, 343-355.
Kim, K. H., Hong, S. P., Kim, K., Park, M. J., Kim, K. J. & Cheong, J. (2007). HCV core
protein induces hepatic lipid accumulation by activating SREBP1 and PPARgamma.
Biochem Biophys Res Commun 355, 883-888.
Kim, K., Kim, K. H., Ha, E., Park, J. Y., Sakamoto, N. & Cheong, J. (2009). Hepatitis C
virus NS5A protein increases hepatic lipid accumulation via induction of activation
and expression of PPARgamma. FEBS Letters 583, 2720-2726.
179
Kim, S.-J., Kim, J.-H., Kim, Y.-G., Lim, H.-S. & Oh, J.-W. (2004). Protein kinase C-
related kinase 2 regulates hepatitis C virus RNA polymerase function by
phosphorylation. J Biol Chem 279, 50031-50041.
Kim, S., Welsch, C., Yi, M. & Lemon, S. M. (2011). Regulation of Infectious Genotype 1a
Hepatitis C Virus Production by Domain III of NS5A. J Virol.
Klein, K. C., Dellos, S. R. & Lingappa, J. R. (2005). Identification of residues in the
hepatitis C virus core protein that are critical for capsid assembly in a cell-free system.
J Virol 79, 6814-6826.
Kneteman, N. M., Weiner, A. J., O’Connell, J., Collett, M., Gao, T., Aukerman, L.,
Kovelsky, R., Ni, Z.-J., Zhu, Q., & other authors. (2006). Anti-HCV therapies in
chimeric scid-Alb/uPA mice parallel outcomes in human clinical application.
Hepatology 43, 1346-1353.
Koch, J. O. & Bartenschlager, R. (1999). Modulation of hepatitis C virus NS5A
hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B. J Virol 73,
7138-7146.
Koike, K. (2009). Steatosis, liver injury, and hepatocarcinogenesis in hepatitis C viral
infection. J Gastroenterol 44, 82-88.
Kolykhalov, A. A., Mihalik, K., Feinstone, S. M. & Rice, C. M. (2000). Hepatitis C virus-
encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3’ nontranslated
region are essential for virus replication in vivo. J Virol 74, 2046-2051.
Korenaga, M. (2005). Hepatitis C Virus Core Protein Inhibits Mitochondrial Electron
Transport and Increases Reactive Oxygen Species (ROS) Production. Journal of
Biological Chemistry 280, 37481-37488.
Krieger, N., Lohmann, V. & Bartenschlager, R. (2001). Enhancement of hepatitis C virus
RNA replication by cell culture-adaptive mutations. J Virol 75, 4614-4624.
Kuerschner, L., Moessinger, C. & Thiele, C. (2008). Imaging of lipid biosynthesis: how a
neutral lipid enters lipid droplets. Traffic 9, 338–352.
Kumar, D., Farrell, G. C., Fung, C. & George, J. (2002). Hepatitis C virus genotype 3 is
cytopathic to hepatocytes: Reversal of hepatic steatosis after sustained therapeutic
response. Hepatology 36, 1266-1272.
Kumar, D., Farrell, G. C., Kench, J. & George, J. (2005). Hepatic steatosis and the risk of
hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C. J Gastroenterol Hepatol 20, 1395-
1400.
180
Kumar, Y., Cocchiaro, J. & Valdivia, R. H. (2006). The obligate intracellular pathogen
Chlamydia trachomatis targets host lipid droplets. Curr Biol 16, 1646-1651.
Kunkel, M., Lorinczi, M., Rijnbrand, R., Lemon, S. M. & Watowich, S. J. (2001). Self-
assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis C virus core
protein. J Virol 75, 2119-2129.
L
Lai, C.-K., Jeng, K.-S., Machida, K. & Lai, M. M. C. (2008). Association of hepatitis C
virus replication complexes with microtubules and actin filaments is dependent on the
interaction of NS3 and NS5A. J Virol 82, 8838-8848.
Lanford, R. E., Chavez, D., Notvall, L. & Brasky, K. M. (2003). Comparison of tamarins
and marmosets as hosts for GBV-B infections and the effect of immunosuppression on
duration of viremia. Virology 311, 72-80.
Larrea, E., Garcia, N., Qian, C., Civeira, M. P. & Prieto, J. (1996). Tumor necrosis factor
alpha gene expression and the response to interferon in chronic hepatitis C.
Hepatology 23, 210-217.
Lavillette, D., Tarr, A. W., Voisset, C., Donot, P., Bartosch, B., Bain, C., Patel, A. H.,
Dubuisson, J., Ball, J. K. & Cosset, F.-L. (2005). Characterization of host-range and
cell entry properties of the major genotypes and subtypes of hepatitis C virus.
Hepatology 41, 265-274.
Lavillette, D., Pécheur, E.-I., Donot, P., Fresquet, J., Molle, J., Corbau, R., Dreux, M.,
Penin, F. & Cosset, F.-L. (2007). Characterization of fusion determinants points to
the involvement of three discrete regions of both E1 and E2 glycoproteins in the
membrane fusion process of hepatitis C virus. J Virol 81, 8752-8765.
Law, M., Maruyama, T., Lewis, J., Giang, E., Tarr, A. W., Stamataki, Z., Gastaminza,
P., Chisari, F. V., Jones, I. M., & other authors. (2008). Broadly neutralizing
antibodies protect against hepatitis C virus quasispecies challenge. Nat Med 14, 25-27.
Le Lay, S., Hajduch, E., Lindsay, M. R., Le Lièpvre, X., Thiele, C., Ferré, P., Parton, R.
G., Kurzchalia, T., Simons, K. & Dugail, I. (2006). Cholesterol-induced caveolin
targeting to lipid droplets in adipocytes: a role for caveolar endocytosis. Traffic 7,
549-561.
Leandro, G., Mangia, A., Hui, J., Fabris, P., Rubbia-Brandt, L., Colloredo, G., Adinolfi,
L. E., Asselah, T., Jonsson, J. R., & other authors. (2006). Relationship between
181
steatosis, inflammation, and fibrosis in chronic hepatitis C: a meta-analysis of
individual patient data. Gastroenterology 130, 1636-1642.
Lemberg, M. K. & Martoglio, B. (2002). Requirements for signal peptide peptidase-
catalyzed intramembrane proteolysis. Molecular Cell 10, 735–744.
Lerat, H., Honda, M., Beard, M. R., Loesch, K., Sun, J., Yang, Y., Okuda, M., Gosert, R.
& others. (2002). Steatosis and liver cancer in transgenic mice expressing the
structural and nonstructural proteins of hepatitis c virus***. Gastroenterology 122,
352–365.
Lesburg, C. A., Cable, M. B., Ferrari, E., Hong, Z., Mannarino, A. F. & Weber, P. C.
(1999). Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase from hepatitis C
virus reveals a fully encircled active site. Nat Struct Biol 6, 937-943.
Levrero, M. (2006). Viral hepatitis and liver cancer: the case of hepatitis C. Oncogene 25,
3834-3847.
Levy, S. & Shoham, T. (2005). Protein-protein interactions in the tetraspanin web.
Physiology (Bethesda) 20, 218-224.
Lewis, G. F., Carpentier, A., Adeli, K. & Giacca, A. (2002). Disordered fat storage and
mobilization in the pathogenesis of insulin resistance and type 2 diabetes. Endocr Rev
23, 201-229.
Liang, G., Yang, J., Horton, J. D., Hammer, R. E., Goldstein, J. L. & Brown, M. S.
(2002). Diminished hepatic response to fasting/refeeding and liver X receptor agonists
in mice with selective deficiency of sterol regulatory element-binding protein-1c. J
Biol Chem 277, 9520-9528.
Lindenbach, B. D. & Rice, C. M. (2005). Unravelling hepatitis C virus replication from
genome to function. Nature 436, 933-938.
Lindenbach, B. D., Evans, M. J., Syder, A. J., Wölk, B., Tellinghuisen, T. L., Liu, C. C.,
Maruyama, T., Hynes, R. O., Burton, D. R., & other authors. (2005). Complete
replication of hepatitis C virus in cell culture. Science 309, 623-626.
Lindenbach, B. D., Meuleman, P., Ploss, A., Vanwolleghem, T., Syder, A. J., McKeating,
J. A., Lanford, R. E., Feinstone, S. M., Major, M. E., & other authors. (2006).
Cell culture-grown hepatitis C virus is infectious in vivo and can be recultured in
vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 3805-3809.
Listenberger, L. L., Ostermeyer-Fay, A. G., Goldberg, E. B., Brown, W. J. & Brown, D.
A. (2007). Adipocyte differentiation-related protein reduces the lipid droplet
182
association of adipose triglyceride lipase and slows triacylglycerol turnover. J Lipid
Res 48, 2751-2761.
Liu, P. (2003). Chinese Hamster Ovary K2 Cell Lipid Droplets Appear to Be Metabolic
Organelles Involved in Membrane Traffic. Journal of Biological Chemistry 279, 3787-
3792.
Liu, P., Bartz, R., Zehmer, J. K., Ying, Y.-shu, Zhu, M., Serrero, G. & Anderson, R. G.
W. (2007). Rab-regulated interaction of early endosomes with lipid droplets. Biochim
Biophys Acta 1773, 784-793.
Liu, Q., Tackney, C., Bhat, R. A., Prince, A. M. & Zhang, P. (1997). Regulated processing
of hepatitis C virus core protein is linked to subcellular localization. J Virol 71, 657-
662.
Liu, S., Yang, W., Shen, L., Turner, J. R., Coyne, C. B. & Wang, T. (2009). Tight junction
proteins claudin-1 and occludin control hepatitis C virus entry and are downregulated
during infection to prevent superinfection. J Virol 83, 2011-2014.
Lohmann, V., Körner, F., Dobierzewska, A. & Bartenschlager, R. (2001). Mutations in
hepatitis C virus RNAs conferring cell culture adaptation. J Virol 75, 1437-1449.
Lohmann, V. (1999). Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma
Cell Line. Science 285, 110-113.
Lohmann, V., Hoffmann, S., Herian, U., Penin, F. & Bartenschlager, R. (2003). Viral and
cellular determinants of hepatitis C virus RNA replication in cell culture. J Virol 77,
3007-3019.
Londos, C., Brasaemle, D. L., Schultz, C. J., Segrest, J. P. & Kimmel, A. R. (1999).
Perilipins, ADRP, and other proteins that associate with intracellular neutral lipid
droplets in animal cells. Semin Cell Dev Biol 10, 51-58.
Lorenz, I. C., Marcotrigiano, J., Dentzer, T. G. & Rice, C. M. (2006). Structure of the
catalytic domain of the hepatitis C virus NS2-3 protease. Nature 442, 831-835.
Love, R. A., Parge, H. E., Wickersham, J. A., Hostomsky, Z., Habuka, N., Moomaw, E.
W., Adachi, T. & Hostomska, Z. (1996). The crystal structure of hepatitis C virus
NS3 proteinase reveals a trypsin-like fold and a structural zinc binding site. Cell 87,
331-342.
Lozach, P.-Y., Lortat-Jacob, H., de Lacroix de Lavalette, A., Staropoli, I., Foung, S.,
Amara, A., Houles, C., Fieschi, F., Schwartz, O., & other authors. (2003). DC-
SIGN and L-SIGN are high affinity binding receptors for hepatitis C virus
glycoprotein E2. J Biol Chem 278, 20358-20366.
183
Lozach, P.-Y., Amara, A., Bartosch, B., Virelizier, J.-L., Arenzana-Seisdedos, F., Cosset,
F.-L. & Altmeyer, R. (2004). C-type lectins L-SIGN and DC-SIGN capture and
transmit infectious hepatitis C virus pseudotype particles. J Biol Chem 279, 32035-
32045.
Luckenbill, L. M. & Cohen, A. S. (1966). The association of lipid droplets with cytoplasmic
filaments in avian subsynovial adipose cells. The Journal of cell biology 31, 195–199.
Lundin, M., Monné, M., Widell, A., Von Heijne, G. & Persson, M. A. A. (2003).
Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. J Virol 77,
5428-5438.
Lyn, R. K., Kennedy, D. C., Stolow, A., Ridsdale, A. & Pezacki, J. P. (2010). Dynamics of
lipid droplets induced by the hepatitis C virus core protein. Biochemical and
Biophysical Research Communications 399, 518-524.
M
Macdonald, A. & Harris, M. (2004). Hepatitis C virus NS5A: tales of a promiscuous
protein. Journal of general virology 85, 2485.
Machida, K., Cheng, K. T.-H., Lai, C.-K., Jeng, K.-S., Sung, V. M.-H. & Lai, M. M. C.
(2006). Hepatitis C virus triggers mitochondrial permeability transition with
production of reactive oxygen species, leading to DNA damage and STAT3 activation.
J Virol 80, 7199-7207.
Maillard, P., Huby, T., Andréo, U., Moreau, M., Chapman, J. & Budkowska, A. (2006).
The interaction of natural hepatitis C virus with human scavenger receptor SR-BI/Cla1
is mediated by ApoB-containing lipoproteins. FASEB J 20, 735-737.
Majeau, N., Fromentin, R., Savard, C., Duval, M., Tremblay, M. J. & Leclerc, D. (2009).
Palmitoylation of hepatitis C virus core protein is important for virion production. J
Biol Chem 284, 33915-33925.
Marcinkiewicz, A. (2006). The Phosphorylation of Serine 492 of Perilipin A Directs Lipid
Droplet Fragmentation and Dispersion. Journal of Biological Chemistry 281, 11901-
11909.
Martin, A., Bodola, F., Sangar, D. V., Goettge, K., Popov, V., Rijnbrand, R., Lanford, R.
E. & Lemon, S. M. (2003). Chronic hepatitis associated with GB virus B persistence
in a tamarin after intrahepatic inoculation of synthetic viral RNA. Proc Natl Acad Sci
U S A 100, 9962-9967.
184
Marzouk, D., Sass, J., Bakr, I., El Hosseiny, M., Abdel-Hamid, M., Rekacewicz, C.,
Chaturvedi, N., Mohamed, M. K. & Fontanet, A. (2007). Metabolic and
cardiovascular risk profiles and hepatitis C virus infection in rural Egypt. Gut 56,
1105-1110.
Masaki, T., Suzuki, R., Murakami, K., Aizaki, H., Ishii, K., Murayama, A., Date, T.,
Matsuura, Y., Miyamura, T., & other authors . (2008). Interaction of Hepatitis C
Virus Nonstructural Protein 5A with Core Protein Is Critical for the Production of
Infectious Virus Particles. Journal of Virology 82, 7964-7976.
Matsumoto, M., Hwang, S. B., Jeng, K. S., Zhu, N. & Lai, M. M. (1996). Homotypic
interaction and multimerization of hepatitis C virus core protein. Virology 218, 43-51.
Matsusue, K., Haluzik, M., Lambert, G., Yim, S.-H., Gavrilova, O., Ward, J. M.,
Brewer, B., Jr, Reitman, M. L. & Gonzalez, F. J. (2003). Liver-specific disruption
of PPARgamma in leptin-deficient mice improves fatty liver but aggravates diabetic
phenotypes. J Clin Invest 111, 737-747.
Ma, H.-C., Lin, T.-W., Li, H., Iguchi-Ariga, S. M. M., Ariga, H., Chuang, Y.-L., Ou, J.-
H. & Lo, S.-Y. (2008a). Hepatitis C virus ARFP/F protein interacts with cellular MM-
1 protein and enhances the gene trans-activation activity of c-Myc. J Biomed Sci 15,
417-425.
Ma, Y., Yates, J., Liang, Y., Lemon, S. M. & Yi, M. (2008b). NS3 Helicase Domains
Involved in Infectious Intracellular Hepatitis C Virus Particle Assembly. Journal of
Virology 82, 7624-7639.
Ma, Y., Anantpadma, M., Timpe, J. M., Shanmugam, S., Singh, S. M., Lemon, S. M. &
Yi, M. (2011). Hepatitis C virus NS2 protein serves as a scaffold for virus assembly
by interacting with both structural and nonstructural proteins. J Virol 85, 86-97.
McLauchlan, J. (2000). Properties of the hepatitis C virus core protein: a structural protein
that modulates cellular processes. J Viral Hepat 7, 2-14.
McLauchlan, J., Lemberg, M. K., Hope, G. & Martoglio, B. (2002). Intramembrane
proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus core protein to lipid droplets.
EMBO J 21, 3980-3988.
McMullan, L. K., Grakoui, A., Evans, M. J., Mihalik , K., Puig, M., Branch, A. D.,
Feinstone, S. M. & Rice, C. M. (2007). Evidence for a functional RNA element in
the hepatitis C virus core gene. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 2879-2884.
185
McPherson, S., Jonsson, J. R., Barrie, H. D., O’Rourke, P., Clouston, A. D. & Powell, E.
E. (2008). Investigation of the role of SREBP-1c in the pathogenesis of HCV-related
steatosis. Journal of hepatology 49, 1046–1054.
Mehta, S. H., Brancati, F. L., Strathdee, S. A., Pankow, J. S., Netski, D., Coresh, J.,
Szklo, M. & Thomas, D. L. (2003). Hepatitis C virus infection and incident type 2
diabetes. Hepatology 38, 50-56.
Memon, R. A., Tecott, L. H., Nonogaki, K., Beigneux, A., Moser, A. H., Grunfeld, C. &
Feingold, K. R. (2000). Up-regulation of peroxisome proliferator-activated receptors
(PPAR-alpha) and PPAR-gamma messenger ribonucleic acid expression in the liver in
murine obesity: troglitazone induces expression of PPAR-gamma-responsive adipose
tissue-specific genes in the liver of obese diabetic mice. Endocrinology 141, 4021-
4031.
Mensenkamp, A. R., Havekes, L. M., Romijn, J. A. & Kuipers, F. (2001). Hepatic
steatosis and very low density lipoprotein secretion: the involvement of apolipoprotein
E. J Hepatol 35, 816-822.
Mercer, D. F., Schiller, D. E., Elliott, J. F., Douglas, D. N., Hao, C., Rinfret, A., Addison,
W. R., Fischer, K. P., Churchill, T. A., & other authors. (2001). Hepatitis C virus
replication in mice with chimeric human livers. Nat Med 7, 927-933.
Merz, A., Long, G., Hiet, M.-S., Brügger, B., Chlanda, P., Andre, P., Wieland, F.,
Krijnse-Locker, J. & Bartenschlager, R. (2011). Biochemical and morphological
properties of hepatitis C virus particles and determination of their lipidome. J Biol
Chem 286, 3018-3032.
Meuleman, P., Hesselgesser, J., Paulson, M., Vanwolleghem, T., Desombere, I., Reiser,
H. & Leroux-Roels, G. (2008). Anti-CD81 antibodies can prevent a hepatitis C virus
infection in vivo. Hepatology 48, 1761-1768.
Meunier, J. C., Fournillier, A., Choukhi, A., Cahour, A., Cocquerel, L., Dubuisson, J. &
Wychowski, C. (1999). Analysis of the glycosylation sites of hepatitis C virus (HCV)
glycoprotein E1 and the influence of E1 glycans on the formation of the HCV
glycoprotein complex. J Gen Virol 80 ( Pt 4), 887-896.
Meunier, J.-C., Russell, R. S., Engle, R. E., Faulk, K. N., Purcell, R. H. & Emerson, S. U.
(2008). Apolipoprotein c1 association with hepatitis C virus. J Virol 82, 9647-9656.
Meylan, E., Curran, J., Hofmann, K., Moradpour, D., Binder, M., Bartenschlager, R. &
Tschopp, J. (2005). Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is
targeted by hepatitis C virus. Nature 437, 1167-1172.
186
Mihm, S., Fayyazi, A., Hartmann, H. & Ramadori, G. (1997). Analysis of
histopathological manifestations of chronic hepatitis C virus infection with respect to
virus genotype. Hepatology 25, 735-739.
Miller, R. H. & Purcell, R. H. (1990). Hepatitis C virus shares amino acid sequence
similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus
supergroups. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 2057-2061.
Mirandola, S., Realdon, S., Iqbal, J., Gerotto, M., Dal Pero, F., Bortoletto, G.,
Marcolongo, M., Vario, A., Datz, C., & other authors. (2006). Liver microsomal
triglyceride transfer protein is involved in hepatitis C liver steatosis. Gastroenterology
130, 1661-1669.
Mirandola, S., Osterreicher, C. H., Marcolongo, M., Datz, C., Aigner, E.,
Schlabrakowski, A., Realdon, S., Gerotto, M., Alberti, A. & Stickel, F. (2009).
Microsomal triglyceride transfer protein polymorphism (-493G/T) is associated with
hepatic steatosis in patients with chronic hepatitis C. Liver Int 29, 557-565.
Mitsuyoshi, H., Itoh, Y., Sumida, Y., Minami, M., Yasui, K., Nakashima, T. & Okanoue,
T. (2008). Evidence of oxidative stress as a cofactor in the development of insulin
resistance in patients with chronic hepatitis C. Hepatol Res 38, 348-353.
Miura, S. (2002). Functional Conservation for Lipid Storage Droplet Association among
Perilipin, ADRP, and TIP47 (PAT)-related Proteins in Mammals, Drosophila, and
Dictyostelium. Journal of Biological Chemistry 277, 32253-32257.
Miyanari, Y., Atsuzawa, K., Usuda, N., Watashi, K., Hishiki, T., Zayas, M.,
Bartenschlager, R., Wakita, T., Hijikata, M. & Shimotohno, K. (2007). The lipid
droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol 9,
1089-1097.
Monto, A., Alonzo, J., Watson, J. J., Grunfeld, C. & Wright, T. L. (2002). Steatosis in
chronic hepatitis C: relative contributions of obesity, diabetes mellitus, and alcohol.
Hepatology 36, 729-736.
Moradpour, D., Gosert, R., Egger, D., Penin, F., Blum, H. E. & Bienz, K. (2003).
Membrane association of hepatitis C virus nonstructural proteins and identification of
the membrane alteration that harbors the viral replication complex. Antiviral research
60, 103–109.
Moradpour, D., Penin, F. & Rice, C. M. (2007). Replication of hepatitis C virus. Nat Rev
Microbiol 5, 453-463.
187
Moriishi, K., Mochizuki, R., Moriya, K., Miyamoto, H., Mori, Y., Abe, T., Murata, S.,
Tanaka, K., Miyamura, T., & other authors. (2007). Critical role of
PA28$\gamma$ in hepatitis C virus-associated steatogenesis and
hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 1661.
Morikawa, K., Zhao, Z., Date, T., Miyamoto, M., Murayama, A., Akazawa, D., Tanabe,
J., Sone, S. & Wakita, T. (2007). The roles of CD81 and glycosaminoglycans in the
adsorption and uptake of infectious HCV particles. J Med Virol 79, 714-723.
Moriya, K., Fujie, H., Yotsuyanagi, H., Shintani, Y., Tsutsumi, T., Matsuura, Y.,
Miyamura, T., Kimura, S. & Koike, K. (1997a). Subcellular localization of hepatitis
C virus structural proteins in the liver of transgenic mice. Jpn J Med Sci Biol 50, 169-
177.
Moriya, K., Fujie, H., Shintani, Y., Yotsuyanagi, H., Tsutsumi, T., Ishibashi, K.,
Matsuura, Y., Kimura, S., Miyamura, T. & Koike, K. (1998). The core protein of
hepatitis C virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. Nat Med 4,
1065-1067.
Moriya, K., Nakagawa, K., Santa, T., Shintani, Y., Fujie, H., Miyoshi, H., Tsutsumi, T.,
Miyazawa, T., Ishibashi, K., & other authors. (2001). Oxidative stress in the
absence of inflammation in a mouse model for hepatitis C virus-associated
hepatocarcinogenesis. Cancer Res 61, 4365-4370.
Moriya, K., Yotsuyanagi, H., Shintani, Y., Fujie, H., Ishibashi, K., Matsuura, Y.,
Miyamura, T. & Koike, K. (1997b). Hepatitis C virus core protein induces hepatic
steatosis in transgenic mice. Journal of general virology 78, 1527.
Moucari, R., Asselah, T., Cazals-Hatem, D., Voitot, H., Boyer, N., Ripault, M.-P.,
Sobesky, R., Martinot-Peignoux, M., Maylin, S., & other authors. (2008). Insulin
resistance in chronic hepatitis C: association with genotypes 1 and 4, serum HCV
RNA level, and liver fibrosis. Gastroenterology 134, 416-423.
Murphy, D. J. & Vance, J. (1999). Mechanisms of lipid-body formation. Trends in
biochemical sciences 24, 109–115.
Murphy, D. G., Willems, B., Deschênes, M., Hilzenrat, N., Mousseau, R. & Sabbah, S.
(2007). Use of sequence analysis of the NS5B region for routine genotyping of
hepatitis C virus with reference to C/E1 and 5’ untranslated region sequences. J Clin
Microbiol 45, 1102-1112.
188
Murphy, S., Martin, S. & Parton, R. G. (2009). Lipid droplet-organelle interactions;
sharing the fats. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of
Lipids 1791, 441–447.
N
Neddermann, P., Clementi, A. & De Francesco, R. (1999). Hyperphosphorylation of the
hepatitis C virus NS5A protein requires an active NS3 protease, NS4A, NS4B, and
NS5A encoded on the same polyprotein. J Virol 73, 9984-9991.
Nicolas-Burdin, N., Roque-Afonso, A.M., Dussaix E. Vol. 48 n°277, pp 31-43. Editions
Orion. Hépatite C en 2007: Stucture et réplication du virus, aspects clinique,
biologique et thérapeutique. Neuilly-sur-Seine (France). Feuillets de Biologie (2007).
O
Oem, J.-K., Jackel-Cram, C., Li, Y.-P., Zhou, Y., Zhong, J., Shimano, H., Babiuk, L. A.
& Liu, Q. (2008). Activation of sterol regulatory element-binding protein 1c and fatty
acid synthase transcription by hepatitis C virus non-structural protein 2. J Gen Virol
89, 1225-1230.
Ogino, T., Fukuda, H., Imajoh-Ohmi, S., Kohara, M. & Nomoto, A. (2004). Membrane
binding properties and terminal residues of the mature hepatitis C virus capsid protein
in insect cells. J Virol 78, 11766-11777.
Ohata, K., Hamasaki, K., Toriyama, K., Matsumoto, K., Saeki, A., Yanagi, K., Abiru, S.,
Nakagawa, Y., Shigeno, M., & other authors. (2003). Hepatic steatosis is a risk
factor for hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C virus infection.
Cancer 97, 3036-3043.
Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Fujita, A. & Fujimoto, T. (2008). Lipid droplets are
arrested in the ER membrane by tight binding of lipidated apolipoprotein B-100. J
Cell Sci 121, 2415-2422.
Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Shinohara, Y., Fujita, A. & Fujimoto, T. (2009).
Biogenesis of cytoplasmic lipid droplets: From the lipid ester globule in the membrane
to the visible structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell
Biology of Lipids 1791, 399-407.
Okamoto, K., Moriishi, K., Miyamura, T. & Matsuura, Y. (2004). Intramembrane
proteolysis and endoplasmic reticulum retention of hepatitis C virus core protein.
Journal of virology 78, 6370.
189
Okamoto, K., Mori, Y., Komoda, Y., Okamoto, T., Okochi, M., Takeda, M., Suzuki, T.,
Moriishi, K. & Matsuura, Y. (2008). Intramembrane Processing by Signal Peptide
Peptidase Regulates the Membrane Localization of Hepatitis C Virus Core Protein and
Viral Propagation. Journal of Virology 82, 8349-8361.
Okuda, M., Li, K., Beard, M. R., Showalter, L. A., Scholle, F., Lemon, S. M. &
Weinman, S. A. (2002). Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene
expression are induced by hepatitis C virus core protein. Gastroenterology 122, 366-
375.
Olofsson, S. O., Asp, L. & Borén, J. (1999). The assembly and secretion of apolipoprotein
B-containing lipoproteins. Curr Opin Lipidol 10, 341-346.
Op De Beeck, A., Montserret, R., Duvet, S., Cocquerel, L., Cacan, R., Barberot, B., Le
Maire, M., Penin, F. & Dubuisson, J. (2000). The transmembrane domains of
hepatitis C virus envelope glycoproteins E1 and E2 play a major role in
heterodimerization. J Biol Chem 275, 31428-31437.
Ozcan, U., Cao, Q., Yilmaz, E., Lee, A.-H., Iwakoshi, N. N., Ozdelen, E., Tuncman, G.,
Görgün, C., Glimcher, L. H. & Hotamisligil, G. S. (2004). Endoplasmic reticulum
stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science 306, 457-461.
Ozeki, S., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H. & Fujimoto, T. (2005).
Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic
reticulum-derived membrane. Journal of cell science 118, 2601.
P
Pang, P. S., Jankowsky, E., Planet, P. J. & Pyle, A. M. (2002). The hepatitis C viral NS3
protein is a processive DNA helicase with cofactor enhanced RNA unwinding. EMBO
J 21, 1168-1176.
Park, C.-Y., Jun, H.-J., Wakita, T., Cheong, J. H. & Hwang, S. B. (2009). Hepatitis C
Virus Nonstructural 4B Protein Modulates Sterol Regulatory Element-binding Protein
Signaling via the AKT Pathway. Journal of Biological Chemistry 284, 9237-9246.
Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.-Y., Trassard, S., Sureau, C. & Roingeard, P.
(2007). Hepatitis B virus subviral envelope particle morphogenesis and intracellular
trafficking. J Virol 81, 3842-3851.
Paul, D., Romero-Brey, I., Gouttenoire, J., Stoitsova, S., Krijnse-Locker, J., Moradpour,
D. & Bartenschlager, R. (2011). NS4B self-interaction through conserved C-terminal
190
elements is required for the establishment of functional HCV replication complexes. J
Virol.
Pavlović, D., Neville, D. C. A., Argaud, O., Blumberg, B., Dwek, R. A., Fischer, W. B. &
Zitzmann, N. (2003). The hepatitis C virus p7 protein forms an ion channel that is
inhibited by long-alkyl-chain iminosugar derivatives. Proc Natl Acad Sci U S A 100,
6104-6108.
Pawlotsky, J.-M. (2003). Hepatitis C virus genetic variability: pathogenic and clinical
implications. Clin Liver Dis 7, 45-66.
Pawlotsky, J.-M. (2005). Current and future concepts in hepatitis C therapy. Semin Liver Dis
25, 72-83.
Pazienza, V., Clément, S., Pugnale, P., Conzelman, S., Foti, M., Mangia, A. & Negro, F.
(2007). The hepatitis C virus core protein of genotypes 3a and 1b downregulates
insulin receptor substrate 1 through genotype-specific mechanisms. Hepatology 45,
1164-1171.
Pazienza, V., Vinciguerra, M., Andriulli, A. & Mang ia, A. (2010). Hepatitis C virus core
protein genotype 3a increases SOCS-7 expression through PPAR-{gamma} in Huh-7
cells. J Gen Virol 91, 1678-1686.
Pekow, J. R., Bhan, A. K., Zheng, H. & Chung, R. T. (2007). Hepatic steatosis is
associated with increased frequency of hepatocellular carcinoma in patients with
hepatitis C-related cirrhosis. Cancer 109, 2490-2496.
PERLEMUTER, G., SABILE, A., LETTERON, P., VONA, G., TOPILCO, A.,
CHRÉTIEN, Y., KOIKE, K., PESSAYRE, D., CHAPMAN, J., & other authors.
(2002). Hepatitis C virus core protein inhibits microsomal triglyceride transfer protein
activity and very low density lipoprotein secretion: a model of viral-related steatosis.
The FASEB journal 16, 185.
Perotti, M., Mancini, N., Diotti, R. A., Tarr, A. W ., Ball, J. K., Owsianka, A., Adair, R.,
Patel, A. H., Clementi, M. & Burioni, R. (2008). Identification of a broadly cross-
reacting and neutralizing human monoclonal antibody directed against the hepatitis C
virus E2 protein. J Virol 82, 1047-1052.
Petit, J.-M., Minello, A., Duvillard, L., Jooste, V., Monier, S., Texier, V., Bour, J.-B.,
Poussier, A., Gambert, P., & other authors. (2007). Cell surface expression of LDL
receptor in chronic hepatitis C: correlation with viral load. Am J Physiol Endocrinol
Metab 293, E416-420.
191
Phan, T., Beran, R. K. F., Peters, C., Lorenz, I. C. & Lindenbach, B. D. (2009). Hepatitis
C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic
interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol
83, 8379-8395.
Pietschmann, T., Kaul, A., Koutsoudakis, G., Shavinskaya, A., Kallis, S., Steinmann, E.,
Abid, K., Negro, F., Dreux, M., & other authors. (2006). Construction and
characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus
chimeras.
Pietschmann, T., Lohmann, V., Kaul, A., Krieger, N., Rinck, G., Rutter, G., Strand, D.
& Bartenschlager, R. (2002). Persistent and transient replication of full-length
hepatitis C virus genomes in cell culture. J Virol 76, 4008-4021.
Pileri, P., Uematsu, Y., Campagnoli, S., Galli, G., Falugi, F., Petracca, R., Weiner, A. J.,
Houghton, M., Rosa, D., & other authors. (1998). Binding of hepatitis C virus to
CD81. Science 282, 938-941.
Piodi, A., Chouteau, P., Lerat, H., Hézode, C. & Pawlotsky, J. (2008). Morphological
changes in intracellular lipid droplets induced by different hepatitis C virus genotype
core sequences and relationship with steatosis. Hepatology 48, 16-27.
Piver, E., Roingeard, P. & Pagès, J.-C. (2010). The cell biology of hepatitis C virus (HCV)
lipid addiction: molecular mechanisms and its potential importance in the clinic. Int J
Biochem Cell Biol 42, 869-879.
Ploegh, H. L. (2007). A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the
endoplasmic reticulum. Nature 448, 435-438.
Ploss, A., Evans, M. J., Gaysinskaya, V. A., Panis, M., You, H., de Jong, Y. P. & Rice, C.
M. (2009). Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required for infection of
mouse cells. Nature 457, 882-886.
Podevin, P., Carpentier, A., Pène, V., Aoudjehane, L., Carrière, M., Zaïdi, S.,
Hernandez, C., Calle, V., Méritet, J.-F., & other authors. (2010). Production of
infectious hepatitis C virus in primary cultures of human adult hepatocytes.
Gastroenterology 139, 1355-1364.
Popescu, C.-I. & Dubuisson, J. (2010). Role of lipid metabolism in hepatitis C virus
assembly and entry. Biol Cell 102, 63-74.
Popescu, C.-I., Callens, N., Trinel, D., Roingeard, P., Moradpour, D., Descamps, V.,
Duverlie, G., Penin, F., Héliot, L., & other authors. (2011). NS2 Protein of
192
Hepatitis C Virus Interacts with Structural and Non-Structural Proteins towards Virus
Assembly. PLoS Pathog 7, e1001278(C. M. Walker, Ed.).
Poynard, T., Ratziu, V., Charlotte, F., Goodman, Z., McHutchison, J. & Albrecht, J.
(2001). Rates and risk factors of liver fibrosis progression in patients with chronic
hepatitis c. J Hepatol 34, 730-739.
Poynard, T., Ratziu, V., McHutchison, J., Manns, M., Goodman, Z., Zeuzem, S.,
Younossi, Z. & Albrecht, J. (2003). Effect of treatment with peginterferon or
interferon alfa-2b and ribavirin on steatosis in patients infected with hepatitis C.
Hepatology 38, 75-85.
Q
Qiang, G., Yang, L., Witek, R. & Jhaveri, R. (2009). Recombinant adenoviruses expressing
Steatosis-associated Hepatitis C virus genotype 3 Core protein produce intracellular
lipid accumulation in cultured and primary hepatocytes. Virus Research 139, 127-130.
R
Ramcharran, D., Wahed, A. S., Conjeevaram, H. S., Evans, R. W., Wang, T., Belle, S. H.
& Yee, L. J. (2011). Serum lipids and their associations with viral levels and liver
disease severity in a treatment-naïve chronic hepatitis C type 1-infected cohort. J Viral
Hepat 18, e144-152.
Randall, G., Grakoui, A. & Rice, C. M. (2003). Clearance of replicating hepatitis C virus
replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A
100, 235-240.
Raney, K. D., Sharma, S. D., Moustafa, I. M. & Cameron, C. E. (2010). Hepatitis C virus
non-structural protein 3 (HCV NS3): a multifunctional antiviral target. J Biol Chem
285, 22725-22731.
Ray, R. B. & Ray, R. (2001). Hepatitis C virus core protein: intriguing properties and
functional relevance. FEMS Microbiol Lett 202, 149-156.
Reddy, J. K. & Rao, M. S. (2006). Lipid metabolism and liver inflammation. II. Fatty liver
disease and fatty acid oxidation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290, G852-
858.
Rice, C. (2011). Perspective: Miles to go before we sleep. Nature 474, S8.
193
Robenek, H. (2005). Lipid Droplets Gain PAT Family Proteins by Interaction with
Specialized Plasma Membrane Domains. Journal of Biological Chemistry 280, 26330-
26338.
Robenek, H., Hofnagel, O., Buers, I., Robenek, M. J., Troyer, D. & Severs, N. J. (2006).
Adipophilin-enriched domains in the ER membrane are sites of lipid droplet
biogenesis. Journal of cell science 119, 4215.
Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Robenek, M. J., Troyer, D. & Severs, N. J. (2009).
Compartmentalization of proteins in lipid droplet biogenesis. Biochim Biophys Acta
1791, 408-418.
Robenek, H., Buers, I., Robenek, M. J., Hofnagel, O., Ruebel, A., Troyer, D. & Severs,
N. J. (2011). Topography of lipid droplet-associated proteins: insights from freeze-
fracture replica immunogold labeling. J Lipids 2011, 409371.
Robenek, M. J., Severs, N. J., Schlattmann, K., Plenz, G., Zimmer, K.-P., Troyer, D. &
Robenek, H. (2004). Lipids partition caveolin-1 from ER membranes into lipid
droplets: updating the model of lipid droplet biogenesis. FASEB J 18, 866-868.
Roccasecca, R., Ansuini, H., Vitelli, A., Meola, A., Scarselli, E., Acali, S., Pezzanera, M.,
Ercole, B. B., McKeating, J., & other authors. (2003). Binding of the hepatitis C
virus E2 glycoprotein to CD81 is strain specific and is modulated by a complex
interplay between hypervariable regions 1 and 2. J Virol 77, 1856-1867.
Roingeard, P. & Hourioux, C. (2008). Hepatitis C virus core protein, lipid droplets and
steatosis. J Viral Hepat 15, 157-164.
Roingeard, P. & Depla, M. (2011). The birth and life of lipid droplets: learning from the
hepatitis C virus. Biol Cell 103, 223-231.
Roingeard, P., Hourioux, C., Blanchard, E., Brand, D. & Ait-Goughoulte, M. (2004).
Hepatitis C virus ultrastructure and morphogenesis. Biol Cell 96, 103-108.
Romero-Gómez, M. (2006). Insulin resistance and hepatitis C. World J Gastroenterol 12,
7075-7080.
Romero-Gómez, M., Del Mar Viloria, M., Andrade, R. J., Salmerón, J., Diago, M.,
Fernández-Rodríguez, C. M., Corpas, R., Cruz, M., Grande, L., & other authors.
(2005). Insulin resistance impairs sustained response rate to peginterferon plus
ribavirin in chronic hepatitis C patients. Gastroenterology 128, 636-641.
Romero-Gómez, M., Fernández-Rodríguez, C. M., Andrade, R. J., Diago, M., Alonso, S.,
Planas, R., Solá, R., Pons, J. A., Salmerón, J., & other authors. (2008). Effect of
194
sustained virological response to treatment on the incidence of abnormal glucose
values in chronic hepatitis C. J Hepatol 48, 721-727.
Roudot-Thoraval, F. (2002). [Modifications of epidemiological characteristics of hepatitis
C]. Gastroenterol Clin Biol 26 Spec No 2, B138-143.
Rubbia-Brandt, L. (2004). Steatosis affects chronic hepatitis C progression in a genotype
specific way. Gut 53, 406-412.
Rubbia-Brandt, L., Leandro, G., Spahr, L., Giostra, E., Quadri, R., Malé, P. J. & Negro,
F. (2001). Liver steatosis in chronic hepatitis C: a morphological sign suggesting
infection with HCV genotype 3. Histopathology 39, 119-124.
Rubbia-Brandt, L., Quadri, R., Abid, K., Giostra, E., Malé, P. J., Mentha, G., Spahr, L.,
Zarski, J. P., Borisch, B., & other authors. (2000). Hepatocyte steatosis is a
cytopathic effect of hepatitis C virus genotype 3. Journal of hepatology 33, 106–115.
Ryan, M. C., Desmond, P. V., Slavin, J. L. & Congiu, M. (2011). Expression of genes
involved in lipogenesis is not increased in patients with HCV genotype 3 in human
liver. J Viral Hepat 18, 53-60.
S
Sabile, A., Perlemuter, G., Bono, F., Kohara, K., Demaugre, F., Kohara, M., Matsuura,
Y., Miyamura, T., Bréchot, C. & Barba, G. (1999). Hepatitis C virus core protein
binds to apolipoprotein AII and its secretion is modulated by fibrates. Hepatology 30,
1064-1076.
Saitou, M., Ando-Akatsuka, Y., Itoh, M., Furuse, M., Inazawa, J., Fujimoto, K. &
Tsukita, S. (1997). Mammalian occludin in epithelial cells: its expression and
subcellular distribution. Eur J Cell Biol 73, 222-231.
Sakai, A., Claire, M. S., Faulk, K., Govindarajan, S., Emerson, S. U., Purcell, R. H. &
Bukh, J. (2003). The p7 polypeptide of hepatitis C virus is critical for infectivity and
contains functionally important genotype-specific sequences. Proc Natl Acad Sci U S
A 100, 11646-11651.
Samsa, M. M., Mondotte, J. A., Iglesias, N. G., Assunção-Miranda, I., Barbosa-Lima, G.,
Da Poian, A. T., Bozza, P. T. & Gamarnik, A. V. (2009). Dengue Virus Capsid
Protein Usurps Lipid Droplets for Viral Particle Formation. PLoS Pathog 5,
e1000632(M. S. Diamond, Ed.).
Samuel, V. T., Liu, Z.-X., Wang, A., Beddow, S. A., Geisler, J. G., Kahn, M., Zhang, X.-
man, Monia, B. P., Bhanot, S. & Shulman, G. I. (2007). Inhibition of protein kinase
195
Cepsilon prevents hepatic insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. J Clin
Invest 117, 739-745.
Sandrin, L., Fourquet, B., Hasquenoph, J.-M., Yon, S., Fournier, C., Mal, F., Christidis,
C., Ziol, M., Poulet, B., & other authors. (2003). Transient elastography: a new
noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound Med Biol 29, 1705-
1713.
Sandrin, V., Boulanger, P., Penin, F., Granier, C., Cosset, F.-L. & Bartosch, B. (2005).
Assembly of functional hepatitis C virus glycoproteins on infectious pseudoparticles
occurs intracellularly and requires concomitant incorporation of E1 and E2
glycoproteins. J Gen Virol 86, 3189-3199.
Santolini, E., Migliaccio, G. & La Monica, N. (1994). Biosynthesis and biochemical
properties of the hepatitis C virus core protein. Journal of virology 68, 3631.
Sanyal, A. J., Campbell-Sargent, C., Mirshahi, F., Rizzo, W. B., Contos, M. J., Sterling,
R. K., Luketic, V. A., Shiffman, M. L. & Clore, J. N. (2001). Nonalcoholic
steatohepatitis: association of insulin resistance and mitochondrial abnormalities.
Gastroenterology 120, 1183-1192.
Saunier, B., Triyatni, M., Ulianich, L., Maruvada, P., Yen, P. & Kohn, L. D. (2003). Role
of the asialoglycoprotein receptor in binding and entry of hepatitis C virus structural
proteins in cultured human hepatocytes. J Virol 77, 546-559.
Schlauder, G. G., Pilot-Matias, T. J., Gabriel, G. S., Simons, J. N., Muerhoff, A. S.,
Dawson, G. J. & Mushahwar, I. K. (1995). Origin of GB-hepatitis viruses. Lancet
346, 447-448.
Schoonjans, K., Peinado-Onsurbe, J., Lefebvre, A. M., Heyman, R. A., Briggs, M., Deeb,
S., Staels, B. & Auwerx, J. (1996). PPARalpha and PPARgamma activators direct a
distinct tissue-specific transcriptional response via a PPRE in the lipoprotein lipase
gene. EMBO J 15, 5336-5348.
Schwer, B., Ren, S., Pietschmann, T., Kartenbeck, J., Kaehlcke, K., Bartenschlager, R.,
Yen, T. S. B. & Ott, M. (2004). Targeting of hepatitis C virus core protein to
mitochondria through a novel C-terminal localization motif. J Virol 78, 7958-7968.
Serfaty, L., Andreani, T., Giral, P., Carbonell, N., Chazouillères, O. & Poupon, R.
(2001). Hepatitis C virus induced hypobetalipoproteinemia: a possible mechanism for
steatosis in chronic hepatitis C. Journal of hepatology 34, 428–434.
Shavinskaya, A., Boulant, S., Penin, F., McLauchlan, J. & Bartenschlager, R. (2007).
The Lipid Droplet Binding Domain of Hepatitis C Virus Core Protein Is a Major
196
Determinant for Efficient Virus Assembly. Journal of Biological Chemistry 282,
37158-37169.
Shelness, G. S. & Sellers, J. A. (2001). Very-low-density lipoprotein assembly and secretion.
Curr Opin Lipidol 12, 151-157.
Shepard, C. W., Finelli, L. & Alter, M. J. (2005). Global epidemiology of hepatitis C virus
infection. Lancet Infect Dis 5, 558-567.
Shimakami, T., Hijikata, M., Luo, H., Ma, Y. Y., Kaneko, S., Shimotohno, K. &
Murakami, S. (2004). Effect of interaction between hepatitis C virus NS5A and
NS5B on hepatitis C virus RNA replication with the hepatitis C virus replicon. J Virol
78, 2738-2748.
Shimano, H., Horton, J. D., Shimomura, I., Hammer, R. E., Brown, M. S. & Goldstein,
J. L. (1997). Isoform 1c of sterol regulatory element binding protein is less active than
isoform 1a in livers of transgenic mice and in cultured cells. J Clin Invest 99, 846-854.
Shimano, H. (2009). SREBPs: physiology and pathophysiology of the SREBP family. FEBS
J 276, 616-621.
Shimomura, I., Bashmakov, Y. & Horton, J. D. (1999). Increased levels of nuclear
SREBP-1c associated with fatty livers in two mouse models of diabetes mellitus. J
Biol Chem 274, 30028-30032.
Shintani, Y., Fujie, H., Miyoshi, H., Tsutsumi, T., Tsukamoto, K., Kimura, S., Moriya,
K. & Koike, K. (2004). Hepatitis C virus infection and diabetes: direct involvement
of the virus in the development of insulin resistance. Gastroenterology 126, 840-848.
Shirota, Y., Luo, H., Qin, W., Kaneko, S., Yamashita, T., Kobayashi, K. & Murakami, S.
(2002). Hepatitis C virus (HCV) NS5A binds RNA-dependent RNA polymerase
(RdRP) NS5B and modulates RNA-dependent RNA polymerase activity. J Biol Chem
277, 11149-11155.
Shi, S. T., Polyak, S. J., Tu, H., Taylor, D. R., Gretch, D. R. & Lai, M. M. C. (2002).
Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and
interacts with apolipoproteins. Virology 292, 198-210.
Siagris, D., Christofidou, M., Theocharis, G. J., Pagoni, N., Papadimitriou, C., Lekkou,
A., Thomopoulos, K., Starakis, I., Tsamandas, A. C. & Labropoulou-Karatza, C.
(2006). Serum lipid pattern in chronic hepatitis C: histological and virological
correlations. J Viral Hepat 13, 56-61.
Siagris, D., Kouraklis-Symeonidis, A., Christofidou, M., Lekkou, A., Papadimitriou, C.,
Arvaniti, V., Thomopoulos, K., Tsamandas, A., Zoumbos, N. & Labropoulou-
197
Karatza, C. (2005). Serum lipid profile and hepatic steatosis of adult beta-
thalassaemia patients with chronic HCV infection. Eur J Gastroenterol Hepatol 17,
345-350.
Simmonds, P. (2004). Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus--15 years on. J
Gen Virol 85, 3173-3188.
Simmonds, P., Bukh, J., Combet, C., Deléage, G., Enomoto, N., Feinstone, S., Halfon, P.,
Inchauspé, G., Kuiken, C., & other authors. (2005). Consensus proposals for a
unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology 42, 962-
973.
Söllner, T. H. (2007). Lipid droplets highjack SNAREs. Nat Cell Biol 9, 1219-1220.
Song, Y., Friebe, P., Tzima, E., Jünemann, C., Bartenschlager, R. & Niepmann, M.
(2006). The hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region strongly enhances
translation directed by the internal ribosome entry site. J Virol 80, 11579-11588.
Sookoian, S. & Pirola, C. J. (2011). Meta-analysis of the influence of I148M variant of
patatin-like phospholipase domain containing 3 gene (PNPLA3) on the susceptibility
and histological severity of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 53, 1883-
1894.
Sookoian, S., Castaño, G. O., Burgueño, A. L., Gianotti, T. F., Rosselli, M. S. & Pirola,
C. J. (2009). A nonsynonymous gene variant in the adiponutrin gene is associated
with nonalcoholic fatty liver disease severity. J Lipid Res 50, 2111-2116.
Spångberg, K., Wiklund, L. & Schwartz, S. (2001). Binding of the La autoantigen to the
hepatitis C virus 3’ untranslated region protects the RNA from rapid degradation in
vitro. J Gen Virol 82, 113-120.
Stapleford, K. A. & Lindenbach, B. D. (2010). Hepatitis C Virus NS2 Coordinates Virus
Particle Assembly through Physical Interactions with the E1-E2 Glycoprotein and
NS3-NS4A Enzyme Complexes. Journal of Virology 85, 1706-1717.
Stapleton, J. T., Foung, S., Muerhoff, A. S., Bukh, J. & Simmonds, P. (2010). The GB
viruses: a review and proposed classification of GBV-A, GBV-C (HGV), and GBV-D
in genus Pegivirus within the family Flaviviridae. Journal of General Virology 92,
233-246.
Steinmann, E., Penin, F., Kallis, S., Patel, A. H., Bartenschlager, R. & Pietschmann, T.
(2007). Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious
virions. PLoS Pathog 3, e103.
198
Stoeckman, A. K. & Towle, H. C. (2002). The role of SREBP-1c in nutritional regulation of
lipogenic enzyme gene expression. J Biol Chem 277, 27029-27035.
Straub, B. K., Stoeffel, P., Heid, H., Zimbelmann, R. & Schirmacher, P. (2008).
Differential pattern of lipid droplet-associated proteins and de novo perilipin
expression in hepatocyte steatogenesis. Hepatology 47, 1936-1946.
Su, A. I., Pezacki, J. P., Wodicka, L., Brideau, A. D., Supekova, L., Thimme, R.,
Wieland, S., Bukh, J., Purcell, R. H., & other authors. (2002). Genomic analysis of
the host response to hepatitis C virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 15669-
15674.
Szymanski, K. M., Binns, D., Bartz, R., Grishin, N. V., Li, W.-P., Agarwal, A. K., Garg,
A., Anderson, R. G. W. & Goodman, J. M. (2007). The lipodystrophy protein seipin
is found at endoplasmic reticulum lipid droplet junctions and is important for droplet
morphology. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 20890-20895.
T
Tai, C. L., Chi, W. K., Chen, D. S. & Hwang, L. H. (1996). The helicase activity associated
with hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3). J Virol 70, 8477-8484.
Tanaka, N., Moriya, K., Kiyosawa, K., Koike, K., Gonzalez, F. J. & Aoyama, T. (2008).
PPARalpha activation is essential for HCV core protein-induced hepatic steatosis and
hepatocellular carcinoma in mice. J Clin Invest 118, 683-694.
Targett-Adams, P. (2003). Live Cell Analysis and Targeting of the Lipid Droplet-binding
Adipocyte Differentiation-related Protein. Journal of Biological Chemistry 278,
15998-16007.
Targett-Adams, P., Boulant, S. & McLauchlan, J. (2007). Visualization of Double-
Stranded RNA in Cells Supporting Hepatitis C Virus RNA Replication. Journal of
Virology 82, 2182-2195.
Targett-Adams, P., Hope, G., Boulant, S. & McLauchlan, J. (2008). Maturation of
Hepatitis C Virus Core Protein by Signal Peptide Peptidase Is Required for Virus
Production. Journal of Biological Chemistry 283, 16850-16859.
Targett-Adams, P., Graham, E. J. S., Middleton, J., Palmer, A., Shaw, S. M., Lavender,
H., Brain, P., Tran, T. D., Jones, L. H., & other authors. (2011). Small Molecules
Targeting Hepatitis C Virus-Encoded NS5A Cause Subcellular Redistribution of their
Target: Insights into Compound Mode of Action. Journal of Virology.
199
Targett-Adams, P., Schaller, T., Hope, G., Lanford, R. E., Lemon, S. M., Martin, A. &
McLauchlan, J. (2006). Signal peptide peptidase cleavage of GB virus B core protein
is required for productive infection in vivo. J Biol Chem 281, 29221-29227.
Tauchi-Sato, K. (2002). The Surface of Lipid Droplets Is a Phospholipid Monolayer with a
Unique Fatty Acid Composition. Journal of Biological Chemistry 277, 44507-44512.
Tellinghuisen, T. L., Foss, K. L., Treadaway, J. C. & Rice, C. M. (2007). Identification of
Residues Required for RNA Replication in Domains II and III of the Hepatitis C Virus
NS5A Protein. Journal of Virology 82, 1073-1083.
Tellinghuisen, T. L., Marcotrigiano, J. & Rice, C. M. (2005). Structure of the zinc-binding
domain of an essential component of the hepatitis C virus replicase. Nature 435, 374-
379.
Tellinghuisen, T. L., Foss, K. L. & Treadaway, J. (2008). Regulation of Hepatitis C Virion
Production via Phosphorylation of the NS5A Protein. PLoS Pathogens 4, e1000032(A.
Garcia-Sastre, Ed.).
Thiele, C. & Spandl, J. (2008). Cell biology of lipid droplets. Current Opinion in Cell
Biology 20, 378-385.
Thomas, E., Feld, J. J., Li, Q., Hu, Z., Fried, M. W. & Liang, T. J. (2010). Ribavirin
potentiates interferon action by augmenting interferon-stimulated gene induction in
hepatitis C virus cell culture models. Hepatology.
Thomssen, R., Bonk, S. & Thiele, A. (1993). Density heterogeneities of hepatitis C virus in
human sera due to the binding of beta-lipoproteins and immunoglobulins. Med
Microbiol Immunol 182, 329-334.
Trinchet, J. C. & Beaugrand, M. (1999). [Increased incidence of hepatocellular carcinoma
in western countries: the reasons and the consequences]. Gastroenterol Clin Biol 23,
1286-1288.
Tsao, M.-L., Chao, C.-H. & Yeh, C.-T. (2006). Interaction of hepatitis C virus F protein
with prefoldin 2 perturbs tubulin cytoskeleton organization. Biochem Biophys Res
Commun 348, 271-277.
Tscherne, D. M., Jones, C. T., Evans, M. J., Lindenbach, B. D., McKeating, J. A. & Rice,
C. M. (2006). Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for
low-pH-triggered entry. J Virol 80, 1734-1741.
Tsutsumi, T., Suzuki, T., Shimoike, T., Suzuki, R., Moriya, K., Shintani, Y., Fujie, H.,
Matsuura, Y., Koike, K. & Miyamura, T. (2002). Interaction of hepatitis C virus
200
core protein with retinoid X receptor alpha modulates its transcriptional activity.
Hepatology 35, 937-946.
U
Umlauf, E. (2004). Association of Stomatin with Lipid Bodies. Journal of Biological
Chemistry 279, 23699-23709.
V
Valenti, L., Pulixi, E., Fracanzani, A. L., Dongiovanni, P., Maggioni, M., Orsatti, A.,
Gianni, C. & Fargion, S. (2005). TNFalpha genotype affects TNFalpha release,
insulin sensitivity and the severity of liver disease in HCV chronic hepatitis. J Hepatol
43, 944-950.
Vaquer, P., Canet, R., Llompart, A., Riera, J., Obrador, A. & Gayá, J. (1994).
Histological evolution of chronic hepatitis C. Factors related to progression. Liver 14,
265-269.
Vassilaki, N., Friebe, P., Meuleman, P., Kallis, S., Kaul, A., Paranhos-Baccalà, G.,
Leroux-Roels, G., Mavromara, P. & Bartenschlager, R. (2008). Role of the
hepatitis C virus core+1 open reading frame and core cis-acting RNA elements in viral
RNA translation and replication. J Virol 82, 11503-11515.
W
Wakita, T., Pietschmann, T., Kato, T., Date, T., Miyamoto, M., Zhao, Z., Murthy, K.,
Habermann, A., Kräusslich, H.-G., & other authors. (2005). Production of
infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med 11,
791-796.
Walewski, J. L., Keller, T. R., Stump, D. D. & Branch, A. D. (2001). Evidence for a new
hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame. RNA 7, 710-721.
Wang, A.-G., Lee, D.-S., Moon, H.-B., Kim, J.-M., Cho, K.-H., Choi, S.-H., Ha, H.-L.,
Han, Y.-H., Kim, D.-G., & other authors. (2009). Non-structural 5A protein of
hepatitis C virus induces a range of liver pathology in transgenic mice. J Pathol 219,
253-262.
Wang, C.-S., Wang, S.-T., Yao, W.-J., Chang, T.-T. & Chou, P. (2007). Hepatitis C virus
infection and the development of type 2 diabetes in a community-based longitudinal
study. Am J Epidemiol 166, 196-203.
201
Wan, H.-C., Melo, R. C. N., Jin, Z., Dvorak, A. M. & Weller, P. F. (2007). Roles and
origins of leukocyte lipid bodies: proteomic and ultrastructural studies. FASEB J 21,
167-178.
Waris, G., Felmlee, D. J., Negro, F. & Siddiqui, A. (2007). Hepatitis C Virus Induces
Proteolytic Cleavage of Sterol Regulatory Element Binding Proteins and Stimulates
Their Phosphorylation via Oxidative Stress. Journal of Virology 81, 8122-8130.
Watashi, K., Ishii, N., Hijikata, M., Inoue, D., Murata, T., Miyanari, Y. & Shimotohno,
K. (2005). Cyclophilin B is a functional regulator of hepatitis C virus RNA
polymerase. Mol Cell 19, 111-122.
Watkins, W. J., Ray, A. S. & Chong, L. S. (2010). HCV NS5B polymerase inhibitors. Curr
Opin Drug Discov Devel 13, 441-465.
Weihofen, A., Binns, K., Lemberg, M. K., Ashman, K. & Martoglio, B. (2002).
Identification of signal peptide peptidase, a presenilin-type aspartic protease. Science
296, 2215-2218.
Welbourn, S., Green, R., Gamache, I., Dandache, S., Lohmann, V., Bartenschlager, R.,
Meerovitch, K. & Pause, A. (2005). Hepatitis C virus NS2/3 processing is required
for NS3 stability and viral RNA replication. J Biol Chem 280, 29604-29611.
Westin, J., Nordlinder, H., Lagging, M., Norkrans, G. & Wejstål, R. (2002). Steatosis
accelerates fibrosis development over time in hepatitis C virus genotype 3 infected
patients. J Hepatol 37, 837-842.
Wolins, N. E., Rubin, B. & Brasaemle, D. L. (2001). TIP47 associates with lipid droplets. J
Biol Chem 276, 5101-5108.
Wolins, N. E., Skinner, J. R., Schoenfish, M. J., Tzekov, A., Bensch, K. G. & Bickel, P. E.
(2003). Adipocyte protein S3-12 coats nascent lipid droplets. J Biol Chem 278, 37713-
37721.
Wolins, N. E., Brasaemle, D. L. & Bickel, P. E. (2006). A proposed model of fat packaging
by exchangeable lipid droplet proteins. FEBS Lett 580, 5484-5491.
Wölk, B., Sansonno, D., Kräusslich, H. G., Dammacco, F., Rice, C. M., Blum, H. E. &
Moradpour, D. (2000). Subcellular localization, stability, and trans-cleavage
competence of the hepatitis C virus NS3-NS4A complex expressed in tetracycline-
regulated cell lines. J Virol 74, 2293-2304.
Wozniak, M. A., Itzhaki, R. F., Faragher, E. B., James, M. W., Ryder, S. D. & Irving, W.
L. (2002). Apolipoprotein E-epsilon 4 protects against severe liver disease caused by
hepatitis C virus. Hepatology 36, 456-463.
202
Wu, J.-M., Skill, N. J. & Maluccio, M. A. (2010). Evidence of aberrant lipid metabolism in
hepatitis C and hepatocellular carcinoma. HPB (Oxford) 12, 625-636.
X
Xie, Z. C., Riezu-Boj, J. I., Lasarte, J. J., Guillen, J., Su, J. H., Civeira, M. P. & Prieto, J.
(1998). Transmission of hepatitis C virus infection to tree shrews. Virology 244, 513-
520.
Xu, Z., Choi, J., Yen, T. S., Lu, W., Strohecker, A., Govindarajan, S., Chien, D., Selby,
M. J. & Ou, J. (2001). Synthesis of a novel hepatitis C virus protein by ribosomal
frameshift. EMBO J 20, 3840-3848.
Y
Yamaguchi, A., Tazuma, S., Nishioka, T., Ohishi, W., Hyogo, H., Nomura, S. &
Chayama, K. (2005). Hepatitis C virus core protein modulates fatty acid metabolism
and thereby causes lipid accumulation in the liver. Dig Dis Sci 50, 1361-1371.
Yamashita, H., Takenoshita, M., Sakurai, M., Bruick, R. K., Henzel, W. J., Shillinglaw,
W., Arnot, D. & Uyeda, K. (2001). A glucose-responsive transcription factor that
regulates carbohydrate metabolism in the liver. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9116-
9121.
Yang, W., Hood, B. L., Chadwick, S. L., Liu, S., Watkins, S. C., Luo, G., Conrads, T. P.
& Wang, T. (2008). Fatty acid synthase is up-regulated during hepatitis C virus
infection and regulates hepatitis C virus entry and production. Hepatology 48, 1396-
1403.
Yang, X.-J., Liu, J., Ye, L., Liao, Q.-J., Wu, J.-G., Gao, J.-R., She, Y.-L., Wu, Z.-H. &
Ye, L.-B. (2006). HCV NS2 protein inhibits cell proliferation and induces cell cycle
arrest in the S-phase in mammalian cells through down-regulation of cyclin A
expression. Virus Res 121, 134-143.
Yasui, K., Wakita, T., Tsukiyama-Kohara, K., Funahashi, S. I., Ichikawa, M., Kajita, T.,
Moradpour, D., Wands, J. R. & Kohara, M. (1998). The native form and
maturation process of hepatitis C virus core protein. J Virol 72, 6048-6055.
Yen, C.-L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C. & Farese, R. V., Jr. (2008). Thematic
review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. J Lipid
Res 49, 2283-2301.
203
Yi, M. & Lemon, S. M. (2003). 3’ nontranslated RNA signals required for replication of
hepatitis C virus RNA. J Virol 77, 3557-3568.
Yi, M., Villanueva, R. A., Thomas, D. L., Wakita, T. & Lemon, S. M. (2006). Production
of infectious genotype 1a hepatitis C virus (Hutchinson strain) in cultured human
hepatoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2310-2315.
Yi, M., Ma, Y., Yates, J. & Lemon, S. M. (2007). Compensatory mutations in E1, p7, NS2,
and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C
virus. J Virol 81, 629-638.
Yi, M., Ma, Y., Yates, J. & Lemon, S. M. (2009). trans-Complementation of an NS2 Defect
in a Late Step in Hepatitis C Virus (HCV) Particle Assembly and Maturation. PLoS
Pathog 5, e1000403(K. Kirkegaard, Ed.).
Yoneda, M., Saito, S., Ikeda, T., Fujita, K., Mawatari, H., Kirikoshi, H., Inamori, M.,
Nozaki, Y., Akiyama, T., & other authors. (2007). Hepatitis C virus directly
associates with insulin resistance independent of the visceral fat area in nonobese and
nondiabetic patients. J Viral Hepat 14, 600-607.
You, S. & Rice, C. M. (2008). 3’ RNA elements in hepatitis C virus replication: kissing
partners and long poly(U). J Virol 82, 184-195.
Yu, C. I. & Chiang, B.-L. (2010). A new insight into hepatitis C vaccine development. J
Biomed Biotechnol 2010, 548280.
Yu, G.-Y., Lee, K.-J., Gao, L. & Lai, M. M. C. (2006). Palmitoylation and polymerization
of hepatitis C virus NS4B protein. J Virol 80, 6013-6023.
Z
Zampino, R., Ingrosso, D., Durante-Mangoni, E., Capasso, R., Tripodi, M.-F., Restivo,
L., Zappia, V., Ruggiero, G. & Adinolfi, L. E. (2008). Microsomal triglyceride
transfer protein (MTP) -493G/T gene polymorphism contributes to fat liver
accumulation in HCV genotype 3 infected patients. J Viral Hepat 15, 740-746.
Zehmer, J. K., Bartz, R., Bisel, B., Liu, P., Seemann, J. & Anderson, R. G. W. (2009).
Targeting sequences of UBXD8 and AAM-B reveal that the ER has a direct role in the
emergence and regression of lipid droplets. J Cell Sci 122, 3694-3702.
Zhang, Y.-L., Hernandez-Ono, A., Siri, P., Weisberg, S., Conlon, D., Graham, M. J.,
Crooke, R. M., Huang, L.-S. & Ginsberg, H. N. (2006). Aberrant hepatic expression
of PPARgamma2 stimulates hepatic lipogenesis in a mouse model of obesity, insulin
resistance, dyslipidemia, and hepatic steatosis. J Biol Chem 281, 37603-37615.
204
Zhong, J., Gastaminza, P., Cheng, G., Kapadia, S., Kato, T., Burton, D. R., Wieland, S.
F., Uprichard, S. L., Wakita, T. & Chisari, F. V. (2005). Robust hepatitis C virus
infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9294-9299.
Marion DEPLA MODÉLISATION IN VITRO ET ÉTUDE
BIOCLINIQUE DE LA STÉATOSE INDUITE PAR LE VIRUS DE
L’HÉPATITE C
Résumé
Les résultats fondamentaux et biocliniques que nous présentons au travers de cette thèse
illustrent la difficulté d’évaluer la part liée au virus et celle liée à des facteurs de l’hôte dans
l’induction d’une stéatose hépatique chez les patients chroniquement infectés par le HCV. Les
données in vitro suggèrent que le virus joue un rôle direct dans l’induction d’une stéatose,
notamment par les propriétés de sa protéine de capside, et que la variabilité du virus peut
avoir un impact sur l’intensité de cette stéatose. Notre étude bioclinique suggère que la
variabilité du virus semble avoir un rôle beaucoup plus modéré in vivo. Ainsi, chez les
patients chroniquement infectés par le HCV, les facteurs de l’hôte joueraient un rôle majeur
pour moduler le dégré de la stéatose associée au virus et de prochaines études seront
nécessaires pour établir la nature de ces facteurs.
Mots clés : Virus de l’hépatite C, stéatose, gouttelettes lipidiques
Abstract
The results presented in this thesis illustrate the difficulty of assessing the part related to the
virus and that related to host factors in the induction of hepatic steatosis in patients
chronically infected with HCV. In vitro data suggest that the virus plays a direct role in the
induction of steatosis, due to the properties of its capsid protein, and that the variability of the
virus can affect the intensity of the steatosis. Our bio-clinical study suggests that this
variability seems to have a much more moderate impact in vivo. Thus, in patients chronically
infected with HCV, host factors seem to play a major role to modulate the degree of steatosis
associated with the virus. Further studies are needed to establish the nature of these factors.
Keywords : Hepatitis C virus, steatosis, lipid droplets
Recommended