A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine Génotypage Rhésus D fœtal sur sang maternel Bénéfice de la technique chez la femme RhD négatif immunisée

A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

Génotypage Rhésus D fœtal sur sang maternel

Bénéfice de la technique chez la femme RhD négatif

immunisée ou non


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh

Protéine RHD :protéine transmembranaire du Globule Rouge15000 sites par GR RhD+


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH

Isolement et séquençage du gène RHD par l’équipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis . Blood 1991 ; 28 : 2747-52

Gène(s) hybride(s) D-CE-D

Gène(s) D muté(s) non fonctionnels

Gène D délété

CaucasiensRhD Négatif

(15 %)

< 1%

< 1 %

> 99 %

Noirs AfricainsRhD Négatif

(3%)

10-20 %

60-70 %

10-25 %

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL PROFIL GENOTYPIQUE

RHDPersonnes RhD négatif

Gène DHaplotype

cDeduplication

I X IXIVIII VI

Gène HybrideD-CE-D

(C)ces/ce

I X IXIII IX

Gène Ddélété

cdeCdecdE

IX

Rh box hybride

Stop


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel

ADN fœtaldans le plasma

Quantité de Génomes

(copies par ml de plasma maternel)

25 (3 à 70) à 15 S.A.290 (77 à 769) à terme

Isolement

Rapide, simple

Persistance in vivo

Demi-vie< 1 heure

Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes (1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire)LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : 768-775.

Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD –

- Diagnostic non invasif


Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD

3

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE

Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml)

72h max entre prélèvement et réception au laboratoire

Centrifugation puis décantation plasma

1Extraction de l’ADN plasmatique

2



- Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD :

- EXON 10 (plus sensible mais moins spécifique)

- EXON 7 ( plus spécifique mais moins sensible)

- EXON 5 (permet l’exclusion d’un maximum de variants du gène D silencieux)

- Les 3 amplifications distinctes permettant d’augmenter la sensibilité du test et détecter un maximum de variant du système RH



Si DISCORDANCE entre les EXONS : problème de variants RHD (identification possible en fonction de la positivité de chacun des exons ou INDETERMINE)

EXON 7

+

ORIGINE DE L’ADN AMPLIFIE

Maternelle

Fœtale

ININTERPRETABLE

RHD POSITIF

EXON 10

+

GENOTYPAGE FOETAL

+ +

EXON 5

+

+

EXON 7

-

VERIFICATIONEXTRACTION

ADN traceur négatif

RHD NEGATIF à vérifier

Sur un second prélèvement

EXON 10

-

GENOTYPAGE FOETAL

- - ADN Traceur positif

RE-EXTRACTION

EXON 5

-

-



PREVENTION DES FAUX- NEGATIFS

REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT POUR ECARTER LE RISQUE « LOURD » DE FAUX NEGATIF

1) Concentration plus élevée d’ADN fœtal

2) Rattraper une erreur d’étiquetage

3) Rattraper un croisement pré-analytique des échantillons

FAUX- POSITIFS

1 % dans la population caucasienneSpécificité du test en tant que facteur prédictif du phénotype n’est pas parfaite : présence de variants silencieux fœtal du gène RHD hérité du père


Equipes Génotypages réalisés

Concordance Génotype RhD -Phénotype

Fass et coll.(1998) 31 31 Lo et Coll. (1998) 57 55 Finning et Coll. (2004)

359 347

Rouillac et Coll. (2004)

851 842

Van der Schott et Coll. (2004)

1257 1249

Gautier et Coll. (2005)

283 283

97,4%

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL SERIE DE LA LITTERATURE


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Kit de 1ère génération

Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE

(INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY)

Trousse développée en 2006-2007

Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter fluorescent. Marquage CE obtenu en JUIN 2007

Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman

ADN marqueur : maïs

Free DNA Fetal Kit® RhD

Kit de génotypage foetal RHD à partir d’ADN foetal libre du sang maternel(Technique PCR Temps réel)

Réf. : 502080133


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION

Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement :

Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionale d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine.

Par des praticiens agrées par l’Agence de Biomédecine.

OBLIGATION D’UN CONSENTEMENT DE LA PATIENTE (préalable à une analyse de biologie moléculaire en vue d’établir un diagnostic prénatal in utero)


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE

FOETUS RHD +INCOMPATIBILITE FOETO-MATERNELLEMise en place d’une surveillance anténatale : BIOLOGIQUE (dosage pondéral)OBSTETRICALE (vélocité-doppler à l’artère cérébrale moyenne du fœtus)

FOETUS RHD –Confirmer sur un second prélèvementPas de surveillance spécifiquePAS DE SITUATION D’INCOMPATIBILITE

PERMET DE LEGITIMER OU NON UNE SURVEILLANCE ANTENATALE OBSTETRICALE ET BIOLOGIQUE

PARTICULIEREMENT CONTRAIGNANTE

FEMME RHD – IMMUNISEE ANTI- D

INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL DES 12 SA



FEMME RHD – NON IMMUNISEE

AmniocentèsePonction de trophoblaste

FOETUS RHD +

Traitement de la patiente au décours immédiat de l’amniocentèse

FOETUS RHD-

Abstention de traitement sous couvert de confirmer le génotype RHD fœtal sur LA dans les 72h.

au minimum 1 semaine avant le geste invasif

INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL



Réception résultat en moyenne 7 jours aprèsEtude Siham Boujida, sage femme maternité St Antoine Concordance génotypage LA/ sang maternel : 99 %

SANS GENOTYPAGE NON INVASIF 102

AVEC GENOTYPAGE NON INVASIF208

117 SAT 48 ROT 43 RDB

386 dossiers de femmes RHD- candidates à une amniocentèse

Etude sur 3 maternités

342 dossiers étudiés 32 exclus car refus PLA ou urgent

310

100 % traitées

100 % traitées12,5 % traitées

55,5 % RHD+39,3 % RHD-1,71 % Indéterminé3,42 % Ininterprétable



FEMME RHD – NON IMMUNISEE

A partir de 12 SA

AmniocentèsePonction de trophoblaste

Sans Amniocentèse

FOETUS RHD +

Traitement de la patiente au décours immédiat de l’amniocentèse

FOETUS RHD-

Abstention de traitement sous couvert de confirmer le génotype RHD fœtal sur LA dans les 72h.

au minimum 1 semaine avant le geste invasif

Cibler l’immunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI itératives (environ 120.000 femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+)

FOETUS RHD +

INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL GENIFERH

Projet STIC 2009-2010 : Génotypage RHD fœtal non invasif systématiqueParis-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes

Objectif principalÉvaluer le rapport coût-efficacité (4000 patientes) de

l’application systématique du génotypage RhD fœtal non invasif sur l’application de l’immunoprophylaxie RhD et la pratique habituelle de suivi des femmes enceintes RhD négatif des maternités en France (RPC 2005)

Objectifs secondairesFaisabilité de la stratégie de génotypage RhD fœtal systématiqueAnalyser les génotypages « indéterminés » et les discordances

génotypes-phénotypes Aide à la décision publique de diffusion du génotypage RHD

fœtal non invasif au sein du réseau français de soin en obstétrique et du tarif de remboursement du test.


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL CONCLUSION

FEMME IMMUNISEE

FEMME ENCEINTE RHESUS D NEGATIF

FEMME NON IMMUNISEE

AMNIOCENTESE SANS AMNIOCENTESE

PERMET DE LEGITIMER OU NON UNE SURVEILLANCE

ANTENATALE

DEVRAIT PERMETTRE D’EVITER INJECTION D’IgRHD SI LE GENOTYPE RHD FOETAL EST NEGATIF (40%)

PERMET D’EVITER INJECTION D’IgRHD SI LE GENOTYPE RHD FOETAL EST NEGATIF


SCHEMA de l’ETUDE GENIFERH 112

RAI 3e

trimestre

26 27 28 29 30

RAI (4 dernières semaines)

Accouchement + 72h

LABORATOIRE : SAISIE des données biologiques mère (extemporané) et nouveau-né (phénotype à la naissance) TRANSMISSION des résultats génotypage non invasif à la maternité (tel +fax investigateur)

Prélèvement N°1 pour GÉNOTYPAGE

Prélèvement N°2 (si N°1 RhD-) pour GÉNOTYPAGE

GROUPE MATERNITE GENOTYPAGE

GROUPE MATERNITE TEMOIN

INCLUSIONÉQUIPE

OBSTÉTRICALE

- Vérification critères.Femme > 18 ans.Grossesse de 8 à 26 SA.Rh D Négatif non immunisée.pas ATCD génotype invasif.Accoucht prévu Mater réseau- Information-Signature consentement-Remise ordonnance au groupe « génotypage »

Recueil N°1 données:Démographie, suivi de grossesse,immunohématologiques,Immunoprophylaxie

A ENVOYER: FAX INCLUSION- à URCEST : 01 49 28 28 13- au LABORATOIRE

ACCOUCHEMENTÉQUIPE OBSTÉTRICALE

Recueil N°2 données:* Patiente- Prophylaxie Rh ciblée et systématique- Données immuno-hématologiques- Consultations / hospitalisations* Nouveau-né- Démographie- Données immuno-hématologiques- Phénotype

A ENVOYER: FAX ACCOUCHEMENT-à URCEST-au LABORATOIRE

. Suivi de grossesse selon les pratiques de la maternité

. Immunoprophylaxie RhD en fonction du résultat du génotypage

CALENDRIER DE LA GROSSESSE EN SEMAINES D’AMÉNORRHÉE

.Suivi de grossesse selon les pratiques de la maternité

. Immunoprophylaxie RhD selon RPC 2005

Documents

A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine Génotypage Rhésus D fœtal sur sang maternel Bénéfice de la technique chez la femme RhD négatif immunisée