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IntroductionIntroduction

• Thèse de Thomas BalletThèse de Thomas Ballet

• Connaître la quantité de protéine Connaître la quantité de protéine renaturéerenaturée

• Démarche:Démarche:• Procéder par étape Procéder par étape • Courbe standard de chaque réactionCourbe standard de chaque réaction

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RéactionsRéactions

Enzyme + substrat + enzyme + produit

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Principe de la fluorescencePrincipe de la fluorescence

Valeur de Valeur de λλ Résorufine Résorufineλλmax absorptionmax absorption = 530 nm = 530 nmλλmax émission max émission = 585 nm = 585 nm

Choix des filtresChoix des filtresλλabsorptionabsorption = 540 nm = 540 nmλλ émission émission = 600 nm = 600 nm

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Renaudot Raphael 5

La solution tampon : élément La solution tampon : élément clé clé

• TRIS : 50 mMTRIS : 50 mM

• MgCl2 : 20 mMMgCl2 : 20 mM

• KCl : 150 mMKCl : 150 mM

• A pH = 7.2A pH = 7.2

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Première étape : gamme étalon de Première étape : gamme étalon de H2O2H2O2

AmplexRed + HAmplexRed + H22OO22 ResorufineResorufine

HRPHRP

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Renaudot Raphael 7

Première étape : gamme de HPremière étape : gamme de H22OO22

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Première étape : gamme de H2O2Première étape : gamme de H2O2

Puits 1 2 3 4

H202 (2 µM) 10 30 50 100

AR (50 µM) 10 10 10 10

HRP (0,3 U/ml) 20 20 20 20

Tris 160 140 120 70

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Première étape : gamme étalon de Première étape : gamme étalon de H2O2H2O2

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Influence du DTTInfluence du DTT

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Deuxième étape : gamme d’ADP Deuxième étape : gamme d’ADP globale globale

Enzyme + substrat + enzyme + produit

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Deuxième étape : essai de la réaction Deuxième étape : essai de la réaction globale globale

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Troisième étape : gamme de pyruvate Troisième étape : gamme de pyruvate oxydaseoxydase

Enzyme + substrat + enzyme + produit

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Renaudot Raphael 14

Troisième étape : gamme de pyruvate Troisième étape : gamme de pyruvate oxydaseoxydase

A B 1 2 3 4 5

Pox (µL) [à 15 U/mL] 2 10 15 20 30

Pyruvate (µL) [à 50 µM] 10 10 10 10 10

FAD (µL) [à 25 µM] 30 30 30 30 30

TPP (µL) [à 250 µM] 30 30 30 30 30

Phosphate (µL) [à 10 mM] 2 2 2 2 2

HRP (µL) [à 0.1 U/mL] 20 20 20 20 20

AR (µL) [à 50 µM] 10 10 10 10 10

Tris (µL) 96 88 83 78 68

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Troisième étape : gamme de pyruvate Troisième étape : gamme de pyruvate oxydaseoxydase

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Quatrième étape : gamme d’ADP Quatrième étape : gamme d’ADP globale globale

Enzyme + substrat + enzyme + produit

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Quatrième étape : gamme d’ADPQuatrième étape : gamme d’ADPF G 1 2 3 4 5 6 Blanc

ADP (µL)

10[à 10 µM]

50

[à 10 µM]80

[à 10 µM]10

[à 100 µM]50

[à 100 µM]80

[à 100 µM] 0FAD (µL) [à 250

µM] 3 3 3 3 3 3 3TPP (µL) [à 2.5

µM] 3 3 3 3 3 3 3PPP (µL) [à 250

µM] 2 2 2 2 2 2 2HRP (µL) [à 0.1

U/mL] 20 20 20 20 20 20 20kinase (µL) [à 50

U/mL] 45 45 45 45 45 45 45oxidase (µL)[à 15

U/mL] 30 30 30 30 30 30 30AR (µL) [à 50

µM] 10 10 10 10 10 10 10Phosphate (µL) [à 10

mM] 2 2 2 2 2 2 2Tris (µL) 75 35 5 75 35 5 85

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Quatrième étape : gamme d’ADPQuatrième étape : gamme d’ADP

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Dernière étape : gamme de pyruvate Dernière étape : gamme de pyruvate kinasekinase

Enzyme + substrat + enzyme + produit

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Dernière étape : gamme de pyruvate Dernière étape : gamme de pyruvate kinasekinase

A B 1 2 Blanc

P Kinase (µL) [à 238 U/mL] 9 90 0

ADP (µL) [à 100 µM] 10 10 10

PPP (µL) [à 250 µM] 20 20 20

Pox (µL) [à 15 U/mL] 30 30 30

Pyruvate (µL) [à 50 µM] 10 10 10

FAD (µL) [à 250 µM] 3 3 3

TPP (µL) [à 2.50 mM] 3 3 3

Phosphate (µL) [à 10 mM] 2 2 2

HRP (µL) [à 0.1 U/mL] 20 20 20

AR (µL) [à 50 µM] 10 10 10

Tris (µL) 83 2 92

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Dernière étape : gamme de pyruvate Dernière étape : gamme de pyruvate kinasekinase

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ConclusionConclusion

• Résultats prometteursRésultats prometteurs

• Utilisation du procédé:Utilisation du procédé:• Cinétique possible Cinétique possible • Mesure finale (?)Mesure finale (?)

• Solutions envisagéesSolutions envisagées• Kinase plus concentréeKinase plus concentrée

Merci de votre attention