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Pr : Nadia . Dakka

TD Immuno S5 2014-2015

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• Anticorps monoclonauxPopulation homogène d ’anticorps issus d ’un « seul et unique » clone de cellules BLes anticorps monoclonaux sont des anticorpsne reconnaissant qu'un seul type d'épitope surun antigène donné . Ils sont par définition tousidentiques et produits par un seul clonede plasmocyte.

• AvantageSpécificitéAffinitéProduction massive et constante

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Les Ac monoclonaux sont disponibles indéfiniment une fois leshybridomes immortalisés.

La production des Ac monoclonaux nécessite moins d’animauxpar rapport à la production des Ac polyclonaux,

Les Ac polyclonaux peuvent être obtenus beaucoup plusrapidement, à moindre coût et avec moins de compétencestechniques que pour produire des Ac monoclonaux.

Les Ac polyclonaux sont obtenus en 4 à 8 semaines, tandis que laproduction d’Ac monoclonaux peut prendre 3 à 6 mois.

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• Les partenaires de fusion– cellules B extraites d ’organes lymphoïdes secondaires (rate,

ganglions), des plasmocytes sécrétant des Ac.– cellules myélomateuses de souris

• Méthode de fusion– Chimique– Physique

• Sélection, clonagein vitro d’un hybridome producteur d’Ac.

• Expansionmultiplication de clones de l’hybridome, soit in vitro, soit in vivo,afin d’obtenir de grandes quantités d’Ac.

Principe de la production des anticorps monoclonaux

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• L'immunisation

– Les sources d'antigènesdegré de pureté : élimination des contaminants

– L'immunisation de l'animal• dose et forme de l ’antigène• adjuvants• voie et nombre d ’injection

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ImmunogèneAntigènen

Quantité de l’immunogène par injection et par animal.

Protéine protéine lyophilisée 2 - 50 µg

en solution 2 - 50 µg

Incluse dans un gel de polyacrylamide 1 - 10 µg

Haptène Peptide 1 - 10 µg

Nucléotide

glucide

Substance chimique naturelle ou synthétique

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Les animaux, souris ou rats, utilisés à la fois pour

l’immunisation en vue de la préparation du clone

d’hybridome et pour la production d’Ac monoclonaux

(production in vivo), doivent être de même souche

(syngéniques) pour des raisons d’histocompatibilité.

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César Milstein et Georges Köhler (1970)

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UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES

OBTENTION DES LYMPHOCYTES OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUESSPECIFIQUES

OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLESOBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES

IMMUNISATION DE LA SOURISAVEC L’ANTIGÈNE ÉTUDIÉ

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Les cellules de myélome utilisées dans les hybridomes n’ont pas

l’enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl

transférase) . Elles ont perdu la capacité de produire des

immunoglobulines (mutants Ig-).

Les cellules de myélome n’apportent que leur propriété

d’immortalité aux cellules résultant de la fusion.

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L’autre partenaire de la fusion est une population de

plasmocytes possédant l’enzyme: HGPRT et sécrétant les Ig.

Ces plasmocytes contribuent à la capacité des hybridomes à

survivre dans le milieu de culture sélectif HAT (Hypoxanthine,

Aminoptérine et Thymidine).

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On fusionne les plasmocytes sécrétant des anticorpsdirigés spécifiquement contre l'antigène choisi, avecdes cellules de tumeur : myélomes (cellulesimmortelles) .

La fusion membranaire se fait grâce à l'additionde polyéthylène glycol (PEG) et permet ainsid'obtenir des hybridomes.

Les hybridomes ont la capacité de se multiplier plusrapidement que les plasmocytes productricesd'anticorps et de développer indéfiniment desanticorps spécifiques.

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• Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG)– fusion des membranes cytoplasmiques– rendement de fusion élevé– DMSO renforce la viabilité cellulaire

• Fusion physique : Electrofusion– Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques– technique onéreuse– moins destructrice

Méthodes de fusion

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Par méthode chimique

Par méthode physique

SELECTION

+

FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly éthylène glycol)

FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION

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• Sélection sur milieu sélectif HAT– Hypoxanthine Aminopterine Thymidine– facteurs de croissance : IL6 β mercaptoethanol– sérum de veau fœtal– fibroblastes– sous atmosphère CO2

– seuls les hybridomes se développent– 1 x 105 cellules/ml

Sélection, clonage

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Après fusion des hybridomes, les cellules sont réparties dansdes plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellulepar puits. le mélange de toutes ces cellules (hybrides et cellulesparentales) est placé sur un milieu de culture sélectif : HAT(Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine) .

Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et lescellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnelpour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides(HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT .

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La sélection par le milieu HAT dépend du fait queles cellules de mammifères peuvent synthétiser lesnucléotides par deux voies différentes :La voie de novo et la voie de récupération enincorporant directement les purines et lespyrimidines dans les nucléotides nécessaires à lasynthèse de l’ADN et de l’ ARN.Les enzymes qui catalysent la voie de récupérationincluent HGPRT et TK. Une mutation de l’un oul’autre de ces deux enzymes bloque la capacité de lacellule à utiliser la voie de récupération et entraînesa mort dans le milieu HAT .

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Culture sur milieu HATHypoxanthine Aminoptérine Thymidine

Cellule myélomateuse HGPRT- Lymphocyte B

MORT CELLULAIREImpossibilité de se diviser

MORT CELLULAIREdisparition après quelques divisions

HYBRIDOME SELECTIONNE

+

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Sur milieu gélosé Par dilution limite

Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit

+

Dès que la croissance est suffisante, il fautpropager les cultures d'hybridomes productrices del'anticorps désiré, les conserver et les cloner. Deuxméthodes sont utilisées pour obtenir un clone àpartir d'une cellule :

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• Sélection d ’une seule cellule et mise en culture.

Clonage dans l’Agar, dans l’Agaroseon visualise directement les colonies cellulaires dans l ’agar, que l ’on remet en culture après dilution.

Clonage par dilution limitela plus utilisée dans les laboratoires.Réalisée directement dans une plaque de microtitrationpeu onéreuseLongue.

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• Immuno précipitation– Ouchterlony, Mancini

• Radio immunologie (RIA)– radio isotope

• Immuno enzymologie (EIA)– enzyme (ELISA)

• Compteur de cellules (Cell sorter)• Western Blot

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TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT

• DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX

PAR LA METHODE ELISA

• DU TYPE D’ANTICORPS PRODUIT

PAR DES METHODES D’IMMUNOPRECIPITATION

+

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• 2 techniques ELISA

– Compétition

– Sandwich : la plus utilisée pour ce propos

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ELISA sandwich

Ac de capture

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• Au bout d'une dizaine de jours, on recherche danschaque puits la présence d'anticorps dirigés contrel'antigène utilisé pour immuniser la souris.

• On peut alors multiplier les clones positifs(producteurs de l’Ac d’intérêt) soit en continuant deles cultiver in vitro, soit en utilisant l’animal immunisépour une production in vivo.

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• Avantages

– Concentration élevée en Ac Mo

– Pas d’intermédiaire industriels

• Inconvénients

– Utilisation de l’animal– Présence de protéines

murines– Contaminants– Stress de la souris

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Amplification des hybridomesProduction parcultures cellulaires

Production dans les liquides d'ascites

+

OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX

CONSERVATIONDES HYBRIDOMES

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• Injection des hybridomes dans le péritoine de souris

• Développement d ’une tumeur : ascite

• Prélèvement des anticorps par ponction de liquide d ’ascite

• Rendement élevé 20 g/l

• C’est la souris qui régule les conditions de culture !

• Purification du liquide d ’ascite nécessaire

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• Préparation de l’échantillon• Purification principale

– Chromatographie d’affinité

• Affinité immunologiques

– spécifique du Fc.– spécifique de

l’antigène.

Ligand

Analyte

Impuretés

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Fixation Elution

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Elution par déplacementavec l’antigène libre

Elution par déplacementavec un analogue

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• Avantages

– Pas d’utilisation d ’animal– Production de grandes

quantité d’anticorps– Pas de personnel

d’animalerie– Pas de contaminant

• Inconvénients

– Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal

– Contamination par les hybridomes morts

– Ac de plus faible affinité– Plus chère pour de petites

production

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• Basé sur la technologie des fibres creuses.• Diminution des coûts, du temps.• Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté• Pas ou peu de contaminant (6 x moins)

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• Spécificité– Reconnaissance d ’un seul motif épitopique– Réactions croisées, non-spécifiques.– Maintient de l ’activité après modification chimique

• L'affinité– Élevée– Constante et contrôlée

• Avantages de ce type de production– Constante– reproductible

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Tout anticorps est caractérisé par deux propriétés :

- capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands

- participation à une ou plusieurs fonctions effectrices

(activation du complément, stimulation de la phagocytose …)

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Premières applications thérapeutiques des Ac Mo en 1981 avec le

muromonab utilisé dans le traitement des épisodes de rejet aigu en

transplantation d'organes.

Inconvénients des premiers anticorps monoclonaux produits par des

hybridomes murins:

- une demi-vie courte

-immunogènes.

Les progrès de la biologie moléculaire, au cours des années 1980, ont

permis la production d'abord d'anticorps chimériques, puis d'anticorps

humanisés et enfin d’anticorps totalement humains.

Depuis, le développement et l'utilisation clinique de ces anticorps

monoclonaux ont connu un essor spectaculaire.

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Ac monoclonal de souris

100% souris

Ac monoclonalhumanisé

90 % homme10% souris

Ac monoclonal chimérique

75% homme

25% souris

Ac monoclonal humain

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La chimérisation et l'humanisation permettent de varier lesisotypes des anticorps donc de manipuler les fonctionspotentielles de l'anticorps (par exemple, la fixation ducomplément).

Un autre avantage: augmentation de la demi-vie de l'anticorps,qui passe de moins de 20 heures avec les anticorps murins àplusieurs jours, s'approchant des 21 jours des IgG humainesendogènes.

Ceci permet une meilleure utilisation de ces Ac comme agentsthérapeutiques.

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ANTICORPS ENTIEREMENT HUMAINS:

Des anticorps entièrement humains et biocompatibles sontcependant de plus en plus recherchés pour l'immunothérapiepassive.

Trois grands types de technologies ont été mis au point pour lesobtenir:

- Techniques d'hybridomes,

- Phage display,

- Souris transgénique.

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Les anticorps monoclonaux utilisés comme médicaments ont tousune nomenclature se terminant par « mab », acronyme de« monoclonal antibody » comme par exemple le rituximab.

Ils sont utilisés dans les tests de grossesse, dans de nombreuxdomaines de la recherche en biologie et par de nombreusestechniques (cytométrie en flux, western blots.), dans les testsd'immuno-hématologie.

Les anticorps monoclonaux, en monothérapie ou en associationavec une chimiothérapie, ont pris place aujourd’hui dans letraitement standard de nombreuses formes de cancers.

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Herceptin (Anticorps humanisé)

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Biotechnologie Recherche

Cytométrie en flux, ImmunohistochimieEtude des lignées cellulairesEtude des marqueurs des cellules non lymphocytaireEtudes des cellules pathologiquesPurification d’antigènes

Diagnostic Recherche d’Ac ou d’AgImmunodétection (ELISA, RIA)Imagerie (immunoscintigraphie)

Thérapeutique ≈ 20 Ac monoclonaux utilisées en thérapeutique+ 70 Ac monoclonaux en essais cliniquestraitement immunosuppresseur

(Maladies auto-immunes et inflammatoires, rejet de greffe)

traitement anticancéreux (élimination des cellules cancéreuses)

cardiologie (traitement anti-thrombotique)

infectiologie (prophylaxie antivirale)

allergologie (traitement asthme)

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Beaucoup d’espoirs soulevés dans le traitement denombreuses pathologies lourdes, pour lesquelles lesthérapeutiques conventionnelles ont montré leurs limites.(thérapeutiques ciblées)

Toutefois le coût de ces produits est un facteur limitantleur utilisation, d’autant plus que de nombreusesapplications restent des traitements de longue durée.

Enfin et en l'absence d'études de tolérance à longterme, le suivi et la prudence sont indispensables pourmieux évaluer les risques liés à leur utilisation.