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8/7/2019 3_me cours de G_n_tique appliqu_e
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2. Les vecteurs de2. Les vecteurs declonageclonage
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Dfinitions : transgense et transgneDfinitions : transgense et transgne
Transgense :
p rocessus de transformation gntique
introduction de caractres nouveaux dans une cellule
absence de barrire entre les es pces
Transgne : gne
transfr un organisme laide de :
vecteurs naturels ou artificielsmoyens ph ysiques ou c h imiques
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2. Les vecteurs de clonage2. Les vecteurs de clonage
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2.1. Structure des vecteurs2.1. Structure des vecteurs
ORI : origine derplication
sites de restrictiongne de rsistance
une substancechimique
vecteur
z one de sites de restriction
une origine de rplication
utilisation de gne rsistant des substances c h imiques(ex: antibiotiques)
utilisation du gne de la B - galactosidase
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2.3. Les plasmides2.3. Les plasmides
molcule dADN circulaire double brin
3 100 kb
unit de r p lication autonome :
ORI : origine de r p licationr p lication ind pendante du gnome de la celluleh te
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2.3. Les plasmides2.3. Les plasmides
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2.3.1. Le vecteur pBR 3222.3.1. Le vecteur pBR 322
sites multi p les et uniques pour enzymes de restriction connues "polylinker " = rgion sites multi p le de clonage.
Un gne de rsistance lam p icilline (antibiotique)
Un gne de rsistance la ttracycline (antibiotique)
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2.3.1. Le vecteur pBR 3222.3.1. Le vecteur pBR 322
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2.3.2. L2.3.2. Lee Plasmide pUCPlasmide pUC
des sites multi p les et uniques des enzymes de restriction connues
Un gne de rsistance lam p icilline
Le gne lac Z qui code pour la B - galactosidase dans lo pronlactose
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a . Lopron lactosea . Lopron lactose
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b . Le gne lacZb . Le gne lacZ
Le gne Z (a pp el lacZ) gne code pour la B - galactosidase
Insertion du fragment dADN dans le p lasmide pUC :
zone du gne codant pour la B - galactosidaseinactivation du gne
Donc
pas insertion ADN = activit enzymatiqueinsertion ADN = perte de lactivit enzymatique
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b . Le gne lacZb . Le gne lacZ
V rification de la p rsence ou labsence de lactivit enzymatiquede la B - galactosidase :
com pos X - galsi cliv par la B - galactosidase = X - gal passe de lincolore au bleu
pour mtaboliser le X - gal, la cellule doit tre ex pose uninducteur : IP TG (isopropylthio- B -D-galactoside).
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b . Le gne lacZb . Le gne lacZ
Colonies bleues = clones non recombinants ( pas de fragmentdADN insr)
Colonies blanc h es = clones recombinants, insertion du fragmentdADN
Slection visuelle des bactries transformes par les p lasmidesrecombinants
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LLee Plasmide pUCPlasmide pUC
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2.3.3. Avantages et inconvnients des plasmides
Inconvnients :
faible efficacit pour la transformation des bactriesim possibilit dinsrer des larges fragments dADN
A vantages :
petite taille du vecteur
slection des p lasmides recombinants
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2.4. Les bactriophages
virus qui infectent les bactries
ADN double brin
gnome : 50 et 150 kb
les extrmits de lADN = sim p les brins sur une longueur rduite
forment des extrmits cohsives = squences cos (cohsives)
5-G AATTC-33-CTTAA G-5
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2.4.1. Le phage L
ADN double brin
gnome : 50 kb
squences cos
tte du virus
queue du virus
deux parties individualises :
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2.4.2. Multiplication du phage2.4.2. Multiplication du phage L L
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2.4.3. Avantages et inconvnients des phages
Inconvnients :
nombre de sites de restriction restreintsobligation dem paqueter lADN
le maniement des ph ages est p lus com p lexe
A vantages :
taille des fragments dADN insrs su prieure aux p lasmidestransformation des bactries par les ph ages p lus efficace que
pour les p lasmides
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22.5. Les cosmides.5. Les cosmides
vecteurs artificiels hybrides
un gne de rsistance aux antibiotiques (am p icilline)
une origine de r p lication
site cos dun ph age L
em paquet dans la tte dun virus L
infecte les bactries
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22.5.1. Les cosmides.5.1. Les cosmides
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2.5.2. Avantages et inconvnients des cosmides2.5.2. Avantages et inconvnients des cosmides
A vantages :
taille des fragments insrables peut atteindre 50 kb
transformation des bactries par les cosmides p lusefficace que pour les p lasmides
Inconvnients :
Obligation dem paqueter lADN
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2.6. Autres types de vecteurs2.6. Autres types de vecteurs
2.6.1. Les BAC
(c h romosomes artificiels de bactries)
fragments d'ADN de taille 100 350 kb.
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2.6.2. Les YAC2.6.2. Les YAC
ch romosome artificiel de levure
I nconvnient :
fragments insrs subissent parfois des rarrangements(insertions, dltions)
pas absolument re p rsentatifs de la rgion initiale introduite
analyse des grands gnomes (gnome humain)
utiliss pour insrer de lADN tranger dans les cellules eucaryotes
clonage de fragments de grande taille (jusqu' 1500kb)