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UNIVERSITE DE NOUAKCHOTTFACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
MANUEL DE TRAVAUX PRATIQUESDE MICROBIOLOGIE
BG2
Par
Aminetou Bent Mohamed Aicha mint Sidi Baba
2007 - 2008
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SOMMAIRE
TP. N 1 - RGLES SUIVRE DURANT LES TRAVAUX PRATIQUES DE
MICROBIOLOGIE
TP. N 2 - LA STRILISATION
TP. N3 - UTILISATION DES MILIEUX DE CULTURE
TP. N 4 - EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES
TP. N 5 - ISOLEMENT DE COLONIES PURES
TP. N6 - LEXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTRIES
TP. N7 - EXAMEN APRS COLORATION
T P. N 8 - COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM
TP. N 9 - INFLUENCE DE LA VARIATION DE CERTAINS FACTEURS
PHYSIQUES SUR LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES
TP N 10 - ETUDE DE LA SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES
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couvillon
Autoclave
Botes de Ptri
Flacon pour milieu de culture
Bec Bunsen
grattoir
Etuve
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TP. N 1. RGLES SUIVRE DURANT LES TRAVAUX PRATIQUES DE
MICROBIOLOGIE
OBJECTIFS :
Se familiariser avec un laboratoire de microbiologie, son
quipement et son fonctionnement
l. Visite des locaux :
- Structure
- Prsentation des gros matriels (tuves, autoclave, )
2. Prsentation d'un poste de travail :
- Matriels (bec bunsen, pipettes, verres, bchers anse, pinces
lame,...),
- Produits (eau, alcool, colorants divers,.)
3. Les consignes de scurit :
- Procder un lavage minutieux des mains, avec brossage des
ongles avant et aprs
les manipulations, et avant toute sortie mme momentane de la
salle de TP.
- viter les ouvertures des fentres pendant les manipulations
- Ouvrir avec prcaution les rcipients contenant des cultures
microbiennes, afin
d'viter toute projection.
- Flamber, avant et aprs manipulations, les anses mtalliques
utilises pour les
prlvements, en commenant par chauffer la partie moyenne de
l'instrument afin de
desscher les restes de culture avant de porter l'extrmit dans la
flamme, ceci pour viter
toute projection.
- Prvenir immdiatement le responsable de TP en cas de bris d'un
rcipient contenant
une culture en cas de contamination accidentelle d'un
manipulateur ou tout incident dispersant
le matriel microbien.
-Interdiction formelle de boire, manger et fumer pendant les
TP
-Striliser tout le matriel septique la fin de la manipulation
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-Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise l'abri
des souches
microbiennes ainsi que leur destruction afin d'viter toute
contamination.
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4. Mise en vidence de la prsence de micro-organismes au
laboratoire
1. Matriel : milieux gloss en boite de Ptri, couvillon, eau de
robinet, cheveu, bec
Bunsen, pice de monnaie.
2. Mode opratoire :
Prendre 3 milieux gloss en boite de Ptri :
- diviser la boite n1 en 2 secteurs : dposer un cheveu sur le
premier et quelques
gouttes deau du robinet sur le second.
- diviser la boite n2 en 4 secteurs : appliquer une trace de
doigt sur le premier, refaire
lopration sur le second aprs stre lav les mains, dposer une pice
de monnaie sur le
troisime, frotter un couvillon sur la paillasse et appliquer
celui-ci sur le dernier secteur.
-laisser la troisime boite ouverte au dessus de la paillasse
(environ 10 min).
Remarque : une srie de 5 boites de Ptri de 8cm de diamtre est
laisse ouverte sur une
paillasse prs dun bec Bunsen allum.
A la fin de la manipulation, regrouper les diffrentes boites de
Ptri et les placer ltuve
37C / 24 heures.
Remarque : pour viter que leau de condensation dans les botes de
Ptri perturbe la surface
du milieu glos, on place les botes en position retourne dans
ltuve.
Poste de travail
Portoirs tubes
Eau de Javel
Verre pied+ instruments
Bec BunsenZone dair strile
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TP. N : 2 - LA STRILISATION
La strilisation est l'opration qui consiste liminer les
micro-organismes d'un objet,
et ce de manire durable. En microbiologie, le but de la
strilisation est d'une part de matriser
les micro-organismes introduits dans le milieu d'tude, et
d'autre part d'viter la contamination
du milieu extrieur et des personnes. Il existe deux grands
moyens de Strilisation :
1. La chaleur
2. La filtration
I. La strilisation par la chaleur
La chaleur dtruit les bactries et les spores. On distingue les
procds chaleur
sche ou humide .
1. Chaleur sche :
a. Flambage : Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la
surface de
matriel non inflammable assure une parfaite strilisation. On
strilise de cette
faon les fils de platine et les pipettes Pasteur.
a. B. Four pasteur : C'est un four-tuve air chaud et sec. Il est
utilis
180C pendant 90 minutes. Cet appareil n'est utilis que pour la
strilisation
de la verrerie pralablement nettoye et sche ou de matriels
mtalliques
(instruments de dissection) pouvant tolrer de trs hautes
tempratures.
Zone de strilit dun bec bunsen
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Le matriel ainsi strilis sera laiss dans ltuve jusqu son
refroidissement complet, puis stock labri des poussires.
b.
2. Chaleur humide
La strilisation par la chaleur humide, reconnat trois
modalits
- la strilisation lautoclave
- La Pasteurisation,
- La Tyndallisation
a. Autoclave : cest un appareil indispensable dans un
laboratoire de
microbiologie. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur deau,
une
temprature de 120C pendant une dure qui varie en fonction du
milieu, de la
temprature utilise et du volume des rcipients. Ce procd tue
toutes les
cellules vgtatives et les endospores.
b. Pasteurisation : la pasteurisation est un traitement chaud
de
liquides, tuant des pathognes mais pas forcment toutes les
bactries. Les
tempratures de la pasteurisation se situent entre 75 80C.
c. Tyndallisation : La tyndallisation est une srie de 3
chauffages bref
des tempratures de 70C intervalles rguliers, ceci afin de
laisser aux
formes rsistantes la possibilit de germer pour les tuer au
chauffage suivant.
Par exemple la destruction des pathognes du lait se fait par un
cycle de 63C
pendant 30 minutes suivie de 73C pendant 15 minutes
II. La filtration
La filtration est une technique qui consiste faire passer un
liquide travers un
filtre dont les pores ont un diamtre de 0,2 m. Les
micro-organismes sont trop gros et
sont donc retenus par le filtre.
Cette technique est intressante lors d'utilisation de
produits
thermolabiles comme certains acides amins aromatiques,
vitamines, hormones de
croissance, acides nucliques et une bonne partie des
antibiotiques.
III. Autres procds de strilisation
Certaines matires (Plastiques, Caoutchous ) ne tolrent pas
lautoclave ou se
dtriorent rapidement aprs des expositions rptes la chaleur.
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1. Radiations :
La strilisation par les U.V. est utilise au laboratoire pour la
dcontamination de lair
et des paillasses situes sous la hotte de protection. Le
rayonnement nagit que de faon
directe et sa pntration est faible. Dautres radiations (rayons
X), peuvent servir pour la
strilisation industrielle des boites de Ptri en matire plastique
et de produit
pharmaceutiques.
2. Agents chimiques :
Ils sont utiliss en gnral pour la dsinfection des salles de
travail et pour la
destruction des germes ports par des instruments souills. Ce
mode de strilisation doit tre
systmatiquement pratiqu dans le laboratoire pour les lames et
pour la verrerie qui ne passe
pas en autoclave.
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TP. N3 - UTILISATION DES MILIEUX DE CULTURE
Les micro-organismes exigent pour leur croissance des aliments.
Ces aliments leur
sont fournis au laboratoire par des milieux nutritifs ou milieux
de culture. Pour permettre le
dveloppement des microbes le milieu doit :
*contenir tous les aliments ncessaires en quantit suffisante et
en proportion relative
convenable : le milieu doit tre nutritif et quilibr.
*avoir un pH, une pression osmotique, une viscosit des
caractristiques physico-
chimiques compatibles avec la vie microbienne. Comme les besoins
nutritionnels des micro-
organismes et les conditions de leurs dveloppements sont trs
varis il n'existe videmment
aucun milieu universel sur lequel tous les microbes soient
capables de se multiplier.
Toutefois, certains milieux conviennent au dveloppement d'une
grande varit de germes
microbiens ; le choix de tels milieux repose sur la connaissance
de l'habitat naturel et de la
physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on dsire
cultiver. D'une manire trs
gnrale, on peut distinguer :
1. Milieux synthtiques :
Prpars exclusivement avec des produits chimiques purs. Le milieu
synthtique de
composition bien dfinie, constitue le milieu de culture idal. Ce
type de milieu permet
d'obtenir des rsultats comparables et de dceler avec prcision
les modifications qu'il subit au
cours du dveloppement microbien. Il n'en est gnralement pas de
mme avec les milieux
non synthtiques qui sont constitus par des lments complexes de
composition variable. Les
milieux synthtiques conviennent surtout aux moisissures
(champignons microscopiques)
mais fort peu aux bactries.
2. Milieux complexes :
milieu dont on ne connat que partiellement la composition. Ces
milieux de culture
peuvent contenir des extraits de levure (cellule de levure
dshydrate et lyses) qui
fournissent une source d'acide amin de vitamine et d'azote, des
extraits de malt apportant une
source de carbone, des peptones (protine animale, de poisson, de
casine de lait) source
d'azote organique qui intresse les individus htrotrophes. (Ex.
bouillon nutritif, bouillon au
soja.).
Parmi ces 2 types de milieu, il existe des milieux slectifs :
qui vont permettre de
slectionner le type de bactries qui pourront cultiver dessus,
alors que tous les autres micro-
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organismes prsents sont inhibs.
Un milieu de culture est rendu slectif pour une espce
microbienne lorsque sont
seules satisfaites les exigences nutritives et les conditions de
dveloppement particulires
cette espce Les principaux facteurs de slection microbienne
utiliss seuls ou en association
sont :
*la temprature dincubation
*Le pH du milieu
*La facult dutiliser une source nutritive dtermine (carbone,
azote).
*La rsistance laction bactricide dun antiseptique ou dun
antibiotique.
Les milieux sont soit liquides, soit solides. On utilise
frquemment la glose ou agar-agar un
polymre de sucre tir d'une algue rouge. Elle ne constitue qu'un
support du milieu de culture.
Capable d'absorber 200 250 fois son poids d'eau, la glose forme
une gele qui se liqufie
65-70 en refroidissant, cette gele demeure en surfusion jusqu'
40-45 et prend une masse
aux tempratures infrieures. La glose est gnralement incorpore
aux milieux liquides la
dose de 15 20%.
Les milieux solides prsentent un grand intrt en Microbiologie.
Ils
permettent, lorsque la technique d'ensemencement est convenable,
le dveloppement des
germes en colonies apparentes, isoles les unes des autres,
provenant en principe, de la
multiplication d'un seul germe (clone) et partir desquelles
peuvent tre obtenues des cultures
pures.
Mode opratoire
Matriels :
- 2 bchers de 500 ml, thermomtre, agitateur, bec bunsen, trpied
et sa grille, boites
de ptri, des tubes vis ou cotonns striles, pince en bois ou
gants
Produits :
- Bouillions nutritif (BN) et Glose Nutritive (GN), en
poudre,
- Eau distille,
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Protocole :
Peser la masse ncessaire de poudre GN pour 250 ml d'eau
distille.
Dissoudre la poudre dans le diluant l'aide de l'agitateur.
Chauffer au bec bunsen jusqu' l'bullition
Laisser refroidir la prparation dans le cne strile du bec
bunsen
Lorsque la prparation a atteint une temprature infrieure 60C
couler dans
des boites de ptri et des tubes vis striles
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TP. N 4 - EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES
L'examen macroscopique des cultures est le premier examen
effectu partir de
l'isolement aprs incubation. L'aspect des colonies dpend du
milieu utilis de la dure et de la
temprature de l'incubation.
Il ne pourra tre dcrit convenablement qu' partir de colonies
bien isoles : les
colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont
rapproches.
La colonie peut apparatre la surface du milieu de culture pour
les germes arobies, ou
tre en profondeur pour les germes anarobies
1. Aspect de colonies en surface sur milieu solide
1.1. La taille
Elle peut tre mesure l'aide d'une rgle gradue pour les grandes
colonies. Il est
possible aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus
faible pour mesurer la taille
des petites colonies en utilisant de micromtres oculaires..
1.2. La forme
Allure de contours : lisse, dentels, dchiquets, irrguliers
Relief : surface bombe, demi-bombe, plate.
Centre : parfois surlve, parfois ombilique (en creux)
1.3. L'aspect de la surface
La surface dune colonie bactrienne peut tre lisse, rugueux,
renvoyer la lumire de
faon leur donner un reflet mtallique ou un aspect iris.
1.4. L'opacit
Les colonies sont dcrites comme :
Opaques (ne laissent pas passer la lumire)
Translucides (laissent passer la lumire mais on ne voit pas les
formes au
travers, comme le verre dpoli)
Transparentes (laissent passer la lumire et voir les formes au
travers, comme
le verre, on parle de gouttes de rose"
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1.5. La consistance
Au moment du prlvement il est possible d'apprcier si les
colonies sont grasses,
crmeuses (on obtient facilement des suspensions homognes), sches
ou encore muqueuses
(on obtient difficilement des suspensions homognes).
1.6. La couleur et/ou pigment
Plusieurs colonies nont pas une couleur bien dfinie (blanc,
gris). Par contre,
certaines bactries produisent un pigment insoluble qui donnent
un aspect bien
caractristique la colonie (rose, jaune, rouge ), tendis que
dautres produisent un
pigment soluble qui diffuse et colore le milieu
2. Aspect des colonies en profondeur :
1. Colonies rgulires en formes de lentilles,
2. Colonies irrgulires de formes diffuses et floues.
3. Aspect des colonies en surface sur glose linaire
1. filiformes
2. lgrement envahissantes avec bords onduls
3. lgrement envahissantes avec bord rod
4. envahissante
II. Aspect de la pousse en milieu liquide
Les bouillons nutritifs sont aussi utiliss pour cultiver les
bactries. Dans un bouillon
la croissance microbienne se traduit par lapparition dun trouble
ou opalescence mais laspect
varie selon les espces.
III. Mode opratoire :
a. Milieu solide :
Repiquer diffrentes aspects et formes de colonies sur des tubes
de glose
linaire
Incuber 37C pendant 24 h
Observer) les diffrents aspects.
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ronde A bords dentels En toile
bombe plate A bords surlevsombilique
Vue par dessus
b. Milieu liquide :
Repiquer laide dune anse de platine des colonies diffrentes dans
des tubes
de bouillon nutritifs
Flamber lanse aprs chaque repiquage
Incuber 37 C pendant 24 48h
Observer les diffrents aspects de pousse en milieu liquide
OmbiliqueBomb
Irrgulire En toileRonde
Forme :
Elvation :
Plate
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TP. N5 - ISOLEMENT DE COLONIES PURES
Les germes se trouvent souvent dans la nature sous forme de
mlange de plusieurs
espces.
Isoler c'est sparer les divers micro-organismes contenus dans le
prlvement initial.
Un isolement peut tre envisag pour :
Sparer des micro-organismes diffrents au sein d'un mlange
(prlvement
par exemple)
Purifier une souche contamine ou contrler sa puret.
L'isolement peut tre ralis par puisement de la semence en talant
le produit initial
la surface d'un milieu solide appropri. Pendant l'incubation,
chaque micro-organisme
dpos se multiplie pour donner un clone de cellules identiques.
Lorsque les micro-
organismes dposs sont suffisamment loigns. le clone se dveloppe
abondamment pour
produire une colonie (amas de cellules identiques). L'objectif
de l'isolement est donc d'obtenir
pour chaque micro-organisme diffrent des colonies
distinctes.
Les colonies obtenues, en talant une souche pure, doivent toutes
prsenter les mmes
caractres. A l'oppos, l'isolement d'un mlange donnera autant de
colonies diffrentes que de
micro-organismes diffrents contenus dans ce mlange.
Notez : deux colonies de mme aspect et de mmes caractres ne
contiennent pas
forcment des micro-organismes identiques
Rappel : les boites doivent tre places couvercle en bas
1. Matriel par groupe
Eau physiologique (tube de 9ml)
Anse de platine
Glose nutritive
Boite de ptri
2. Principe
Diluer dans de leau physiologique une fraction du mlange de
germe jusqu'
obtention dune suspension opalescente,
Prlever ensuite une fraction de cette chantillon dilu puis taler
sur la plus grande
surface possible de milieu nutritif a laide dun instrument
disolement (anse de platine,
pipette pasteur boutonnes etc.).
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Le nombre de germe restant sur linstrument sera de plus en plus
faible, ce qui va
permettre dobtenir des colonies distantes les une des
autres.
3. Mode opratoire (Technique utilisant la boite de ptri) :
a. Mthode de nevot
Prlever laide de lanse de platine une fraction de linoculum
Ensemencer par stries fines et trs serres le premier demi-
cercle
Flamber lanse de platine, laisser refroidir
Ensemencer le deuxime demi- cercle
Flamber lanse de platine
Ensemencer le troisime demi-cercle
b. Technique des 4 sries de stries
Tracer sur le fond extrieur de la boite de ptri deux diamtres
perpendiculaires
sparant la boite en quatre secteurs.
Prlever l'anse (strile) la suspension ou le bouillon dans le cne
strile.
Avec la main gauche maintenir entrouverte la boite dans le cne
strile et taler
le prlvement par stries trs serres dans une moiti de quadrant
(quadrants 1
et 2 - Flamber l'anse et laisser refroidir
Etaler nouveau le prlvement par stries serres dans la moiti
correspondante aux quadrants 2 et 3.
Flamber l'anse et laisser refroidir.
Rpter une dernire fois l'talement en stries serres dans la
moiti
correspondante aux quadrants 3 et 4
c. technique de buttiaux :
On se sert dune pipette pasteur boutonne; la petite boule est
plonge dans linoculum,
ensuite on balaye toute la surface de la glose.
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Dpt initial
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TP. N6 - LEXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTRIES
Lobservation microscopique permet de faire une tude
morphologique des cellules
dune espce bactrienne. Elle comprend :
I. Examen ltat frais
Cest lexamen microscopique de bactries vivantes, en milieu
liquide. Il permet dapprcier
leur mobilit (ou immobilit) et leur morphologie.
Prparation :
1. A partir dune culture en milieu liquide :
Dposer sur une lame propre soit le contenu dune anse de platine
soit une petite
goutte laide dune pipette Pasteur. Recouvrir la goutte dune
lamelle.
2. A partir dune culture sur milieu solide :
Dposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la
lame. Prlever une trace de
culture lanse de platine et lmulsionner dans le liquide.
Recouvrir dune lamelle.
3. Recouvrir d'une lamelle
2. Dposer une goutte de la suspension bactrienne
1. Flamber lanse de platine
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TP. N7 - EXAMEN APRS COLORATION
Lexamen aprs coloration permet dobserver des bactries tues fixes
sur une lame
et ayant subi laction dun ou plusieurs colorants. Les
colorations, ralises sur des frottis
sches et fixes, sont classes en :
Coloration simple (un seul colorant)
Coloration diffrentielle type Gram
Colorations spciales des structures bactriennes (capsules,
spors.).
Remarque :
La ralisation de frottis de bonne qualit est une condition
pralable toute coloration.
1. Ralisation des frottis :
Les frottis doivent tre tals en couche mince et rgulire, puis
schs et fixs.
1. Etalement sur lame de verre :
1. Notez la rfrence de lchantillon sur une lame parfaitement
propres et
dgraisses, 2. Prlevez strilement laide dune anse de platine une
goutte de culture
bactrienne et talez un film mince,
2. Schage :
Le schage est effectu laire libre jusqu ce que le frottis
prsente un aspect mat.
3. Fixation du frottis sec :
Cette tape consiste tuer les bactries et les coller sur la lame,
sans en altrer la
structure. La fixation seffectue par la chaleur :
La lame, tenue par une pince (frottis situ sur le dessus) est
passe 3ou 4 fois dans
la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant dentreprendre
une coloration.
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1. Identifier la lame 2. Dposer une goutte deau
3. Flamber lanse 4. Prlever une partie
dune colonie isole
5. Mlanger les bactries avec la goutte deau 6. Laisser scher
ltalement
lair
7. Fix le frottis en passant dlicatement et rapidement la lame
2-3 fois au dessus de la
flamme
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I. COLORATIONS SIMPLES : (Coloration au bleu de Mthylne)
La coloration au bleu de mthylne peut apporter des informations
concernant la
morphologie des germes.
Mode opratoire :
Sur le frottis fix et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de mthylne phniqu jusqu' ce
que toute la lame
soit recouverte.
- Laisser agir 1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau
distille, ou l'eau du
robinet jusqu' limination des colorants en excs.
- Scher l'air ou sur une platine chauffante, ou encore scher
dlicatement entre deux
feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif immersion.
Rsultats
Les bactries sont colores en bleu sombre. Cette coloration est
intressante pour
l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement
l'tude de la morphologie des
bactries.
1. Raliser un talement sur lame 2. Coloration au bleu de
mthylne
3. Elimination du bleu de mthylne
Bleu de mthylne
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TP. N 8 - COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM
Cest la coloration de base en bactriologie qui permet de
distinguer les bactries en
Gram positif et en Gram ngatif, cette distinction est
fondamentale pour leur identification.
En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants
cytoplasmiques et aprs ce
temps de coloration, toutes les bactries sont violettes. Chez
les bactries Gram ngatif, la
paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mlange
alcool + actone) qui dcolore le
cytoplasme alors que, chez les bactries Gram positif, la paroi
constitue une barrire
impermable l'alcool et le cytoplasme demeure color en
violet.
Ractifs :
- Violet de gentiane phnique
- Lugol (iodo-iodure de potassium)
- Alcool 95% (ou mlange alcool absolu+ 1/5me dactone)
- Safranine (ou Fuchsine phnique de ziehl)
Mode opratoire :
1. Raliser un frottis et le fixer la flamme
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact
1 minute
3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de
Lugol ; laisser agir le Lugol
environ 1 min
4. Jeter le Lugol et faire couler de lalcool sur la prparation ;
rincer immdiatement
leau
5. Recouvrir la prparation de Safranine, laisser agir environ 1
min. laver abondamment.
6. Scher au dessus de la flamme dun bec Bunsen.
Rsultats :
A lissue de cette coloration, on peut distinguer :
- Des bactries colores en violet fonc ; elles ont gard le
violet, le gram elle sont
dites Gram positif ;
- Des bactries colores en rose ou rouge ple ; elles ont perdu le
violet, le Gram
elles sont dites gram ngatif.
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1. Prlever une partie dune colonie isole 2. Raliser un talement
sur lame
3. Fixer la chaleur
4. Raliser les tapes de coloration
Anse boucle
Frottis vers le haut
Colorant
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TP. N 9 - INFLUENCE DE LA VARIATION DE CERTAINS FACTEURS
PHYSIQUES SUR LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES
Un certains nombre de facteurs physique externes peuvent
intervenir dans le
dveloppement des microorganisme.
La variation de certains entre eux (pH du milieu, la temprature,
la pression osmotique
etc.) peut acclrer, retarder, ou arrter la croissance
microbienne. Nous tudions dans cette
sance linfluence de la variation de temprature.
Variation de la temprature
Pour chaque microorganisme, on dfinit une temprature optimale de
croissance pour
laquelle le dveloppement est maximal, une temprature minimale en
de de laquelle il ny
a plus de croissance et une temprature maximale au dla de
laquelle le dveloppement est
stopp
1. But de exprience
Il sagit dapprcier les valeurs limites de la temprature et la
valeur optimale de
croissance dun germe donn (germe msophile)
2. Matriel par groupe
5 tubes de bouillons nutritifs (contenant 5 ml de milieu)
Anse de platine
Boites ensemences par le germe tudier
3. Mode opratoire
Marquer chaque tube de la temprature correspondante : + 4C,
20C,37C,44Cet
55C.
Ensemencer les cinq tubes avec la souche microbienne a
tudier
Incuber immdiatement chaque tube a la temprature indique. La
dure
dincubation est de 24 h, mais elle peut tre prolonger jusqu' 48
h ( pour 20C) ;voir
une semaine (pour + 4C)
4. Lecture des rsultats
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On note par le systme des croix le dveloppement des germes dans
les tubes
(-) : absence de pousse
(+) : lger trouble douteux
(+) : lgre turbidit, visible
(++): dveloppement assez important
(+++) : trouble maximale
Remarque : Pour plus de prcision, il est prfrable de dterminer
la densit optique des
tubes avec un turbidimtre.
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TP N 10 - ETUDE DE LA SENSIBILIT AU ANTIBIOTIQUES
Les antibiotiques sont des composs chimiques, labors par un
micro-organisme ou
produit par synthse et dont lactivit spcifique se manifeste dose
faible sur les micro-
organismes.
La dtermination de la sensibilit dune bactrie divers
antibiotiques est dune
grande importance en microbiologie. Elle permet llaboration des
milieux disolement
slectifs, le contrle dune infection par chimiothrapeutique et
enfin elle peut tre utilise
comme approche dans la caractrisation et lidentification
bactrienne. Lantibiogramme
dune souche peut tre dtermin en milieu liquide par la mthode de
la CMI (concentration
minimale inhibitrice) ou par la technique des disques.
1. Matriel par groupe
Disques de celluloses imprgnes dantibiotique
Boite de ptri + de glose
Culture microbienne en suspension
Rteau
2. Mode opratoire
Couler la glose dans une boite de ptri
Laisser prendre en masse
Prlever 2 ou 3 gouttes de la suspension bactrienne, les dposer a
la surface de la
glose les taler avec un rteau
Sassurer que la surface de la glose est bien sche, et y dposer
les disques de
celluloses imprgnes dantibiotique
Placer la boite de ptri basse temprature +4C pendent 15 30mn
afin de permettre
aux antibiotiques de diffuser dans la glose avant que les
bactries ne commencent
se multiplier
Retirer la boites du rfrigrateur et la placer dans lincubateur,
la temprature
optimale de croissance du germe a tudier( 37 C) pendent 24 h
Rappel : les boites doivent tre places couvercle en bas
3. Lectures des rsultats
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Lactivit de chaque antibiotique sera apprcie, par le diamtre de
laurole
dinhibition provoqu autour du disque
Remarque : Cette mthode est une application de la diffusion en
glose .Le diamtre de
laurole dpend de la vitesse de diffusion de lantibiotique dans
la glose.
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4. Mise en vidence de la prsence de micro-organismes au
laboratoire1. Matriel: milieux gloss en boite de Ptri, couvillon,
eau de robinet, cheveu, bec Bunsen, pice de monnaie.Poste de
travailTP. N: 2 - La strilisationI. La strilisation par la
chaleurLa chaleur dtruit les bactries et les spores. On distingue
les procds chaleur sche ou humide.1. Chaleur sche : III. Autres
procds de strilisation
