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UNIVERSITE CADI AYYADFACULTE DES SCIENCES SEMLALIA -
MARRAKECHDépartement de Chimie
2014/2015
Préparé par :
Ahmed AIT KHOUYA
Idir BENAISSA
Encadré par:Mr. Aziz BENYAICH
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Plan:
Définition d’électrophorèseL’Histoire d’électrophorèse Principe d’électrophorèse
Différents types d’électrophorèse
Les application de l’électrophorèse
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L'électrophorèse est une technique permettant la séparation de molécules porteuses de charges électriques comme les acides aminés, les protéines, les acides nucléiques dont l'ADN...
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Cette technique a été imaginée en 1892 par S.E. Linder et H. Picton qui sont inspirés des travaux d’Hermann Von Helmholtz sur l’électro-osmose. En effet, ce dernier constata qu’il était possible de déplacer des particules chargées sous l’effet d’un champ électrique.
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Principe
Le principe consiste à soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce qui entraine la migration des molécules chargées. En fonction de différents paramètres (charge, masse, forme, nature du support, conditions physico-chimiques) la vitesse de migration va être variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules.
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Les différents types d’électrophorèse
électrophorèse en veine liquide
Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de ce champ est constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenables dont les ions conduisent le courant d'un pôle à un autre.
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Electrophorèse de zone On distingue plusieurs types électrophorèse de zone:
Sur Papier
Il servait surtout à séparer des acides aminés ou d'autres petites molécules chargées. Le dépôt et la migration des échantillons se font en surface. Puis détermination du point isoélectrique d’un acide aminé. On a une mesure de mobilité par détermination de mobilité d’un acide aminé à différent pH
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acétate de cellulose
l'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5 % à 2 % (masse/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN.
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Electrophorèse sur gel
L'électrophorèse en gel d'agarose est une technique de base au laboratoire de biologie moléculaire. Elle est utilisée
•Soit à des fins analytiques: pour séparer et identifier des fragments d'ADN, pour déterminer leur taille, pour en estimer la quantité,
•Soit à des fins préparatoires, pour purifier un fragment d'ADN de taille connue.
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Sur gel de polyacrylamide
C'est une méthode très fine de séparation par simple électrophorèse sur support. Est réalisée en présence de SDS
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Révélation des protéines séparées présentant un gel par coloration avec comme colorant possible :
•le bleu noir naphtol
•le nitrate d'argent (qui est plus sensible)
•le bleu de Coomasie
Ex : Gel coloré au bleu de Coomassie
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Électrophorèse en champ pulsé
en utilisant un champ électrique discontinu ou bien en modifiant périodiquement la direction du champ. Dans ces conditions, le temps mis par la molécule d'ADN pour se positionner dépend de sa longueur. Ainsi, une molécule d'ADN très longue (2 000 kb) passera plus de temps à se réorienter qu'à se déplacer, tandis qu'une plus petite molécule (200 kb) passera plus de temps à migrer. Le repérage des fragments, après leur positionnement, fait appel à la technique d'hybridation moléculaire.
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Electrophorèse bidimensionnelle
Lorsqu'il est existé des bandes protéiques très proches, on a un chevauchement. Par les méthodes unidimensionnelles la résolution et bon pour moins de 50 protéines. Grâce à l'électrophorèse bidimensionnelle, on combine deux modes de séparation différents. La résolution peut être appliquée pour plus de 1000 protéines différentes.
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Electrophorèse bidimensionnelle
Selon le pHi (modifications de la charge ) focalisation isoélectrique
DIMENSION 1
DIMENSION 2
Selon le PM (durant cette migration, faite à un pH où les anticorps sont électriquement neutres)
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Séparation des acides aminés
Séparation des protéines
Séparation des fragment d’ADN
Domaine d’industrie
Domaine médicale
Les application de l’ électrophorèse :
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pH > pHi
l'acide aminé a une charge
globale négative
Anode
pH = pHi
l'acide aminé a une charge
globale nulle(zwitterion)
ne migre pas et reste au point de
départ.
pH < pHi
l'acide aminé a une charge
globale positive
Cathode
Séparation des acides aminés
Chaque acide aminé caractérisé par une valeur de pH isoélectrique, pHi auquel les acides aminés sont électriquement neutres.
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Electrophorèse des protéines (protéines sériques comme exemple) :
Les protéines sériques sont des protéines contenues dans le sérum ou le plasma sanguin. Les protéines sériques jouent différentes fonctions de transport, de défense de l'organisme.
Elle repose sur la capacité des protéines chargées à migrer au travers des pores d'un gel lorsqu'on applique un courant électrique.
Principe :
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2µl de sérum sont disposés dans un endroit convenable de la bande d’acétate de cellulose imbibée de tampon sodique de pH 8,6.
Technique :
Les protéines chargés négativement à ce pH lorsqu’elles sont soumises à un champs électrique se déplacent vers l’anode (électrode positive) avec des vitesses dépendant de leur charge.
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Détection d'anomalies immunitaires :
Sérum humain normal :
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Sérums pathologiques
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Électrophorèse de l’ADN (sur gel d'agarose) :
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