Méthodes d’évaluation de la biocompatibilité des biomatériaux dentaires

1. INTRODUCTION

Polémique de la toxicité de l’amalgame dentaire: premières recommandations 1927.Années 50: intérêt dans les toxiques éventuels, cf produits synthétiques et semi-synthétiques (rési-nes).Normes régissent utilisation des biomatériaux: premières normes pays anglo-saxons et scandinave, Loi Hurick, 1970.En dehors de la toxicité, intérêt des propriétés biologiques: cf implants.

2. DEFINITIONS

2.1. BIOCOMPATIBILITE

• Définit l’aptitude d’un matériau à se comporter avec une réponse appropriée de l’hôte dans une application spécifique.

• pas d’application universelle, parfois on souhaite réponse violente (CaOH2) ou pas de ré-ponse.

2.2. BIOMATERIAUX

• Matériau non vivant utilisé à des fins thérapeutiques (pour remplacer tout ou une partie d’un organe défaillant) et appelé à interagir avec les systèmes biologiques. (Chester 1981)

• Rôle principal= suppléance fonctionnelle. On peut ajouter propr pharmaco, chim, immuno, mé-taboliques,...

• Applications: ophtalmo, orthopédie, cardio, chir réparatrice et esth, endocrino (pancréas),chir maxillo-faciale,dentisterie.

• Futur: ingéniérie tissulaire, biomat hybrides (avec cell vivantes, surtout supports pour régénéra-tion tissulaire). Le biomat sera un moment de la régénération.

2.2.1. CLASSIFICATION DES BIOMATERIAUX

2.2.1.1. SELON LA DUREE ET LE TYPE DE CONTACT AVEC LE CORPS HUMAIN

‣ Durée: ‣ A limitée (<24h), B prolongée (<30j), C permanente(>30j).‣ influence directement l’évaluation biologique: norme ISO 10993

‣ Contact: du moins au plus invasif,‣ dispositif au contact d’une surface‣ communiquant avec l’extérieur‣ implantable

2.2.1.2. SELON LA NATURE CHIMIQUE

‣ Influence directement le comportement physico-chimique et biologique: corrosion, dégradation polymère...

‣ Métalliques: usinés NP, coulés P et NP, foulés P et NP‣ Minéraux: céramiques, biocéramiques, bioverres, ciments‣ Organiques: naturels (collagène), artificiels (naturels modifiés: hydrocolloide),

synthétique (Bis GMA, teflon,...)‣ Organo-minérale: ciments, composites

2.2.2. IMPERATIFS

2.2.2.1. BIOFONCTIONNALITE

‣ R méc: hanche, prothèse dentaire‣ Forme: lentilles, dents‣ Miniaturisation: coeur artificiel‣ Résorbabilité: fil‣ Longévité: prothèse valvulaire‣ Etat de surface: xxx

2.2.2.2. BIOCOMPATIBILITE compromis biofonctionnalité/ biocompatibilité d’où normes.

2.2.2.3. CADRE REGLEMENTAIRECritères, méthodes d’évaluation, conditions de mise sur le marché, suivi des effets négatifs. Définition par directives européennes qui impliquent:

‣ Utilisation des normes‣ Matériovigilance (1998)‣ Traçabilité

3. INTERACTIONS CELLULES-BIOMATERIAU ET TISSUS-BIOMATERIAU

3.1. FACTEURS QUI DETERMINENT LES INTERACTIONS

3.1.1. BIOMATERiAU

‣ propriétés de surface: nature chimique, morpho, charges électriques‣ nature chimique de la masse‣ porosité‣ dégradation (corrosion, biodégradation)

3.1.2. REPONSE DES CELLULES HÔTES

‣ évaluation par essais de l’activité basale: viabilité, prolif, tx de prot‣ évaluation des activités spécifiques: différenciation, expression phénotype‣ Il n’y a jamais biocompatibilité totale.

3.1.3. PELLICULE INTERMEDIAIRE ADSORBEE

‣ Couche protéique qui recouvre le matériau‣ Origine, nature: Protéines d’adhésion en provenance de la matrice extracellulaire.

Fibronectine,vibronectine, osteopontine, collagène, laminine,...‣ Séquence de reconnaissance commune d’AA: RGD (arginine, ..., ac aspartique)‣ Facteurs régissant adsorption: E surface du matériau.‣ Forces mises en jeu: liaisons H, électrostatiques, hydrophobes>‣ Rôle: intermédiaire dynamique régulant les interactions biomat-hôte. Interactions

via séqu. RGD- prot transmembranaire (intégrines, dans cytoplasme et mbrane cellu-laire).

composition, rugosité, topographie→ E surf→couches d’adsorption, adhésion cellulai-re→ prolif, différenciation, sécrétion matrice, minéralisation des prot → régén. tissu à la surface biomat.

‣ L’absence totale de réponse de l’hôte n’existe pas : il y a toujours une tentative d’ad-sorption.

‣ Eau + TiO2: hydroxylation avec création de groupements acides et basiques liés en alternance aux ions métalliques. Les séquences RGD peuvent se fixer à ces groupe-ments: modèle électrostatique de liaison RGD/TiO2. Adsorption fibronectine: les cellu-les n’adhèrent pas directement au biomatériau mais à la couche de protéine adsor-bée, en perpétuel remaniement.

3.2. CARACTERISTIQUES

3.2.1. NIVEAU D’INTERACTION: 3 types d’interfaces observables

‣ Matériau biotoléré: présence d’une couche fibreuse acellulaire 0,1 à 10μ (ex collagène), isole le matériau mais pas d’adhésion cellulaire sur celui-ci (biocomp. pas exception.).ex: CoCr, PMMA

‣ Matériau bioinerte:biocompatibilité plus élevée: pas de couche fibreuse mais pas de contact réel (couche fibrine), présence d’un très petit espace par ex. entre os néoformé et titane.ex: alumine, titane.

‣ Matériau bioactif:Induction d’une réaction biologique spécifique qui se traduit par la formation de liaisons chimiques avec les tissus.ex: HA, bioverres (diffusion, gradients de ⊏⊐ en silice par ex entre les 2)

Biorésorbable: dégradation in vivo, disparition totale des produits de dégrada-tion dans l’organisme, remplacé totalement par le tissu dans lequel il est im-planté. ex: corail: couche d’interface riche en phosphate de Ca.

Biodégradable: dispersion dans l’organisme des produits de dégradation (non souhaité, ex corrosion ou usure). Comportement compromettant la biocompati-bilité.

3.2.2. MECANISME D’INTERACTION

Si lésion, mécanismes qui vont conduire à la cicatrisation peuvent être décomposés en 3 phases. P ex, lors de la mise en place d’un biomatériau: blessure chirurgicale et hémorragie puis,

‣ Hémostase: formation caillot‣ activation plaquettaire+ libération médiateurs et macromoléc pour aggrégation

(sérotonine, kinine, PG,fibrinogène).‣ libération cytokines par plaquettes: R infl, réparation (PDAF,TGF,PDGF)

‣ R infl aigue (indispensable): modif localisée μvasc. et nature des cellules.‣ neutrophiles‣ monocytes: d’où macrophages → cytokines (PDGF,TNF,TGFβ), IL1(lymphos)‣ prot. plasmatiques s’adsorbent: permettent adhésion, stim cell.

‣ Cicatrisation: restaure structure+ fonction (infl chron: couche fibreuse)

‣ ex: implant dans os, macrophages qui attirent cell peu différenciées, qui peuvent s’adsorber, proliférer et se différencier, sécréter MEC qui peut se minéraliser.

Régulations négatives: corrosion, usure, mobilité: infl chron donc couche fi-breuse.Régulations positives: présence de PO4--- et Ca 2+, facteurs de croissance pour stimuler différenciation cellulaire.

‣ ex: MTA, régénération stimulée par biomat., les cell. se différencient à son contact.

La réponse immunitaire à la mise en place d’un biomatériau peut-être liée à 3 mécanismes:

‣ Chimiotactisme: biomat influencent le chimiotactisme directement ou via leurs pro-duits de dégradation. ex: ions Ni inhibent phénomène chimio des neutrophiles

‣ Activation du système du complément ex: influence de l’adsorption des prot à la surface, partic Co et Ni, Ca3(PO4)2, CHPO4.

‣ Réaction immunitaire à médiation cellulaire (IL1)

On a souvent un antagonisme entre biocompatibilité et biofonctionnalité, p ex au niveau des bioma-tériaux implantables. Les matériaux bioactifs ont souvent une R méc faible (bioverres, phosphates de Ca,...) tandis que les matériau résistants (SiO2, Al203,Zr02, titane,..) sont bioinertes. D’où compromis et réglementations !

4. METHODES D’EVALUATION BIOLOGIQUE DES BIOMATERIAUX DENTAIRES

4.1. NORMES

• Norme EN 14155: investigations cliniques des dispositifs médicaux pour sujets humains.• Norme EN 10993: évaluation biologique des dispositifs médicaux.

Définit les classes de dispositifs suivant la nature et la durée de contact (voir+ haut). Indique les essais préconisés pour chaque classe (en fonction durée dans l’organisme...) et décrit tous les essais en détails.

Chronologie des essais (obligatoires) (in vitro):

‣ Essais I ou initiaux‣ Génotoxicité (iv) et cancérogénicité‣ Hémolyse (iv)‣ Toxicité systémique‣ Cytotoxicité et cytocompatibilité (iv)

‣ Essais II‣ Essais d’irritation des muqueuses‣ Essais d’irritation cutanée‣ Essais de sensibilisation: pouvoir allergénique‣ Essais d’implantation (sous cut,...)

‣ Essais d’utilisation (animaux): cond. d’utilisation chez l’homme, comprend la notion de biofonctionnalité.

‣ Essais cliniques (humains)

4.2. ESSAIS DE TOXICITE GENIQUE

• Génotoxicité: observation des mutations géniques, modif. struct. ou nbre chromosomes, autres altérations de l’ADN. Plusieurs tests à réaliser, temps B et C. Rejet du matériau.

ex: Test de AMES (détection mutations chez une bactérie de type Salmonella qui ne peut proli- férer qu’en présence d’histidine: si génotox, devient His+, prolifèrent sans) Test des micronoyaux (dommage chromos. après mitoses de lymphos humains en cult) Test des comètes (visualisation de cassures d’ADN dans cell. eucaryotes isolées)

• Cancérogénicité: in vivo mammifère (rongeur), sur durée de vie animal, sites implantés et adj.• Toxicité sur la reproduction: in vivo mammifère (rongeur)

4.3. EVALUATION DU BIOMATERIAU SUR CELLULES DE CULTURE: essai de cytotoxicité et de cytocompatibilité

• Plusieurs types en fonction:• type d’essai: contact direct ou indirect avec le biomat. ou ses extraits• type de cellules cibles: issues d’explants ou lignées cellulaires• critères d’évaluation: activités basales ou spécifiques

4.3.1. Type d’essai (schémas)

‣ Cytocompatibilité‣ incubation de cell. en culture au contact du biomatériau soit directement soit

indirectement, par diffusion .‣ Zone de non croissance cell. ou “halot d’inhibition”, compar. témoins - (teflon) et

+

‣ Cytotoxicité‣ Incubation de cellules avec des extraits du matériau que l’on récupère d’un

milieu d’extraction.‣ témoin -: pas de réponse cytotox avec mat non cytotox (contamination

bact...)‣ témoin +: avec mat. très cytotox (méthodologie expérimentale)‣ véhicule d’extraction témoin: milieu de culture sans biomat (cf milieu dégradé

ou contaminé).

4.3.2. Cellules cibles

‣ Cultures primaires‣ <explants prélevés sur tissus vivants‣ ⊕ même comportement que cellules en clinique‣ ⊝ dédifférenciation après qques divisions et perdent leur spécificité‣ ⊝ comportement lié à l’espèce, état physio et âge donneur

‣ Lignées cellulaires‣ cell clonées non transformées, soit transformées par cancérisation, soit inten-

tionnellement immortalisées.‣ ⊕capacité de propagation à l’infini‣ ⊕uniformité génétique au sein d’une même lignée‣ cf norme: uniquement lignées‣ ⊝ ne se comporte pas comme une cell normale‣ ⊝ ne subit aucune modification du phénotype (ex modif prot sécrétées) au cours

de sa vie ≠ cell norm.‣ ex: ostéoblaste sécrète collagène puis murit, sécrète phosphatase alcaline,

puis osteocalcine,pontine. Cell d’explants permettent évaluation plus fine en mettant en évidence toxicité via perturbations prot. sécrétées.

4.3.3. Critères d’évaluation de la réponse cellulaire

‣ Activités cellulaires basales: viabilité, prolifération, sécrétion de protéines (tx tot)‣ Comptage des cellules

‣ Cell de Malassez: μscope optique + grille ou logiciel analyse d’images.‣ Densité optique par spectrophotométrie ou spectrofluorométrie: colora-

tion avant.‣ Evaluation de l’intégrité membranaire

‣ Colorant des mb intactes: bleu trypan, erythrosine B, fluo.‣ Incorporation d’une moléc métabolisée qd intactes: libération Cr 51,

fluo.‣ Libération const. cytoplasme si altérée: enzyme lactate deshydrogé-

nase.‣ Modifications de la quantité de protéines sécrétées‣ Activité organites cellulaires

‣ Activité lysosomiale via colorant rouge neutre

‣ Activité mitochondriale: MTT très rapide, métabolisé par mito.⇒cristaux de formazan bleus qu’on solubilise⇒lecture de densité par spectrocolo-rimètre, ∺ viabilité.

‣ Activités spécifiques: différenciation, expression du phénotype spéc. (prot)‣ Après test activité basale, mettre en évidence prot. caract. de la cell. cible.‣ Anticorps “marqués” qui se lient à la prot.: marquage immunohistochimique.‣ ex: anti-corps anti-coll I et III pour fibroblastes

4.3.4. Synthèse, corrélation entre les essais sur cellules de culture et les résultats cli-niques

‣ Très répandus: all prothèse avec cell ging épith et conj, implanto avec cell os et ging, mat rest coron avec cell pulpaires.

‣ Avantages/ inconvénients‣ ⊕ rapide, peu couteux, quantification, tests de fonctions spécif‣ ⊝ 1 seul type de cell à la fois, standardisation, pas de réponse inflammatoire

‣ Premier screening mais très faible corrélation avec clinique ex: ZnO eugénol

‣ Exemple: résines composites utilisées comme mat. de restaur.: toxicité pulp.‣ Moléc relarguées dans l’eau: produits d’origine (monom. etc) et autres moléc

dont certains sont toxiques.‣ Evaluation de la toxicité via la dose toxique 50 (TC 50) (dose nécess. pour tuer

1/2 cell)‣ On note que le TEGDMA n’est relargué que 10 jours.‣ Quelle est la ⊏⊐ dans la pulpe? Dentine=barrière ? Perméabilité denti-

naire?‣ Diffusion TEGDMA à travers la dentine: inférieure mais même profil: diminue

rapidement cependant peut être supérieure à TC 50 les premiers jours. ‣ Mécanismes protecteurs:

‣ faible hydrolyse (faible humidité dentine)‣ pouvoir tampon HA ‣ ↘⊏⊐ monomère de la cavité vers la pulpe (vasc,diffusion)‣ système immun.

‣ Autres types d’essais pour améliorer corrélation‣ interposition d’une couche d’agarose (schéma): cell. colorées au rouge neutre

(diamètre zone décolor,%age cell mortes)‣ filtre millipore

‣ Améliorations proposées pour matériaux restaur. coron.‣ poudre ou tranche de dentine (schéma)‣ Modèle de Hume: dent (schéma), milieu devient milieu d’extraction.‣ Modèle de Camps:

‣ évaluation préalable de la perméabilité dentinaire (méth de la filtra-tion): cofacteur dans les résultats

‣ simulation de la p pulpaire‣ réduction du vol de dilution du milieu: cf vol pulpaire

4.4. ESSAIS SUR DES ANIMAUX ET ESSAIS CLINIQUES

4.4.1. ESSAIS II

‣ Test d’irritation des muqueuses: observ. visuelle + histo, disques au niv joues lapins.

‣ Test d’irritation cutanée: observ. visuelle au niveau peau lapin, compresses.

‣ Test de sensibilisation: cochons d’inde, peau, oedème/érythème‣ Test d’implantation

‣ sous-cut: rat, souris, évaluation histo à ≠ temps‣ intramusculaire: rat, lapins, chien, mouton etc évaluation histo à ≠ temps‣ intra-osseuse: fémur, idem ci-dessus.‣ très utilisés pour biomat dent‣ évaluation qualitative R tissulaire: (fibrine, nécrose, cell infl,...), peu per-

formant, opérateur dépend.‣ évaluation quantitative: analyse d’images (⊝seuillage), marquage immuno-

histochimique.

‣ ⊕ sur animal⇒ Rinfl, immuno‣ ⊝ espèce représentative, long et couteux, site d’implantation vs utilisation, biais de

la réaction< geste opératoire, durée contact< durée réelle

4.4.1. ESSAIS D’UTILISATIONBiomatériaux mis en oeuvre des animaux, dans conditions de leurs indications chez l’homme. (=essai clinique chez l’animal)

4.4.2. ESSAIS CLINIQUES

‣ Ils précèdent mise sur le marché, réglementés par loi Huriet (1988)+ nouvelle loi “comités de protection”.

‣ Sans bénéfices individuels directs‣ Avec bénéfices individuels directs‣ Consentement éclairé‣ Pourquoi essais cliniques ? Extrapolation de la culture cellulaire à des situations

cliniques (cf synergies, antag, addition, complexité biologique, défenses immunit, effets subtoxiques).

‣ ex: caractère plurifactoriel de la biocompatibilité pulpaire: toxicité des matériaux mais aussi étanchéité et bactéries, adhésion et pumping effect,...

‣ Difficultés rencontrées‣ ex: évaluation mat restaur sur dent à extraire, cl V, extraction, histo.

⊝ critères d’évaluation qualitatifs, appréciation subjective, effectif petit (pas mi-neurs)⇒ recherche d’une méthode quantitative

‣ Méthode quantitative proposée: quantification de l’altération de la couche odon-toblastique: mesure de son épaisseur.

5. ALLERGIES

1. ORIGINE‣ Réponse du SI à l’allergène après premier contact. 2 types:‣ Type I: hypersensibilité immédiate chez l’individu sensibilisé (choc, cf latex).‣ Type IV: retardée, 24 à 48h après 2ème rencontre. cf résines, domaine dentaire.

2. PRICK TESTS (type I)‣ Allergène en sous-cut à l’aide d’un Prick‣ Comparaison avec témoin + et -‣ Allergie si diam test> diam témoin +

3. PATCHS TESTS (type IV: dentaire)‣ Test épicutané, lecture 48 à 96 h après retrait allergène. Erythème, oedème, papules,

vésicules.

4. DERMATITE CONTACT‣ Démangeaisons, brulûre, érythème, vésicules, d’où érosion et risque de surinfection.‣ Moins fréquent en bouche cf dilution et nettoyage par la salive.

5. ALLERGIE Ni‣ Au premier rang des dermatites de contact.‣ Vecteur= souvent transpiration, moins fréquent en bouche. Fil ortho ?

6. RECOMMANDATIONS‣ Entretien‣ Pas de patch test systématique: cf symptômes en bouche‣ Vérifier avec retrait allergène supposé