18/02/2007

1

Les Archaea - le troisième domaine du vivant

BMC429cours de G. Sezonov

- 2007 -

http://genetique.snv.jussieu.fr/master1.htm

1

-les Archées sont des procaryotes unicellulaires

-les Archées ne sont pas des bactéries

-les Archées ne sont pas que des bêtes exotiques vivant dans des conditionsextrêmes dans des endroits inaccessibles et uniques (sources chaudes, fond d’océan).

- elles sont partout et représentent jusqu’à 20% des procaryotes en biomasse ;

Les notions à retenir à la fin du cours

2

La découverte des Archaea (archées, archéobactéries)

3

Partie I

Les classifications du vivant au XX siècle – classification de Robert Whittaker (1969)

Cinq règnes du vivantreprésentant 2 mondes

eucaryotes et

procaryotes

= bactéries

=

procaryotes

eucaryotes

4

Trois domaines du vivant de Carl Woese

1977-1990-nouvel arbre du vivant basé sur laphylogénie moléculaire

- trois domaines de la vie- découverte des Archaea

« the Woesian Revolution »

Bacteria Archaea Eucarya

ancêtre commun universel

procaryotes

Woese is currently a professor of Microbiology University of Illinois at Urbana-Champaign.

5

Questions à poser

- pourquoi les Archées n’ont-elles pas été découvertes plus tôt ?

- comment ont-elles été découvertes?

6

18/02/2007

2

3 groupes de procaryotes connus depuis longtemps et mal classifiés

Par leur phénotype

-petites cellules; - pas de noyau; - pas d’organites

ils ressemblent aux procaryotes typiques et ne peuvent pas être distingués des bactéries

les méthanogènes les halophiles

Methanobrevibacter HalobacteriumHalococcus

en réalité, ce ne sont pas des bactéries mais des Archées (Archaea)

Sulfolobus acidocaldarius60-95°C pH 1-5

les extrêmophiles

7

Une archée hyperthermophile, Sulfolobus solfataricus

L’observation au microscope ne permet pas de constater la différenceentre les vraies bactéries et les archées

8

les méthanogènes les halophiles

Methanobrevibacter HalobacteriumHalococcus Sulfolobus acidocaldarius60-95°C pH 1-5

les extrêmophiles

9

La découverte du méthane – gaz combustible – par Alessandro Volta en 1776 – Lac Majeur

le gaz est produit par une « bactérie » appelée méthanogène et habitant dans les marais

10

Les méthanogènes: une biodiversité extraordinaire

Habitats variés:- eaux stagnantes (marais, station d ’épuration)- sol- lacs salés- zones volcaniques- sédiments sous-marins des sources chaudes- tractus intestinal des mammifères (homme inclus)

Modes de vie très variés:- adaptation à la salinité- adaptation à toutes les températures

Methanogenium frigidum (15°C)Methanopyrus, 100°C

11

… ce sont les seuls organismes sur Terre à produire du méthane:

méthanogenèse

CO2 + 4H2 = CH4 + 2H2O

réduction du CO2 ou des substrats méthylésen utilisant l’hydrogène comme donneur d ’e-

CONDITIONS: anaérobie stricte; une réductase avec des coenzymes uniquescontenant le Ni2+

Les méthanogènes: comme leur nom l’indique…

12

18/02/2007

3

l’étude phénotypique et métabolique des méthanogènes ne permettait pas de mettre en évidence leur différence par rapport aux autres bactéries

Conclusion

Alors – les méthanogènes, sont elles tout simplement des bactéries bizarres?

13

les méthanogènes les halophiles

Methanobrevibacter HalobacteriumHalococcus Sulfolobus acidocaldarius60-95°C pH 1-5

les extrêmophiles

14

Un organisme halophile (du grec alos, sel et philein, aimer) est un organisme qui a un besoin absolu de fortes concentrations en sel pour vivre

Procaryotes- Halobacterium- cyanobactérie Aphanothece halophytica

Eucaryotes- une algue verte Dunaliella salina

Les halophiles sont parmi les premiers extrêmophiles connus

Les extrêmophiles sont des organismes capables de vivre dans des conditions de température, pression , salinité, acidité, rayonnement… extrêmes, qui seraient mortelles pour la majorité des êtres vivants.

15

Great Salt Lake, Utah, USA La Mer morte Marais salants,Californie

Les extrêmes halophiles - habitat

16

Type trophique : chimioorganotrophes - acides aminés , acides organiques

Respiration: aérobes obligatoires

Division cellulaire: fission binaire; pas de noyau – procaryotes typiques

Capacité de mouvement : motiles

Les procaryotes extrêmes halophiles

Haloferax sulfurifontis Halobacterium

17

les études phénotypiques et métaboliques de certains halophiles ne permettaient pas de mettre en évidence leur différence par rapport aux autres bactéries

Conclusion

Alors – tous les procaryotes halophiles, sont elles tout simplement des bactéries bizarres?

18

18/02/2007

4

La taxonomie classique des microorganismes est difficile et inexacte…

Les critères sont

- morphologie- coloration- métabolisme- habitat-- autres ??

… et ne reflète pas l’évolution réelle du monde des procaryotes

19

Les macromolécules, témoins de l’évolution

(Emile Zuckerkandl, Linus Pauling)

1965

nouvelle approche – la phylogénie moléculairebasées sur l’analyse de séquences des gènes

20

L’ADN en tant que mémoire de l’évolution

- les gènes ont une histoire commune car ils descendent d’un même ancêtre.

- l’analyse de rares changement dans la séquence d’ADN codantpermet de construire un arbre phylogénique

gène ancestral

2A

1A1

1 2

2B

1A2

1B

1B1 1B2

21

Arbre phylogénique d’un gène …

….reflète l’histoire naturelle des espèces

22

Phylogénie moléculaire des grands groupes – avec quel(s) gène(s)?

Les gens candidats doivent être :

- ubiquitaires- fonctions conservées et essentielles- riches en informations = suffisamment long

les ARN ribosomaux - ubiquitaires et essentiels

toutes les cellules possèdent des ribosomes !!!

23

Quel ARNr?

ARN 16S – 1400 - 1500 nt(18S chez eucaryotes)

- plus riche en information que le 5S – 120-130 nt

-plus facile à étudierque le 23S – ~3000 nt

Pour comparer il faut connaître la séquences de ARN 16S venant de plusieurs espèces

24

18/02/2007

5

2007 - comment déterminer la séquencer de l’ARN 16S d’une espèce?

On séquence le gène codant cet ARN

ou (mieux)

on séquence le génome en entier et on cherche des gènes codant pour les ARNr

Nitrosomonas europaea complete genomesequence and annotation.

25

Construire un arbre phylogénique en 2007

organisme séquence

A

B

C

D

séquences identiquescar leurs origine est ocmmune

changements accumulés au coursde l’évolution

B et C sont proches – 3 points de différence A et D sont éloignés - 5 points de différence

séquencesdes gènes codant les ARNr16S disponibles

26

Construire un arbre phylogénique en 2007

Un arbre phylogénique reflète la distance séparant les espèces

27

1977 – la technique employée par C. Woese pour séquencer l’ARN 16S

- la technique de séquençage de l’ADN est inconnue

- cependant, l’ARN 16S peut être facilement extrait des ribosomes

- une technique laborieuse permet de comparer les séquences des différents ARN

28

Les bibliothèques d’oligonucléotides

diapo

29

Production d’un catalogue d ’oligonucléotidesdigérés par la RNAse T1

coupure sur Gpar l’RNase T1

30

trop courtes pour être spécifiques

bibliothèque des oligos

les oligos assez spécifiques à partir de 5-6 nt

18/02/2007

6

Les bibliothèques d’oligonucléotides

31

La comparaison des bibliothèques d’oligonucléotides

Sab – la coefficient de similarité (ou coefficient d'association)

espèce a espèce b

32

Les premiers résultats de Woese –les bactéries sont loin des eucaryotes

– les chloroplastes sont des ex-bactéries

proches

éloignés

proches

éloignés

proches

éloignés

33

Carl Woese entreprend alors l’analyse des « bactéries bizarres »:

- les méthanogènes

- les halophiles

- les hyper thermoacidophiles (Sulfolobus)

34

Le résultat

les « bactéries » bizarres

35

Les « bactéries » bizarres ne sont pas les bactéries (ni les eucaryotes).Une autre forme de vie??

Trois formes de vie

existence de la troisième forme de vie

I ére forme de vie - eucaryotes

II éme forme de vie - eubactéries

36

18/02/2007

7

- les méthanogènes sont aussi éloignés de l’homme que des bactéries

- les trois groupes analysés

-méthanogènes-halophiles -hyperthermophiles

forment un domaine très distincts de ceux de vraies bactéries et d’eucaryotes

C. Woese appelle ce domaine Archeobactéries devenu aujourd'hui Archées (Archaea)

Conclusions

37

LUCA –« last universal common ancestor »

procaryotes eucaryotes

38

Domaines :

diversification sur Archaea et Eucarya

En 2003 Carl Woese reçoit le Prix Crafoord à Stockholm

Le Prix Crafoord a été créé par Holger Crafoord, l'inventeur du rein artificiel1980. Administré par l'Académie royale des sciences de Suède, le prix a pourobjet de récompenser et de promouvoir la recherche dans les disciplinesscientifiques qui ne sont pas reconnues par un Prix Nobel. Ces domainessont les mathématiques, la géologie, la biologie (en particulier l'écologie etl'évolution) et l'astronomie.

39

Evolution du monde vivant à l’échelle du temps

LUCA –« last universal common ancestor «

organismes multicellulaires

oxygène

évolution indépendante de 3 lignées de vie

nous

800 My

2,2 Gy

3,5 Gy

4,5 - 4,8 Gy

formation de la planète Terre40

41

Identifier les nouvelles archées – où et comment?

Partie II

Les premières archées identifiées par C. Woese sont essentiellement des extrêmophiles

-halophiles

-thermoacidophiles

Cherchons les extrêmophiles….. dans les endroits extrêmes:

- lacs hyper salées

- sources chaudes géothermales

42

18/02/2007

8

Wolfram Zillig Karl Stetter

Les deux grands explorateur du monde des Archaea extrêmophiles

Pyrococcus furiosus – producteur de la polymérase - Pfu 43

Les principales sources chaudes géothermales sur Terre

Italie

44

« Hot spots »- explication des géologues

manteau2900 km

plaque tectonique

plume

Geologists have identified some 40-50 such hotspots around the globe, with Hawaii, Réunion, Yellowstone, Galápagos, and Iceland

45

noyau

Islande

Italie, Sicile

USA, Yellowstone Park

conditions –température 85-115°CpH – de 0 à 2 riche en H2SO4

46

L’étonnante richesse morphologique et métabolique des Archées hyperthermophiles et acidophiles

47

Découverte des

hyperthermophilesneutrophiles

anaérobies

Thermotoga

Desulfurococcus

Pyrobaculum

Staphylothermus

Methanopyrus

Thermoproteus

48

18/02/2007

9

optimum

minimum90°C

maximum113°C

Une résistance extraordinaire à la chaleur

49

Les archées sont les champions de la thermorésistance

0

60°C

113°C

EUCARYOTES

113°C

90°C

ARCHAEA

BACTERIA

80°Chyperthermophiles

50°C

thermophiles

50

Les premières formes de vie ont été hyperthermophiles

les branches courtes et profondes de l’arbre de vie sontreprésentées exclusivement pardes hyperthermophiles

LUCA51

L’arbre phylogénique des Archaea cultivables

phylum Crenarchaeotaphylum Euryarchaeota

hyperthermophiles

halophiles

méthanogènes

52

- structure de la cellule et thermorésistance

- réplication de l’ADN

- transcription

- traduction

- métabolisme et adaptation aux conditions de leurs environnements

La biologie des Archaea

53

Partie III

processus informationnels

54

Les Archaea ressemblent à la fois aux bactéries et aux eucaryotes

mais elles portent également un certain nombre de gènes uniques

Transcription

Translation

DNA replication

DNA reparation

18/02/2007

10

La paroi: bactéries vs archées

Bactéries

Gram+ Gram-

Archées

la majorité des archées possèdent la couche S (S-layer) qui joue le rôle de paroi S layer- est composé de protéines ou de glycoprotéines - qui forment une structure régulière rassemblant à

celle d’un cristal (structure paracristalline)

S layer

55

- certains méthanogènes possèdent du pseudopeptidoglycane

lien

pep

tid

iqu

e

lien

pep

tid

iqu

e

bactéries archées méthanogènes

La paroi: bactéries vs archées – l’exception des méthanogènes

56

La membrane cytoplasmique: bactéries /eucaryotes vs archées

une archée typique

bactéries

archées3 points principaux qui distinguent la membraned’Archaea:

- chiralité du glycérol- liaison ester entre Gly-chaine non polaire- présence des chaines isopréniques

ramifiées

57

Archées – les lipides de la membrane cytoplasmique

BacteriaEukarya

Archaea

diéster phosphoglycerolacides gras non saturé, non ramifiés

diéther phosphoglycerolchaines isoprène saturées ramifiées

de 20 à 40 carbones

58

La membrane plasmiques : bi- et tétra- éthers; sa structurepolaire

non polaire

non polaire

caldarchaeol

membranebi-couche

membranemono-couche

lipide mono polaire

lipide bipolaire

membranemixte (de 1 à 95% de lipides bipolaires)

hyperthermophilesthermoacidophiles

59

H+

H+H+

H+

H+

H+ H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+

Membrane classique Membrane formées

de glycérides géants

100°C 100°C

Pompe

protéique

H+

H+

H+

H+

archéesbactéries/eucaryotes

membrane perméabledépolarisée

membrane non perméabletoujours polarisée 60

18/02/2007

11

61

Archaea – d’autres mécanismes facilitant l’adaptation aux températures extrêmes

hyperT reverse gyrase

Reverse gyrase est présente chez tous les hyperthemophiles –bactéries comme archées

62

Hyper thermorésistance des Archées - ADN

Gyrase – une topoisomérase II capable d’introduire des supertours négatifs dans l’ADN. Elle relaxe l’ADN surenroulé positivement et produite l’ADN surenroulé négativement.

Reverse gyrase – une topoisomérase capable d’introduire des supertours positifs

gyrase

reverse gyrase

présente chez tous leshyperthemophiles –bactéries comme archées

63

(+)

(-)

se dénature à plus haute température???

état normal de l’ADN

L ’ADN circulaire fermé résiste à la dénaturation jusqu’à 107°C

64

même sans être surenroulé positivement

Le rôle exact de la reverse gyrase est incertain

1990

2004

65

Comment l’ARN des hyperthermophiles est-il protégé ?

Hyper thermorésistance des Archées – ARN

A haute température l’activité du radical OH- dissocie la molécule d’ARN

66

18/02/2007

12

nucléotides modifié spécifiques aux Archaea

Chez les hyperthermophiles, les ARNt sont stabilisés par des modifications chimiques

67

Les protéines des hyperthermophiles sont stabilisées par une augmentation dunombre d’interactions ioniques entre acides-aminés

Les protéines hyperthermophiles sont enrichies en acides-aminés chargés- Asp, Glu, Lys, Arg

- diminution des résidus thermo instables : Asn, Gln, Cys

Certaines protéines hyperthermophiles peuvent fonctionner jusqu'à 140°C !

Hyper thermorésistance des Archées – les protéines

68

69

Archaea – les processus informationnels

Réplication de l’ADN chez Archaea

bactéries eucaryotes archées

ori

- unique site ori- réplication bidirectionnelle

- multiples sites ori- réplication bidirectionnellesur toutes les ori

?

70

Archée+Bacteriés : peu d‘introns et de séquences répetées (Alu etc)

(277 on 21.4.04)

(21 on 21.4.04)

(46 finished + unfinished on 21.4.04)

Chromosome – Archaea vs Bacteria vs Eukarya

71

Origines de réplication

bactéries eucaryotes archées

sites ori 1 multiples de 1 (Pyrococcus abyssi)à 3 (Sulfolobus solfataricus)ou plus ?

sites ori toujours très proches du gène orc1/cdc6

cdc6-1

cdc6-2

cdc6-3

ori1

ori2

ori3

72

18/02/2007

13

Initiation de réplication

bactéries eucaryotes archées

DnaChélicase loader

DnaAinitiation

DnaBhélicase

ORC« origin recognition complexe» 6 protéines Orc (1-6)

Cdc6

Mcm(2-7)hélicase

Orc1/Cdc6 fusionnée

Mcm(6)hélicase

73

La composition du réplisome

protéines bactéries eucaryotes archées(Sulfolobus)

hélicase DnaB MCM(2-7) MCM(6)

protéine se fixant à l’ADN ss

SSB RPA RPA

primase DnaG plusieurs Pri

plusieurs Pri

DNA pol PolIII familles A,B,C,D,X et Y

famille B -réplicationB1, B2, B3famille Y –réparationDpo4

sliding clamp b - clamp PCNA PCNA

clamp loader g -complexe

plusieurs RFC

plusieurs RFC

74

La vitesse de réplication

bacteries eucaryotes archéesP. abyssi

vitesse de réplication kb/min

50 2 15-20

taille de fragments d’Okazaki

~ 2000 ~120 ~120

Euryarchaea (1 ori)Pyrococcus abyssi

DNA pol. 300nt s-1

Genome: 1765kbEst. repln time: 49 min

Crenarchaea (3 oris)Sulfolobus solfataricus

DNA pol. 80-110nt s-1

Genome: 2992kbEst. repln time: 76 min

Sulfolobus acidocaldaricusDNA pol. 80-100nt s-1

Genome: 1900kbEst. repln time: 52 min

Les archées répliquent leurs chromosomes aussi vite que les bactériestout en utilisant les protéines de réplication eucaryotiques

75

Promoter Operator Gene 1 Gene 2 Gene 3 Terminator

mRNA

Protein 1 Protein 2 Protein 3proteins

5‘- -3‘

RNApol.

ribosome

La transcription chez les Archées

les gènes forment des opérons régulés comme chez les bactéries par des répresseurs ou activateurs qui se lient à l’ADN

76

La transcription chez les Archées

• RNA polymérase d’Archaea

• 12 sous-unités

77

Eukaryotes Archaea

TBP+TFIID+TFIIA TBP - TATA box binding protein

TFIIB TFB

TFIIETFIIFTFIIH

RNApol IIRNApol II

TFEoptional

Initiation de la transcription

78

18/02/2007

14

Les promoteurs chez les bactéries et chez les archées

bactéries

archées

purines riche siteBRE

79

Archaeal transcriptional regulatorsEuryarchaeota

Crenarchaeota motif

HTH

HTH

HTH

Les régulateurs transcriptionnels chez les Archaea

80

typebactérien

typebactérien

168 proteins23 families

AsnC/Lrp is the most abundant

51 proteins11 familiesincluding metal- bindingand Zn-finger-likemotifs

61 protein(RpoB, Spt5…)

60%archaeal/bacterial

18%archaeal/eukaryotic

22%universal

Les Archaea transcrivent leurs gènes comme les eucaryotes mais régulent leur expression via des régulateurs de type bactérien

81

Bacteria Archaea Eukaryotes

RNA-Pol. 1 typesigma factor

1 type (similar toeukaryotic RNA pol.II)

RNA pol. I: rRNARNA pol. II: mRNARNA pol. III: tRNAmany cofactors

promoter

initiator element

coding monocistronicpolycistronic (operon)

monocistronicpolycistronic (operon)

monocistronic

82

Transcription: le résumé

Traduction chez les Archaea – un système plutôt eucaryotique

bactéries archées eucaryotes

ribosomes 70S=30S+50S 70S=30S+50S 80S=40S+60S

rARN 16S/5S+23S~1400nt

~130nt~3000nt

16S/5S+23S 18S/5S+5,8S+28S

opérons ribosomaux:le nombre

de 1 à 7 (E. coli)ou plus

1 seul r opéron sauf méthanogènes et

halophiles

beaucoup

opéron r:les gènes

16S—tARN—23S —5S—tARN

16S—tARN—23Set 5S à part

18S—5,8S—28S et 5Sà part

codons d’initiation

ATG, GUG, UUG ATG, GUG, UUG ATG

ribosome bindingsite(RBS)

de type Shine-Dalgarno

de type Shine-Dalgarno autre

initiation de la traduction

f-méthionine méthionine méthionine

facteurs d’initiation IF

3 facteurs IFbactériens

beaucoup d’IFtype -eucaryotiqiue

beaucoup d’IF

sensibilité à latoxine diphtérique

insensible sensible sensible83

30S/50S30S/50S

30S/50S

La distribution des protéines ribosomales entre les 3 domaines

une seule r-protéine spécifique aux archées

aucune protéinespécifique aux Bactéries/Archées

aucune protéinespécifique aux Bactéries/Eucaryotes

Archées et Eucaryotes partagent beaucoup de r protéines

les ribosomes des Archaea – une version miniaturisée de ceux des Eucaryotes

84

18/02/2007

15

Conclusion: les principaux points de différence entre les 3 domaines

les voies métaboliques et laconversion de l’énergie

proches chez les Archées et les Bactéries

85 86

Présentation plus détaillée de quelques Archaea

Korarchaeota

CrenarchaeotaEuryarchaeota

L’arbre phylogénique d’Archées basé sur la séquence des ARN 16S

extrêmes halophiles

methanogènes

ThermoplasmaMethanopyrus

Methanococcus

Halobacterium

Methanosarcina

hyperthermophiles1

23

87

Les Archaea produisant le méthane – les méthanogènes

Taxonomie – trois classes

88

méthanogenèse

CO2 + 4H2 = CH4 + 2H2O

-chimiolithotrophes et autotrophes en croissance sur CO2 et H2

89

butyrate, propionate

protéines, lipides, glucides

acétate

La chaine alimentaire dans les conditions anaérobiques

90

18/02/2007

16

Relations symbiotiques entre les bactéries et les méthanogènes

91 92

Le rumen est riche en méthanogènes

Methanobrevibacter

400 litres CH4/jour

93 94

1013 – 1014 microorganismes-72 types de bactéries (83% non cultivables) - 1 seule archaea Methanobrevibacter smithii

Une archée méthanogène, Methanobrevibacter smithii, est un composant majeur de l’intestin humain

son rôle n’est absolument pas connu

Les méthanogènes mésophiles non cultivables sont abondants dans les champs de riz

de 10 à 25% du méthane est produit par des archées méthanogènes identifiées comme Rice Cluster I

-les archées méthanogènes sont abondantes dans les champs de riz- elles produisent du méthane en grande quantité- ces archées ne peuvent pas être cultivées

95Korarchaeota

CrenarchaeotaEuryarchaeota

L’arbre phylogénique d’Archées basé sur la séquence des ARN 16S

extrêmes halophiles

méthanogènes

ThermoplasmaMethanopyrus

Methanococcus

Halobacterium

Methanosarcina

hyperthermophiles1

2 3

96

18/02/2007

17

Haloferax sulfurifontis

Halobacterium

Halobacteria – la taxonomie

poissons salés

Mer Morte

Mer Morte

97

14 genres

Les archées halophiles sont les mieux adaptées aux milieux riches en sels

bactéries algues archées

98

Les extrêmes halophiles - hétérotrophie et photosynthèse

- minimum de NaCl – 1,5 M; optimum – 3-4 M- tous sont chimioorganotrophes- la majorité sont des aérobes- leur membrane contient des caroténoïdes donnant une couleur rougeâtre caractéristique - certains sont photosynthétiques grâce à la bactériorhodopsine ou à l’halorhodopsine

99

Halobacterium salinarum

Bactériorhodopsine de Halobacterium salinarum

coloration pourpre d’une saline provoquée par Halobacterium salinarum

100

101

bactériorhodopsine

sodium / proton antiport

sodium / AA symport

sodium / calcium antiport

potassium uniport

Flux des ions et des molécules au travers de la membrane chez les archées halophiles

5,3 M de K+3,3 M de Na+

102

18/02/2007

18

- la présence de fortes concentrations de Na+ (de 1,5 à 5,5 M – 32%!!) est indispensable

- les protéines du cytoplasme contiennent peu d’aminoacides hydrophobes et basiqueset beaucoup d’aminoacides acides. En conséquence, elles restent solubles malgré une forte concentration de K+

- une forte concentration de K+ est requise pour l’activité catalytique de beaucoup de protéines, les ribosomes inclus

Les extrêmes halophiles - la composition des protéines

malate déshydrogénasearchée halophile bactérie

en rouge, aminoacides acides (aspartate, glutamate); en bleu - basiques103

Les protéines des halophiles et des hyperthermophiles sont adaptées auxétudes structurales

- facilité de purification- facilité de cristallisation

la structure 3D de la sous unité 50S du ribosome de Haloarcula marismortui,Science 2000

23S ARNr

28 protéines

104

Korarchaeota

CrenarchaeotaEuryarchaeota

L’arbre phylogénique d’Archées basé sur la séquence des ARN 16S

extrêmes halophiles

méthanogènes

ThermoplasmaMethanopyrus

Methanococcus

Halobacterium

Methanosarcina

hyperthermophiles1

2 3

105

hyperthermo

Les Archaea hyperthermophiles du phylum Crenarchaeota

106

archaea

Hyperthermophiles et acidophiles – définir les termes

taux de croissance

107

Hyperthermophiles – les sources d’énergie et du carbone

la majorité sont des chimiolithotrophes et des autotrophes…

… mais certains sont également des hétérotrophes facultatifs -ils poussent sur de l’extrait de levures et du trypton

108

18/02/2007

19

T C° pH

Les gourmandises des archaea hyperthermophiles - le soufre et l’acide sulfurique, l’acide nitrique et l’hydrogène - tout ce que donne un volcan en éruption

109

sulfure d hydrogène

110

Milieu de croissance pour une souche de Sulfolobus

111

Sulfolobus solfataricus

Sulfolobus tokodaii

S. acidocaldariusSulfolobus solfataricusinfecté par le virus STSV1

Quelques photos de la famille Sulfolobales

112

Nanoarchaeum equitans - la plus petite cellule procaryotique- et le seul parasite connu chez les Archaea

1. Découverte

Island, Kolbeinsey crête Cheminée blanche – petit volcan de50 cm de hauteur situé à 106 m de profondeur,éjectant de l’eau chaude à 103°C

Hôte - Ignicoccus-taille 1-2 mm- phylum Euryarchaeota- autotrophe réducteur de soufre,nécessite H2 et CO2

Symbiote - Nanoarchaeum equitans- taille 350-500 nm (1% de volume d’E. coli)- phylum Crenarchaeota- complètement dépendant de l’hôte

hôte

symbiote

113

Nanoarchaeum equitans – premier représentant du nouveau phylum Nanoarchaeota….et le plus ancien organisme connu?

Arbre phylogénique construit d’après l’analyse de la séquence de l’ARN 16S

2. Taxonomie

114

18/02/2007

20

archaea

bactérie

Nanoarchaeum equitans – le plus petit génome procaryotique connu - 487 gènes

Nanoarchaeum equitans - absence de gènes de biosynthèse de novo des aminoacides, des nucléotides, des lipides et des cofacteurs

- absence de gènes du cycle de Krebs, de gluconéogenèse et des voies connues de l’assimilation du carbone

Nanoarchaeum equitans transporte tous ces composants de son hôte Ignicoccus

115

Virus des Archaea hyperthermophiles

Les virus représentent un composant majeur de tous les écosystèmes

- 105 – 106 particules par ml dans l’eau de mer;

- ~ 20% des cellules procaryotiques sont infectées et lysées quotidiennement ;

- les virus participent à l’échange génétique par transduction

116

?

Les virus d’Archaea - existent-ils; comment sont ils?

117 118

100 nm

Zillig et al.

Fuselloviridae: SSV1, SSV2, SSV3, SSV4

119

200nm

Prangishvili et al., Genetics 1999

Sulfolobus islandicus Rod-shaped Virus 1, SIRV1

120

18/02/2007

21

micro pinces – outil de nano technologie du demain?

Acidianus Filamentous Virus 1, AFV1

121

100 nm

Häring et al., J. Virol., 2005

Acidianus Bottle-shaped Virus, ABV

122

Bars, 100 nm

Häring et al., J. Virol., 2005 123

incubation at 90°C, 1 hr

incubation at 10°C, 6 months

incubation at 75°C, 6 days

purified

virions

Häring et al., Nature, 2005

Acidianus convivator Two-tailed Virus, ATV

124

Häring et al., Nature, 2005

Acidianus convivator „Two-tailed Virus“ ATV

125

Sulfolobus Icosahedral Turreted Virus (STIV)

Thermal Viruses in Yellowstone National Park

126

18/02/2007

22

Sulfolobus STIV virus sliced density map

127

Virus des Archaea hyperthermophiles – conclusions

- une vingtaine de virus infectant des archaea hyperthermophiles sont identifiés;

- tous contiennent de l’ADN double brin;

- après l’infection, les virus établissent des relation stables avec leurs hôtes:-les cellules ne sont pas lysées;-les particules virales sont produites en continu ;

- peu de virus intègrent leur ADN dans le chromosome de l’hôte ;

-la majorité des protéines codées par des gènes viraux ne ressemblent àaucune des protéines connues chez les bactéries ou chez les eucaryotes

128

129

Partie IVla génétique des Archaea –

inactiver et surexprimer les gènes

Les approches génétique pour les études sur les Archées

Halobacterium NRC-1

obtenir des colonies isolées

agar classique « Gelrite » pour les hyperthermophiles

polysaccaride produit par Pseudomonas elodeaaprès la polymérisation il est stable jusqu’à 120°C

130

Transformation difficile….

méthanogènes

méthanogèneshalophiles

sans résultat

sans résultat

applicable dansdes cas limités

131

Marqueurs de sélection – résistance aux antibiotiques

les gènes de résistance aux antibiotiques - rares et souvent limités à certains groupes d’Archaea

antibiotique gène de résistance utilisé pour

132

18/02/2007

23

Marqueurs de sélection – auxotrophies

l’intérêt du système URA/5-FOA – sélection dans les deux sens

sélection ura- ura+ milieu minimum sans uracile (acquisition du gène ura+)

sélection ura+ ura- milieu avec uracile et 5-FOA (la perte du gène ura+ car5-FOA est métabolisé dans ura+ et donne un dérivé toxique))

133

Comment inactiver un gène chez les Archaea – remplacement par un marqueur

134

Comment inactiver un gène chez les Archaea – délétion en 2 étapes

souche Ura-

sélection Ura+

allèle nul du gène

ura+

plasmidenon réplicatif

étape 1intégration

étape 2excision

sélection Ura- en présence du 5-FOAet de l’ uracile

inactivation d’un autre gène

aucun marqueur ajouté

135 136

L’approche métagénomique pour les étudesenvironnementales des Archaea

- 200 litres d’eau de mer- extraction d’ADN- clonage des fragments de 2 à 6 kb- séquence et analyse

Archaea à l’époque de la metagénomique

Résultat: - 1,66 millions de fragments lus- 1,36 Gb d’ADN séquencées

2004

137

The Institute for Genomic Research (TIGR) in Rockville, Maryland

Des représentants non-extrêmophiles de deux phyla d’Archaea sont abondants dans l’eau de mer

Archaea mésophilesnon cultivables6% de population

reconnus par la séquence spécifique de leurs ARN 16S

-certains fragments portentles gènes amoAB codant pour l’ammonium oxydase

138

18/02/2007

24

Le cycle de l’azote

ammonium oxydase

139

nitrification

2,3x1028 cellules d’archées dans le milieu marin et dans le sol

la présence des gènes d’ammonium oxydase amoABsuggère leur capacité d’oxyder NH4

+ en NO2-

2006

vers les plantes

fragment metagénomique16S et 23S typiquement archaea

140

Nature - 2006

- 99% de microorganismes du sol ne sont pas cultivables- jusqu’à 3000 fois plus d’Archaea que des bactéries dans

des sols non agricoles- dans le cycle d’azote sur Terre, l’oxydation de l’ammonium est

en grande partie assurée par les archées crenarchaeota Ratio:amoA Archae/amoA bacteria

profondeur cm 141

Les majorité des Archaea ne sont pas des extrêmophiles

-années 70-90-les Archaea sont des créatures bizarres habitant dansdes environnements marginaux et extrêmes (très chauds, très salés, fond de l’océan etc)(sauf quelques exceptions comme les méthanogènes)

écologie des Archaea – deux points de vu

142

archées extrêmophiles

archées marines

archées du sol

méthanogènes

-années 2000- les Archaea sont un composant ubiquitaire de tous les écosystèmes

- les Archaea mésophiles (Cren- comme Euryarchaeota) représentent 20%de la biomasse sur Terre

- leur rôle dans le cycle de l’azote sur Terre est prédominant

143

Les Archaea mésophiles ne sont pas cultivables ….. ….on les identifie par:

-approche PCR -avec les oligoscorrespondant aux partiesconservées des gènes codant pour les ARN 16S

-approche RT-PCR avec les oligoscorrespondant au gènesamoA d’Archaea

- dosage des lipides typiquement Archaea

sauf 2 cas ….144

18/02/2007

25

Axinella mexicana

séquençage du génome

145

Absence de bactéries de nitrification . Quel organisme est responsable de cette transformation?

L’eau du Shedd Aquarium à Chicago ne contient pas de NH4.

Crenarchaeota Nitrosopumilus maritumus146

Phylogénie des Archaea – état actuel

Nanoarchaeota

147

Archaea et astrobiologie :les extrêmophiles peuvent ressembler aux formes de vie extraterrestre

Les archées méthanogène sur Mars?

méthane volcan eau

148

149

… et un jour Mars-archaeota???

150

18/02/2007

26

Tableau final – comparaison des trois phyla de l’arbre de vie

Faux

151