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DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN

HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 :HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 : New New

Tools: SNP arrays,Tools: SNP arrays, mutations, Expression profiles mutations, Expression profiles

S. D. RaynaudS. D. RaynaudDépartement d’Hématologie BiologiqueDépartement d’Hématologie Biologique

CHU de NiceCHU de Nice

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Trois décennies de recherche en onco-hématologie

GénétiqueGénétique MoléculaireMoléculaire

Protéomique / NGS /Protéomique / NGS / Génomique Génomique

FonctionnelleFonctionnelle

CytogénétiqueCytogénétique

GénomiqueGénomiquetranscriptomiquetranscriptomique

1980 1990 2000 2010

Bases moléculaires des hémopathies=> Amélioration de la prise en charge des patients

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Délétion: caryotype

Régions communes de délétion, double minutes, homogenous staining regions, caractérisation des gènes partenaires de translocations.

Del 16q Normal

Cytogénétique

Délétions, amplifications, double minutes, caractérisation des partenaires d’une translocation.

FISH

Délétion p53

Délétion

Southern blot : délétions et

amplifications

Techniques classiques de détection des déséquilibres Techniques classiques de détection des déséquilibres chromosomiques et géniqueschromosomiques et géniques

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Comparaison des méthodes actuelles de caractérisation des Comparaison des méthodes actuelles de caractérisation des déséquilibres chromosomiquesdéséquilibres chromosomiques

Méthode

Résolution(Sensibilité en % cell

anormales)

Détection des UPD

NécessiteCellules en

division

Distinction entre clones

individuels

Caryotype sur métaphases

Faible (10 à 15%)

Non Oui Oui

FISH Faible (élevée)

Non Non Oui

CGH arrays Elevée (20-30%)

Non Non Non

SNP arrays Très Elevée (20-

30%)

Oui Non Non

FISH: Fluorescent in situ Hybridization CGH: Comparative Genomic HybridizationSNP: Single Nucleotide Polymorphism UPD: Uniparental Disomy

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• Support solide (verre, plastique, métal, silicone)

• Chip = cible miniaturisée composée de clones ADNs (BAC, PAC, P1s, oligonucleotides)

• Taille des clones variable (oligomères à 200 kb

• Nombre de clones par array: < 300 à > 250 k

• Basée sur principe biochimique de l’hybridation complémentaire ADN/ADN

• ADNs test et référence sont marqués par fluorescence : Cy3 (tumeur) / Cy5 (référence)

• Hybridation compétitive des ADNs test et référence sur les séquences cibles

Nouveaux outils de détection : CGH sur microarray. LE PRINCIPENouveaux outils de détection : CGH sur microarray. LE PRINCIPE

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• ADN (0.1 g à 5 g) marqué par random priming avec incorporation de colorants fluorescents (Cy3 & Cy5)

• Dénaturation d’ADN Cot-1 et de l’ADN marqué• Pré-hybridation• ADNs marqués appliqués sur la lame• Hybridation (conditions variables)• Lavages• Puces scannées, puis étapes de quantification du signal,

normalisation, et exploitation des données grâce à des logiciels dédiés

• Plateformes spécifiques (four à hybridation, station de lavage, scanner, logiciels informatiques dédiés)

CGH sur microarray : LA TECHNIQUECGH sur microarray : LA TECHNIQUE

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Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arraysNouveaux outils en cytogénétique : CGH arraysDétection des gains et pertes de matériel génétiqueDétection des gains et pertes de matériel génétique

Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300

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Nouveaux outils en cytogénétique : Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arraysCGH arrays

Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300

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Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q14.2-3Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q14.2-3

D13S319 / D13S25 D13S319 / D13S25 (Microarray 300 Abbott)(Microarray 300 Abbott)

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LLC stade A avec Del 13q14.2-3 Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32

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LLC stade A avec Del 13q14.2-3 Délétions multiplesDélétions multiples / / Ampli 9q11.2Ampli 9q11.2

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Délétion:

LOH marqueur microsatellite

Etude des LOH par analyse des MicrosatellitesEtude des LOH par analyse des Microsatellites

Paradigme de la progression tumorale: Mutation d’un allèle, perte de l’allèle normal et duplication de l’allèle anormal.

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Single nucleotide polymorphism (SNP)

TGCAT GCATGCA : Allele A

TGCAA GCATGCA : Allele B

CHIP ADN

Sonde SNP Oligonucléotide

Analyse des cancers humains par SNP-CHIP

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Data analysis of SNP-CHIP

Heterozygosity (A/B)

Allele A Allele B

Hybridized

signal

Matched Normal

Hybridized

signal

Tumor

Allele B is missing in Tumor Gene dosage reduction Gene dosage reduction

Homozygosity (A/A)

Allele specific gene dosage Total gene dosage Allele A Allele B

Matched Normal

Tumor

Allele specific Total gene dosage

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A gauche, technique utilisée par Affymetrix SNP-A; à droite, bead array plateforme utilisée par Illumina (San Diego, CA), incluant les variants 1 et 2 couleurs utilisés par les arrays Infinium I et II X (Illumina).

Maciejewski, J. P. et al. Blood 2008;112:965-974

Analyse bioinformatique:•Mesure les pertes d’hétérozygotie par génotypage (fréquence des calls hétérozygotes) et détermination de l’intensité des signaux d’hybridation. Traitement des données via différents logiciels. Ex. CNAG qui combine l’analyse des CNV et des LOH•Résultats à évaluer en tenant compte de la variabilité normale du génome:•12% du génome contient 1500 régions variables (CNV) type duplications et délétions•taille moyenne de chaque CNV 20Mb•Des centaines de gènes sont en CNV Détection des CNA et UPD

Principes de base des techniques de SNPs appliquées au caryotypage moléculaire (allelo-karyotyping)

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Chromosome 9

Dosage génique

Héterozygotie

Dosage génique spécifique d’allèle

LOH

Délétion homozygote

Délétion hétérozygote

Réduction du Dosage Génique

Barres roses : LOH détectées dans tumeurs

Un allèle est absent, l’autre allèle est intact

420

210

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Chromosome 9 (UPD) Chromosome 10 (Normal)

Dosage génique

Hétérozygotie

Dosage génique spécifique d’allèle

Dosage génique normal

LOH: Loss of Heterozygosity

Un allèle délété (Vert)Un allèle amplifié (Rouge): Uniparental disomie (UPD)

420

420

210

210

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Entraînent LOH sans anomalie du dosage génique.Ce phénomène concerne des fragments de chromosomes ou des

chromosomes entiers. Dispersés sur tout le génome.Conséquences potentielles en oncologie: duplication d’un gène muté,

homozygotie d’un allèle de susceptibilité, duplication d’un gène avec profil

de méthylation atypique, haploinsuffisance...

Attention:Ne pas confondre avec faux LOH ou LOH reliquat d’une étape précoce

de l’embryogénèseLOH détectés chez 8% à 10% individus contrôlesTous sont interstitiels et ont une taille moyenne de 8,7Mb (Maciejewski et

al, Blood 2008)Toute lésion interstitielle <24.8Mb (95% CI) est exclue ou doit être

confirmée par étude du tissu sain du patient (Maciejewski et al, Blood 2008).

Identification de UPD somatiquesIdentification de UPD somatiques

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ALGORITHME DIAGNOSTIQUE POUR L’IDENTIFICATION D’UNE ALGORITHME DIAGNOSTIQUE POUR L’IDENTIFICATION D’UNE ANOMALIE CHROMOSOMIQUE D’ORIGINE SOMATIQUEANOMALIE CHROMOSOMIQUE D’ORIGINE SOMATIQUE

Exclure une CNV par :Exclure une CNV par : la taille de l’anomaliela taille de l’anomaliesa localisationsa localisationle % de recouvrement avec une CNV connuele % de recouvrement avec une CNV connue

SNP-aSNP-a

Confirmé par MC ou FISHConfirmé par MC ou FISH Ne pas pousser plus loin l’investigation

Détection d’une lésionDétection d’une lésion

Micro délétionMicroduplication

UPDUPD

télomérique

Interstitiel ≥ 25Mb

Interstitiel ≤ 25Mb

Interroger CNV database

CNV connu Pas de CNV

Germline Probablement somatique

Somatique

Somatique

Probablement non somatique

Confirmer sur CD3+Confirmer sur CD3+

D’après Maciejewski, Patras 2009D’après Maciejewski, Patras 2009

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21

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Place des SNP- et CGH-arrays dans l’analyse des SMD/AML

Objectifs principaux :

•Démembrement des anomalies cryptiques

•Impact sur le pronostic (révision potentielle des scores pronostiques)

•Corrélation avec réponse aux nouvelles molécules thérapeutiques

Quelques cibles des investigations pangénomiques :

•SMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array-SMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array-

CGHCGH

•SMD avec del(5q)SMD avec del(5q)

•SMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevéSMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevé

•Formes frontières SMD/SMPFormes frontières SMD/SMP

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Cohorte de 175 patientsFig. 5 Type, frequency, and number of lesions detected by MC and SNP-A. (A) The frequency of chromosomal aberrations and noninformative results as detected by both MC and SNP-A. The insert in the SNP-A pie chart shows the portion of acquired UPD, either as the sole change or in addition to other abnormalities. (B) The percentage of patients with 0, 1, 2-3, and more than 3 lesions, respectively, as detected by MC (■) and SNP-A (□). Pie charts demonstrate distribution of low versus advanced stage of MDS within noninformative and normal karyotypes detected by MC and SNP-A.

Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS,

MDS/MPD, and MDS-derived AML. Gondek LP et al., Blood. 2008 Feb

1;111(3):1534-42.

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Impact sur la survie du SNP-A caryotypage(Maciejewski, Patras 2009)

Grouping by lesions SurvivalLow risk – No additional SNP lesions NR

Low risk – with additional SNP lesions 157 months

Advanced risk – No additional SNP lesions 21 months

Advanced risk – with additional SNP lesions 9 months

1 - Post-SNP-A analysis risk stratification according to IPSS1 - Post-SNP-A analysis risk stratification according to IPSS

2 - Survival outcome for new recurrent lesions2 - Survival outcome for new recurrent lesions

Anomalies des Chromosomes 7, 11, 17 et 6, détectées par SNPs: valeurs de p très significatives (Log rank p=<0.0001)

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UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes

Dunbar, A. J. et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357

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UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes

Région de UPD Gène Maladie

UPD9q JAK2 MPD

UPD13q FLT3-ITD AML

UPD17q NF-1 JMML

UPD17p TP53 sAML

UPD21q RUNX1 AML

UPD19q CEBP AML

UPD4q TET2 MDS, AML, MPD

UPD1p C-MPL MDS/MPD, MPD

UPD11p WT1 AML

UPD11q C-CBL CMML, sAML

Ces régions de UPD sont aussi celles de mutations mono/bialléliques connues de nombreux gènes (JAK2, FLT3, c6MPL W515L, NRAS, p53, RUNX1…)

Profil Génomique des LMMC :43% UPD 4q24 (TET2)37% UPD 11p (WT)12% UPD 11q23.3 (CBL)8% UPD 1p13.2 (NRAS)

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Copyright ©2009 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Grimwade, D. et al. Hematology 2009;2009:385-395

Frequency of prognostically relevant molecular and cytogenetic subgroups of AML arising in younger adults

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Copyright ©2010 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Dohner, H. et al. Blood 2010;115:453-474

Figure 1 Pie chart illustrating the molecular heterogeneity of cytogenetically normal AML based on mutations in the NPM1, CEBPA, MLL, FLT3 (ITD and TKD mutations at codons

D835 and I836), NRAS, and WT1 genes

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Depuis 2005 de nouvelles méthodes de séquençage massifnouvelles méthodes de séquençage massif ayant en commun le clonageclonage et l'amplification moléculaireamplification moléculaire ont été développées. Ces méthodes permettent d’amplifier spécifiquement un fragment d’ADN isolé soit dans des microgouttes d’huiles (GS-FLX, Roche) soit par fixation sur lame (Solexa). Les étapes de clonage bactérien particulièrement longues sont ainsi évitées. Trois Trois méthodesméthodes utilisent actuellement ce nouveau système :

1. le GS FlexGS Flex basé sur l'amplification de l'ADN lié spécifiquement à une bille en émulsion et le pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate)

2. le SolexaSolexa basé sur l'amplification, l’accrochage-liaison sur puce et l'utilisation de terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes,

3. le SOLIDSOLID basé sur l'amplification par émulsion et l'hybridation-ligature chimique.

Ces méthodes offrent de nouvelles perspectivesnouvelles perspectives dans de nombreux domaines tels que la génomique médicale (impact majeur dans le diagnostic, les traitements et la prévention des maladies génétiques).

Ley et al.,Ley et al., Nature, 2008Nature, 2008 : Séquençage du génome entier d’un patient LAM Séquençage du génome entier d’un patient LAM (Illumina/Solexa)(Illumina/Solexa)

Cependant, ces avancées posent de nouveaux problèmes dans la compilation, nouveaux problèmes dans la compilation, l'étude et la fiabilité des résultatsl'étude et la fiabilité des résultats.

Next Generation Sequencing (NGS)Next Generation Sequencing (NGS)

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IRON: The IRON: The IInterlaboratory nterlaboratory RORObustness of bustness of NNGS GS StudyStudy

Aims:Aims:

• To establish 454 technology as a robust methodology to perform deep-To establish 454 technology as a robust methodology to perform deep-

sequencing analysis of hematological tumorssequencing analysis of hematological tumors

• To evaluate 454 technology in terms of interlaboratory precision and accuracyinterlaboratory precision and accuracy

• Testing of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratoriesTesting of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratories

• Sample processing including MIDs using the MLL-designed Assay-on-demand

plates (96-well) and Titanium Amplicon chemistry

• Establish a “454 Hematology Focus” group

• Publish consensus guidelines on QC and assay robustnessPublish consensus guidelines on QC and assay robustness

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IRON Study: Participants and laboratories

Austria

GB

Belgium

Germany

Germany

Italy

Austria

USA

SpainNether-lands

Italy

Dr. Gabriel, Blood Bank, Linz

Dr. Garicochea, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre

Dr. Simen, 454 Life Sciences, Branford

Prof. Vandenberghe, UZ Leuven, Belgium

Prof. Martinelli, University of Bologna

Dr. JH Jansen, Radboud University Medical Centre, Nijmegen

Switzer-land

Brazil Italy

Prof. Haferlach, Münchner Leukämie Labor, München

Dr. Timmermann, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin

Dr. te Kronnie, Università degli studi di Padova, Padova

Prof. Young, St. Bartholomews, London

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Classification morphologique des hémopathies(FAB, WHO, WF)

Classification cytogénétique des hémopathies(LAL, LAM, LNH)

Classification moléculaire des hémopathies(LAL, LAM, DLBCL)

TranscriptomiqueTranscriptomique

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Classification moléculaire des LymphomesClassification moléculaire des Lymphomes

Alizadeh et al., Nature 2000;403:503

DLBCL de l’adultepuce cDNA

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Classification moléculaire des LymphomesClassification moléculaire des Lymphomes

Wright et al., PNAS 2003;100:9991.

274 DLBCLpuce cDNA

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- Clustering à partir des 40 top gènesidentifiant chaque catégorie.- Pas d’identification des ss-classes B.- 20% des LAL restent inclassables.- 70% des gènes identifiant les HD sontsur l’X ou le 21 (indépdt de +X ou non).- 4 cas classés dans TEL-AML1, sans t(12;21) Tous anormaux pour TEL.

Yeoh et al., Cancer Cell 2002;1:133.

360 LAL pédiatriquespuce Affymetrix

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Comparaison LAL / LAM

38Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41.

Nouvelles cibles thérapeutiquesNouvelles cibles thérapeutiques

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COST:European COST:European COCOoperation in the field of operation in the field of SScientific and cientific and TTechnical researchechnical research

Kick-off meeting : Novembre 2008 / Durée 4 ansKick-off meeting : Novembre 2008 / Durée 4 ans

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Chair: K. MillsChair: K. Mills

Chair: L. Bullinger

Chair: S. Raynaud

Chair: S. Lehman

Chair: RA Padua

Chair: M. Dugas

17 pays européens17 pays européens