2006-2007

Enseignement de M1 « Physiologie des épitheliums »

Bases structurales, Modèles animaux et physiologie

Robert DUCROCInserm Unité 773

Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon

• Importance des mouvements d’électrolytes dans l’activité fonctionnelle des cellules épithéliales digestives

• Méthode de la chambre de Ussing

• Application à un problème d’endocrinologie digestive :le contrôle du transport intestinal de glucose

Estomac:sécrétion acideMucus, FI,pepsinogène

Duodénum:sécrétion de bicarbonate et mucus

Jéjunum:absorption des sucres

Iléon :absorptions desacides aminéseau, électrolytes

Côlon :Sécrétion de mucusCarbohydrates : butyrate, propionate..)

Duodénum(25 cm)

Sécrétion bicarbonateFe, Ca

Jéjunum( 200 cm)Sucres

Iléon(300 cm) Cecum

rongeursfermentation

Côlon(180 cm)Equilibre

Hydro minéralbactéries

Sphyncter pylorique

rectumPlaques de PeyerCanal pancréatiqueCanalicule biliaire

Goblet cells

Hauteur des villosités

Aminoacides

Segmentation intestinale et fonctions selon l’axe proximo-distal

Ph acide, peu de bactéries Ph alkalin, flore ++

Cellules Caco2

Structure polarisée (cf épithélium)Repliement : augmentation de la surface d’échange

Organisation des tuniques

villosité

crypte

Migrationet

différenciation

Cellules de PanethCellules souches

Compartiment d’amplification

Types cellulaires Matures :Cellules absorbantesCellules entéro-endocrineCellules en gobeletcellules M

Différenciation de l’intestin selon un axe crypto-villositaire

Mort cellulaire,desquamation

entérocyte

Cellule sécrétoire

Cellule progénitrice

Cellule de Paneth

HNF1Cdx2

GATA4HNF4

Cellule épithélial

e absorptivemature

Cellule en gobelet

Cellule entéro-

endocrine

12 phénotypes distincts : G, I, K…

Facteurs impliqués dans la différenciation des cellules intestinales

BETA2PAX4, PAX6Pdx1

NGN3Math1

Wnt(c-myc) HES1

Notch

Klf4Elf4

Cellule souche

lumièresang

Na+

K+

Na K ATPase~

K+

Na+glucose

Transports ioniques dans les entérocytes< gradient électrochimique <<

NHE2,Na+

H+

NHE3

H+Amino acides

Na+ENAc

Absorption de Na+Sécrétion de Chlore

ClCFTR

lumièresang

Na+

K+

Na K ATPase~

K+

K+Cl-

Na K 2Cl

Na+

Na+carbohydrates

Transports ioniques dans une cellule intestinale

H2OCO2

AC

pH

< gradient électrochimique <<

H+Di-peptides

NHE2,Na+

H+

NHE3

H+Amino acides

Cellule « au repos »

Cellule « absorbante »

mouvements ioniques dans les cellules épitheliales intestinales

lumièresang

K+Cl-

Na K 2Cl

Na+

NHE2Na+

H+Cl-Na+

HCO3

HCO3-Cl-

Échangeur Cl/Bicarbonate

Na+ENAc

Cl-CFTR

Cl-CaCl

Na+

K+

Na K ATPase~

K+

amiloride

DPCDiphenylamineacrboxylateBumétamide

ouabaine

DIDSdi-isothiocyanostilbene-disulfonic acid

DIDS

Na+carbohydratesH2O

CO2AC

  SLC1: The high affinity glutamate and neutral AA transporter family 7

  SLC2: The facilitative GLUT transporter family 14

  SLC3: The heavy subunits of the heteromeric amino acid transporters 2

  SLC4: The bicarbonate transporter family 10

  SLC5: The sodium glucose cotransporter family 11

  SLC6: The sodium- chloride- dependent neurotransmitter transporter family 16

  SLC7: The cationic amino acid transporter/glycoprotein-associated family 13

  SLC8: The Na+/Ca2+ exchanger family 3

  SLC9: The Na+/H+ exchanger family 9

  SLC10: The sodium bile salt cotransport family 5

  SLC11: The proton coupled metal ion transporter family 2

  SLC12: The electroneutral cation-Cl cotransporter family 9

  SLC13: The human Na+-sulfate/carboxylate cotransporter family 5

  SLC14: The urea transporter family 2

  SLC15: The proton oligopeptide cotransporter family 4

  SLC16: The monocarboxylate transporter family 14

  SLC17: The vesicular glutamate transporter family 8

  SLC18: The vesicular amine transporter family 3

  SLC19: The folate/thiamine transporter family 3

  SLC20: The type III Na+-phosphate cotransporter family 2

  SLC21/SLCO: The organic anion transporting family 20

Solute Carrier Family , From HUGO

SLC22: The organic cation/anion/zwitterion transporter family 18

  SLC23: The Na+-dependent ascorbic acid transporter family 4

  SLC24: The Na+/(Ca2+-K+) exchanger family 5

  SLC25: The mitochondrial carrier family 29

  SLC26: The multifunctional anion exchanger family 11

  SLC27: The fatty acid transport protein family 6

  SLC28: The Na+-coupled nucleoside transport family 3

  SLC29: The facilitative nucleoside transporter family 4

  SLC30: The zinc efflux family 9

  SLC31: The copper transporter family 2

  SLC32: The vesicular inhibitory amino acid transporter family 1

  SLC33: The Acety-CoA transporter family 1

  SLC34: The type II Na+-phosphate cotransporter family 3

  SLC35: The nucleoside-sugar transporter family 23

  SLC36: The proton-coupled amino acid transporter family 4

  SLC37: The sugar-phosphate/phosphate exchanger family 4

  SLC38: The System A & N, Na+-coupled neutral amino acid transporter family 6

  SLC39: The metal ion transporter family 14

  SLC40: The basolateral iron transporter family 1

  SLC41: The MgtE-like magnesium transporter family 3

  SLC42: The Rh ammonium transporter family (pending) 3

  SLC43: Na+-independent, system-L like amino acid transporter family 3

Total 319

Hediger MA, Romero MF, Peng JB, Rolfs A, Takanaga H, Bruford EA. Pflugers Arch. 447(5) : 465-8, 2004;

The Human Genome Organization (HUGO) Nomenclature Committee Database includes more than 40 transporter families of the so-called SLC (solute carrier) gene ...

basolateralmembrane

apicalmembrane

3 Na+2 K+

ATP

SGLT1 : sodium

Na+/K+-ATPaseK+channel Glut2

Low glucose

glucose transporter 1

basolateralmembrane

apicalmembrane

3 Na+2 K+

ATP

SGLT1

Na+/K+-ATPase K+channel Glut2

High glucose

Glut2

basolateralmembrane

apicalmembrane

3 Na+2 K+

ATP

SGLT1

Na+/K+-ATPase K+channel Glut2

Low glucose

Glut5

( fructose )

le gradient de sodium généré par l’ATPase Na+,K+constitue un moteur pour l’activité de plusieurs transporteurs :

- Transport Na-dépendant d’hexose (glucose, galactose..)jéjunum

-Transport Na+-dépendant d’acides aminés (glutamine, alanine..)Ileum

-Transport Na+-dépendant d’acides gras à chaînes courtes (butyrate, lactate..Côlon

Ces transports ont lieu dans des segments différents du tube digestifs

Ils peuvent être étudié sur le tissu isolé en suivant les mouvements de sodium

Importance des mouvements ioniques à travers l’épithélium intestinal :

- les pompes constituent des moteurs pour l’entrée des nutriments -les mouvements d’eau sont indispensables aux fonctions d’échanges (dilutions des enzymes, pH..) de défense (sécrétion de chlore, rinçage de la lumière.), de transit du bol alimentaire..

Na+

sang Lumière intestinale

K+ATP

aseNa+ SGLT1

Glut 5 Fructose

glucose

Glucose

fructose

Transport intestinal des sucres

fructose, glucose, galactose..

Glucose

FructoseGlut2

Etudes des mouvements ioniques à travers le tissus isolé

Méthode de la chambre de Ussing

Ussing HH and Zerahn K. Active sodium as the source of electric current in the short circuited isolated frog skin.Acta Physiol Scand 23: 110, 1951Schultz SG and Zalusky R. Ion transport in isolated rabbit ileum. I. : Short circuit current and Na fluxes.J Gen Physiol 47: 567, 1964

La chambre de Ussing un outil classique de la physiologie…

- Démonstration du caractère actif du transport (pas de gradientélectrochimique)

Principe = pas de forces s’exerçant sur le mouvement des ions (gradient de

concentration, pH, gradient de pression, de température..

Donc seul l’activité des transporteurs est en cause = transport actif

- Permet la mesure qualitative et quantitative des mouvements ioniques

La chambre de Ussing …un outil classique de la physiologie…

-Démonstration du caractère actif du transport (pas de gradient électrochimique) : - Mesures qualitative et quantitative des mouvements ioniques- Accès aux faces séreuse et muqueuse de l’épithélium (application pharmacologiques..)

- Application aux tissus, biopsies, cellules en culture sur filtre …

Ussing HH and Zerahn K. Active sodium as the source of electric current in the short circuited isolated frog skin.Acta Physiol Scand 23: 110, 1951

Isc

muqueuxséreux

Chambre de Ussing

ddp (mV)

O mV

Intestin, biopsie..

Mélange gazeux (carbogène)

Tissu

Electrode « potentiel »

Electrode « courant »

Boitier « relai » avec le millivoltmètreet le microampéremètre

Chambre 2Chambre 1

Système thermostatée

V2 V1

I2 I1Oxygénation

Un poste complet de mesure des courants de court-circuit..

Bain-marie

Microordinateur

Chambres de Ussing

Micro-voltmètre et Micro-ampèremètreréunis dans un Voltage Clamp automatique

Interfaceavec

microordinateur

Oxygène, 95%CO2, 5%

basolateralmembrane

apicalmembrane

3 Na+2 K+

ATP

SGLT1 : sodium

Na+/K+-ATPaseK+channel Glut2

Low glucose

glucose transporter 1

Isc

(μA)

time (min)

20

30

40

50

40 50 5545 60

Glucose, 10 mM

Carbachol, 100 µM

60± treatment

65

± peptide

Etude de la régulation du transport actif de glucose

Equipe de Physiologie Digestive Inserm U. 773

Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon, CRB3 Faculté de Médecine Xavier Bichat, Paris

Application à l’étude de la régulation de l’absorption de glucose

par des peptides

La leptine luminale inhibe l’absorption active de glucose

dans l’intestin

Leptine :Une protéine non glycosylée de 16KDaProduite par l’adipocyte, secrétée dans la circulation, libérée tardivement après le repas

Cible principale : l’hypothalamus Fonction : contrôle de la masse adipeuse

Leptine adipocytaire vs. leptine digestive

L’estomac est également une source de leptine….

Leptine digestive

Ob-R

J Clin Invest 2001

Leptine digestive :Cellules gastriques, sécrétée dans la lumière digestive, augmente rapidement après le repas

GlucoseNa+

sang lumière

K+ATPase

Na+

Glut2 Glucose

?

?Ob-R

Leptinedigestive

SGLT1

Leptine

?

Pool intracellulairePool intracellulairede SGLT1de SGLT1

GlucoseNa+

~

Isc

muqueuxséreux

Chambre de Ussingleptineleptine

2Δ

Isc

(μA/

cm )

25

0

50

75+ GLP-2

*+ CCK-8

*

modulation du transport de glucose Na+-dependant

+ leptine (mucosal)

*

La leptine inhibe le transport d’un sucre non métabolisé, le methyl D glucopyranoside

0

5

10

15

20

25

30

35Δ

Isc (μ

A/cm

)2

Methyl D Gluc

Leptin (10 nM)+

Methyl D Gluc

Quelles sont les caractéristiques de cette inhibition par la leptine luminale ?

-11 -10 -9 -8 -7

0

20

40

60

80

100

leptin [- log M]

gluc

ose-

indu

ced

Isc (

%)

IC50 : 0.13 nM

Inhibition du transport actif de glucosedépendant de la concentration

0

5

10

15

20

25

2 G

luco

se in

duce

d Isc

(Δ,

μA/

cm )

30

35

Glucose (mmol/L)1 10 50

40

La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose concentration différentes de glucose

Zucker ratsFat (fa/fa) Lean (Fa/fa)

2

0

5

10

15

20

25

Δ Isc

(μA/

cm )

*

La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose action directe, récepteurs fonctionnels

Quel est le mécanisme de l’inhibition de l’absorption de glucose par la leptine luminale ?

GlucoseNa+

sang lumière

K+ATPase

Na+

Glut2 Glucose

?

?

Ob-R

Leptinedigestive

SGLT1

Pool intracellulairePool intracellulairede SGLT1de SGLT1

??

SGLT-1

β-actin 45 kd

75 kd

CTRL0

1

2

3

4

glucose Leptine + glucose

Protéines totales

1

CTRL0

2

3

4

glucose Leptine + glucose

Protéines de la bordure en brosse

La leptine luminale réduit l’abondance de SGLT-1dans la bordure en brosse

leptine

25

0

50

Δ Is

c (μ

A/cm

)2

Gö6976

*

CTRL

Inhibiteurisoformes classiques

Rottlenin

leptine

* *

CTRL

Inhibiteurisoformes ‘nouvelles’

La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose implication de la PKC

En résumé, La leptine digestive contrôle le transport actif de glucose dans la lumière de façon rapide, directe et physiologiqueLa présence de récepteurs fonctionnel est requise

Le mécanisme de l’inhibition vise la translocation de SGLT1 dans la bordure en brosse en impliquant une voie PKC dépendante (βII ?)

Quel est l’effet de la leptine administrée du côté séreux ?

0 5101520253035

Δ Is

c (μ

A/cm

)2

mucosal

serosal

Effet de la leptine après 2 minutes

Leptine muqueuse

50

75

100

0 2 5 10 15 20 min

Glucose-induced Isc (% of controls)

Cinétique de l’inhibition du transport de glucosepar la leptine muqueuse vs. séreuse

Leptine séreuse

25

0

la CCK est sécrétée par les cellules endocrines I duodéno-jéjunales

en réponse à la leptine (Guilmeau et al Diabetes 2003)

Question : cet effet du coté séreux est-il dépendant de la CCK ?

Cellule épitheliale intestinale

lumière

Cellule endocrine type I

Récepteur CCK

Leptine (Sx)

Récepteur leptine

Récepteur leptineglucose

Leptine (Sx)

??

?? Antagonistes récepteurs CCKType 1 ou type 2 ??

Adipocyte

L 365 260

YM 022

Leptine

25

0

50

- + + + +

Δ Is

c (μ

A/cm

)2

L 364 718

- - + - -- - - + -- - - - +

antagonistesdes récepteurs

CCK-2

antagonistedes récepteurs

CCK-1

Cellule épitheliale intestinale

lumière

Cellule endocrine (I)

Récepteur CCK

Leptine (Sx)

Récepteur leptine

Récepteur leptine

glucoseLeptine (Sx)

L’effet ‘séreux’ de la leptine sur le transport de glucose apparaît indirect, médié par le récepteur CCK-2

Ceci suggère une implication de la CCK dans l’inhibition induite par la leptine. Cette action pourrait prolonger l’effet inhibiteur direct de la leptine…

Conclusion,

la leptine digestive joue un rôle majeur, à la fois direct et indirect, dans le contrôle de l’absorption intestinale de glucose

Cette fonction nouvelle de la leptine digestive doit être considérée dans le contexte :- de l’activité de signalisation de SGLT-1 (PKC, regulatory protein RS1)- de la sécrétion de leptine par l’adipocyte- du rôle important de l’intestin dans l’homéostasie du métabolisme énergétique

Neurones entériques (CCK..

Cellule épitheliale intestinale

lumière

Cellule endocrine (I, L, ..)

Récepteur 1

CCKLeptin

etc

insulinGLP-2

etc