"Everything you always wanted to know about sex (but were afraid to

ask)" in Leishmania after two decades of laboratory and field analyses.

Rougeron V., De Meeûs T., Kako Ouraga S., Hide M., Bañuls A-L.

Laboratoire d’accueilInstitut de Recherche pour le Développement

Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses

(UMR CNRS/IRD 2724)

Contexte des maladies infectieuses et parasitaires

- 2ème cause de mortalité dans le monde

- OMS : ¼ des décès dus aux maladies infectieuses et parasitaires

Echelle globale - Dynamique

- Organisation

Un domaine de recherche COMPLEXE

Foyer de transmission

Pathogènes

circulants

Hôtes réservoir

s

Vecteurs

Agents infectieux

Processus biologiques

Structure des populations

Transmission de la maladie

Challenge : mieux comprendre et appréhender l’épidémiologie et les cycles

de transmission des pathogènes

Mode de reproduction de l’agent infectieuxMultiplication et transmission des gènes : propagation de la

maladie.Structure génétique des populations et des

stratégies de reproduction :

- compréhension des patterns et des cycles de transmission,- le diagnostic, les enquêtes épidémiologiques ou le développement de vaccins ou de médicaments.

BUT : Progrès faits dans la connaissance du système de reproduction du modèle

Leishmania

Observations expérimentales du mode de reproduction difficiles, voire

impossibles …

Un modèle d’étude captivant : les leishmaniesEn 2002, l’OMS a estimé:

- 350 millions le nombre de personnes à risque,

- 2.357.000 le nombre de nouveaux cas / an,

- Réactivation de nombreux foyers,

- Emergence de nouveaux foyers,

- Sous-estimation de la gravité et de la sévérité de ces parasitoses, et de leur impact socio-économique.

- Importance des co-infections VIH/leishmaniose,

Important problème de

santé publique

Chez le vertébréChez le phlébotome

Repas sanguin

Promastigote de multiplication

Amastigotes dans un

macrophage

Promastigote métacyclique :

forme indivisible

Un cycle biologique complexe

(Schéma du cycle biologique des Leishmania, modifié d’après http://dpd.cdc.gov/dpdx)

Chez le vertébréChez le phlébotome

Repas sanguin

Promastigote de multiplication

Amastigotes dans un

macrophage

Promastigote métacyclique :

forme indivisible

Formes cliniques majeures

Leishmaniose cutanée

Leishmaniose

mucocutanée

Leishmaniose viscérale

PKDLPost-Kala-Azar Dermal Leishmaniasis

Outils moléculaires peu adaptés

Soit pas assez résolutifs (MLEE,

RFLP), soit dominants (RAPD), soit

multifactoriels (PFGE).

Echantillons mal adaptés

Petite taille, répartitions

géographique et temporelle

larges

Déséquilibre de liaison

Estimation précise de la proportion de reproduction sexuée ou de clonalité mal

aisée(De Meeûs et Balloux 2004)

Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité

Deux hypothèses s’opposent :

- Majoritairement clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels.

- Reproduction sexuée, de type automictique (fusion de gamètes descendants d’un même germe cellulaire).

(Tibayrenc et al., 1990)

(Bastien et al., 1992)

MAIS…

Théoriquement, dans un modèle

clonal strict

Accumulation indépendante de

mutations

Production d’excès en

hétérozygotes

Modèle clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels.

Postulat : les descendants sont génétiquement identiques à leurs parents

Faibles taux de locus

hétérozygotes et une structure génétique non

strictement subdivisée en

lignées individualisées.

Résultats en

contradiction

Cependant…

(Balloux et al. 2003; De Meeûs et al. 2006)

Théorie clonale : (Tibayrenc et al., 2000)

(Judson and Normak, 1996; Welch et al. 2000)

(Bañuls A-L., 1998)

Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité

• 124 souches humaines de L. (V.) braziliensis

• Génotypage sur 12 locus microsatellites

• Caractéristiques des sites d’étude : départements, forêt

amazonienne, grande diversité en termes de

faune et de flore

-Bolivie, 1994

-Bolivie, 1998

-Pérou, 1993

-Pérou, 1994

• Leishmanioses cutanées et muco-cutanées• 4 sous-échantillons

Plus de sexe chez les Leishmanies?

(Rougeron et al., Molecular Ecology ressources, 2008)

Méthodes d’analyseGénétique des populations• Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT

v. 2.3.9.2.Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes

produits par l’association aléatoire des gamètes.

- FIS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1),

FISFIS

FISFIS

Méthodes d’analyseGénétique des populations

• Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2.

Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes produits par l’association aléatoire des gamètes.

- FIS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1),

-1

+1

0Panmixie

Clonalité

Autofécondation

Méthodes d’analyseGénétique des populations

• Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2.Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes

produits par l’association aléatoire des gamètes.

- FIS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1),

- s : taux d’autofécondation extrapolé,

FIS = s / (2-s) s = (2*FIS) / (1+FIS)

FISFIS

FISFIS

- DL : association non aléatoire des allèles à différents locus.

• Tester l’existence d’un effet Wahlund :

Se produit lorsque l’échantillon considéré est en réalité

composé de plusieurs sous-populations.

BAPS v. 4.1 = Bayesian Analysis of Population Structure- Inférer la structure génétique d’une

population- Déterminer l’existence de clusters intra-population sur la base des génotypes multilocus

• Vérification de la cohérence des hypothèses proposées : EASYPOP v. 2.0.1.

FSTAT v. 2.3.9.2 = déficit en hétérozygotes, FIS, calculé à nouveau.

Forts déficits en hétérozygotes

- Valeur moyenne FIS = 0,504

- Taux d’autofécondation estimé correspondant : s = 0,67

Graphe n°1 :

Déficit en hétérozygotes dans chacune des populations

Graphe n°2 :

Déficit en hétérozygotes pour chacun des 12 locus étudiés

Résultats :

(Rougeron et al., PNAS, 2009)

Effet WahlundGraphe n°3 :

Déficit en hétérozygotes pour chaque population et et après clusterisation des

populations (BAPS)

- Nombre de clusters : 13 à 15 / population

- Forte diminution des FIS au sein des 4 populations

étudiées

MAIS, les valeurs de FIS restent importantes : FIS =

0,307

Taux d’autofécondation s = 0,47.

Déséquilibres de liaison significatifsDL significatifs pour 13 des 66 paires de locus étudiées

Résultats :

(Rougeron et al., PNAS, 2009)

Forts FIS = faible hétérozygotie, DL significatifs

Effet Wahlund

Diminution des valeurs de FIS

Sous-structuration géographique

Barrières géographiques

Biologie des réservoirs

mammifères et des vecteurs

Présence d’un effet Wahlund, MAIS…

Clonal = faible FIS = forte hétérozygotie, DL significatifs

(Rougeron et al., PNAS, 2009)

Les valeurs de FIS restent importantes…Mode de reproduction mixte

Alternance de différents modes de reproduction :

Hypothèse testée sous Hypothèse testée sous EASYPOPEASYPOP

• Clonalité,

• Recombinaison sexuée entre individus apparentés, • Evènements de recombinaison sexuée entre individus non apparentés

s ~ 47%

c ~ 50%

r ~ 3%

L. (V.) braziliensis : (Rougeron et al., PNAS, 2009)

• Echantillon structuré en petites sous-populations• Echantillon caractérisé par un mode de reproduction mixte

Encore plus de sexe chez certaines espèces de leishmanies.Régime de reproduction mixte

Alternance de différents modes de reproduction :

Clonalité Evènements de recombinaison entre individus

non apparentés

Reproduction sexuée, de

type allogamique

Evènements de recombinaison entre individus

apparentés

Reproduction sexuée, de

type endogamique (Rougeron et al., PNAS, 2009)

Clonalité

Clonalité

Alternance de différents modes de reproduction : cycle de vie

EndogamieAllogamie

Exemples :

- P. falciparum

- Trypanosoma brucei brucei

Chez le vertébréChez le phlébotome

Repas sanguin

Promastigote de multiplication

Amastigotes dans un

macrophage

Promastigote métacyclique :

forme indivisible

(Rougeron et al., PNAS, 2009)

Rougeron et al., PLoS Pathogens, 2010

Confirmation de l’hypothèse d’endogamie

Mise en évidence de phénomènes de recombinaison génétique entre individus issus de deux souches différentes de L.

major.

Résistante à la

drogue A

Résistante à la

drogue B

Hybrides résistants aux deux drogues

Première étude à mettre en évidence expérimentalement l’existence de

reproduction sexuée chez les leishmanies.

2/ Valider expérimentalement l’existence d’endogamie

1/ Mener le même type d’étude de génétique des populations sur d’autres espèces de leishmanies

Quelles sont les prochaines étapes?

Résultats en désaccord avec la théorie clonale pour certaines espèces du genre Leishmania

Mode de reproduction mixteAlternance de différents modes de

reproduction

BUTS : Etudier la composition génotypique d’une souche hétérozygote.

Suivre au cours du temps l’évolution des génotypes. HYPOTHESE : L’attendu d’un mode de reproduction endogamique est une diminution de l’hétérozygotie au cours du temps.

Une souche = une population de génotypes ≠ un seul génotype

Jusqu’à présent les études de génétique des populations considéraient une souche

comme un seul individu.

Etude préliminaire :

Kako et al. (Session Poster)

Quelles sont les prochaines étapes?

Quelles sont les prochaines étapes?

3/ Le vecteur = unité de reproduction ?

Isoler les parasites Etudes de

génétique des populations

Développer une technique de biologie

moléculaire

Exemple : P. falciparum

REMERCIEMENTS

Projets :

- European Community SD3 project (n8TS3*-CT92-0129)

- French National Project ANR 06-SEST-20 IAEL

Laboratoires :

- Unit of Molecular Parasitology from the Institut voor Tropische Geneeskunde, Belgium

- Institudo de Medicina Tropical ‘Alexander von Humboldt’, Peru

- Laboratoire de Parasitologie et de Mycology de Montpellier