2013 - Poly TD

UNIVERSITE JOSEPH FOURIER GRENOBLE I

MODULE BIO 241

Deuxième année de LICENCE

(L2, S4)

ANNEE 2012-2013

TRAVAUX DIRIGES DE BIOCHIMIE

TD BIO 241 2012-2013 AVANT-PROPOS

1

AVANT-PROPOS Ce fascicule est organisé de façon à illustrer les différents thèmes abordés en cours magistral et en travaux pratiques. La préparation personnelle des exercices qui nécessite une maîtrise préalable du cours est vivement recommandée afin de tirer le meilleur profit des séances de travaux dirigés. La plupart des thèmes sont précédés de quelques rappels théoriques des notions abordées en cours et qui vous seront utiles pour résoudre les exercices. En aucun cas, ces rappels théoriques très succincts ne remplacent le cours. Les thèmes 1 et 2 sont des révisions des notions que vous devez avoir acquises en Licence 1ère année dans le module BIO 121. Les thèmes suivants illustrent directement le programme abordé en Licence 2ème année dans le cadre de ce module BIO 241. CONTROLE DES CONNAISSANCES Dans le cadre du module BIO 241, deux notes de contrôle continu et une note d’épreuve terminale nous permettront d’évaluer vos connaissances. La première note de contrôle continu (CC1) sera une note de travaux pratiques. Le deuxième contrôle continu (CC2) sera réalisé sous forme d’un examen écrit (1h), au cours du semestre, et portera sur des notions abordées en cours magistral et travaux dirigés. Enfin, une épreuve terminale écrite (2h) se déroulera à la fin du module et portera sur l’ensemble des connaissances devant être acquises dans ce module. La note finale de l’UE = CC1(25%) + CC2(25%) + ET (50%)


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EQUATIONS UTILES Equation de Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + log ([A-] / [AH]) Variation d’énergie libre dans les conditions non standard

G’ = Go’ + RT ln )[B][A]

[D][C](

Variation d’énergie libre et potentiel redox

Go’ = - n F E0’ Potentiel redox dans une réaction d’oxydo-réduction E0’ = E0’ (accepteur) – E0’ (donneur) Equation de Michaelis-Menten

KM[S]

[S]VV max0

QUELQUES UNITES Masse molaire, poids moléculaire, dalton

- Masse molaire : masse d’une mole de molécules de la substance, c’est-à-dire la masse de 6,022.1023 molécules. Elle s’exprime en g.mol-1.

- Poids moléculaire : correspond au rapport entre la masse d’une molécule de

la substance et le douzième de la masse d’un atome de carbone 12. C’est un nombre sans dimension.

- Dalton : unité introduite pour définir la masse de certaines particules biologiques pour lesquelles le terme de poids moléculaire est impropre. Le dalton est le douzième de la masse d’un atome de carbone 12, soit 1/6,022.1023 grammes.

Les 3 modes d’expression font apparaître la même valeur numérique pour un composé donné. Exemple pour l’hémoglobine : on dira que cette protéine a un poids moléculaire de 64 000, ou une masse molaire de 64 000 g.mol-1, ou encore qu’une molécule de cette protéine possède une masse de 64 000 Da ou 64 kDa.


3

TERME

ABBREVIATION

UNITE

Variation d’énergie libre Potentiel redox Vitesse initiale d’une réaction Activité enzymatique Activité spécifique Vitesse maximale d’une réaction Constante de Michaelis Constante catalytique Efficacité catalytique

G E0 Vo AE AS Vmax KM kcat kcat / KM

J.mol-1 Volts (V) mol.L-1.s-1 (ou M.s-1) nmol.s-1 (nanokatals, nkat) nkat.mg-1 mol.L-1.s-1 (ou M.s-1) mol.L-1 (ou M) s-1 s-1.M-1

TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS

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THEME N°1 : RAPPELS CONCENTRATIONS SPECTROPHOTOMETRIE CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES


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CONCENTRATIONS Notions déjà acquises, à revoir :

- Concentration massique. - Concentration molaire. - Concentration en % (p/v) ou en % (v/v). - Normalité. - Préparation d’une solution de concentration exacte à partir d’une

substance solide (soluté). - Produit anhydre, produit hydraté. - Pureté en %. - Dilutions en cascade.

Exercice n°1 : Vous voulez réaliser un dosage des protéines suivant un protocole appelé méthode de Lowry. Pour cela, vous devez préparer différentes solutions :

A- Solution de NaOH 0,1 M dans l’eau distillée. B- Solution de CuSO4, 5H2O à 1% (p/v) dans l’eau distillée. C- Solution de tartrate double de K et Na (C4H4KNaO6) à 2% (p/v) dans l’eau

distillée. D- Solution de Na2CO3 à 2% (p/v) dans NaOH 0,1 M.

1- Calculer les quantités de produits à peser pour préparer 100 mL de chaque

solution, sachant que vous disposez des poudres suivantes : - NaOH M = 40 g.mol-1 Pureté = 97%. - CuSO4, 5H2O M = 249,68 g.mol-1 Pureté = 98%. - C4H4KNaO6, 4H2O M = 282,22 g.mol-1 Pureté = 98%. - Na2CO3, 10H2O M = 286,14 g.mol-1 Pureté = 99%.

2- En pratique, comment procédez-vous ? Quel type de verrerie devez-vous

utiliser ? 3- A l’aide de ces différentes solutions, vous devez ensuite préparer le réactif

cuproalcalin selon le protocole suivant : - 1 mL de solution de sulfate de cuivre (B) - 1 mL de tartrate double de K et Na (C) - Compléter à 100 mL avec la solution de carbonate de sodium à 2% (p/v)

dans la soude 0,1 M. Calculer la concentration finale en sulfate de cuivre et en tartrate double de K et Na. 4- Comme vous n’avez aucune idée de l’ordre de grandeur de la concentration en

protéines de l’extrait biologique dont vous souhaitez doser les protéines, vous devez au préalable effectuer une gamme de dilutions en cascades de cet extrait : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Comment réalisez-vous ces dilutions en cascades, sachant que vous devez réaliser le dosage de chaque dilution en triplicata pour tester la reproductibilité de votre manipulation ? (voir le protocole exact du dosage ci-dessous).


6

Protocole du dosage des protéines par la méthode de Lowry : - A 200 L d’échantillon protéique, ajouter 1 mL de réactif cuproalcalin et

agiter. - Laisser reposer 15 min. - Ajouter rapidement 100 L de réactif de Folin-Ciocalteu et homogénéiser. - Laisser reposer 30 min. et lire l’absorbance à 750 nm contre un témoin

sans protéines. Exercice n°2 : A partir des données ci-dessous, calculer la molarité et la normalité des deux solutions. Indiquer comment préparer 1 litre de solution 1 N. 1- Acide acétique (CH3CO2H) M = 60,05 g.mol-1 d = 1,05 Pureté = 99,7%. 2- Acide sulfurique (H2SO4) M = 98,08 g.mol-1 d = 1,83 Pureté = 95%.

SPECTROPHOTOMETRIE Notions déjà acquises, à revoir :

- Absorbance d’une substance colorée (spectre dans le visible) ou incolore (spectre dans l’UV).

- Loi de Beer-Lambert et ses limites. - Loi d’additivité. - Gamme étalon.

Exercice n°1 : Le tryptophane présente une bande d’absorption avec un maximum à la longueur d’onde de 280 nm. Dans une cuve de trajet optique 1 cm, une solution de tryptophane à 200 M a une absorbance à 280 nm de 1,2. 1- Calculer le coefficient d’extinction molaire du tryptophane. Une solution de la protéine X, à la concentration de 25 µM, présente une absorbance à 280 nm de 0,6. La protéine X ne contient aucun résidu tyrosine et phénylalanine. 2- Déterminer le nombre de résidus tryptophane que contient cette protéine X. Exercice n°2 : L’uracile et l’adénine sont deux bases azotées qui présentent un maximum d’absorption à 260 nm. Une solution d’uracile à 20 mol.L-1 présente une absorbance à 260 nm égale à 0,24 dans une cuve de trajet optique 1 cm. 1- Calculer le coefficient d’extinction molaire de l’uracile.


7

Une solution contenant un mélange d’uracile et d’adénine présente une absorbance à 260 nm égale à 0,4 (cuve de 1 cm). Sachant que la concentration molaire en uracile est le double de celle de l’adénine et que le coefficient d’extinction molaire de l’adénine à 260 nm est de 16000 mol-1.L.cm-1 : 2- Calculer les concentrations molaires en adénine et en uracile dans le mélange.

CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES

Notions déjà acquises, à revoir :

- Equation de Henderson-Hasselbalch. - Titration d'un acide faible par une base forte ; courbe de titration. - Solutions tampon.

Exercice n°1 : Calculer le pH des solutions tampon suivantes : 1- Acide acétique (1 M) + acétate de sodium (0,5 M). 2- Acide phosphorique (0,3 M) + KH2PO4 (0,8 M). Données : pKa de l’acide acétique = 4,76 ; pKa de l’acide phosphorique = 2,14. Exercice n°2 : L’acide phosphorique est un triacide. Il se trouve très souvent associé à diverses molécules biologiques (protéines, lipides) sous forme de groupement phosphate. Son état d’ionisation dépend du pH de la solution et des valeurs de ses pKa. 1- Quelles sont les formes présentes à pH physiologique (7,4) ? 2- Sous quelle forme va-t-on l’écrire préférentiellement ? Données : pKa1 = 2,1 ; pKa2 = 7,2 ; pKa3 = 12,4.

TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES

8

THEME N°2 : RAPPELS SUR LES PROTEINES PROPRIETES IONIQUES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES STRUCTURE ET METHODES D’ETUDE


9

PROPRIETES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES Notions déjà acquises, à revoir :

- Molécules à caractère hydrophobe, polaire, apolaire. - Formule semi-développée des 20 acides aminés standard. - Attribuer à chaque fonction ionisable la valeur de pKa correspondant. - Ecrire les équilibres de dissociation des acides aminés et peptides. - Calcul du pHi d’un acide aminé et d’un peptide. - Courbe de titration des acides aminés et peptides.

Propriétés des 20 acides aminés rencontrés dans les protéines :

Nom Abréviation pKa -COOH

pKa -NH3

+ pKa Chaîne latérale

Masse molaire (g.mol-1)

Alanine Ala, A 2,3 9,7 89 Arginine Arg, R 2,2 9,0 12,5 174 Asparagine Asn, N 2,0 8,8 132 Aspartate Asp, D 2,1 9,8 3,9 133 Cystéine Cys, C 1,7 10,8 8,3 121 Glutamate Glu, E 2,2 9,7 4,3 147 Glutamine Gln, Q 2,2 9,1 146 Glycine Gly, G 2,4 9,6 75 Histidine His, H 1,8 9,2 6,0 155 Isoleucine Ile, I 2,4 9,7 131 Leucine Leu, L 2,4 9,6 131 Lysine Lys, K 2,2 9,0 10,5 146 Methionine Met, M 2,3 9,2 149 Phénylalanine Phe, F 1,8 9,1 165 Proline Pro, P 2,0 10,6 115 Sérine Ser, S 2,2 9,2 105 Thréonine Thr, T 2,6 10,4 119 Tryptophane Trp, W 2,4 9,4 204 Tyrosine Tyr, Y 2,2 9,1 10,1 181 Valine Val, V 2,4 9,6 117 Les différentes classes d’acides aminés : En biochimie, la classification généralement utilisée traduit la capacité de l’acide aminé à interagir avec son environnement (ex : capacité à former des liaisons électrostatiques, Hydrogène, ou de van der Waals). 1- Acides aminés relativement apolaires – hydrophobes - :

(Gly), Ala, Pro, (Met), Val, (Tyr), Leu, Ile, Trp, Phe. 2- Acides aminés relativement polaires non chargés – hydrophiles - :

Ser, Thr, Cys, Asn, Gln. 3- Acides aminés plus ou moins ionisés selon le pH – hydrophiles - :

Asp, Glu, Lys, His, Arg.


10

Structure des 20 acides aminés rencontrés dans les protéines (formes prépondérantes à pH 1) :

Acides aminés aliphatiques

Acides aminés à chaîne latérale comportant des groupements hydroxyle ou sulfhydryle

Acides aminés acides et les amides dérivées Acide aminé cyclique

Acides aminés aromatiques

Acides aminés basiques


11

Exercice n°1 : Classer les composés suivants par ordre d’hydrophobicité décroissante à pH =7 :

- 1,3-dihydroxypropane - n-propanol - sérine - glycérol - alanine - propane - sérine phosphoester - alanylamide

Exercice n°2 : Ecrire les équilibres de dissociation et calculer le pHi des acides aminés suivants : Leucine, Cystéine, Histidine. Exercice n°3 : On étudie le peptide tyrosyl-alanyl-glutaminyl-aspartyl-lysine. 1- Ecrire la formule semi-développée du peptide à pH = 1. Indiquer les extrémités N-

terminale et C-terminale. Indiquez les carbones . 2- Ce peptide comporte 5 fonctions ionisables dont les pKa sont respectivement :

2,2 ; 3,9 ; 9,1 ; 10,1 ; 10,5. Attribuer chaque valeur de pKa à chaque fonction ionisable en justifiant votre réponse (d’après le tableau).

3- Ecrire les équilibres de dissociation et calculer le pHi du peptide. 4- Tracer la courbe de titration de 1 mole du peptide par la soude.

STRUCTURE ET METHODES D’ETUDE DES PROTEINES Notions déjà acquises, à revoir :

- Structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire. - Interactions non covalentes (liaison hydrogène, liaison ionique, liaison de

van der Waals, interaction hydrophobe) - Rôle des agents dénaturants et des agents réducteurs sur la conformation

des protéines. - Précipitation des protéines par les sels ou les solvants organiques. - Méthodes chromatographiques. - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions natives ou

dénaturantes.


12

Exercice n°1 : Dans des conditions de pH proches des conditions physiologiques, la masse molaire d’une protéine P a été déterminée par filtration sur gel. M = 140 000 g.mol-1. 1- Rappeler le principe de la chromatographie par filtration sur gel. Lorsque cette même protéine est étudiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS avec ou sans 2-mercaptoéthanol, les profils électrophorétiques obtenus sont représentés sur les pistes A et B de la figure suivante. La piste C contient les marqueurs de masse moléculaire.

A : en absence de 2-mercaptoéthanol ; B : en présence de 2-mercaptoéthanol ; C : marqueur de masse moléculaire. 2- Qu’est-ce que le SDS et quel est son rôle dans cette électrophorèse ? 3- Quel est le rôle du 2-mercaptoéthanol ? 4- Sur quel (s) critère (s) sont séparées les protéines lors de cette électrophorèse ? 5- A partir de ces données, décrire la protéine P native en termes de masse molaire

des sous-unités présentes, de stœchiométrie entre les sous-unités et du type de liaisons (covalentes ou non) existant entre les sous-unités.

Exercice n°2 : Dans une protéine, identifier quels sont les groupes pouvant former des liaisons hydrogène ou électrostatiques avec la chaîne latérale de l’arginine à pH 7.

A B C

Albumine sérique : 67 000 Da

Ovalbumine : 43 000 Da

Anhydrase carbonique : 30 000 Da

Inhibiteur de trypsine : 20 000 Da

Dépôts

TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE

13

THEME N°3 : ENZYMOLOGIE ENERGIE D’ACTIVATION

CINETIQUE ENZYMATIQUE INHIBITION ACTIVITE ENZYMATIQUE NOTION DE SITE ACTIF

TD BIO 2

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14

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15

Cette réaction peut avoir lieu sans catalyseur, en présence d’un catalyseur chimique (le platine colloïdal), ou en présence d’un catalyseur enzymatique (la catalase). 1- D’après les données du tableau suivant, déterminer le facteur par lequel la

vitesse de la réaction est augmentée en présence de chacun des catalyseurs. 2- Quel est le catalyseur le plus efficace ?

Conditions de réaction Ea (kJ.mol-1) à 20°C Aucun catalyseur En présence de platine colloïdal En présence de catalase

75 49 8

CINETIQUE ENZYMATIQUE Quelques rappels théoriques : 1- Relation de Michaelis-Menten : Le modèle de Michaelis-Menten permet de décrire le comportement d’un grand nombre d’enzymes. Dans ce modèle, une enzyme (E) fixe un substrat (S) pour former un complexe enzyme-substrat (ES) qui peut se dissocier en E et S ou conduire à la formation du produit de réaction (P).

La vitesse de la réaction enzymatique est définie par : V = dt

[P]d

dt

[S]d .

V = dt

[P]d est, pour chaque temps t, la pente de la tangente à la courbe [P] = f(t).

Si l’on se place en condition de vitesse initiale (V0), c’est-à-dire dans des temps de réaction très courts, nous pouvons supposer que le produit n’est pas converti de nouveau en substrat par la réaction inverse. Nous voulons établir une expression qui relie la vitesse de catalyse avec les concentrations en substrat et enzyme. Notre point de départ est :

V0

E + S ES E + Pk 1

k -1

k 2

[P]

Temps V = cte = V0

V = cte = 0


16

[ES]kV 20 (1)

Nous avons maintenant besoin d’exprimer [ES] en termes de concentrations connues. Les vitesses de formation et de disparition de ES sont données par : Vitesse de formation de ES : k1 [E] [S] (2) Vitesses de disparition de ES : k-1 [ES] + k2 [ES] Ou (k-1 + k2) [ES] (3) Pour simplifier, nous allons nous placer dans l’hypothèse de l’état stationnaire, c’est-à-dire un état dans lequel la concentration en ES reste constante. Cet état s’établit dans les tous premiers temps de la réaction. La vitesse de formation de ES est donc égale à sa vitesse de disparition : k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES] (4) En réarrangeant l’équation (4), on obtient :

1

21

k

kk

[ES]

[S][E] (5)

L’équation (5) se simplifie en définissant une nouvelle constante, KM, appelée la constante de Michaelis :

1

21M k

kkK

(6)

L’équation (5) devient alors :

MK[ES]

[S][E] ou

MK

[S][E][ES] (7)

Il faut maintenant exprimer [E] en termes de concentrations connues. Examinons alors la loi de conservation de l’enzyme : [E]T = [E] + [ES] (8) Ou encore : [E] = [E]T – [ES] (9) L’équation (7) devient alors :

M

T

K

[S][ES])([E][ES]

(10)

D‘où l’on tire : M

T K[S]

[S][E][ES]

(11)


17

En revenant à l’équation (1) V0 = k2 [ES] et en substituant [ES] par son expression dans l’équation (11), on obtient :

KM[S]

[S][E]kV T20

(12)

La vitesse maximale étant atteinte lorsque toute l’enzyme est saturée en substrat et donc quand [E]T = [ES], on obtient : Vmax = k2 [E]T (13) L’équation (12) devient ainsi la relation de Michaelis-Menten:

KM[S]

[S]VV max0

(14)

2- Représentations graphiques :

2.1- Représentation de Michaelis-Menten : En fixant [E] et en faisant croître [S], on constate que la vitesse croît et tend vers une limite Vmax quand toute l’enzyme est saturée de substrat, c’est-à-dire quand toute l’enzyme est sous forme de complexe ES. Ainsi, si [S] devient très grande, KM << [S] et V0 = Vmax. 2.2- Représentation de Lineweaver et Burk : La représentation graphique de Michaelis-Menten n’étant pas suffisamment précise pour déterminer KM et Vmax, c’est le plus souvent la représentation en double inverse 1/V0 = f(1/[S]0) qui est utilisée. La représentation graphique de Michaelis-Menten n’étant pas suffisamment précise pour déterminer KM et Vmax, c’est le plus souvent la représentation en double inverse 1/V0 = f(1/[S]0) qui est utilisée.

Vmax / 2

Vmax

[S]0

V0

S = KM


18

3- Signification de KM, kcat et kcat/KM : - La représentation de Michaelis-menten montre que KM est égal à la concentration

en substrat avec laquelle la réaction atteint la moitié de sa vitesse maximale. La constante de Michaelis KM est souvent associée à l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Cependant, cette relation n’est valable que pour les réactions dans lesquelles k2 est très petit devant k -1, ce qui conduit à :

KM = 1

1

k

k = Ks = constante de dissociation du complexe ES

- La constante catalytique kcat est égale à k2. Elle représente le nombre de

molécules de substrat transformées par une molécule d’enzyme en une seconde. L’unité de kcat est donc s-1. Elle traduit l’efficacité cinétique de l’enzyme.

- C’est en fait le rapport de ces 2 valeurs (kcat / KM) qui traduit le mieux l’efficacité

catalytique d’une enzyme. 4- Les effecteurs de l’activité enzymatique : Les effecteurs sont des substances chimiques qui modifient l'activité des enzymes. On distingue : - les activateurs qui augmentent l'activité catalytique. Ex : certains cations

augmentent l'activité des enzymes (Mg2+ pour les kinases, Zn2+ pour les phosphatases alcalines).

- les inhibiteurs qui diminuent l'activité catalytique. Nous ne détaillerons ici que les inhibiteurs. Nous nous intéresserons à 2 types d’inhibitions réversibles, c’est-à-dire caractérisées par une dissociation rapide du complexe enzyme-inhibiteur EI. D’une façon générale, un inhibiteur est lié à l’enzyme mais n’est pas transformé par elle.

1 / V0

1 / [S]0

1 / Vmax

- 1 / KM


19

4.1- Inhibition compétitive : Lorsque l’inhibiteur possède une structure voisine de celle du substrat (on parle alors d’analogue de substrat), il peut se fixer à l’enzyme sur le même site que le substrat. Inhibiteur et substrat ne peuvent donc pas se trouver ensemble dans le site actif de l’enzyme : il s’agit d’une inhibition compétitive. Un inhibiteur diminue la vitesse de catalyse en réduisant la proportion de molécules d’enzyme liées au substrat. Une inhibition compétitive peut être levée par un excès de substrat.

La constante d’inhibition Ki est également la constante de dissociation du complexe

EI : Ki = [EI]

[I][E]

La représentation de Lineweaver et Burk suivante montre qu’un inhibiteur compétitif n’induit pas de variation de la Vmax, mais augmente la valeur du KM. Le KM apparent

devient alors : KM app. = KM (1 + iK

[I])

4.2- Inhibition non compétitive : Dans une inhibition non compétitive, le substrat et l’inhibiteur peuvent se lier simultanément à l’enzyme sur des sites distincts. Un inhibiteur non compétitif agit en diminuant la constante catalytique plutôt que la proportion de molécules de substrat liées à l’enzyme. Contrairement à l’inhibition compétitive, une inhibition non compétitive ne peut pas être levée par un excès de substrat.

E + S + I

ES E + P

EI

Ki

x

+ Inhibiteur

- Inhibiteur

1 / [S]0

1 / V0

1 / Vmax

- 1 / KM - 1 / KM app.


20

La représentation de Lineweaver et Burk suivante montre qu’un inhibiteur non compétitif n’induit pas de variation du KM, mais diminue la valeur de Vmax. La Vmax

apparente devient : Vmax app. = )K/[I](1

V

i

max

(dans le cas simple ou Ki = Ki’)

Exercice n°1 : Les affirmations suivantes sont-elles vraies ? 1- V0 et Vmax sont des vitesses initiales. 2- On peut calculer Vmax et KM à partir des cinétiques d'apparition du produit en

fonction du temps obtenues à partir de plusieurs concentrations en substrat. 3- Si l'on exprime V0 en fonction de [S]0, on obtient une parabole. 4- Il est possible de déterminer Vmax et KM en représentant 1/V0 en fonction de 1/[S]0. 5- KM est la concentration en enzyme qui donne la moitié de Vmax. 6- Pour une enzyme et un substrat donnés, les valeurs de KM et Vmax sont

invariables. 7- La vitesse initiale d'une réaction enzymatique :

- Présente une relation linéaire en fonction de quantités croissantes d'enzyme. - Présente une relation hyperbolique en fonction de quantités croissantes

d'enzyme. - Peut être sensible aux variations de température. - Est maximale à pH 7. - Est sensible à la présence d'autres ligands que le substrat.

1 / Vmax app.

E + S + I

ES+ I

E + P

EI + S EI x

Ki Ki’

1 / Vmax

1 / V0

+ Inhibiteur

- Inhibiteur

- 1 / KM

1 / [S]0


21

Exercice n°2 : Les mesures des constantes de vitesse d’une réaction enzymatique simple, avec une enzyme E obéissant à la cinétique de Michaelis-Menten, donnent les valeurs suivantes :

k1 = 2 x 108 M-1 sec-1 k-1= 1 x 103 sec-1 k2 = 5 x 103 sec-1

1- Calculer la constante de Michaelis KM de l’enzyme. 2- Quelle est la valeur de la constante catalytique (kcat) de l’enzyme ? 3- Déterminer l’efficacité catalytique de l’enzyme. 4- Indiquer si cette enzyme est proche de la perfection cinétique. Exercice n°3 :

1/Vo

[So] 1 / [So]

[ P ]

te m p s

Vo

1

2 3

Les figures suivantes représentent :courbe 1 [P] = f ( t )courbe 2 Vo = f ( [ So ] )courbe 3 1/Vo = f ( 1/[So] )

1- Que peut-on déterminer à partir de chacune des courbes ci-dessus ? Compléter

les graphiques (flèches). 2- A partir de la courbe 2, donner l'expression de la vitesse de la réaction pour les

concentrations en substrat : - Inférieures à KM / 10. - Comprises entre KM / 10 et 10 KM. - Supérieures à 10 KM.

3- A quelle partie de la courbe correspond : - Une réaction d'ordre 1. - Une réaction d'ordre 0. - Une réaction d’ordre intermédiaire.

E + S ES E + Pk 1

k -1

k 2


22

4- Une enzyme E qui obéit à une cinétique michaelienne a un KM = 1 M vis-à-vis de son substrat S. Pour une concentration de [S] = 100 M, la vitesse initiale V0 mesurée est de 0,1 M.min-1. Quelle sera la valeur de V0 dans les conditions suivantes : a- [S] = 1 mM b- [S] = 1 M c- [S] = 2 M

5- Les figures 4 et 5 représentent : )[S]

1(f

V

1

0

en présence d'un inhibiteur

compétitif (IC) et non compétitif (INC). a- Indiquer sur les graphiques lequel représente l’inhibition compétitive et lequel

représente l’inhibition non compétitive. Justifier. b- Compléter les graphiques en précisant ce que chaque flèche indique.

Exercice n°4 : Les vitesses initiales d'une réaction enzymatique sont données pour cinq concentrations en substrat (Tableau ci-dessous). 1- Déterminer KM graphiquement. 2- Calculer la concentration d'un inhibiteur compétitif, ayant une constante de

dissociation Ki = 2,4.10-4 M, qui aurait pour effet de doubler la valeur du KM.

[S] (mol.L-1) V0 (mol.L-1 min-1)

1,0 x 10-4

1,5 x 10-4

2,0 x 10-4

5,0 x 10-4

7,5 x 10-4

28

35

42

63

75

[ I ] [ I ] = 0 1/Vo

1/ [S]

[ I ] [ I ] = 0 1/Vo

1/ [S]

4 5


23

Exercice n°5 : Le tableau ci-dessous traduit la cinétique de la transformation d'un substrat S par une décarboxylase en présence et en l'absence d'une substance F. 1- Sans construire la courbe, déterminer la vitesse maximale et la constante de

Michaelis en l'absence et en présence de F ; en déduire le rôle précis de F.

[S] (mM) 1 1,5 2 3 4 8 16 20 V0 (mM.min-1)

0,15

0,21

0,25

0,30

0,33

0,40

0,42

0,42 V0 en présence de F (mM.min-1)

0,06

0,08

0,10

0,12

0,13

0,15

0,16

0,16

On mesure la vitesse de transformation du substrat S en présence de 3 substances M, N et P. On obtient les courbes 1, 2 et 3 ci-après. 2- Déduire de ces courbes si M, N et P sont des activateurs ou des inhibiteurs.

Justifier. 3- Dans le cas d'un inhibiteur, préciser le type d'inhibition. Justifier les réponses.

1/Vo

1/ [S]

[M]= 2 mmol/ml Vo

1

2 3

[S]

[M]= 0 mmol/ml

[N]= 2 mmol/ml

[N]=0 mmol/ml

[P]=O mmol/ml

[P]= 2 mmol/ml

1/ [S]

0

0 0

1/Vo


24

Exercice n°6 : Pour caractériser une enzyme nouvellement purifiée, un biochimiste a mesuré les vitesses de réaction en présence de concentrations croissantes de substrat et cela dans trois conditions : a) En présence de l'enzyme seule. b) En présence de l'enzyme et d'un analogue non métabolisable du substrat

(composé A) à une concentration de 150 M. c) En présence de l'enzyme et d'un composé qui inhibe l'enzyme en se liant hors du

site actif de l'enzyme (composé B), à une concentration de 60 M. A partir des résultats expérimentaux, il a tracé les diagrammes de Lineweaver et Burk représentés dans la figure ci-dessous. 1- Indiquer la correspondance entre les expériences a, b, c et les symboles

employés (losanges, cercles, triangles). Justifier la réponse. 2- Déterminer graphiquement KM, KM app., Vmax et Vmax app. 3- Calculer les constantes d'inhibition pour les composés A et B (c’est-à-dire les

constantes de dissociation des complexes EI).

ACTIVITE ENZYMATIQUE Quelques rappels théoriques : 1- L’activité enzymatique : elle s’exprime en nanokatals. Un nanokatal mesure l’activité d’une solution enzymatique qui catalyse la transformation d’une nanomole (10-9 mole) de substrat en une seconde dans les conditions optimales de la réaction (pH, température, concentration saturante en substrat) dans un volume réactionnel donné.

0

1

2

-5,00E+03 0,00E+00 5,00E+03 1,00E+041 / [S]0 (M

-1)

1 / V0 (min.M-1)


25

AE (nkat) = (s)réactiondetemps

estransformésubstratdenanomolesdenombre

L’activité enzymatique se rapporte toujours à un volume de solution enzymatique donnée. Par convention, on ramène souvent le résultat à 1 mL de solution enzymatique non diluée. 2- L’activité spécifique : Elle correspond à l’activité enzymatique ramenée à 1 mg de toutes les protéines présentes dans l’échantillon (et non pas à l’enzyme seule).

AS (nkat.mg-1) = (mg)protéinesdemasse

eenzymatiquactivité

3- Evaluation d’une purification enzymatique : Un extrait enzymatique brut est constitué de la protéine à laquelle on s’intéresse mais aussi d’un grand nombre de protéines indésirables dites contaminantes. Une purification réussie implique : a- De récupérer le maximum d’activité enzymatique par rapport à ce que contenait

l’extrait brut initial ; ceci est traduit par la valeur du rendement de purification. b- D’éliminer le maximum de protéines contaminantes présentes dans l’extrait brut

initial ; ceci est traduit par la valeur du facteur de purification. Après chaque étape de purification, plusieurs paramètres doivent ainsi être mesurés : a- La masse totale de protéines (mg) : elle est obtenue en déterminant la

concentration (en mg.mL-1) d’une partie de l’échantillon et en multipliant par le volume total de la fraction.

b- L’activité enzymatique totale (nkat) : elle est obtenue en mesurant l’activité enzymatique (en nkat.mL-1 d’extrait enzymatique) d’un volume d’échantillon et en multipliant par le volume total de l’échantillon.

c- L’activité spécifique (nkat.mg-1) : ce paramètre est obtenu en divisant l’activité enzymatique totale par la masse totale de protéine. Elle est généralement exprimée en nkatals.mg-1 de protéines.

Ces trois paramètres permettent ensuite de calculer :

a- Le rendement de la purification = 100xbrutextraitl'detotaleAE

purifiéextraitl'detotaleAE (%)

b- Le facteur de purification =initialbrutextraitl'deAS

purifiéextraitl'deAS

4- Notion de vitesse et d’activité – Unités : - Une vitesse de réaction en phase liquide est conventionnellement exprimée en variation de la concentration de produit (ou substrat) en fonction du temps car ce sont les concentrations qui déterminent les équilibres réactionnels. La vitesse caractérise donc l’aspect cinétique de la réaction enzymatique.


26

- L’activité enzymatique est exprimée en variation du nombre de moles de produit (ou substrat) en fonction du temps. Le volume d’enzyme utilisé pour réaliser le test enzymatique doit alors être obligatoirement précisé. L’activité enzymatique caractérise ainsi le pouvoir catalytique de l’échantillon enzymatique. Exercice n°1 : La glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G-6-P-D) catalyse la réaction : D-glucose-6-phosphate + NADP+ 6-phosphoglucono--lactone + NADPH + H+

Le coefficient d'extinction molaire du NADPH à 340 nm est 6220 M-1.cm-1. Les autres composés n'absorbent pas à 340 nm. On se propose de purifier la G-6 P-D de Bacillus subtilis. Pour tester le degré de pureté de la préparation, après chaque étape de purification, on ajoute une partie de la préparation enzymatique à une solution de D-glucose-6-P et de NADP+ qui restent en excès pendant tout le temps de la mesure dans la cuve de spectrophotomètre. La longueur du trajet optique est 1cm. Le volume total final est 1mL. 1- Après une étape de purification, on ajoute au mélange réactionnel une partie de

préparation enzymatique contenant 100 g de protéines (dosées par la méthode de Lowry). Après 5 min., la variation d'absorbance à 340 nm est de 0,3. Calculer l'activité spécifique (AS) de la préparation de G-6-P-D à ce stade de purification.

2- Après de nouvelles opérations de purification, une partie de la préparation enzymatique contenant 1 g de protéines entraîne après 1 min. un accroissement de l'absorbance de 0,36.

2.1- Calculer l'AS de la préparation de G-6-P-D à ce stade de purification. 2.2- Par rapport au stade précédent, combien de fois l’enzyme a t’elle était

purifiée ? 3- Après de nouvelles étapes de purification, on ne parvient pas à obtenir une

activité spécifique plus élevée. Qu'en déduire ? Exercice n°2 : Plusieurs étapes de purification sont utilisées pour obtenir une enzyme :

- étape 1 : précipitation par le sulfate d'ammonium - étape 2 : chromatographie par échange d'ions - étape 3 : chromatographie par filtration sur gel

1- Rappeler le principe des différentes techniques utilisées pour purifier l’enzyme. 2- Les mesures effectuées au cours de cette purification sont données dans le tableau suivant. Calculer pour chaque étape l'activité enzymatique totale (AT), l'activité spécifique (AS), le rendement (Rdt) et le facteur de purification (Fp ).


27

Fraction Volume de solution (mL)

Masse de protéines (mg)

Activité enzymatique mesurée sur 0,1 mL de

solution protéique (nmol.sec-1)

Extrait cellulaire brut 100 50000 20 étape 1 10 500 20 étape 2 1 50 100 étape 3 1 5 50

Exercice n°3 : Etude de transaminases sériques Les 2 principales enzymes de transamination présentes dans le sérum sont :

- La glutamate oxaloacétate transaminase (GOT). - La glutamate pyruvate transaminase (GPT).

1- Ecrire la réaction catalysée par ces 2 enzymes.

Données : l'-cétoglutarate est l'-cétoacide dicarboxylique dérivé de Glu et l'acide oxaloacétique est l'-cétoacide dicarboxylique dérivé de Asp.

On dispose des réactifs suivants :

- réactif 1 : alanine à 0,08 M, lactate déshydrogénase à 10 mg.L-1 et NADH à 2.10-4 M dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,4.

- réactif 2 : solution à 0,1 M d'acide -cétoglutarique. On met à incuber 2,2 mL de réactif (1) avec 0,5 mL de sérum pendant 5 min. à 25°C. On ajoute alors 0,3 mL de réactif (2) et, très rapidement, le mélange est transvasé dans la cuve d'un spectrophotomètre réglé à 340 nm. L'épaisseur de la cuve est de 1 cm. On relève l'absorbance toutes les minutes pendant 5 minutes, ce qui donne les résultats suivants :

temps (min.) 0 1 2 3 4 5 A340 0,558 0,452 0,348 0,245 0,142 0,070

2- Quelle est la transaminase dosée ? 3- Calculer l'activité transaminasique en nkat par mL de sérum.

Donnée : NADH à 340 nm = 6220 M-1.cm-1. 4- Les valeurs physiologiques sont comprises entre 5 et 15 mU.mL-1 de sérum

(milliunités internationales). Commenter la valeur trouvée dans l'expérience proposée. Donnée : Une unité internationale est l'activité enzymatique qui transforme 1 mole de substrat par minute dans les conditions optimales de pH, de force ionique et de concentration en substrat.

Exercice n°4 : La glutamate déshydrogénase (GDH) catalyse la réaction suivante :


28

Cette enzyme permet la désamination de l'acide glutamique en présence de NAD+. On mesure l'activité de la GDH dans le sens de formation de l'acide glutamique dans les conditions suivantes :

- 0,2 mL de sulfate d'ammonium à 5 M - 2,4 mL d'une solution tampon pH 8 - 0,1 mL d'une solution de NADH à 6,5 mg.mL-1 (M = 709 g.mol-1) - 0,2 mL d'une solution à 1 M d'acide -cétoglutarique - Pré-incubation 5 min. à 25°C - Addition de 0,1 mL de solution de GDH contenant 1,6 mg.mL-1 de

protéines (dosées par la méthode de Lowry) pour démarrer la réaction. On mesure l'absorbance du milieu réactionnel (maintenu à 25°C) à 340 nm en fonction du temps dans une cuve de trajet optique de 1 cm. On obtient les résultats suivants :

Temps (min.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A à 340 nm 1,760 1,718 1,675 1,635 1,595 1,550 1,510 1,476 1,450 1,430

1- Expliquer le rôle des différents constituants du milieu réactionnel. 2- Tracer la courbe A = f(t). Commenter l'allure de cette courbe, en expliquant

notamment l’apparition d’un début de plateau. 3- Donner la vitesse initiale V0 de la réaction en M.min-1. 4- Calculer l'activité enzymatique de 1mL de solution de GDH dans les conditions du

test. 5- Calculer l'activité spécifique de la solution de GDH.

Donnée : NADH à 340 nm = 6220 M-1.cm-1. Exercice n°5 : On souhaite étudier une nouvelle protéase P isolée du tube digestif d'un insecte amazonien. Cette protéase existe sous deux formes Pi et Pa ayant des séquences en


29

acides aminés identiques. Seule la forme Pa possède une activité protéasique. Pour élucider le mode d'activation de la protéine Pi (forme inactive) en protéine Pa (forme active), une expérience à l'aide de DIFP a été réalisée. La découverte de la neurotoxicité du DIPF (diisopropylphosphofluoridate) a conduit à utiliser ce réactif comme agent inactivateur d'enzyme. Le DIPF réagit avec une sérine du site actif de l’enzyme, selon la réaction suivante :

1. Les deux protéases Pa et Pi sont incubées séparément en présence de 32P-DIPF pendant 30 minutes à 37°C, puis dialysées pour éliminer l'excès de réactif radiomarqué. Les deux protéases sont alors analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de SDS (sodium dodecyl sulfate) avec ou sans 2-mercaptoéthanol.

Après coloration au bleu de Coomassie, la photographie du gel obtenu donne le résultat suivant : Les marqueurs de masse molaire déposés dans la piste 1, sont les suivants : β-galactosidase 120 000 g.mol-1 ; albumine du sérum de bœuf 70 000 g.mol-1 ; ovalbumine 42 000 g.mol-1 ; trypsine 25 000 g.mol-1 ; myoglobine 16 000 g.mol-1 ;

Enzyme

Enzyme

Piste 1 Piste 2 Piste 3 Piste 4 Piste 5


30

peptone 9 000 g.mol-1. La protéine Pi est déposée sur les pistes 2 et 3, respectivement en absence et en présence de 2-mercaptoéthanol. De même, la protéine Pa est déposée sur les pistes 4 et 5, respectivement en absence et en présence de 2-mercaptoéthanol. 1- Que pouvez-vous tirer de l'analyse de cette électrophorèse sur le mode

d'activation de la protéine P ? Après autoradiographie du gel, les bandes radioactives sont révélées sur un film photosensible par une coloration noire. Le résultat est le suivant :

2- Compléter votre analyse précédente (question 1) de l'électrophorèse, par l'étude des résultats obtenus par autoradiographie pour affiner vos conclusions sur le mode d'activation de la protéine P.

2. L'étude enzymatique de la protéine P s'effectue sur un substrat artificiel, le para-nitrophénylacétate (pNPA) dont le produit d'hydrolyse absorbe à 410 nm avec un coefficient d'extinction molaire à 410 nm de 4 000 M-1.cm-1. 1- Ecrire la réaction catalysée par la protéine P sur le substrat artificiel. 2- L’extrait enzymatique est trop concentré en activité pour être utilisé en l’état. Une

dilution au 1/300 est nécessaire. Quels sont les volumes respectifs en solution tampon et en extrait enzymatique que vous devez prendre pour effectuer cette dilution sachant qu'un volume minimum de 600 µL d'extrait dilué est nécessaire pour la suite de vos manipulations ?

Le protocole expérimental pour mesurer l'activité enzymatique de l'enzyme P est le suivant. Le spectrophotomètre est programmé pour faire une cinétique pendant 3 minutes à 410 nm. Le zéro d’absorbance est fait à 410 nm à l’aide d’1 mL de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7. Dans une cuve de 1 mL, 450 µL de tampon phosphate 0,1 M, pH 7, et 500 µL de pNPA à 1 mM sont mis en présence de 50 µL d’extrait enzymatique dilué et homogénéisés rapidement avant de démarrer la cinétique.

Piste 1 Piste 2 Piste 3 Piste 4 Piste 5


31

3- Quelle critique apportez-vous au choix du contenu de la cuve utilisé pour faire le

zéro d'absorbance ? Le résultat expérimental obtenu est le suivant :

4- Calculer l'activité enzymatique de 1mL de l'extrait enzymatique de départ dans les

conditions expérimentales proposées. Détailler vos calculs. Le dosage selon la méthode de Bradford des protéines présentes dans l'extrait enzymatique est effectué selon le protocole suivant :

A 100 µL d’échantillon protéique dilué, ajouter 1 mL de réactif de Bradford. Laisser 20 min. à température ambiante. Lire l’absorbance à 595 nm contre un témoin ne contenant pas de protéines.

5- Donner le contenu du tube témoin. L'extrait enzymatique est préalablement dilué au 1/10ème. Les résultats expérimentaux obtenus sont les suivants : Tube 1 2 3 4 5 6 Tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7 (L)

50 50 50 0 0 0

Extrait enzymatique dilué (L) 50 50 50 100 100 100 Réactif de Bradford (mL) 1 1 1 1 1 1 A à 595 nm 0,102 0,098 0,101 0,199 0,200 0,200 6- Quel est l'intérêt de faire plusieurs mesures ?


32

7- Calculer la concentration en protéines de l'extrait enzymatique à l’aide de la courbe d’étalonnage suivante, effectuée avec de la sérum albumine bovine.

8- Calculer l'activité spécifique de l'extrait enzymatique.

NOTION DE SITE ACTIF Quelques rappels théoriques : Le site actif est une zone de l'enzyme où se fixe le substrat et où intervient l'effet catalytique. Les acides aminés présents dans cette zone, ainsi que les molécules non protéiques (dites cofacteurs) qui y sont également localisées, participent directement à l'action catalytique. On distingue les acides aminés qui participent à la fixation du substrat par l’intermédiaire de liaisons non covalentes (essentiellement ioniques, hydrophobes et hydrogène) et les acides aminés catalytiques participant à la transformation du substrat en produit. NB : Les protéines sont des molécules déformables ; il en résulte que les ligands qui se fixent en un autre point de l'enzyme que le site actif, et souvent fort loin, peuvent modifier la conformation du site actif et ainsi changer les valeurs des constantes cinétiques de l'enzyme. Principe de l'étude expérimentale d'un site actif : Toutes les méthodes physicochimiques d'étude des protéines sont utilisées pour déterminer le mécanisme d'action d'une enzyme. Néanmoins, de nombreuses méthodes sont basées sur le principe suivant : modification légère soit de la structure d'un ligand soit de celle de l'enzyme et mesure des variations d'activité et d'affinité correspondantes. Si les constantes caractéristiques KM ou kcat sont nettement modifiées, on en déduit que la zone concernée du ligand ou de l'enzyme participe à la fixation du substrat ou à sa transformation.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Absorbance à 595 nm

Masse de SAB (en g / tube)


33

Exercice n°1 : La carboxypeptidase est une métalloenzyme qui assure l'hydrolyse de la liaison peptidique liant le dernier acide aminé du côté COOH terminal au reste des peptides et des protéines substrats. La fixation du peptide L-alanyl-L-tyrosine sur le site actif de cette enzyme, est donnée dans le schéma ci-dessous :

OH

C H 2

H C C O -

O NH

C O

C

H N

H

H O

H

+ N C

NH 2

N

H

COO -

Zn ++

Tyr 248

H

H

Arg 145

Glu

Poche apolaire

NB : Cette représentation donne une image plane de la structure spatiale du site actif : deux groupes positionnés au voisinage l'un de l'autre sur ce schéma, sont supposés l'être dans la structure réelle, tridimensionnelle de l'enzyme. Les traits hachurés représentent les liaisons enzyme-substrat. 1- Quels types d'interactions interviennent dans la fixation du substrat ? 2- Préciser à priori si le KM est modifié si on remplace le L-alanyl-L-tyrosine par les

substrats suivants : L-alanyl-L-phénylalanine ; L-alanyl-L-aspartate ; L-aspartyl-L-tyrosine.

Exercice n°2 : La glycéraldehyde-3-phosphate-deshydrogénase catalyse l'oxydation du glycéraldehyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate :

Si on fait réagir de l'iodoacétate sur cette enzyme, on constate que le glycéraldehyde-3-phosphate continue à se fixer sur l'enzyme modifiée mais ne s'oxyde plus. Que peut-on conclure ?


34

Donnée : l'iodoacétate ICH2COO- est un agent alkylant qui réagit avec les thiols (-SH) pour former de façon irréversible des groupements -S-CH2COO-. Exercice n°3 : Les paramètres Vmax et KM d'une réaction enzymatique sont étudiés en fonction du pH et donnent les résultats suivants :

1- Que représentent les paramètres Vmax et KM pour une enzyme michaelienne ?

Que permettent-ils d’étudier chez cette enzyme ? 2- Quel est le type d'acides aminés qui apparaît comme essentiel pour le

fonctionnement du site catalytique, et quel est l'état de protonation de ce (ou ces) acide(s) aminé(s) dans l'enzyme active ?

3- Même question en ce qui concerne le site de fixation du substrat sur l'enzyme.

pH

Vmax (unités arbitraires)

4 8 6 10

0

10

20

pH

KM (mM)

4 8 6 10

0

40

80

KM = 1mM

TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE

35

THEME N°4 : BIOENERGETIQUE ENERGIE LIBRE – SENS DES REACTIONS – EQUILIBRE POTENTIELS REDOX – FORMULE DE NERNST


36

ENERGIE LIBRE – SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE Quelques rappels théoriques : Variation d’énergie libre et constante d’équilibre Considérons la réaction chimique suivante, se déroulant au sein d'un système à pH = 7 (à ce pH, les grandeurs thermodynamiques classiques sont affectées du signe "prime"). A + B C + D Bien que la réaction puisse évoluer dans les 2 sens, nous avons écrit C et D à droite ; nous les appellerons donc “ produits ”. A et B sont alors appelés “ substrats ”. Nous voulons calculer la variation d’énergie libre lorsque moles de A et moles de B sont converties en moles de C et moles de D, chacun à une concentration donnée. Pour la réaction inverse, nous avons seulement besoin de changer le signe de l’énergie libre que nous aurons calculée. Dans une réaction chimique, la variation d’énergie libre (G’), exprimée en kJ.mol-1, dépend de la variation d’énergie libre dans les conditions standard (Go’) et de la concentration des substrats et produits.

G’ = Go’ + RT ln )[B][A]

[D][C](

βα

δγ

(1)

Avec : - Conditions standard : Concentrations molaires des réactants autres

que H+, 298°K, pH = 7. - R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol-1. °K-1. - T = température absolue en kelvins (°K).

- [A], [B], [C], [D] : concentrations dans les conditions initiales. Signification de G’ :

- Si G’ > 0 : la transformation n’est pas spontanée, et il faut lui fournir de l’énergie pour qu’elle se fasse (c’est la réaction inverse qui est alors spontanée) : elle est dite endergonique.

- Si G’ < 0 : la transformation est spontanée et elle est susceptible de fournir de l’énergie : elle est dite exergonique.

- Si G’ = 0 : la transformation n’a tendance à se faire ni dans un sens ni dans l’autre : elle est à l’équilibre.

Lorsque le système est à l’équilibre, les concentration dans le facteur entre parenthèses de l’équation (1) ne sont plus les concentrations initiales mais les concentrations à l’équilibre. De ce fait, ce facteur entre parenthèses est appelé la constante d’équilibre K de la réaction :

K = eq)[B][A]

[D][C](

(2)


37

L’équation (1) devient donc : 0 = Go’ + RT ln eq)[B][A]

[D][C](

(3)

ou : Go’ = - RT ln K (4) Exercice n°1 : La variation d'énergie libre standard de la réaction : D-glucose-1-phosphate D-glucose-6-phosphate considérée de gauche à droite, est de : - 7270 J.mol-1 (à 25°C et pH = 7). Dans quel sens la réaction tend-elle à se faire spontanément dans les 3 cas suivants :

D-glucose-1-phosphate (mM) D-glucose-6-phosphate (mM) 72 72 7,2 137 5,55 555

Exercice n°2 : La variation d'énergie libre standard de la réaction :

pyruvate + aspartate oxaloacétate + L-alanine considérée de gauche à droite, est nulle à 25°C, pH = 7. On incube du pyruvate, de l'aspartate et de la L-alanine dont les concentrations initiales sont 1 x 10-3 M, l'oxaloacétate étant initialement absent. Calculer la molarité des différents composés à l'équilibre. Exercice n°3 : Le tableau suivant donne les variations d’énergie libre standard d'hydrolyse de quelques composés phosphorylés.

Composés Go’ (kJ.mol-1) Phosphoénolpyruvate Carbamyl-phosphate

Acétyl-phosphate Créatine-phosphate

Pyrophosphate ATP

Glucose-1-phosphate Glucose-6-phosphate Glycérol-3-phosphate

- 61,7 - 51,4 -43,0 - 43,0 - 33,4 - 30,4 - 20,8 - 13,8 - 9,1


38

1- Qu’est-ce que le potentiel de transfert de groupement phosphate ? 2- Quel est le composé qui a le potentiel de transfert le plus élevé ? 3- Quel est le sens de chacune des réactions suivantes lorsque les réactifs sont

initialement présents en quantités équimolaires (1M) ? ATP + créatine créatine-phosphate + ADP ATP + pyruvate phosphoénolpyruvate + ADP

4- Quel est l’élément de couplage absolument indispensable ? Exercice n°4 : La réaction de biosynthèse de la L-glutamine chez l'homme est catalysée par la L-glutamine synthétase. On peut la résumer de la manière suivante : ATP + glutamate + NH3 ADP + phosphate + glutamine Go’ de cette réaction est de -16,3 kJ.mol-1 (de gauche à droite). 1- Préciser la signification de cette dernière donnée. 2- Cette réaction peut être considérée comme la somme de deux réactions

composantes, l'une exergonique, l'autre endergonique. Ecrire ces deux réactions composantes et évaluer Go’ de la réaction endergonique.

3- Plus généralement, quelles sont les conditions thermodynamiques nécessaires pour qu'une réaction endergonique puisse se produire ?

Donnée : Go’ de l’hydrolyse de l’ATP = - 30,4 kJ.mol-1.

POTENTIELS REDOX – FORMULE DE NERNST Quelques rappels théoriques : Le transport des électrons dans les systèmes biologiques consiste en une série de réactions d’oxydation et réduction couplées entre elles (encore appelées réactions redox). Une oxydation = perte d’électrons ; une réduction = gain d’électrons. Un réducteur est un composé ayant tendance à fournir un (ou des) électron(s). Un oxydant est un composé ayant tendance à capter un (ou des) électron(s). Oxydant + n e- Réducteur Les formes réduite et oxydée d’un même composé constituent un couple redox. Le pouvoir réducteur d’un couple redox est défini par le potenteil redox (E). Plus ce potentiel redox est négatif, plus le couple a un pouvoir réducteur.


39

Il est possible de calculer les potentiels redox grâce à la relation de Nernst :

E’ = E0’ + [red]

[ox]ln

Fn

TR

Avec : - E’ = potentiel redox en volts à pH 7. - E0’= potentiel standard redox à pH 7, 298°K, [ox] = [red] = 1 mol.L-1. - R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol-1. °K-1.

- T = température absolue en kelvins. - n = nombre d’électrons impliqués. - F = faraday = 96 500 J.V-1.mol-1 = 96 500 C. (Coulombs). - [ox] et [red] = concentrations des formes oxydée et réduite.

Une réaction d’oxydo-réduction fait intervenir 2 couples redox : la forme réduite d’un premier couple transfère ses électrons à la forme oxydée du second couple. On obtient alors la forme oxydée du premier couple et la forme réduite du second couple.

Ox1 + n e- Red1 E0’ (1) Red2 Ox2 + n e- E0’ (2) Si E0’ (2) < E0’ (1), le couple 2 est le plus réducteur. Spontanément, les électrons sont transférés de la forme réduite du couple 2 à la forme oxydée du couple 1 et donc le système 2 réduit le système 1 :

Red2 + Ox1 Ox2 + Red1 Il est possible de calculer la variation d’énergie libre des réactions redox dans les conditions standard grâce à la relation suivante :

Go’ = - n F [ E0’ (1) – E0’ (2) ] = - n F E0’ Quelques potentiels redox standard E0’ utiles en biochimie : E0’ (Volt) ½ O2 + 2 H+ + 2 e-

NO3

- + 2 H+ + 2 e- 2 cyt c (ox) + 2 e-

2 cyt b (ox) + 2 e- Pyruvate + 2 H+ + 2 e- NAD+ + 2 H+ + 2 e- Acétoacétate + 2 H+ + 2 e-

H2O NO2

- + H2O 2 cyt c (red) 2 cyt b (red) Lactate NADH + H+ -hydroxybutyrate

+ 0,81 + 0,42 + 0,25 + 0,08 - 0,19 -0,32 - 0,35


40

Exercice n°1 : En vous aidant du tableau précédent, déterminer le sens de chacune des réactions suivantes. Justifier les réponses (on suppose que les conditions sont les conditions standard et que le milieu contient l'enzyme catalysant la réaction considérée). Pyruvate + -hydroxybutyrate Lactate + Acétoacétate (1) Acétoacétate + NADH + H+ -hydroxybutyrate + NAD+ (2) 2 cyt c (ox) + 2 cyt b (red) 2 cyt c (red) + 2 cyt b (ox) (3) Exercice n°2 : Une bactérie dénitrifiante A est anaérobie stricte. Elle possède néanmoins une chaîne transporteuse d'électrons lui permettant de “ respirer ”. L'accepteur final d'électrons, au lieu d'être l'oxygène moléculaire comme dans l'aérobiose est le nitrate (NO3

-) réduit en nitrite (NO2-). Les électrons sont introduits dans la chaîne des

transporteurs d'électrons par le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH + H+). 1- Ecrire le bilan global des réactions réalisées par cette bactérie. 2- Calculer la variation d'énergie libre standard correspondante. 3- La “ respiration nitrate ” est-elle théoriquement plus ou moins exergonique que la

respiration aérobie ? Justifier par le calcul.

TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL

41

THEME N°5 : METABOLISME GENERAL GLYCOLYSE CYCLE DE KREBS PHOSPHORYLATION OXYDATIVE -OXYDATION DES ACIDES GRAS


42

Exercice n°1 : Fermentation des bactéries lactiques. La plupart des bactéries lactiques sont dépourvues de cytochromes. Elles peuvent dégrader le glucose par 2 voies :

- La voie de la glycolyse - La voie hétéro-fermentaire.

Le bilan de la voie de la glycolyse en conditions anaérobie peut s'écrire :

1 glucose 2 acides lactiques 1- On laisse se développer la souche bactérienne sur un milieu contenant du

glucose dont le C1 est radioactif (14C). Sur quel atome de carbone de quel produit retrouvera-t-on la radioactivité au terme de la glycolyse ?

2- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consommé ? On précisera quelles sont les étapes au cours desquelles il y a consommation ou production d'ATP.

3- La transformation de glucose en acide lactique s'accompagne-t-elle globalement d'une réduction de nicotinamide-adénine-dinucléotide ? Expliquer votre réponse.

4- Quel serait le bilan en ATP et en NADH de la dégradation d’une mole de saccharose par la voie de la glycolyse ?

5- La voie de la glycolyse comprend plusieurs réactions couplées. Décrire celles qui correspondent à des réactions de phosphorylation liée au substrat.

La voie hétéro-fermentaire d'une bactérie lactique comporte la séquence de réactions donnée dans la figure 1. Le 3-phosphoglycéraldéhyde formé est transformé en lactate par une séquence de réactions commune avec celle de la voie de la glycolyse. 6- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consommé par la voie

hétéro-fermentaire, lorsque cette voie donne les produits de fermentation figurant dans le bilan suivant :

1 glucose 1 CO2 + 1 acide lactique + 1 éthanol

7- Etablir le bilan de NADH + H+ participant aux réactions de cette voie. Une étude précise des produits formés donne les résultats regroupés dans le tableau ci-dessous. Toutes les valeurs sont exprimées en mmol. de produits formés à partir de 10 mmol. de glucose fermenté. Acide lactique Ethanol Dioxyde de carbone Acide acétique

10,2 9,7 9,5 0,0

8- Etablir la balance carbonée de cette fermentation (rapport exprimé en

pourcentage entre le nombre de moles d'atomes de carbone récupérées en

TD BIO2

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241 2012-2013

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43

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e de la gll-1 à 25°C.

e produit Xreprésenta

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ent aux


44

Exercice n°3 : L’enzyme aldolase catalyse la réaction suivante dans la voie de la glycolyse :

Fructose-1,6-bisphospate Dihydroxyacétone phosphate + Glycéraldéhyde-3-phosphate

Le Go' de la réaction est + 5,7 kcal.mol-1 (T = 25°C), alors que le G dans la cellule est – 0,3 kcal.mol-1. Calculer le rapport entre produits et substrat à l’équilibre et dans les conditions intracellulaires. A l’aide de vos résultats, expliquer comment la réaction peut être endergonique dans les conditions standard et exergonique dans les conditions intracellulaires. Rappel : 1 cal = 4,18 J. Exercice n°4 : Un être humain consomme environ 2800 kcal par jours en s'alimentant. Si on considère que les voies métaboliques qui conduisent à la production d'ATP opèrent avec une efficacité thermodynamique de 50%. Calculer le poids d'ATP qui est produit par le corps humain en une journée sachant que l'énergie libre produite par l'hydrolyse d'une mole d'ATP = 50 kJ et masse molaire de l'ATP = 551 g/mol. Exercice n°5 : Quelle quantité d’ATP, exprimée en moles, une cellule musculaire peut-elle produire : 1.1- en condition aérobie à partir :

a- d’une mole de glucose b- d’une mole d’acide gras palmitique (C16) (donner seulement l’ordre de

grandeur) 1.2- en condition anaérobie prolongée à partir :

a- d’une mole de glucose b- d’une mole d’acide gras palmitique (C16)

Données : Utilisez pour le calcul les valeurs P/O suivantes : 2 moles ATP formées par mole de FADH2 re-oxydé et 3 moles ATP formées par mole de NADH,H+ re-oxydé (quelle que soit son origine cytosolique ou mitochondriale) Exercice n°6 : Un fragment de muscle squelettique humain dans lequel une électrode a été implantée est plongé dans une solution physiologique contenant du glucose. Lorsqu’il est stimulé par un courant électrique, le fragment de muscle consomme 76 µmoles d’ATP par minute. La concentration initiale en glucose de la solution physiologique est de 3,6 g/L. Le volume total est de 10 ml. Dans ces conditions expérimentales, tout l’ATP consommé par le fragment de muscle provient


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uniquement de l’oxydation du glucose présent dans la solution physiologique, en condition aérobie. En vous aidant des résultats de la question précédente, déterminer le temps nécessaire pour que la quantité de glucose présente dans la solution initialement soit totalement épuisée. Détailler votre raisonnement et vos calculs. Donnée : la masse molaire du glucose est de 180 g/mol


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THEME N°6 : METABOLISME GENERAL

SPECIFICITES MICROBIENNES


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Remarque préliminaire : Tous les exercices qui suivent impliquent le calcul de temps de génération (Tg) et de taux de croissance (). Il s’agit de notions que vous avez abordées au cours de l’UE BIO231, et il vous suffira donc de vous reporter au polycopié de TD de cette UE pour vous remémorer leur mode de calcul.

= Tg

1 ( est exprimé en divisions.min-1 ou divisions.h-1, et Tg en min ou h)

log N = (Tg

log2 x t ) + log N0 avec N = population à un temps t

N0 = population initiale t = t – t0

Exercice n°1 :

Dans le cadre d'un travail sur le catabolisme des sucres chez Escherichia coli, vous avez voulu étudier l'influence de la nature des sources de carbone sur la croissance. Vous avez effectué trois cultures parallèles, inoculées avec la même pré-culture à une DO600 initiale égale à 0,7, en variant la composition du milieu comme suit : A, milieu minimum + glucose 0,25% + lactose 0,1% ; B, milieu minimum + glucose 0,15% + lactose 0,2% ; C, milieu minimum + glucose 0,07% + lactose 0,28%. Les résultats sont présentés dans la figure ci-dessous. 1- Décrivez l’allure générale de la courbe (A, B ou C). 2- Calculez (aussi précisément que possible) les différents temps de génération et taux

de croissance horaires. 3- Interprétez les différences observées entre les 3 courbes, en faisant référence à vos

connaissances théoriques sur le sujet. 4- Comment pourriez-vous faire pour tester votre interprétation du phénomène mis en

évidence ? 5- Si vous aviez remplacé le glucose par du maltose, qu'auriez-vous vu ?

5 4 3 2 1 0 54321 0 5 4 3 210 t (h)

DO600

A B C 0,1


48

Exercice n°2 : Vous étudiez le catabolisme du glycérol chez une bactérie. Vous avez réalisé différentes cultures en milieu minimum en variant uniquement la concentration en glycérol, sachant qu’il s’agit là de la seule source de carbone disponible. A : [glycérol] = 400 mg.L-1, B : [glycérol] = 100 mg.L-1, C : [glycérol] = 40 mg.L-1, D : [glycérol] = 10 mg.L-1. Le milieu de culture ne contient que des nutriments, le glycérol rentre dans la cellule par diffusion facilitée. 1- Calculez les temps de génération des différentes courbes. 2- Comment interprétez-vous le fait que les courbes de croissances A et B soient

identiques ? Quelle expérience complémentaire vous permettrait de tester votre hypothèse quant à la culture A (proposez un protocole succinct, et analysez les probables résultats expérimentaux) ?

3- Pourquoi la culture C entre-t-elle en phase stationnaire avant les cultures A et B, et à une DO plus faible ? Quelle expérience complémentaire vous permettrait de tester votre hypothèse (proposez un protocole succinct, et analysez les probables résultats expérimentaux) ?

4- Comment expliquez-vous les différences entre les courbes C et D ?

Exercice n°3 : On étudie la croissance d'une bactérie dans un milieu défini, contenant un tampon de régulation du pH (Na2HPO4 : 3,8 g.L-1, KH2PO4 : 1,5 g.L-1), des sels minéraux (MgSO4 : 200 mg.L-1; CaCl2 : 20 mg.L-1). Le glucose (2 g.L-1) est la seule source de carbone et d’énergie ; la source d’azote est soit du nitrate de potassium (KNO3) (culture A), soit du chlorure d’ammonium (NH4Cl) (culture B). Après 3 h de culture, on fait buller de l’azote (N2) dans le milieu de culture dans le seul but de chasser rapidement l’oxygène dissous. Toutes les 30 minutes, une aliquote de la culture est prélevée, sur laquelle on effectue une mesure de DO600 (le « 0 » est réglé avec le milieu de culture non inoculé).

5 4 3 2 1 0 t (h)

DO600

AB

98 7 6 13121110 17 161514 19 18

C

D

x

0,1


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1- Calculez temps de génération et taux de croissance (expliquez brièvement vos calculs).

2- Commentez l'aspect des deux courbes. A quel(s) phénomène(s) biologique(s) peut-on imputer l’origine des différences observées : avant et après le bullage ; entre les cultures A et B (justifiez vos réponses).

3- On s’intéresse à deux mutants (M1, M2) dérivés de la bactérie étudiée. D’après les courbes de croissance obtenues, quelle(s) hypothèse(s) pourriez-vous émettre qui puisse expliquer, pour chaque mutant, la différence de comportement : par rapport à la souche sauvage ? entre les deux cultures A et B ?

4- Pour chacune des trois souches étudiées, que se passerait-il si, après avoir lancé une culture dans le milieu A en absence d’oxygène, on injectait de l’oxygène dans la culture à t = 3 h (esquissez la courbe de croissance) ?

2,5 21,510,50 t (h)

DO600 M1-A

4,543,53 6,565,55 8,587,57 9,5 9

M1-B M2-A M2-B

bullage d’azote

0,1

2,5 2 1,5 1 0,5 0 t (h)

DO600

A

4,54 3,5 3 6,565,55 8,5 8 7,57 9,59

Bbullage d’azote

0,1


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Exercice n°4 :

Des chercheurs s’intéressent au comportement de bactéries du genre Shewanella quand on ajoute dans leur milieu de culture de l’ADN. Ils ont réalisé différentes cultures dont les résultats sont présentés dans les deux figures ci-dessous.

Figure 1 : Cultures en aérobie des bactéries Shewanella oneidensis MR-1 (A), Shewanella putrefaciens CN32 (B) et Shewanella sp. souche W3-18-1 (C) dans un milieu de culture contenant : du PIPES (solution tampon) ; de l’acide lactique ; NH4Cl, NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 et Na2SeO4 ; des traces de vitamines et de minéraux ; et NaH2PO4 (carrés noirs) ou ADN de sperme de hareng (carrés blancs). Les données présentées correspondent à la densité optique, c.a.d. la biomasse totale.

Figure 2 : Cultures en anaérobie de Shewanella oneidensis MR-1 dans un milieu contenant : du PIPES (solution tampon) ; de l’acide lactique ; NH4Cl, NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 et Na2SeO4 ; Fe(III)-NTA (= Fe3+ complexé à de l’acide nitriloacétique) ; des traces de vitamines et de minéraux. Dans la figure 2A, les chercheurs ont ajouté au milieu de culture du NaH2PO4 ; dans la figure 2B, du NaH2PO4 et de l’ADN de sperme de hareng. Les carrés noirs représentent la quantité de cellules en suspension ; les ronds blancs représentent la concentration en Fe2+.

1- Au vu des résultats présentés dans la Figure 1, que pouvez-vous dire du rôle joué par l’ADN (justifiez votre réponse) ?

2- Quels autres rôles pourrait-il jouer (et quelles incidences pourrait-on en tirer quant à la composition des milieux de culture) ?

TD BIO 241 2012-2013 METABOLISME GENERAL

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3- Quel rôle le Fe(III)-NTA joue-t-il dans les cultures de la Figure 2, et quelles conclusions pouvez-vous en tirer quant aux capacités métaboliques des bactéries du genre Shewanella ?

4- Pouvez-vous expliquer l’absence de croissance bactérienne dans la Figure 2C ?


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CORRIGES – valeurs numériques Thème n°1 : Rappels Concentrations Ex 1 1: 0,41 g NaOH - 1,02 g CuSO4, 5H2O - 2,73 g tartrate de K et Na, 4H2O - 5,44 g Na2CO3, 10 H2O 3: Sulfate de cuivre :0,01 % - Tartrate de K et Na 0,02% Ex 2 1: 17,4 M - 17,4 N - 57 mL acide acétique concentré + H2O qsp 1L 2: 17,7 M - 35,4 N - 28 mL acide concentré + H2O qsp 1L Spectrophotométrie Ex 1

1: εtrp = 6000 M-1.cm-1 2: 4 résidus Trp Ex 2 1: εura = 12 000 M-1.cm-1 2: [Ade] = 10-5 M - [Ura] = 2 .10-5 M Acides/Bases faibles Ex 1 1: pH = 4,46 2: pH = 2,56 Thème n°2 : Rappels sur les protéines Ex 2 Leu pHi = 6 - Cys pHi = 5 - His pHi = 7,6 Ex 3 pHi peptide = 6,5 Thème n°3 : Enzymologie Energie d’activation 1 : Aucun catalyseur : k = 4,27.10-14 Platine colloïdal : k= 1,84.10-9 Catalase : k = 3,75.10-2 2 : Platine colloïdal : 4,3.104 - catalase env 1012 Cinétique enzymatique Ex 2 1 : KM = 3.10-5 M 2 : kcat = 5.103 s-1 3 : kcat/KM = 1,67.108 s-1.M-1 Ex 3 4a : Vo = 0,1 µM.mn-1 4b : Vo = 0,05 µM.mn-1 4c : Vo = 0,066 µM.mn-1 Ex 4 1: KM = 2,86.10-4 M


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2 : [I] = Ki Ex 6 2 : composé A Ki = 150 µM - composé B Ki= 60 µM Activité enzymatique Ex 1 1 : AS1 = 1,6 nkat.mg-1 protéines 2 : AS2 = 965 nkat.mg-1 protéines - Fp ~ 600 Ex 3 3 : pour 1 mL de sérum, AE = 1,67 nkat.mL-1 Ex 4 3 : Vo = 6,7.10-6 M.mn-1 4 : 1 ml sol GDH, AE = 3,3 nkat.mL-1 5 : AS = 2,1 nkat.mg-1 Ex 5 4 : AE : 20000 nkat.mL-1 7 : conc. Protéines = 0,04 mg.mL-1 8 : AS = 5.104 nkat.mg-1 Thème n°4 : Bioénergétique ENERGIE LIBRE – SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE Ex 2 [oxaloacétate] = 3,33.10-4 M. [L-alanine] = 1,33.10-3 M. [pyruvate] = [aspartate] = 6,67.10-4 M. POTENTIELS REDOX – FORMULE DE NERNST Ex 2 2 : respiration nitrate Go’ = -142,8 KJ.mol-1 3 : respiration aérobie Go’ = -218 KJ.mol-1 Thème n°5 : Métabolisme général Ex 1 8 : Balance carbonée de la voie hétérofermentaire = 99,2% Ex 3 A l’équilibre : [dihydroxyacétone-P] [glycéraldéhyde-3-P] = 6,7.10-5 [fructose-1,6-BP] Conditions intra-cellulaires : [dihydroxyacétone-P] [glycéraldéhyde-3-P] = 4.10-5 [fructose-1,6-BP] Ex 4 Le poids d’ATP produit est : = 64,5 kg Ex 6 Temps d’épuisement du glucose : = 100 min soit 1h 40 min Thème n°6 : Métabolisme - spécificités bactériennes Ex 1 2 : 1ère phase de croissance : Tg = 1h ; ν= 1 division.h-1

2ème phase de croissance : Tg = 2h30 ; ν = 0,4 division.h-1 Ex 2


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1 : A - B - C : Tg = 2,5 h - D : Tg = 4,5 h Ex 3 1: Avant bullage : Tg = 0,75 h (45 min) - ν = 1,32 divisions.h-1 Après bullage - A : Tg = 1,25 h (75 min) - ν = 0,8 divisions.h-1

Après bullage - B : Tg = 3,4 h (205 min) - ν = 0,3 divisions.h-1

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