Tumeur Cellule tumorale Sang/Moelle ADNARNPROTEINE Temps Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse...

tumeur

Cellule tumorale

Sang/Moelle

ADN ARN PROTEINE

Temps

MarqueurDiagnosticPronostic Réponse

traitement

Suivi

Rechute

APL: Différenciation in vitro

Cytologie

Test NBT

Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM

Bon RépondeurMauvais Répondeur

days

P(s

urvi

val)

0 500 1000 1500 2000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Diff<50%

Diff > 50%

P= 0.10

days

P(r

elap

se f

ree)

0 500 1000 1500 2000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Diff<50%

Diff > 50%

P= 0.04

days

P(e

vent

fre

e)

0 500 1000 1500 2000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Diff<50%

Diff > 50%

P= 0.01

APL 93: Différenciation in vitrofacteur de pronostic indépendant

N= 77

Event-free survival Relapse-free survival

Overall Survival

Diagnostic Maladie Résiduelle Rechute

PCR +++ + _ _ + +++

Applications de la PCR

Translocations des APL

PML-RAR

PLZF-RAR

NuMA-RAR

NPM-RAR

STAT5b-RAR

t(15;17)insertions

t(11;17) (q23;q21)

t(11;17) (q13;q21)

t(5;17)

der(17)

> 95%

1%

1 cas

< 1%

1 cas

RT-PCR

RT-PCR

?

?

?

Exons 3 4 5 6 7a 3 4

Bcr3 Bcr1Bcr2

PMLchromosome 15

RARchromosome

Translocations t(15;17)

Bcr1 : 60%

Bcr2 : 10%

Bcr3 : 30%

RAR-PML exprimé chez seulement 75% des patients

Protocole de RT-PCR Nichée

2072

600

100

bpBcr3 bcr2 bcr1 MW

2072

600

100

bp bcr3 bcr2 bcr1 MW

PML RAR

exon 3bcr 1bcr 2bcr 3exon 3

O7 O8

RARPML

R5M7

RARPML

Points de Cassure t(15,17)

PCR N°1

PCR N°2

Sensibilité: 10-5 à 10-6

Diagnostic et MRD Typage

O1M7

RARPML

p= 0.06

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

months

bcr2, bcr3bcr1

Event-free survival

p= 0.05

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

months

bcr2, bcr3bcr1

Time to relapse after remission

Pronostic selon le typage Bcr

p= 0.05

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

months

bcr2, bcr3bcr1

Overall survival

N= 110

RT-PCR standard après le diagnostic (APL93)

Nombre de prélèvements % de prélèvements

4 - 6 mois après diagnostic N = 84

010203040506070

Positif (%) Négatif (%)

Bcr1Bcr2+3

12 mois après diagnostic N = 65

0

10

20

30

40

50

Positif (%) Négatif (%)

Bcr1Bcr2+3

Nombre de prélèvements % de prélèvements

P= 0.61

0

10

20

30

40

50

Positif Négatif

total

Bcr1

Bcr2+3

0

10

20

30

40

50

Positif Négatif

total

Bcr1

Bcr2+3

0

5

10

15

20

<50% >50%

PCR positive

PCR négative

0%

20%

40%

60%

80%

<50% >50%

PCR positive

PCR négative

PCR standard après 4 - 6 mois (APL93) et Différenciation in vitro au diagnostic

% de cellules différenciées à J3 de culture % de cellules différenciées à J3 de culture

N= 37

Nombre de Patients % de Patients

P= 0.038

0

5

10

15

20

25

30

35

PCRPositive

PCRNégative

rechute +

rechute -

0

20

40

60

80

100

Positif Négatif

rechute + (%)

rechute - (%)

PCR standard après 4 - 6 mois (APL93)et Risque de Rechute

Nombre de Patients % de Patients

N= 84

P= 0.010

Valeur Prédictive Négative= 82.5 %

Approches par RT-PCR standard

Sensibilité importante (10-6)

- 50% des patients positifs après consolidation

- 80% des patients négatifs post-conso ne vont pas rechuter

- incapacité à prédire le pronostic des patients encore positifs

- positivité de patients en rémission à long terme

Sensibilité médiocre (10-4)

- < 10% des patients sont positifs après consolidation : mauvais pronostic

- incapacité à prédire le pronostic des patients négatifs:

30% des rechutes sont précédées d ’une PCR négative

- forte probabilité (70%) de rechute des patients se repositivant

- essai de traitement de la rechute moléculaire : allo BMT

RT-PCR Quantitative en temps réel

PCR quantitative en temps réel

Idée: suivre l ’apparition des produits de PCR au fur et à mesure de leur formation

et non plus en point final

But: détecter le point de démarrage de la partie exponentielle de la réaction

qui est proportionnelle à la quantité initiale de matériel

Moyen: générer un signal fluorescent proportionnel à la quantité de matériel

et suivre la fluorescence au cours de la réaction

Agents Intercalants

3’ 5’5’ 3’

5’

3’

Amorce sens

Amorceantisens

R Q

3’

3’

3’ 5’5’ 3’

5’

Q

3’

R

3’

3’ 5’5’ 3’

5’

Q3’

3’

3’ 5’5’ 3’

5’

Q3’

Polymérisation

Déplacement du brin

Clivage

Fin de la polymérisation

R

R

R = ReporterQ = Quencher

Sonde Taqman

Source laser

Spectrographe

Lentille

Lentille

Miroir dichroïque

Fibres optiques

Plaque96 puits

Multiplexer

REPRESENTATION DU SYSTEME DE DETECTIONDE LA FLUORESCENCE (Abi Prism 7700)

Accumulation des produits de PCR

Seuil

Cycle Seuil = Ct

Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

Ct des différentes dilutions

Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

Temps

MarqueurDiagnosticPronostic Réponse

traitement

Suivi

Rechutes

DiagnosticMaladie Résiduelle Rechute

PCRStandard +++ + _ _ + +++

PCRQuantitative

Sonde

Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel

1 2 3 4 5 6

RARPML

Sonde

1 2 3 4 5 6

Bcr1

Bcr2

Sonde

1 2 3

RARPML

Bcr3

Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene

RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003

Comparaison Moelle - Sang

DFS, %

Cutoff Relapses / Patients P value 1 y 2y 3y

> 10-5 6/9 56 44 33

< 10-5 16/44

0.008

86 72 65

> 10-7 / 10-8 8/13 0.074 62 54 46

<10-7 / 10-8 14/40 88 72 63

>10-10 11/21 0.244 67 62 52

negative 11/32 91 70 64

RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003

Risque de rechute et DFS selon cutoff de positivité après consolidation

Indétectable

10

102

103

104

105

106

107

Diagnostic 1 mois

RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois

N= 25

No

mb

re d

e c

op

ies

au

dia

gn

ost

ic

1 mois après le Diagnostic N= 15

0

2

4

6

8

10

12

<50% >50%

Positif

Négatif

No

mb

re d

e p

atie

nts

% de cellules différenciées à J3 de culture

p=0.022

RQ-PCR: Positivité et Différenciation au diagnostic

Corrélation entre différenciation au diagnostic et positivité

en RQ-PCR à 1 mois

Indétectable

Mois

Rechute

10

102

103

104

105

106

Suivi par RQ-PCR: Exemple de résultat N

om

bre

de

Co

pie

s N

orm

alis

é

Conclusion

Méthode de choix: RQ-PCR- quantifier la qualité des échantillons- suivi cinétique de la réponse au traitement- suivi cinétique d ’une re-positivation- évaluer des seuils

Objectifs : - établir un schéma précis des temps de prélèvements- Sang ou moelle ?- établir des seuils prédictifs de l ’évolution des patients

* seuil après traitement : Induction? Consolidation?* seuil de re-positivation* seuil de positivité d ’un échantillon pour autogreffe

- standardisation

Question : traitement de la rechute moléculaire? Arsenic?

Induction Consolidation Entretien Rémission

Début Fin Fin 1/6 mois 1/6 moisMOELLE

• RQ-PCR

Entretien Rémission

1/3 mois 1/6 mois

SANG

• RQ-PCR

Protocole de prélèvements dans la leucémie aiguë à promyélocytes

Références Bibliographiques

- David Grimwade

The significance of minimal residual disisease in patients with t(15;17)

Best Practice and research Clinical Haematology Vol15, n°1, p137-158, 2002

- Grimwade D, Lo Coco F Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and

residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia.

Leukemia. 2002 Oct;16(10):1959-73.

- Gallagher RE et al.

Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RARa mRNA in acute

promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult

patients from intergroup protocol 0129

Blood Vol 101, n°7 p2521-2528, 2003