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Sommaire
Résumé
Introduction
Matériels et méthodes
1 – Matériels
a – Types cellulaires
b – Amorces et sondes de RT-PCR quantitative en temps réel
2 – Méthodes
a – Conditions générales de culture
b – Extraction des ARN messagers
c – Comparaison de la sensibilité au NGF des diverses lignées épithéliales de
sein humain
d – Test de l’effet de l’inhibition de contact
e – Effet de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose
f – RT-PCR quantitative en temps réel
g – Immunoprécipitation et analyse en Western blot
h – Test d’apoptose en Hoescht
Résultats
1 – Expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75) dans les lignées
de cancer du sein et sur les cellules normales
a – Expression du gène p75
b – Expression du gène TrkA
c – Expression du gène du NGF
2 – Variation de l’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75)
en fonction de l’inhibition de contact
3 – Variation de l’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75)
en fonction de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose
Discution et conclusion
Bibliographie
Remerciments
Sébastien DUPRAT, DEA biologie santé 1999-2000.
REGULATION DE L’EXPRESSION DU NGF ET DE
SES RECEPTEURS (TRKA ET P75) DANS LES
CELLULES DE CANCER DU SEIN.
RESUME :
Le cancer du sein touche près d’une femme sur dix. La meilleure compréhension de
cette maladie est un des défis prioritaires de la santé publique à l’heure actuelle.
Il a préalablement été prouvé dans le laboratoire que le Nerve growth factor (NGF)
stimule la croissance et la survie des cellules de cancer du sein par l’intermédiaire de deux
récepteurs : TrkA et p75 (Descamps et al. 1998). Dans cette recherche il a également été
démontré que les cellules épithéliales mammaires normales ne sont pas stimulées à proliférer
par ce facteur de croissance. L’objectif de mon travail de DEA est de définir la régulation du
NGF et de ses récepteurs dans les lignées de cancer du sein en culture.
Différentes lignées de cancer du sein ainsi que des cellules épithéliales mammaires
normales ont été cultivées en présence de facteurs modifiant la prolifération et la survie
cellulaire. Les résultats ont alors été analysés en RT-PCR quantitative en temps réel ou en
western blot.
INTRODUCTION :
La recherche en biologie cellulaire
sur les cancers hormonaux dépendants
repose principalement sur l’étude de la
prolifération, de la différentiation et de
l’apoptose. Ces phénomènes sont
conditionnés par l’environnement
cellulaire, notamment par les molécules de
signalisation. On trouve dans cette
catégorie les facteurs de croissance, petits
polypeptides de faible poids cellulaire qui
agissent par l’intermédiaire de récepteurs
membranaires.
Le NGF est le premier facteur de
croissance à avoir été caractérisé. Ce
travail a valu le prix Nobel de médecine en
1986 à Rita-Levi Montalcini. C’est
l’archétype des facteurs de croissance
neurotrophique. Il a été très largement
étudié pour son rôle d’induction de la
croissance et de la survie des neurones
sympathiques. Plus récemment, une
activité mitogène lui a été attribuée sur
certaines lignées de cellules épithéliales.
Dans un travail effectué préalablement à
mon arrivée dans mon laboratoire
d’accueil, cet effet a été démontré sur les
cellules épithéliales mammaires
cancéreuses (Descamps et al. 1998). Une
particularité est intéressante dans ce
modèle : le NGF stimule les cellules
cancéreuses du sein à proliférer mais reste
sans effets mesurables sur les cellules
normales.
Le NGF agit par l’intermédiaire de
deux récepteurs membranaires : TrkA et
p75. Le proto-oncogène TrkA (p140trk) est
un récepteur à activité tyrosine kinase,
c’est le récepteur à haute affinité du NGF.
P75 est un récepteur accessoire, de basse
affinité, et sans activité tyrosine kinase. Ce
dernier semble pourtant posséder une voie
de transduction propre liée aux fonctions
de survie cellulaire.
L’étude du rôle du NGF dans le
cancer du sein en est à ses débuts. Dans le
cadre de ce stage de DEA, nous nous
somme intéressé aux mécanismes régulant
la sensibilité des cellules épithéliales
mammaires humaines pour ce facteur de
croissance. Notre approche nous a
renseigné sur l’évolution de cette
sensibilité au NGF induite par des
molécule agissant sur la croissance et/ou
l’apoptose.
MATERIEL METHODES :
1 - Matériel
a) Types cellulaires
Un certain nombre de types
cellulaires ont été utilisés. Ce sont des
lignées cancéreuses ou des cellules
normales, mais toutes sont d’origine
épithéliales mammaires humaines.
- la lignée MCF-7 est hormono-
dépendante. Elle a été établie à
partir d’effusions pleurales d’un
adénocarcinome. Cette lignée a
conservé de nombreuses
caractéristiques d’un épithélium
mammaire (particulièrement
pour la présence des récepteurs
à haute affinité des œstrogènes
et progesterone). En plus de la
lignée MCF-7 commune, nous
avons également utilisé des
MCF-7 transfectées par le
proto-oncogène ras
(dénomination : MCF-7 ras).
Ces dernières se comportent en
permanence comme stimulées
par des facteurs de croissance,
même en milieu de sevrage
(sans sérum de veau fœtal).
- Les lignées T47D et SK-Br-3
sont également hormono-
dépendantes et peu invasives.
Elle sont issues
d’adénocarcinomes. SK-Br-3
surexprime le récepteur erb-B2,
et T47D possède des récepteurs
à certains stéroïdes.
- La lignée BT20 semble être
hormono-dépendante, mais ceci
est controversé dans la
littérature. Elle est issue de
cellules échapées d’une tumeur
en culture primaire. Elle a la
particularité de ne pas posséder
de récepteurs aux œstrogènes.
- Nous avons également étudié 3
lignées de MDA. Elles sont
toutes trois hormono-
indépendantes. Ce sont les
lignées MDA-MB-231 (issues
d’effusions pleurales
d’adénocarcinomes, fortement
invasive. Ces cellules
n’expriment pas de récepteurs
aux œstrogènes et à la
progestérone), MDA-MB-453
(possédant de nombreux
récepteurs aux androgènes et
très invasive. Elle surexprime
également erb-B2) et MDA-
MB-468 (possède de nombreux
récepteurs à l’EGF et
surexprime le FGF-2).
- Enfin, nous avons utilisé des
cellules épithéliales mammaires
humaines normales
(dénomination : CEMN). Ces
cellules sont issues de réduction
mammaires non pathologiques
(venant du département de
chirurgie plastique, CHU Lille,
Dr.Pellerin) et mises en culture
primaire au laboratoire.
b) Amorces et sondes de RT-
PCR quantitative en temps
réél.
Les séquences des amorces sens et
antisens ainsi que des sondes sont les
suivantes :
TrkA :
Sens : CATCGTGAAGAGTGGTCTCCG
Antisens :
GAGAGAGACTCCAGAGCGTTGAA
Sonde :
AGGAGTGAAATGGAAGGCATCTGGC
G
P75 :
Sens :
CCTACGGCTACTACCAGGATGAG
Antisens : TGGCCTCGTCGGAATACG
Sonde :
CTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGC
NGF :
Sens :
Antisens :
Sonde :
2 – méthodes
a) Conditions générales de
culture
En routine, les cellules sont
maintenues en MEM (Milieu essentiel
minimum, avec des sels de Eagle) (Gibco
BRL) supplémenté avec 5% de sérum de
veau fœtal (SVF) (Eurobio ? ? ? ?), 1%
d’acides aminés essentiels (Eurobio), 2
mM de glutamine (Eurobio), 5 l/ml
d’insuline (Organon), et des antibiotiques
(Penicilline-Streptomycine : 100 U/ml et
Gentamycine : 50 l/ml) (Eurobio). Les
cellules sont encemencées dans des
flasques de plastique de 75 cm2 (Falcon) et
incubées dans un atmosphère humide, à
37°C en présence de 5% de CO2. Le milieu
est changé tous les 2 jours. Les cellules
sont régulièrement décolées, avant la
confluance dans une solution de trypsine
(0,1%) – EDTA (0,25%) (eurobio), à 37°C
pendant 5 à 10 minutes (en fonction du
type cellulaire). La trypsine est inhibée par
5 ml de MEM SVF (décrit ci-dessus).
Les cellules en culture sont
régulièrement observées au microscope
inversé à contraste de phase. Cela permet
de suivre l’évolution de la confluance et de
s’assurer du maintient de la morphologie
épithéliale.
Avant un traitement de facteurs de
croissance, les cellules sont sevrées dans
du MEM supplémenté comme pour le
MEM – SVF d’acides aminés non
essentiels, de L-glutamine, de
pénistreptomycine, de gentamycine, de
bicarbonate de sodium, et d’HEPES. A
ceci, nous ajoutons 2 g/ml de fibronectine
et 30 g/ml de transférine.
b) Extraction des ARN
messagers
Les ARN totaux ont été extraits
avec le kit Quiagen selon le protocole
décrit par Quiagen. Ensuite, on évalue la
quantité d’ARN en spectrophotométrie à
260 nm de longueur d’onde. On vérifie
aussi la pureté du résultat en s’assurant que
le ratio 260/280 est compris entre 1,7 et
2. Les ARN sont dilués à 10g /ml puis les
solutions mères et dilués sont stockées à –
80°C.
c) Comparaison de la
sensibilité au NGF des diverses
lignées épithéliales de sein humain
Pour évaluer le niveau d’expression
du NGF et de ses récepteurs, les cellules
ont été ensemencées dans des boites de
petri 100mm (………), à 10000 cellules
par cm2, puis cultivées dans deux
conditions standard :
- 48 heures en MEM – SVF :
condition de sérum.
- 48 heures en MEM – SVF puis
48 heures en MEM sevrage :
condition de sevrage.
(Remarque : dans cette partie, le milieu MEM de
sevrage ne contient pas de rouge de phénol. Ce
n’est pas le cas dans le reste de l’étude.)
Ensuite, les cellules sont trypsinisées. La
quantité de cellules comprise dans chaque
échantillon est déterminée par comptage
sur lame de Malassez. Ensuite, on
centrifuge 10 minutes à 1200 tour par
minutes. Les culots sont conservés à –80°C
en attendant d’en extraire les ARN
messagers. Les ARN seront analysés en
RT-PCR quantitative en temps réel.
d) Test de l’effet de
l’inhibition de contact
Les cellules MCF-7 ont été
ensemencées à 10000 cellules par cm2 dans
des boites de Petri de 100mm de diamètre
puis cultivées en MEM – SVF. Le milieu
est régulièrement changé. Chaque jours,
trois boites sont récoltées par une solution
de trypsine, le nombre de cellules est
déterminé par un compteur de cellules
automatique. A partir de ces cellules, on
extrait les ARN messager que l’on analyse
en RT-PCR quantitative en temps réel.
e) Effet de substances agissant
sur la croissance et/ou l’apoptose
Les cellules (MCF7 et BT-20) ont
été ensemencées à 5000 cellules par cm2
dans des boites de petri de 100mm de
diamètre. Les cellules ont été laissées 48h
en MEM – SVF dans un incubateur (37°C,
5% de CO2). A partir de cette étape, il faut
différencier deux cas :
- Pour le test du FGF-2, ainsi que
le test conjoint du butyrate de
sodium (NaB) et du C2 avec le
NGF, les cellules ont été lavées
2 fois avec du PBS stérile (15
minutes puis 2 heures) et mises
24h en MEM sevrage. Enfin,
elles ont été traitées 48h dans
du MEM sevrage supplémenté
de 1ng/ml de FGF-2, 0.5mM de
NaB, 2M de C2, et/ou 200
ng/ml de NGF.
- Concernant les test avec le C2
ou le butyrate de sodium (NaB)
en présence de sérum, le milieu
MEM – SVF a été renouvelé
24h puis les cellules ont été
traitées 48h dans du MEM –
SVF supplémenté de 1mM de
NaB ou 10M de C2.
f) RT-PCR quantitative en
temps réel.
La réaction est faite en une seule
étape. Le mélange de réaction se compose
dans chaque tube de : 50ng d’ADN total
d’échantillon, MgCl2 : 6mM pour TrkA ;
3mM pour p75 ; 4mM pour NGF, 5 l de
tampon TaqMan 10X (500mM KCl, 0,1
mM EDTA, 100 mM tris HCl, pH 8.3, 600
nM ROX qui est un dérivé de la rhodamine
utilisé comme référence interne passive
pour normaliser la fluorescence), 20 U
d’ADN polymérase AmpliTaq Gold, 300
M de dATP, dCTP, dGTP, dUTP, 200
nM d’amorces sens et antisens et 200 nM
de sonde.
La transcription inverse se fait
pendant 30 min à 48°C. On active ensuite
par chauffage l’AmpliTaq Gold 10 min à
95°C. Puis on effectue 40 cycles dans les
conditions suivantes : 15 sec à 95°C
(dénaturation) puis 90 sec à 60°C
(hybridation + élongation).
Les données recueillies sont
comparées à une courbe étalon amplifiée
simultanément aux échantillons à partir
d’une quantité connue des ARN standard
respectifs. Une courbe d’amplification est
réalisée par informatique (logiciel Abi-
Prism 7700) en rapportant l’intensité du
signal fluorescent au nombre de cycles de
PCR. La courbe étalon est basée sur une
relation linéaire entre le logarithme de la
quantité d’ARN standard de départ et le
seuil significatif d’augmentation de la
fluorescence ( = cycle de sortie).
g) Immunoprécipitation et
analyse en Western blot
Les cellules sont décolées par 200
l (pour une boite de pétri 100mm) de
tampon de lyse (0.3% SDS, 1% -
mercaptoéthanol, 0.5% Triton X100). Les
cellules ainsi récupérées sont laissées 5
min dans la glace, puis les protéines sont
dissociées par ultrasons. On centrifuge 3
min à 10000 tr/min, on dose le surnageant
en spectrophotométrie (longueur d’onde :
595nm), puis on stocke la solution de
protéines à –20°C.
Pour augmenter l’efficacité du
western, on réalise une
immunoprécipitation au préalable avec les
anticorps spécifiques de TrkA, p75 et
NGF.
h) Test d’apoptose en Hoescht
Nous avons réalisé les test
d’apoptose dans des boites de pétri de
35mm de diamètre, dans lesquels sont
déposées 3 lamelles de microscopie cottées
au collagène. Les cellules y sont
encemencées et traitées dans les mêmes
conditions que décrites précédemment.
A l’issue du traitement, on aspire le
millieu, les cellules sont fixées au
méthanol à –20°C puis rincées 2 fois au
PBS . On place ensuite les lamelles dans
une solution de Hoescht, 15 min, à
température ambiante et à l’abris de la
lumière. Les lamelles sont enfin rincées 2
fois au PBS puis montées sur lames
microscopiques avec du glycérol.
On lit les lames en microscopie à
fluorescence. L’observation de la
morphologie des noyaux permet de
déterminer la proportion de cellules en
apoptose.
________________________________________________________
RESULTATS :
Les résultats obtenus se composent
en 3 parties, chacune concernant
l’expression du NGF et des ses récepteurs :
dans différents types cellulaires de sein
humain.
et leur évolution en fonction de la
densité cellulaire.
sur des cellules traitées par des facteurs
agissant sur la prolifération ou
l’apoptose.
1) Expression du NGF et de ses
récepteurs (TrkA et p75) dans les
lignées de cancer du sein et sur les
cellules normales.
Cette étude regroupe toutes les
lignées décrites dans « matériel et
méthodes ». Les cellules ont été cultivées
dans des conditions d’étude standard : en
MEM – SVF ou en MEM sevrage. Compte
tenu de l’activité oestrogénique du rouge
de phénol, nous avons décidé d’utiliser en
sevrage du MEM sans rouge de phénol.
Ceci nous donne 2 conditions standard
extrêmes de culture : en condition
favorable et en condition limitante.
L’objectif a été de collecter les
informations necessaires au choix d’un
modèle expérimental pour la suite du
travail.
a) Expression du gène p75.
La fig. 1A présente le résultat en
RT-PCR quantitative du niveau
d’expression des ARN messagers de p75.
Les types cellulaires sont classées de la
façon suivante : d’abord les cellules
normales, puis les lignées cancéreuses par
ordre décroissant d’hormonodépendance.
On observe pour la majorité des
types cellulaires une expression de p75
significativement plus importante sans
SVF. Il y a une exception néanmoins : la
lignée MCF-7 exprime de façon égale ce
gène dans les conditions de sérum et de
sevrage.
Ce sont dans les lignées MCF-7,
T47-D et BT-20 que l’expression du gène
p75 est la plus importante. Elle est par
contre particulièrement faible dans les
cellules normales, ainsi que dans les
lignées SKBr3, MDA-MB-453 et MDA-
MB-468.
b) Expression du gène TrkA.
Les résultats sont présentés dans la
fig. 1B.
On observe dans la plupart des
types cellulaires une expression
équivalente de TrkA dans les conditions de
sérum et de sevrage. Cela concerne les
cellules normales, ainsi que les MCF-7,
SKBr3, MDA-MB-231, MDA-MB-453 et
MDA-MB-468. Dans le cas des lignées
BT-20 et T47-D, TrkA est largement plus
exprimé dans les cultures avec du sérum.
L’expression de TrkA est la plus
faible dans les cellules normales, les MCF-
7, les MDA-MB-231 et les MDA-MB-453.
c) Expression du gène du
NGF.
Les résultats ne sont pas présentés
car l’expression est nulle ou suffisamment
faible pour ne pas être détectable en PCR,
même après 40 cycles, et ce, dans chacune
des conditions précédentes et pour chaque
type cellulaire testé.
Fig. 1A :
Fig. 1B :
2) Variation de l’expression du
NGF et de ses récepteurs (TrkA et
p75) en fonction de l’inhibition de
contact.
Cette étude a été réalisée sur la
lignée cancéreuse MCF-7.
L’encemencement s’est fait à 50000
cellules par boites. Le jour 1 correspond à
la phase « lag » avec 71600 cellules par
boites. Les jours 2 et 3 composent la phase
« log » avec respectivement 104000 et
181000 cellules par boites. Enfin, le jour 4
représente le début de la phase plateau
avec 270000 cellules.
Ce travail présente l’expression des
ARN messagers des étudiés.
Le résultat de cette étude est
présenté dans la fig. 2A pour p75 et fig.
2B pour TrkA. Comme dans l’étude
précédente, l’expression du NGF a été
testé et il n’est pas exprimé de façon
mesurable.
On observe une expression
relativement forte des 2 récepteurs du NGF
lors de la phase d’adhérence. Par la suite,
cette expression diminue progressivement
jusqu’à la phase de plateau.
Fig. 2A :
Fig. 2B :
3) Variation de l’expression du
NGF et de ses récepteurs (TrkA et
p75) en fonction de substances
agissant sur la croissance et/ou
l’apoptose.
Cette étude a été commencé sur
deux lignées cellulaires (MCF-7 et BT-20)
choisies comme modèle d’étude au vue des
résultats précédents. Nous avons défini
l’expression de TrkA et p75 (NGF n’étant
pas exprimé, comme précédemment) après
un traitement par le C2 ou le NaB en
milieu MEM – SVF, ou après un
traitement par le FGF-2 en condition de
sevrage. Suite aux résultats de cette étude
qui montre une réponse parfaitement
identique dans les 2 lignées, nous avons
continué le travail sur la seule lignée MCF-
7.
Nous avons ensuite étudié en détail
l’effet conjoint du NaB ou du C2 avec le
NGF.
Cette 3ème partie comprend des tests
d’apoptose en Hoescht, des tests de RT-
PCR quantitative sur les gènes TrkA et p75
qui sont confirmés par Western blot.
DISCUSSION ET CONCLUSION:
Les résultats de cette étude montrent comment évolue la sensibilité des cellules
épithéliales mammaires humaines pour le NGF.
Il a fallu tout d’abord choisir le modèle expérimental de l’étude. Nous avons pour cela
comparé le niveau d’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75) dans les
différentes cellules usuelles d’étude du cancer du sein. Le profil obtenu, tant pour p75 que
pour TrkA, a montré des divergences de comportement entre les différents types cellulaires.
Nous avons donc choisi deux lignées : MCF7 qui est typiquement la lignée prototype des
études sur le cancer du sein ; et BT-20 dont le comportement semble (au vu de cette étude
préalable) différent de MCF7 et qui a l’avantage d’avoir un niveau d’expression assez élevé
pour les gènes de notre étude. Par la suite, en constatant que la réponse de ces deux lignées
aux traitements, aussi bien sur la plan de la croissance que de l’expression des gènes, était
identique, nous avons fini l’étude sur la seule lignée MCF-7.
Tout d’abord, les cellules épithéliales mammaires humaines (aussi bien les cellules
normales que les cellules cancéreuses) ne produisent pas le NGF. L’hypothèse de la voie de
régulation autocrine s’avère donc non fondée.
Nous avons largement observé l’expression des deux récepteurs du NGF (TrkA et
p75) en conditions routinière ainsi que son évolution suite à un traitement par des molécules
agissant sur la prolifération ou/et sur l’apoptose. Grâce à la technique de RT-PCR
quantitative, nous n’avons pas constaté de différence d’expression des récepteurs TrkA et p75
suite à un traitement de 48h avec du FGF-2 ou du C2. Nous avons par contre observé une
expression de p75 de l’ordre de trois fois celle du contrôle en cas de traitement 48h avec du
NaB. Avec ce même traitement, TrkA ……… Ceci a pu être vérifié dans deux lignées
différentes (MCF-7 et BT-20), avec un profil de réponse au traitement parfaitement identique.
BIBLIOGRAPHIE :
Descamps et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 : 16659-62.
REMERCIMENTS :
Je remercie chaleureusement le Professeur H. Hondermarck et le Docteur J.P. Peyrat pour
m’avoir laissé beaucoup de liberté dans l’organisation de mon travail tout en me faisant bénéficier
d’un encadrement régulier et de qualité.
Un grand merci au Professeur B. Boilly pour l’interret constant qu’il a porté à mon travail et
pour m’avoir généreusement fait profiter de son expérience.
Je remercie tout particulièrement Simon Descamps pour sa patience et sa disponibilité à mon
égard.
Merci aux Docteurs X. Dong-Lebouhris et Y. El Yazidi pour leur bonne humeur et leur
gentillesse.
Je me dois aussi de ne pas oublier tous ceux sans qui mon travail n’aurait pas pu être aussi
enrichissant : Pr Victor Nurcombe, Dr Patrice Richard, Dr. Louis Hornez, Dr. Françoise Révillon,
Valérie C., Valérie P., Anne-Sophie, Rachel, Sylviane, Isabelle, Marie-Michelle, Laurent, Robert-
Alain, David V., David L., Johan, Alain, Arnaud,…
Une pensée émue enfin, avec l’espoir sincère d’une rapide guérison, pour Anthony, je te
souhaite tous mes vœux pour une longue carrière dans la recherche quand ta maladie sera passée.
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