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Stress Oxydant et Vieillissement
Modifications oxydatives des protéinesau cours du vieillissement
GERONTOLOGIE FONDAMENTALE
Isabelle Petropoulos
Laboratoire de Biologie Cellulaire du VieillissementUMR 7079
Implication du stress oxydant dans les processus de vieillissement (rôle des espèces réactives de l’oxygène ou ERO)
Modifications par voie oxydative des protéines au cours du vieillissement
Implication du protéasome et plus généralement des systèmes de maintenance (élimination et réparation des protéines oxydées)
Plan du cours
Le vieillissement se caractérise par une diminution de la capacité d’unorganisme à faire face à son environnement
Usure de l’organisme suite à l’accumulation d’altérations subies aucours du temps
Théorie des radicaux libresLes changements associés au vieillissement sont dus à l’accumulation desdommages produits pas les ERO.
Production des ERO
Défenses antioxydantes
Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondreau stress oxydant
Qu’est ce que le vieillissement ?
Relation entre la longévité et résistance au stress oxydant
Igf-1 receptor Tyrosine-kinase receptor 26 % increase in KO mouse Enhanced (paraquat, H202)
(Nature, 2003, Y. Le Bouc)
Défenses antioxydantesSources endogènes Sources exogènes
ROSONOO-
H2O2
RO.O2
.-
NO.
ROO.NO2
OH.
• Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx
• Systèmes non-enzymatiques : Glutathion etvitamines (A, C et E)
Taux basal Taux élevé
• Mitochondries• Péroxysomes• Lipoxygénases• NADPH oxydase• Cytochrome P450
• UV• Radiations ionisantes•Toxines• inflammation (cytokines)
Homéostasie• Croissance normale• métabolisme normal
Altération des fonctions physiologiques• vieillissement• maladie• mort cellulaire
Origine et réponses cellulaires aux ROS
Les principales cibles des Espèces Réactives de l’Oxygène dans la cellule
Oxydation de l’ADNmutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl : 8 hydroxyguanineCoupures simple brin et double brinDélétions (ADN mitochondrial)
Oxydation des lipides
Oxydation des phospholipides des membranesFormation de peroxydes lipidiques
- 4-hydroxynonenal (4-HNE)- malonaldéhyde (MDA)
Oxydation des protéinesModifications oxydatives multiples (carbonyles)
Qu’est-ce que l’oxydation des protéines?
Modification covalente des protéines provoquées par
des espèces réactives de l’oxygène ou par des
dérivés induits par le stress oxydant
Protéine oxydée non fonctionnelle
Protéine active
Oxydation
Oxydation
GlycationConjugaison avec des
produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA)
Glycoxydation
Tous les acides aminés
LysineArginine
AGEs
HistidineCystéineLysine
CarboxymethylysineCOO-CH2R NH
Modification des protéines par voie oxydative
R’
N
N
H
NH
NR
Pentosidine
Produits d’Amadori
Protéine nativeHydroxyls R-OHCarbonyls R-C-H, R-C-R’,
O ODisulfide cys-S-S-cysMethionine sulfoxide MeSO
Acides aminés les plus susceptibles à l’oxydation et leurs principaux produits de réaction
Acide aminé Produits d’oxydation
Cysteine Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiques
Methionine Methionine sulfoxide, methionine sulfoneTyrosine Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPA
Tryptophane Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynureninesPhenylalanine Hydroxyphenylalanines
Valine, Leucine HydroperoxidesHistidine 2-Oxohistidine, asparagine, aspartateGlutamyl acide oxalique, acide pyruvique
Proline Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehyde
Threonine Acide 2-Amino-3-cetobutyriqueArginine semialdehyde glutamique, chloramines
Lysine semialdehyde, chloramines,
Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l’oxydation des protéines
Athérosclérose (LDL)Arthrite rhumatoïde (IgG)Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébraleEmphysème pulmonaire (inhibiteur de l’α -1-proteinase, elastase)Maladies neurodegeneratives - Alzheimer
- ParkinsonDystrophie musculaireSyndrome de détresse respiratoireVieillissementProgeria/syndrome de WernerAlcoolismeCataracte (α-crystallines)Cancer
OXYDATION
CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION
LIPIDIQUESGLYCATION/
GLYCOXIDATION
PROTEINENATIVE
BIOSYNTHESE
PROTEINEENDOMMAGEE DEGRADATION
PEPTIDESAcides Aminés
Proteasome
Aggregats
REPARATIONPeptide methionine
sulfoxide reductase system
Modification et devenir des protéines cellulairesendommagées
Immunodétection des groupements carbonyles sur les protéines
Western blot, ELISA, immunohistochimie
Anti-DNPanticorps
* **
***
oxydéeproteine
O
DNPHDNP
protéine
DNP DNP
En western blot :
• Détection des protéines oxydées dans un mélange de protéines (susceptibilité différentielle des protéines à l’oxydation)
• Sensibilité ≤1 pmol de groupement carbonyle
DNP protéine
Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502
(fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche)
OXYDATION
CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION
LIPIDIQUESGLYCATION/
GLYCOXIDATION
PROTEINENATIVE
BIOSYNTHESE
PROTEINEENDOMMAGEE
DEGRADATION
PEPTIDESAcides Aminés
Proteasome
Aggregats
REPARATIONPeptide methionine
sulfoxide reductase system
Modification et devenir des protéines cellulairesendommagées
LE PROTEASOME
Rôles dans le vieillissement et les maladiesliées à l’âge
ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES
Le protéasome : machinerie d’élimination des protéines endommagées
Protéasome 20S
ATP
Complexe 19S
Protéasome 26S
Chymotrypsine-similaire
Hydrolase post-glutamique
Trypsine-similaire
αββα
Dégradation des protéines modifiées par oxydation
Dégradation des protéines marquéespar les chaînes de polyubiquitines
Rôles physiologiques importants dans:
Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines)La présentation de l ’antigèneL ’inflammation (activation de NFkB)L ’apoptose (p53)La réparation de l ’ADN (PARP)
Protéasome 20 SProtéasome 26 S
Régulateur 19 S
+ ATP
Micrographies de particules protéasomales
Dégradation des protéines ubiquitinées par le protéasome 26 S
Dégradation des protéines oxydées par le protéasome 20 S
Protéasome et vieillissement de la peau
Diminution du renouvellement cellulaire, sénescenceDégradation de la matrice extra-cellulaireEndommagement des macromolécules cellulaires
Vieillissement intrinsèquechronologique et génétique
Vieillissement extrinsèqueStress oxydant, photo-vieillissement
Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l’épidermeRôle du protéasome dans les processus de vieillissement
120
84
47.8
B0.8
ng e
q gl
ycat
ed-B
SA/μ
g of
pro
tein
s
0
0.2
0.4
0.6
0 20 40 60 80age of donor (years)
D
AMWMkDa
97.4
68
C120
84
47.8
MWMkDaOxyblot
Western blot anti-HNE
Western blot anti-AGE
ELISA anti-AGE
Modifications des protéines cytosoliques durant le vieillissement de l’épiderme
Excitation 350 nmEmission 440 nm
Activités protéolytiques du protéasome
20S
LLVY-AMC
Activité Chymotrypsine-similaire
-AMC
(Coupure après acide aminé aromatique)
LSTR-AMC
Activité Trypsine -similaire
(Coupure après acide aminé basique)
-AMC
LLE-NA
Activité Hydrolasepost - glutamique
(Coupure après acide aminé acide)
-βNA
Excitation 333 nmEmission 410 nm
33.2
20
MWMkDa
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100A
B8070605040302010
age du donneur (années)
Chy
mot
ryps
in-li
kepm
ol A
MC
/min
. per
mg
Pept
idyl
glut
amyl
-pep
tide
hydr
olas
epm
ol N
A/m
in. p
er m
g
Effet de l’âge sur les activités du protéasome dans les cellules épidermiques
b
pH=3 pH=10
SDS-PA
GE
21kDa
30.6 kDa
GEL BIDIMENSIONNEL DE PROTEASOME PURIFIE A PARTIRDE L’ EPIDERME DE DONNEUR DE 17 ANS
Comparaison avec des donneurs plus âgés : Diminution de 3 sous-unités α : α3, α4 et α5Augmentation d ’1 sous-unité β : β4
β5
MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60
20
40
60
80
100
α3
MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60
20
40
60
80
100
MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60
20
40
60
80
100
EE)
Nombre de passages18 22 26 30 34
0
20
40
60
80
100
β7
MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60
20
40
60
80
100β2
MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60
20
40
60
80
100
α6
Expression des sous-unités du protéasome 20 S
espèce tissu âge effet sur l’activité
Humain
Rat
Lymphocytes T
Cristallin
Foie
CoeurPoumonCerveau
muscle
21-30 ans vs 65-85 ans
clair vs cataracte
3-8 mois vs 24-34 mois
3 mois vs 28 mois
4 mois vs 34 mois
Chymotrypsine
Chymotrypsine
ChymotrypsineTrypsine
PGPH
Chymotrypsine
ChymotrypsineTrypsine
PGPH
Effet de l’âge sur les activités peptidasiques du protéasome
Effet de l’âge sur l’expression du protéasomeAnalyse de transcriptome
espèce tissu âge Effet sur l’expression
Effet de la restriction calorique
Humain
souris
Fibroblastes
Muscle squelettique
8 ans vs 92 ans
5 mois vs 30 mois
α2, α7(protéasome 20 S)sous-unités du 19S
(protéasome 26S)
β2, β7(protéasome 20 S)sous-unités du 19S
(protéasome 26S)
PROTEASOME ET VIEILLISSEMENT CONCLUSIONS
Le contenu en groupements carbonyles des protéines augmentent avec l ’âge dans les kératinocytes et les fibroblastes. Ces groupements peuvent être générés :
- soit par oxydation directe d ’acides aminés- soit par conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique- soit par glycation
Deux des activités (chymotrypsine et peptidyl-glutamylpeptide hydrolase) du protéasome diminuent avec l ’âge, ce qui peut s ’expliquer, au moins en partie, par une diminution de la quantité de protéasome cellulaire.
Une diminution de l ’activité, de la quantité du protéasome est également observée au cours de la sénescence réplicative (kératinocytes et fibroblastes en culture).
Une diminution de l ’expression de certains gènes codant des sous-unités catalytiques et régulatrices a été observée dans les fibroblastes âgés.
Les centenaires semblent avoir la capacité de «préserver» leur protéasome
Rôle de l’oxydation des LDL dans l’athérogenèse
Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l’ athérogenèse et sont impliquées dans les événements précoces de formation de la plaque :
- Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T)- Formation de cellules spumeuses- Migration et prolifération des cellules musculaires lisses- Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose)- Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome
Bile
FCCL
Foie
A-I
MacrophageA-I
CECELCATF
C
CETP
HDL MatureHDL Naissant
CL
Oxydation des HDL et transport reverse du cholestérol
HDL impliqués dans le transport réverse du cholestérol des macrophages spumeuxvers le foie.
Dysfonctionnement des HDL mis en cause dans les maladies cardiovasculaires
Ce dysfonctionnement serait en partie du aux attaques oxydatives(myélopéroxydase élevée dans les macrophages des tissus athérosclérotiques).
Rôle de l’oxydation de l’Apo A1 sur l’activité de la LCAT (lecithine:cholestérolacyltranférase)
Oxydation de l’Apo A1 et activité LCAT
Exemple de l’α1-antitrypsine
Synthétisée dans les hépatocytes.
Présente dans le parenchymepulmonaire. Protection de la matricealvéolaire contre l’activité de l’élastase(sérine protéase).
Contient 9 résidus méthionines dont2 (Met 351 et Met 358) seulementsont oxydables en présence d’oxydant.
Une déficience de l’activité de cette enzyme est mise en causedans l’emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonairecaractérisée par une destruction des bronchioles)
Inactivation de l’ α1-antitrypsine par oxydation desrésidus méthionines
cigarette
Cigarette(H202, phénol)
Régulation de l’activité élastase
Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d’Alzheimer
Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence et mort neuronale
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