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ISBN 2 10 048425 7

Cet ouvrage offre un panorama trs dtaill des mthodes actuelles danalyseprsentes dans des secteurs aussi varis que les industries chimiques,agroalimentaires, les laboratoires danalyse mdicale, les sciences delenvironnement. Le principe adopt est de relier les aspects pratiques dechaque mthode tudie aux notions scientifiques qui lexpliquent.Abondamment illustr par plus de 250 figures et photos originales, ce livreest organis en trois sections : les mthodes sparatives (les diffrentestechniques de chromatographie et dlectrophorse), les mthodes danalysespectrale (RMN, IR, UV, fluorimtrie, fluorescence X, absorption et missionatomique), les autres mthodes (spectromtrie de masse, mthodes avecmarquage, lectrochimie). Quelques notions sur les statistiques et sur laprparation des chantillons sont donnes en complment.En fin de chaque chapitre, une liste de sites internet invite le lecteur dcouvrirdes dmonstrations de matriels prsents dans le livre.Dans cette nouvelle dition, le texte a t entirement remani et mis jourpour tenir compte des progrs technologiques les plus rcents, et quelquesnouveaux exercices corrigs sont proposs au lecteur.Ce livre sadresse aux tudiants des 1ers cycles universitaires/Licence et depharmacie. Il sera aussi utile aux tudiants des deuximes cycles/Masterorients vers les sciences de la matire et aux personnels des laboratoires etdes entreprises confronts tous niveaux des problmes danalyse.

FRANCIS ET ANNICKROUESSAC

sont respectivementprofesseur mrite delIUT du Mans et matrede confrenceshonoraire.

DANIEL CRUCH

est professeur agrg lIUT du mans.

SCIENCES SUP

Francis Rouessac Annick Rouessacavec la collaboration de Daniel Cruch

Prface de Guy Ourisson

ANALYSE CHIMIQUEMthodes et techniques instrumentales modernesCours et exercices corrigs

MATHMATIQUES

PHYSIQUE

CHIMIE

SCIENCES DE LINGNIEUR

INFORMATIQUE

SCIENCES DE LA VIE

SCIENCES DE LA TERRE

SCIENCES SUP

ANALYSE CHIMIQUEMthodes et techniques

instrumentales modernes

6e dition

Francis Rouessac Annick Rouessac

avec la collaboration de Daniel Cruch

1er cycle/Licence Pharmacie

CO

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www.dunod.com

6 e dition

1 2 3 4 5 6 7 81er cycle 2e cycle 3e cycle

LICENCE MASTER DOCTORAT

Cours et exercices corrigs

NordCompoFichier en pice jointe9782100484256_couverture.jpg

ANALYSE CHIMIQUE

ANALYSE CHIMIQUE

Mthodes et techniquesinstrumentales modernes

Cours et exercices corrigs

Francis RouessacProfesseur mrite de l'universit du Mans

Annick RouessacMatre de confrences honoraire

Avec la collaboration de Daniel CruchProfesseur agrg l'IUT du Mans

Prface deGuy Ourisson

Membre de lAcadmie des Sciences

6e dition

Illustrations intrieures : Francis RouessacIllustration de couverture : Lionel Auvergne

Dunod, Paris, 2004 Masson, Paris, 1992 pour la 1re dition

ISBN 2 10 048425 7

Prface

Une lente volution, lente, lente, se produit-elle dans les pratiques universitaires franaises ?Des livres scientifiques en franais deviennent disponibles. En trente ans, on a vu disparatreles gros classiques davant-guerre, dmods, puis sortir quelques livres qui taient essen-tiellement des notes de cours amliores, peu diffuses sans doute parce que correspondantdavantage un besoin local qu une tentative srieuse de rnover la pdagogie. Puis destraductions plus ou moins profondment remanies de livres amricains. Et enfin quelquesouvrages succs, dont le grand nombre dditions, et le tirage, ont d remplir daise au-teurs et diteurs et cela parce quils sont utiles aux tudiants et quils sont originaux parrapport leurs homologues trangers.

Sil nous tait possible depuis quelques annes de conseiller aux tudiants de se procurerpour la Chimie Organique le H.&C. , ou de leur indiquer que le niveau de Chimie Phy-sique atteint en DEUG tait celui de la 15e dition du A , il tait bien difficile jusquicide pouvoir miser sur un livre dintroduction gnrale en Chimie Analytique. Le R , leRouessac, va pouvoir combler cette lacune.

Analyse Chimique , en fait, tel est son titre. Il y a quelques annes, des collguesspcialiss en Chimie Analytique mavaient effectivement expliqu que je confondais leurdomaine et lanalyse chimique : la Chimie Analytique tait une science dsincarne, loi-gne des basses applications, celles de lanalyse chimique (notez le jeu dinitiales majus-cules et minuscules). Pourtant, je nen crois rien, et je nai jamais su si le cours de ChimieAnalytique que jai introduit Strasbourg il y a une quinzaine dannes tait Ceci ou cela.Le Rouessac est lun ou lautre. Son sous-titre est plus explicite : il sagit de Mthodes etTechniques Instrumentales Modernes . Explicite, mais peu informatif : lanalyse chimiquesest toujours faite laide dinstruments, et ils nont jamais cess de se moderniser. Pendantlongtemps, le plus important a t la balance ; il reste essentiel (et on peut esprer quuneprochaine dition du R. dcrira ce quest devenue cette mthode instrumentale moderne - ily suffira de quelques pages).

Aujourdhui, ce sont des mthodes bien plus varies et plus complexes qui font la loidans les laboratoires. Le R. les dcrit de faon systmatique et simple, mais prcise. Quece soit pour les mthodes de sparation comme, bien sr, toutes les variantes des chroma-tographies, ou pour les mthodes didentification structurale on y trouvera une introductionbien quilibre. Livre denseignement, le R. lest dans la mesure o un chimiste qui enconnatrait tout le contenu (et aurait reu une initiation pratique, bien sr) ne serait gureen peine de se rendre utile dans nimporte quel laboratoire. Livre denseignement russi, illest aussi, par le soin quil met aux explications.

VI Prface

Une prface logieuse se doit dvoquer de futures ditions. Dans ces nouvelles versions,jespre que F. Rouessac et son pouse pourront trouver la place de quelques complments :sur la balance, je lai dit, mais aussi sur les mthodes lectrochimiques, lchantillonnage si rarement discut , et sur le traitement des donnes numriques (conservation des donnesprimaires, archivage, traitements statistiques, prsentations graphiques, etc.).

Guy OurissonMembre de lAcadmie des Sciences

23 avril 1992.

Table des matires

AVANT-PROPOS XVII

INTRODUCTION 1

PARTIE 1 MTHODES SPARATIVES

Linvention de la chromatographie 6

CHAPITRE 1 CHROMATOGRAPHIE, ASPECTS GNRAUX 71.1 Gnralits sur la chromatographie analytique 7

1.2 Le chromatogramme 9

1.3 Pics dlution gaussiens 11

1.4 Modle des plateaux 11

1.5 Coefficient (ou Constante) de distribution de Nernst (K) 14

1.6 Efficacit dune colonne 15

1.7 Grandeurs de rtention 17

1.8 Facteur de sparation (ou slectivit) entre deux soluts 18

1.9 Facteur de rsolution entre deux pics 19

1.10 Influence de la vitesse de la phase mobile 20

1.11 Optimisation dune analyse chromatographique 23

1.12 Les diverses techniques chromatographiques 24

ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE 27

1.13 Principe et relation de base 27

1.14 Aires des pics et logiciels de chromatographie 27

1.15 Mthode de ltalonnage externe 28

1.16 Mthode de ltalonnage interne (talon interne) 30

1.17 Mthode par normalisation interne 32

EXERCICES 33

VIII Table des matires

CHAPITRE 2 CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE 362.1 Lorigine de la CLHP 36

2.2 Conception gnrale dun appareil de CLHP 37

2.3 Pompes et gradients dlution 38

2.4 Injecteurs 40

2.5 Colonnes 41

2.6 Phases stationnaires 42

2.7 Chromatographie liquide chirale 47

2.8 Phases mobiles 48

2.9 Chromatographie dappariement dions 50

2.10 Chromatographie dinteraction hydrophobe 51

2.11 Principaux dtecteurs 52

2.12 Tendances actuelles de la CLHP 57

EXERCICES 59

CHAPITRE 3 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE 613.1 Principe dune installation de CPG 61

3.2 Gaz vecteur et rgulateur de dbit 63

3.3 Introduction de lchantillon et chambre dinjection 64

3.4 Enceinte thermostate 68

3.5 Colonnes 68

3.6 Phases stationnaires 70

3.7 Principaux dtecteurs 73

3.8 Dtecteurs conduisant des donnes structurales 77

3.9 Chromatographie rapide 78

3.10 Indices de rtention et Constantes des phases stationnaires 80

3.11 Chromatographie multidimensionnelle 84

EXERCICES 85

CHAPITRE 4 CHROMATOGRAPHIE IONIQUE 884.1 Principe de la chromatographie ionique (CI) 88

4.2 Phases stationnaires 90

4.3 Phases mobiles 92

4.4 Dtecteurs conductivit 94

Table des matires IX

4.5 Le suppresseur dions de llectrolyte 95

4.6 Analyseurs dacides amins 96

EXERCICE 99

CHAPITRE 5 CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE 1005.1 Mise en uvre de la chromatographie planaire 100

5.2 Particularits lies la CCM 102

5.3 Phases stationnaires 103

5.4 Paramtres de sparation et de rtention 105

5.5 CCM quantitative 105

EXERCICES 107

CHAPITRE 6 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE 1086.1 Rappel sur les fluides supercritiques 108

6.2 Les phases supercritiques comme phase mobile 109

6.3 Instrumentation en SFC 110

6.4 Comparaison de la SFC avec la CLHP et la CPG 111

6.5 Place de la SFC en chromatographie 112

CHAPITRE 7 CHROMATOGRAPHIE DEXCLUSION STRIQUE 1147.1 Principe de la chromatographie dexclusion strique (CES) 114

7.2 Phases stationnaires et phases mobiles 115

7.3 Traitement du chromatogramme 117

7.4 Instrumentation 118

7.5 Domaines dapplication 119

EXERCICES 121

CHAPITRE 8 LECTROPHORSE CAPILLAIRE ET LECTROCHROMATOGRAPHIE 1238.1 De llectrophorse de zone llectrophorse capillaire 123

8.2 Mobilit lectrophortique et flux lectro-osmotique 125

8.3 Instrumentation 129

8.4 Techniques lectrophortiques 131

8.5 Performances 133

8.6 lectrochromatographie capillaire (ECC) 135

EXERCICES 137

X Table des matires

PARTIE 2 MTHODES SPECTROMTRIQUES

Les inventeurs de la colorimtrie 140

CHAPITRE 9 SPECTROMTRIE DABSORPTION DE LULTRAVIOLET ET DU VISIBLE 1419.1 Le domaine spectral UV-Vis et lorigine des absorptions 141

9.2 Le spectre UV-VIS 143

9.3 Transitions lectroniques des composs organiques 144

9.4 Groupements chromophores 146

9.5 Effets dus aux solvants : solvatochromie 148

9.6 Rgles de Woodward-Fieser 149

9.7 Instrumentation dans lUV/Visible 150

9.8 Les diffrentes configurations des spectromtres UV/Vis 154

9.9 Analyse quantitative : lois de labsorption molculaire 158

9.10 Mthodes utilises en analyse quantitative 161

9.11 Analyse dun seul analyte et contrle de puret 162

9.12 Analyse multicomposants (MCA) 164

9.13 Mthodes de correction de ligne de base 167

9.14 Distribution des erreurs relatives dues aux appareils 168

9.15 Spectromtrie drive 169

9.16 Colorimtrie visuelle par transmission ou rflexion 171

EXERCICES 172

CHAPITRE 10 SPECTROMTRIE DU MOYEN ET DU PROCHE INFRAROUGE 17510.1 Origine de labsorption lumineuse dans linfrarouge 175

10.2 Prsentation des absorptions dans linfrarouge 176

10.3 Bandes de vibration-rotation dans linfrarouge 177

10.4 Modle simplifi des interactions vibrationnelles 178

10.5 Les composs rels 179

10.6 Bandes caractristiques des composs organiques 181

10.7 Spectromtres et analyseurs infrarouges 182

10.8 Sources et dtecteurs dans le moyen IR 187

10.9 Examen des chantillons 189

10.10 Spectroscopie dimagerie chimique 193

10.11 Archivage des spectres 193

Table des matires XI

10.12 Comparaisons de spectres 197

10.13 Analyse quantitative 197

EXERCICES 202

CHAPITRE 11 FLUORIMTRIE ET CHIMILUMINESCENCE 205

11.1 Fluorescence et phosphorescence 205

11.2 Origine de la fluorescence 206

11.3 Relation entre fluorescence et concentration 208

11.4 Diffusion Rayleigh et diffusion Raman 210

11.5 Instrumentation 212

11.6 Quelques applications de la fluorescence 215

11.7 Fluorimtrie rsolue dans le temps 217

11.8 Chimiluminescence 218

EXERCICES 221

CHAPITRE 12 SPECTROMTRIE DE FLUORESCENCE X 223

12.1 Principes de base 223

12.2 Le spectre de fluorescence X 224

12.3 Modes dexcitation des lments en fluorescence X 226

12.4 Dtection des rayons X 230

12.5 Les diverses catgories dinstruments 231

12.6 Prparation des chantillons 235

12.7 Absorption des rayons X - densimtrie X 236

12.8 Analyse quantitative par fluorescence X 237

12.9 Applications de la fluorescence X 237

EXERCICES 239

CHAPITRE 13 ABSORPTION ATOMIQUE ET MISSION DE FLAMME 242

13.1 Effet de la temprature sur un lment 242

13.2 Application aux appareils actuels 244

13.3 Absorption atomique contre mission de flamme 245

13.4 Dosages par SAA ou par EF 246

13.5 Instrumentation de base en absorption atomique 247

13.6 Photomtres de flamme 253

XII Table des matires

13.7 Correction des absorptions parasites 253

13.8 Perturbations physiques et chimiques 257

13.9 Sensibilit et limite de dtection en SAA 258

EXERCICES 260

CHAPITRE 14 SPECTROMTRIE DMISSION ATOMIQUE 26214.1 Spectromtrie dmission optique des atomes (OES) 262

14.2 Principe de lanalyse par mission atomique 263

14.3 Procds pour dissocier lchantillon en atomes ou ions 264

14.4 Systmes dispersifs et raies spectrales 267

14.5 Appareils simultans et appareils squentiels 269

14.6 Performances 272

14.7 Couplage CPG/mission atomique (CPG/ICP-OES) 273

14.8 Applications de la spectromtrie dmission atomique 274

EXERCICES 275

CHAPITRE 15 SPECTROMTRIE DE RSONANCE MAGNTIQUE NUCLAIRE 27715.1 Gnralits 277

15.2 Interaction spin/champ magntique pour un noyau 278

15.3 Les noyaux qui peuvent tre tudis par RMN 280

15.4 Thorie de Bloch pour un noyau dont I = 1/2 281

15.5 Frquence de Larmor 282

15.6 Obtention du spectre par RMN impulsionnelle 284

15.7 Les processus de relaxation des noyaux 287

15.8 Le dplacement chimique 288

15.9 Mesure des dplacements chimiques 288

15.10 Noyaux blinds ou dblinds 289

15.11 Facteurs affectant les dplacements chimiques 290

15.12 Structure hyperfine Couplages spin-spin 292

15.13 Couplages htronuclaires 292

15.14 Couplages homonuclaires 295

15.15 Dcouplage de spin et squences particulires 298

15.16 Couplage CLHP/RMN 300

15.17 RMN du fluor et du phosphore 301

Table des matires XIII

15.18 RMN quantitative 302

15.19 Analyseurs utilisant la RMN impulsionnelle 305

EXERCICES 310

PARTIE 3 AUTRES MTHODESLes analyses de trace 314

CHAPITRE 16 SPECTROMTRIE DE MASSE 31516.1 Principe de base 315

16.2 Le spectromtre de Bainbridge (1933) 318

16.3 Analyseurs lectromagntiques de type EB 320

16.4 Analyseurs temps de vol (TOF) 323

16.5 Analyseurs filtre quadripolaire par transmission 325

16.6 Analyseurs pigeage dions par quadripole 329

16.7 Analyseurs rsonance cyclotronique (FTMS) 330

16.8 Performances des spectromtres de masse 332

16.9 Principaux procds dionisation sous vide 335

16.10 Procds dionisation pression atmosphrique 339

16.11 Spectromtres de masse en tandem (MS/MS) 342

16.12 Dtecteurs ions 343

QUELQUES APPLICATIONS EN SPECTROMTRIE DE MASSE 345

16.13 Identification au moyen dune spectrothque 345

16.14 Analyse de la composition lmentaire des ions 346

16.15 Mesure des rapports isotopiques dun lment 349

16.16 Fragmentation des molcules organiques 350

EXERCICES 355

CHAPITRE 17 MTHODES DE DOSAGE PAR MARQUAGE 35717.1 Principe des mthodes de marquage 357

17.2 Dilution isotopique avec un marqueur radioactif 358

17.3 Mthode substchiomtrique 359

17.4 Tests radio-immunologiques (RIA) 359

17.5 Mesure des activits radio-isotopiques 360

17.6 Antignes et anticorps 363

17.7 La mthode de dosage immunoenzymatique (EIA) 363

XIV Table des matires

17.8 Autres techniques immunoenzymatiques 366

17.9 Avantages et dfauts des tests ELISA en chimie 367

17.10 Fluoro-immunologie (IFA) 367

17.11 Marquage avec un isotope stable 368

17.12 Analyse par activation neutronique (NAA) 369

17.13 Sources de neutrons thermiques 369

17.14 Activit induite Dure dirradiation 370

17.15 Dtection par comptage principe des mesures 370

17.16 Applications 371

EXERCICES 372

CHAPITRE 18 ANALYSEURS LMENTAIRES 374

18.1 Analyses particulires 374

18.2 Analyse lmentaire organique 375

18.3 Analyseurs dazote total 377

18.4 Analyseurs de soufre total 379

18.5 Analyseurs de carbone total 380

18.6 Analyseurs de mercure 380

EXERCICES 382

CHAPITRE 19 MTHODES POTENTIOMTRIQUES 383

19.1 Gnralits sur les cellules de mesure 383

19.2 Une lectrode slective particulire : llectrode pH 385

19.3 Les principaux types dlectrodes ioniques slectives 386

19.4 Les calculs et les diffrentes mthodes 389

19.5 Quelques applications 391

EXERCICES 392

CHAPITRE 20 MTHODES VOLTAMPROMTRIQUES ET COULOMTRIQUES 394

20.1 Gnralits sur la mthode voltampromtrique 394

20.2 Llectrode goutte de mercure tombante 396

20.3 Polarographie courant continu 396

20.4 Le courant de diffusion 397

20.5 Polarographie impulsions 398

Table des matires XV

20.6 Dtection voltampromtrique en CLHP et ECHP 400

20.7 Capteurs de type ampromtriques 401

20.8 Voltampromtrie redissolution (stripping voltammetry) 405

20.9 Dosages coulomtriques courant ou potentiel constant 406

20.10 Le dosage de leau daprs la mthode de Karl Fischer 407

20.11 Conduite dun dosage selon la mthode de Karl Fischer 409

EXERCICES 412

CHAPITRE 21 TRAITEMENT DES CHANTILLONS 41421.1 La ncessit dun traitement pralable 414

21.2 Extraction en phase solide (SPE) 415

21.3 Cartouches dimmuno-extraction 417

21.4 Procds de micro extraction 418

21.5 Extraction gazeuse sur colonne ou sur disque 419

21.6 Espace de tte (headspace) 420

21.7 Extraction par solvant ltat supercritique 422

21.8 Racteurs digestion par micro-ondes 423

21.9 Analyseurs en ligne 424

CHAPITRE 22 PARAMTRES STATISTIQUES DE BASE 42622.1 Valeur centrale, justesse et fidlit dun ensemble de mesures 426

22.2 Variance et cart-type 427

22.3 Erreurs alatoires ou indtermines 429

22.4 Intervalle de confiance de la moyenne 431

22.5 Comparaison de rsultats Tests paramtriques 432

22.6 Test de rejet Quotient Q ou test de Dixon 434

22.7 Courbes dtalonnage 434

22.8 Mthodes robustes ou tests non-paramtriques 437

22.9 Optimisation par la mthode un seul facteur la fois 438

EXERCICES 439

RPONSES AUX EXERCICES 441

TABLE DES CONSTANTES PHYSICO-CHIMIQUES 454

BIBLIOGRAPHIE 455

INDEX 459

nos enfants et petits enfants

Avant-propos

Ce manuel est destin donner un ensemble de connaissances de base sur les mthodesles plus souvent rencontres actuellement en analyse chimique, qualitative, quantitative etstructurale, dans des secteurs aussi varis que constituent les industries chimiques, phar-maceutiques, agroalimentaires, ainsi que ceux de lenvironnement et des rglementationsdiverses.

Les mthodes passes en revue dans cet ouvrage sont classes en mthodes sparatives,mthodes spectrales et autres mthodes. Chacune delles fait lobjet dune tude qui sap-puie sur les ides de base pour se prolonger par les principales techniques instrumentalescorrespondantes. Lensemble est illustr de photographies, de nombreux dessins et schmasde principe, dont beaucoup sinspirent dinstruments rels et de documents obtenus auprsdes constructeurs. Afin de maintenir une taille raisonnable lensemble de cet ouvrage, lesmthodes plus rarement utilises ou celles en volution rgressive, nont pas t traites.

Rdig aussi clairement que possible, le texte sadresse un large ventail dtudiantsdes IUT (Dpartements chimie, mesures physiques, biologie applique...), des classes detechniciens suprieurs (BTS), des premiers cycles universitaires (DEUG, DEUST), ainsiquaux tudiants des seconds cycles scientifiques (licence, IUP, DESS) qui veulent com-plter ou retrouver des connaissances de base, tudies de manire fragmentaire. Ce livredevrait galement tre utile aux participants de cycles de formation continue, aux formationsdu CNAM et aux agents de matrise de lindustrie, confronts aux problmes danalyse decomposs chimiques ou qui ont lintention de prparer des concours. Les besoins en ana-lyse chimique dans des secteurs professionnels qui en taient rests lcart, allie au choixgrandissant des techniques et instruments disponibles, justifient galement linformation etla mise niveau de nombreuses personnes dont les connaissances ncessitent un recyclage.

Ce livre a t conu pour rpondre aux besoins des lecteurs dans le domaine de la chi-mie analytique applique en tant quoutil utilis dans beaucoup de sciences exprimentaleset domaines divers. Les connaissances requises pour aborder cet ouvrage correspondent celles des tudiants en premire anne des premiers cycles universitaires, voire pour les-sentiel celles des bacheliers scientifiques. Les auteurs se sont donc limits au rappel desprincipes fondamentaux et ont tenu compte de lvolution des connaissances des tudiantsdont lapproche des phnomnes physiques et le bagage mathmatique ont volu. Le textecomporte un minimum de rappels thoriques sur les phnomnes concerns, afin de ne pascarter une partie des lecteurs auxquels ce livre est destin. Les intresss pourront, si n-cessaire, aborder ultrieurement, sans difficult majeure, la lecture douvrages spcialiss,en ayant acquis avec ce livre une vision densemble assez complte des mthodes actuelleset de leurs aspects pratiques.

XVIII Avant-propos

Le contenu de ce livre reflte aussi le profond changement dans les techniques analytiquesdes laboratoires, qui rsulte de laccroissement de la demande, du volume des donnes quien rsulte, de linformatisation et des besoins nouveaux en analyses de traces notamment.

Prsenter plus dune vingtaine de mthodes, avec des exercices (et leur corrigs) surenviron 450 pages peut sembler un dfi, chacune delles pouvant faire lobjet dun longdveloppement compte tenu du grand nombre dapplications dont elles font toutes lobjet.Cest la raison pour laquelle les auteurs ont prfr se limiter la prsentation des outilsplutt que de dcrire tout ce que leur usage permet de faire. Seules les mthodes ont uncaractre universel. Les applications ont donc t simplement choisies dans un but illustratif.

Ce livre a pour origine le cours et les travaux dirigs effectus aux tudiants de lIUT duMans depuis de nombreuses annes. Cette nouvelle dition a t actualise et complte,par rapport la prcdente. Une version proche de la 4e dition de cet ouvrage a t traduiteen langue anglaise. Elle a pour titre Chemical Analysis, Modern Instrumentation Methodsand Techniques, John Wiley & Sons (Chichester, 2000). La 5e dition a t traduite enlangue espagnole. Elle a pour titre Anlisis Quimico. Methodos y Tcnicas InstrumentalesModernas, McGraw-Hill Interamericana de Espana, S.A.U.

Les auteurs remercient Daniel Cruch, Professeur agrg lIUT du Mans pour ses sug-gestions et qui a complt, pour certains chapitres, le nombre des exercices proposs.

Ils remercient galement toutes les socits franaises et trangres contactes pour leurinformation et qui ont toujours rpondu favorablement. Leur aide a t tout fait prcieuse,tant donn que linstrumentation analytique est un secteur qui simprgne sans retard desprogrs technologiques dans des domaines trs varis.

Les auteurs expriment enfin leur vive reconnaissance au professeur Guy Ourisson, Pr-sident de lAcadmie des Sciences, pour le grand honneur quil leur a fait en acceptant deprfacer les premires ditions de ce livre.

Le Mans, Juillet 2004 F. Rouessac & A. Rouessac

Liste non exhaustive des socits qui ont aimablement accept de fournir des renseigne-ments et documents, dont certains sont reproduits dans ce livre :

Agilent Technologies, American Stress Technologies, Anotec, Antek, Arelco, Asoma, ATI, ATS,Aurora, Bio-Rad, Bosch, Bruker, Camag, Carbone-Lorraine, Chrompack, Ciba, CTTM, Daiiso Com-pany, Desaga, Dionex, DuPont, EG& G-ORTEC, Erba Science, ETP Scientific, Eurolabo, Finnigan,Fisons-Instruments, Foxboro, Galileo, Grasby-Electronics, Hamamatsu, Hamilton, Imaging SensingTechnology, Jeol, Jenway, Jobin-Yvon, Jordan Valley, Labsystems, Leeman Labs., Leybolds, Merck,Metorex, Metrohm, Mettler-Toledo, Microsensor Technology, Nicolet, Oriel, Ortec, Oxford Instru-ments, Perkin-Elmer, PESciex, Pharmacia-Biotech, Philips, Photovac, Polymer Lab., PSS, Rheo-dyne, RTI, Scientec, Scientific Glass Company, Servomex, Shimadzu, Siemens, SMIS, Supelco,Tekmar, Teledyne, Thermo Electron, Thermo-Optek, Thermo-Quest, Thermo Jarrell Ash, Tosohaas,Varian, VG Instruments, Waters, Wilmad.

Introduction

La chimie analytique est une science proche de la chimie physique. Elle se rapporte ltudedu comportement chimique et physique des composs purs ou en solution soumis diversesconditions. En cela cest une science fondamentale et quelquefois abstraite. Elle a aussipour rle dinterprter les informations recueillies. Mais on la peroit souvent sous son as-pect appliqu, ayant pour objet de mettre en uvre des mthodes appropries dans le butdacqurir des informations sur la nature, la composition et la structure de composs pr-sents dans des chantillons varis. Cet aspect rduit de la chimie analytique nest autre quelanalyse chimique qui rassemble toutes les mthodes et procds permettant de rsoudreles problmes concrets danalyse. Le terme chimique rappelle quil sagit de lanalyse deslments chimiques et des composs dfinis qui en drivent.

Son tude implique daborder des domaines de connaissances varis. Cest une sciencemultidisciplinaire, de transfert, dont les retombes se font dans toutes les sciences expri-mentales. Elle fait appel pour parvenir ses fins beaucoup de notions dont certaines sontfort loignes de la chimie, au sens habituel de ce terme.

En analyse chimique, il est dusage de distinguer deux catgories de mthodes. La pre-mire regroupe les mthodes chimiques proprement dites qui mettent en jeu les propritschimiques pour obtenir linformation chimique sur la matire traite et la seconde, dorna-vant au premier plan, qui comprend les mthodes physiques et physico-chimiques utilisantdes proprits particulires de la matire pour aboutir des mesures en relation avec cettemme information chimique.

Les mthodes traditionnelles, dites par voie humide, lorigine du terme de chimieanalytique ont beaucoup diminu dimportance. Les analyses actuelles, dont plus de lamoiti concerne des composs ltat de traces, vitent en effet de mettre en jeu des r-actions chimiques parce que souvent ces mthodes sont laborieuses, ncessitent des chan-tillons importants car moins sensibles et risquent dtre fausses si on doit utiliser des rac-tifs dont la puret est insuffisante.

En revanche, un grand nombre danalyses seffectuent par lintermdiaire dinstrumentsvaris que lon trouve souvent installs ailleurs que dans des laboratoires danalyses clas-siques. Beaucoup relvent par exemple de la spectroscopie applique. Ainsi est ne lana-lyse instrumentale avec son formidable arsenal de procds, grce auquel lanalyste est mme de rpondre des demandes de plus en plus nombreuses et varies

La chimie analytique est indispensable dans de nombreux secteurs autres que ceux, tra-ditionnels, de la chimie ou de la parachimie. Elle est de plus en plus prsente au sein desactivits humaines. Ainsi on la retrouve dans le mdical (elle dbouche ainsi sur les diag-nostics), la biochimie, lagroalimentaire, lenvironnement (pollution), la scurit dans unmonde souvent dangereux et dans de nombreux secteurs industriels.

2 Introduction

Tout un chacun en bnficie. Il nest qu prendre pour exemples toutes les analysessur la qualit de lair, de leau, des aliments et autres produits essentiels, quentranent lesrglementations mises en place au niveau de lEurope, ou concernant la libre circulation desproduits.

Parmi les tendances actuelles de lanalyse on observe une augmentation des instrumentsportables et miniaturiss, des analyseurs spcifiques pour les drogues, les explosifs, lesodeurs, les procds, et des applications qui touchent lenvironnement, la bio-pharmacie.

Chromatographieliquide

Chromatographiegazeuse

28%

17%14%11%9%

4% 17%

Infrarouge Spectromtriede masse

Autresmthodes

LIMS

SpectromtrieUV/VIS

Pour 2003, le chiffre d'affaire mondialprvu est de l'ordre de 20 milliards d'Euros

Analyse molculaire

Une faon de dfinir limportance dune technique est de se reporter aux statistiques co-nomiques concernant les ventes des instruments correspondants. La diffusion dune tech-nique se rpercute sur la probabilit, pour lanalyste, de la rencontrer dans sa vie profes-sionnelle. Ainsi, la statistique ci-dessus fait apparatre que la chromatographie, elle seule,reprsente une large part du chiffre daffaires de linstrumentation danalyse molculaire(par opposition lanalyse lmentaire, 2 fois moins importante). Dans ce domaine riennest fig. Des secteurs nouveaux de lanalyse mergent, des mthodes font leur apparition.Par ailleurs, laspect conomique nest pas le seul qui doit tre pris en compte pour dfinirlimportance dune mthode. Pour certaines analyses, une mthode, mme trs rare, peuttre la plus importante, ds lors quelle est la seule permettre de rsoudre le problmepos.

Lanalyse chimique fait preuve de beaucoup dinnovations. Lvolution des technologiesa permis la ralisation dinstruments trs performants, apportant des possibilits nouvelles,notamment avec lintroduction des mthodes couples et des mthodes non destructives, domaine du contrle non destructif qui se contentent de petits chantillons ne ncessitantpas, ou trs peu, de prparation pralable la mesure. Les utilisateurs peuvent dsormais ac-qurir des appareils qui rpondent des normes de prcision et de qualit, ncessaires pouraccder la certification, tape importante sinon suffisante, pour faire reconnatre officiel-lement la qualit des rsultats du laboratoire. Ces procdures daccrditation sont imposespar de nombreux organismes de contrle de tous pays.

Pour mener bien ces tudes, lanalyste doit tre form aux diffrentes techniques. Il doittre expert et connatre les concepts de base de la chimie, sachant quil arrive souvent quuncompos puisse tre dos par des mthodes diffrentes. Choisir une bonne mthode, et sipossible la meilleure, exige la connaissance de beaucoup de paramtres. On doit se posertout un ensemble de questions :

de quel type dchantillon sagit-il (acier, terre, eau...) ?

est-ce un constituant majeur, mineur ou ltat de trace (moins de 0,01 %) ?

Introduction 3

sagit-il dune analyse partielle ou complte de lchantillon ?

lchantillon doit-il tre rcupr aprs la mesure ?

lanalyse demande est-elle unique ou sera-t-elle rptitive ?

quel est le degr de prcision ncessaire ?

dispose-t-on du personnel comptent pour mener bien lanalyse ?

quel sera le cot de lanalyse ?

quel est le laps de temps dont on dispose pour fournir le rsultat ?

quelle est la fiabilit des rsultats de la mthode envisage ?

quelles sont les consquences derreurs possibles ?

Ainsi lorsquun nouvel objectif danalyse a t dfini, le problme doit tre abord m-thodiquement.

Au dpart, compte tenu de la nature de lanalyte doser, on doit faire le choix de lamthode : mthode spectroscopique, lectrochimique, sparative...

Puis vient le choix de la technique : si, par exemple, on a choisi la mthode chromato-graphique, fera-t-on appel la chromatographie en phase gazeuse ou la chromatographieen phase liquide ?

Mais avant de commencer lanalyse, se pose galement le choix du procd relatif auprlvement et au traitement pralable faire subir lchantillon,

Enfin le suivi dun protocole correspond au mode opratoire retenu. Cest la recettedu dosage , gnralement un processus faisant lobjet de normes dfinies (AFNOR). Cettenormalisation porte sur la standardisation des tapes, de la prparation de lchantillon laconduite des mesures.

Les rsultats, enfin, seront tablis suivant les normes en vigueur, et les donnes brutes delanalyse seront conserves, par exemple sous forme dun fichier informatique qui ne peuttre rcrit. Cet aspect important du travail a fait lobjet de textes officiels connus sous lenom de Bonnes Pratiques de Laboratoire, ou BPL.

Pour conseiller la meilleure mthode afin de rsoudre le problme danalyse, il existe unescience, appele chimiomtrie. Elle a pour but de venir en aide lanalyste, en fonction desimpratifs exigs et selon plusieurs orientations : mthodologie approprie, plan dchan-tillonnage minimum, traitement des donnes et interprtation des rsultats. En sappuyantsur loutil informatique, elle cherche apporter une rponse correcte par exploitation desrsultats au moyen des mthodes statistiques afin de rduire le nombre dessais pour lesanalyses longues ou coteuses.

En conclusion, la chimie analytique englobe lanalyse chimique et la chimiomtrie :

Lanalyse chimique qui a pour but de donner des rsultats, gnralement quantitatifs(concentrations) ;

la chimiomtrie qui regroupe lensemble des mthodes dexploitation et dinterprtationdes rsultats pour rsoudre le problme pos.

PARTIE 1

Mthodes sparatives

0 2 4 6 8 10 14 1612 18 min.

LINVENTION DE LA CHROMATOGRAPHIE

On a coutume dattribuer Michel Tswett linvention, peu aprs 1900, de la chromato-graphie actuelle. Au travers de ses publications successives, on peut en effet reconstituersa dmarche intellectuelle qui en fait un pionnier, si ce nest linventeur, de cette impor-tante mthode sparative. Son domaine de recherche tait li la biochimie des plantes. son poque on savait extraire avec de lthanol la chlorophylle et les autres pigments desplantes vertes, souvent des feuilles. En vaporant ce solvant, il restait un extrait noirtrequi pouvait tre redissous dans bon nombre dautres solvants et en particulier dans ltherde ptrole (on dirait maintenant des solvants polaires ou non polaires). Cependant on necomprenait pas bien pourquoi ce dernier solvant tait incapable dextraire directement lachlorophylle des plantes. Tswett mit lhypothse que dans les plantes la chlorophylle devaittre retenue par des forces qui la fixait sur la cellulose, empchant ainsi lther de ptrolede lextraire. Il entrevoyait ici le principe de ladsorption. Pour tester cette hypothse il eutlide de dissoudre lextrait de pigments dans lther de ptrole et dajouter du papier filtre(cellulose), comme succdan du tissu des feuilles. Il saperut alors que le papier captait lateinte et quen ajoutant de lthanol au mlange on pouvait r-extraire ces mmes pigments.En prolongement de ce travail, il dcida de faire des essais systmatiques avec toutes sortesde poudres dont il pouvait disposer. Pour gagner du temps, il avait ralis un montage quilui permettait de faire plusieurs essais simultanment.

Il plaait les poudres tester dans les tubes et il ajoutait chacun deux une solutiondes pigments dans lther de ptrole. Cela lui permit dobserver que dans certains tubesles poudres laissaient apparatre des anneaux superposs aux couleurs diffrentes, ce quitmoignait que la force de rtention variait avec la nature des pigments prsents. En rin-ant les colonnes avec des solvants diffrents, il put recueillir sparment certains de cesconstituants. La chromatographie moderne tait ne. Cest un peu plus tard, en 1906, quilrdigea la publication (parue dans Ber. Dtsch. Botan., Ges.), dans laquelle il crivit leparagraphe le plus souvent cit : Comme les radiations lumineuses dans le spectre, lesdiffrents composants dun mlange de pigments, obissant une loi, se trouvent sparssur la colonne de carbonate de calcium et peuvent ensuite tre dtermins qualitativementet quantitativement. Jappelle une telle prparation un chromatogramme et la mthode cor-respondante la mthode chromatographique .

Chapitre 1

Chromatographie,aspects gnraux

La chromatographie est une mthode de sparation des constituants prsents dans desmlanges varis. Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des composs au seindchantillons divers. Le principe de base repose sur les quilibres de concentrationqui apparaissent lorsquun compos est mis en prsence de deux phases non miscibles.En chromatographie, lune, dite stationnaire, est emprisonne dans une colonne ou fixe surun support et lautre, dite mobile, se dplace au contact de la premire. Si plusieurs compo-ss sont prsents, ils se trouvent entrans des vitesses diffrentes, provoquant leur spara-tion. Ce procd hydrodynamique a donn naissance une mthode analytique instrumen-tale qui a un trs grand domaine dapplicabilit et par suite se trouve trs rpandue. Aucunlaboratoire analysant des composs molculaires ne peut ignorer la chromatographie.

1.1 GNRALITS SUR LA CHROMATOGRAPHIE ANALYTIQUE

La chromatographie est un procd physico-chimique de sparation, au mme titre que ladistillation, la cristallisation ou lextraction fractionne, des constituants dun mlange ho-mogne liquide ou gazeux. Les applications de ce procd sont donc potentiellement trsnombreuses, dautant plus que beaucoup de mlanges htrognes ou sous forme solidepeuvent tre mis en solution par emploi dun solvant (celui-ci apparaissant comme un com-pos supplmentaire).

Lexprience de base en chromatographie peut tre dcrite comme suit (fig. 1.1) :

1. On immobilise dans une colonne un solide finement divis appel phase stationnaire.2. On place au sommet de cette colonne un petit volume de lchantillon sparer.3. On force cet chantillon traverser la colonne de haut en bas au moyen de la phase

mobile afin dentraner ses divers constituants. Si les composs prsents migrent desvitesses diffrentes, ils pourront tre recueillis sparment, chacun en solution dans laphase mobile.

En dehors de cette exploitation de la chromatographie qui perdure depuis son origine, ceprocd est devenu en soi une mthode danalyse lorsquon eut lide de mesurer les tempsde migration des composs dans la colonne pour les identifier. Pour cela il devenait indis-pensable de matriser certains paramtres (dbits, temprature...) et il fallait placer en sortiede colonne un dtecteur pour reprer les changements de composition de la phase mobile.

8 Partie 1 Mthodes sparatives

Cette application de la chromatographie, dont le but nest plus de rcuprer les compossspars mais de mesurer leurs temps de passage dans la colonne sest dveloppe lentement.

Ech.

Ech.

Ech.

PMPM PM

PM

C

a b c d

PS

PS b

b

a

a

c

c

1 2 3...

PS

Figure 1.1 Lexprience de base en chromatographie.a) Les ingrdients ncessaires C, colonne, PS, phase stationnaire, PM, phase mobile etE, chantillon ; b), le dpt de lchantillon ; c) le dbut de llution ; d) la rcuprationdes produits aprs sparation.

Lidentification dun compos par chromatographie correspond une mthode compara-tive.

Pour identifier un compos, dont on ne sait sil sagit de A ou de B, par la mthodechromatographique, on compare son temps de migration ceux des deux composs de rf-rence A et B, ceci, sans changer dappareillage et en se plaant dans les mmes conditionsexprimentales.

Dans une telle exprience de chromatographie analytique, on na pas effectu des spara-tions (il sagit de produits purs) mais simplement repr des temps de migration. Cependantil apparat trois points faibles cette mthode : le procd est assez long de mise en uvre,lidentification nest pas absolue, et le contact physique entre lchantillon et la phase sta-tionnaire peut modifier ses proprits demeure, en particulier les temps de rtention.

Ce procd particulier de fractionnement est n, sous sa forme moderne, au dbut dusicle dernier des travaux du botaniste Michal Tswett qui on attribue galement linven-tion des termes de chromatographie et de chromatogramme.

La technique sest considrablement amliore depuis ses dbuts. On dispose actuelle-ment de chromatographes pilots par des logiciels qui rassemblent autour dune colonneperformante et miniaturise pour pouvoir sparer des micro-quantits dchantillon toutun ensemble daccessoires destins assurer la rptabilit des expriences successives parla matrise parfaite des diffrents paramtres de sparation. Pour des analyses successivesdun mme chantillon, ralises dans des conditions identiques plusieurs heures dinter-valle, les temps de rtention sont reproductibles la seconde prs (fig. 1.2).

Chaque sparation effectue donne lieu un enregistrement particulier appel chromato-gramme, qui correspond au trac des variations de composition de la phase lue au coursdu temps. Pour obtenir ce document particulier, il faut placer lextrmit aval de la colonneun capteur dont il existe un grand nombre de variantes.

1 Chromatographie, aspects gnraux 9

a

alimentationen phase mobile

temps

chromatogramme

dtecteur

b

ou

0

1

1

22 33

Figure 1.2 Principe de lanalyse par chromatographie.Le chromatogramme, passage oblig de toute analyse chromatographique, est obtenu partir des variations en fonction du temps dun signal lectrique envoy par le dtec-teur. Il est soit prsent en temps rel soit en diffr partir des valeurs instantanesmises en mmoire dans un micro-ordinateur. Les logiciels de chromatographie recal-culent ces valeurs pour tre mises au format dsir (a, imprimante). Pendant longtempsil a t obtenu avec un simple enregistreur graphique ou un enregistreur-intgrateur(b). Chromatogramme illustrant la sparation dun mlange de 3 constituants princi-paux. Noter lordre dapparition des pics en correspondance avec la position de chaqueconstituant dans la colonne.

Lidentification dun compos molculaire, partir du chromatogramme, est quelque-fois alatoire. Une manire plus sre consiste associer deux techniques complmentaires.On runit, par exemple, un chromatographe et un second appareil en ligne , tel un spec-tromtre de masse ou un spectromtre infrarouge. Ces mthodes couples, du second ordre(ou bidimensionnelles) permettent de rcuprer deux types dinformations indpendantes(temps de migration et spectre ). On peut alors dterminer avec certitude la compositionde mlanges complexes ou la concentration de certains composs partir de quantits delordre du nanogramme (analyses de confirmation).

1.2 LE CHROMATOGRAMME

Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps dun para-mtre reli la concentration instantane du solut en sortie de colonne (fig. 1.3). Le temps(ou trs rarement le volume dlution) est port en abscisse et lintensit du signal de d-tection en ordonne. La ligne de base correspond au trac obtenu en labsence de composlu. La sparation est complte quand le chromatogramme prsente autant de pics chroma-tographiques revenant la ligne de base quil y a de composs dans le mlange analyser.

Un constituant est caractris par son temps de rtention tR, qui reprsente le tempscoul entre linstant de linjection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maxi-mum du pic qui lui est li. Dans le cas idal tR est indpendant de la quantit injecte.Un constituant non retenu sort de la colonne au temps tM, appel temps mort (1) (dsigngalement par t0).

(1) Les symboles utiliss suivent les recommandations de lIUPAC Pure & Appl. Chem, 65(4), 819, (1993).D

unod

L

aph

otoc

opie

non

auto

ris

ees

tun

dli

t

10 Partie 1 Mthodes sparatives

La diffrence entre le temps de rtention et le temps mort est dsigne par le temps dertention rduit du compos t R.

En analyse quantitative on se contente le plus souvent de bien sparer du mlange leou les constituants doser. Si le signal envoy par le capteur varie linairement avec laconcentration dun compos, il en sera de mme de laire du pic correspondant sur le chro-matogramme.

min

t'R

tM (ou t )0 tR0 temps

a) b)

c)

d)

0,4

0,399

0,242

0,199

0 10 20 30

courbe de Gauss avec 20 et = 1

l'aire comprise entre -2 et +2vaut 95,4% de l'aire totalecomprise entre la courbe etl'axe des x

temps de rtention

0,054

= 2,35

= 4

= 1,7I I

-2 0 1 +2

10

0%

60

,6%

50

%

13,5%

caractristiques du pic idal

comparaison entre un chromatogramme rel et des courbes gaussiennes

x

courbe gaussienne

O

Figure 1.3 Pics chromatographiques.a) Notion de temps de rtention ; b) exemple de trac de la fonction 1.2 ; c) significationdes trois paramtres classiques et rsum des caractristiques dune courbe de Gauss ;d) un exemple de chromatogramme rel qui montre que llution des composs peutconduire des pics qui ressemblent vraiment des courbes gaussiennes.

1 Chromatographie, aspects gnraux 11

1.3 PICS DLUTION GAUSSIENS

Un pic dlution idal, sur un chromatogramme, a le mme aspect que la reprsentationgraphique de la loi Normale de distribution des erreurs alatoires (courbe de Gauss 1.2,cf. 22.3). En conservant les notations classiques, m correspond ici au temps de rtention ets lcart-type du pic dlution (dont le carr symbolise la variance). y reprsente le signal,en fonction du temps x , du dtecteur situ en sortie de colonne (fig. 1.3).

Cest pourquoi, afin de modliser le signal dun pic dlution parfait dun constituant, onse sert de la fonction densit de probabilit (1.2).

y =1

s

2p exp

[ (x m)

2

2 s2

](1.1)

y =12p exp

[ x

2

2

](1.2)

Cette fonction caractrise une courbe paire (maximum pour x = 0, y = 0,399) quipossde deux points dinflexion pour x = 1 (fig. 1.3), dont lordonne est de 0,242 (soit60,6 % de la valeur du maximum) et dont la largeur aux points dinflexion est gale 2s,(s = 1).

En chromatographie, d dsigne la largeur mi-hauteur (d = 2,35 s) et s2 la variance dupic. La largeur la base du pic, appele v est mesure 13,5 % de la hauteur, point o,la courbe tant gaussienne, on a v = 4s par dfinition.

Les chromatogrammes rels sont quelquefois loin de prsenter des pics daspect gaussien.Il y a plusieurs raisons cela. En particulier il se produit une irrgularit de concentrationdans la zone de dpt de la substance en tte de colonne. De plus, la vitesse de la phasemobile est nulle au niveau de la paroi et maximum au centre de la colonne. Lasymtrieobserve dun pic est traduite par deux paramtres appels facteur dasymtrie (Fa) et facteurde trane (Ft ), mesurs 10 % de sa hauteur (pour la signification de a et b, voir figure 1.4) :

Fa =b

a(1.3)

Ft =a + b

2a(1.4)

1.4 MODLE DES PLATEAUX

Depuis un demi-sicle, diffrentes thories visant modliser la chromatographie ont tet continuent tre proposes. Les plus connues sont les approches statistiques (thoriestochastique), le modle des plateaux, et lapproche par la dynamique molculaire.

Pour expliquer le mcanisme de migration et de sparation des composs dans la colonne,le modle le plus ancien, ou modle des plateaux de Craig, est une approche statique, jugeobsolte, mais qui permet de dcrire de manire simple les sparations.

Dun

od

La

phot

ocop

ieno

nau

tori

se

estu

nd

lit

12 Partie 1 Mthodes sparatives

temps temps temps

CM CM CM

isotherme concaveisotherme convexeisotherme linaire

CSCS CS

a b c

100

100

a b

F > 1tF = 1t F < 1tF > 1aF = 1a F < 1a

Figure 1.4 Isothermes de distribution.a) Situation idale correspondant linvariance de lisotherme de concentration ; b) si-tuation dans laquelle la phase stationnaire est sature de ce fait la monte du pic estplus rapide que la descente (facteur de trane plus grand que 1) ; c) situation inverse :le constituant est trop retenu dans la phase stationnaire, le temps de rtention estallong et la monte du pic est plus lente que la descente, qui apparat normale. Pourchaque type de colonne, les fabriquants indiquent quelle est leur capacit limite expri-me en ng/compos, avant dformation du pic. Les situations a, b et c sont illustresavec des chromatogrammes rels en CLHP.

Bien que la chromatographie soit un phnomne continu, on considre dans le modlestatique de Craig, que chaque solut se dplace progressivement en une suite dtapes dis-tinctes. Le processus lmentaire est reprsent par un cycle dadsorption/dsorption. Len-chanement de ces tapes reproduit la migration des fluides dans la colonne, de mme quunfilm de dessins anims donne lillusion du mouvement par un suite dimages fixes. Chaquetape correspond un nouvel tat dquilibre de toute la colonne.

Ces quilibres successifs sont la base de la notion de plateau thorique selon lequella colonne de longueur L est dcoupe en N petits disques fictifs de mme hauteur H ,numrots de 1 n. Pour chacun deux, la concentration du solut dans la phase mobile esten quilibre avec la concentration dans la phase stationnaire de ce solut. chaque nouvelquilibre le solut a progress dun petit disque supplmentaire dans la colonne, appelplateau thorique.

La hauteur quivalente un plateau thorique (HEPT ou H ) vaut donc (1.5) :

H =LN

(1.5)

Cette approche fait appel aux rgles de dveloppement des polynmes pour calculer, auniveau de chaque plateau, les masses rparties entre les deux phases en prsence.

1 Chromatographie, aspects gnraux 13

plateau J-1

plateau J

instant I-1

(I-1, J)

(I-1, J-1)

instant I

(I, J)

(I, J-1)

plateau J+1...

Si on se place linstant I , le plateau Jcontient une masse totale de solut mT quise compose de la quantit m M de ce solutqui vient darriver de la phase mobile duplateau J 1, en quilibre linstant I 1, laquelle sajoute la quantit mS dj pr-sente dans la phase stationnaire du plateauJ linstant I 1.

mT (I , J ) = mM (I 1, J 1) + mS(I 1, J )

En posant que pour chaque plateau mS = K m M et mT = mM + mS , on peut, par uneformule de rcurrence, calculer mT (ainsi que m M et mS). tant donn que, pour chaqueplateau, le solut est en quilibre de concentration entre les deux phases, la masse totale desolut en solution dans le volume de phase mobile VM de la colonne demeure constante,tant que le solut na pas atteint son extrmit. Quant au chromatogramme, il correspond la masse transitant par la phase mobile au (N + 1)e plateau (fig. 1.5) au cours des quilibressuccessifs. Cette thorie a pour dfaut de ne pas tenir compte de la dispersion due ladiffusion des composs dans la colonne.

compos A

compos B

1 100

conce

ntr

atio

ns

(g/m

L)

1

5

10

15

20

25

fractions d'lution

Figure 1.5 Modle des plateaux.Simulation laide dun tableur de llution de deux composs A et B, chromatogra-phis sur une colonne de 30 plateaux (KA= 0,6 ; KB=1,6 ; MA=300 mg ; MB=300 mg).Composition du mlange en sortie de colonne pour les 100 premiers quilibres. Lappli-cation de ce modle montre lvidence une forme de pic non symtrique. Cependant,compte tenu de la diffusion, et comme le nombre dquilibres est trs grand, la courbeprend de plus en plus nettement laspect dune courbe de Gauss.

Le terme de plateau thorique vient dune approche ancienne dcrivant la chromatogra-phie en prenant pour modle la distillation par Martin et Synge (prix Nobel de chimie en1952). Ce terme ancr pour des raisons historiques na pas la signification physique de sonhomonyme servant mesurer les performances dune colonne distiller. Il aurait peut-tret prfrable de le baptiser par exemple du nom de Tswett !D

unod

L

aph

otoc

opie

non

auto

ris

ees

tun

dli

t

14 Partie 1 Mthodes sparatives

Le temps total tR de migration du solut dans la colonne peut tre spar en deux termes :le temps tM pendant lequel il est dissous dans la phase mobile et o il progresse la mmevitesse que celle-ci, et le temps tS pendant lequel il est fix la phase stationnaire et o ilest donc immobile. Entre deux transferts successifs dune phase lautre, on admet que lesconcentrations ont le temps de se rquilibrer.

La chromatographie fait intervenir au moins trois quilibres : solut/phase mobile, so-lut/phase stationnaire et phase mobile/phase stationnaire. Dans une thorie rcente de lachromatographie, on ne parle plus de molcules immobilises par la phase stationnaire maissimplement ralenties lorsquelles passent proximit.

1.5 COEFFICIENT (OU CONSTANTE) DE DISTRIBUTIONDE NERNST (K)

Cest le paramtre physico-chimique de base en chromatographie qui quantifie le rapportde concentration de chaque compos entre les deux phases en prsence.

K =CSCM

=concentration du solut dans la phase stationnaire

concentration du solut dans la phase mobile(1.6)

Les valeurs de K sont trs variables. Elles sont grandes (1 000, par exemple) lorsque laphase mobile est un gaz, et petites (2, par ex.) lorsque les deux phases sont ltat condens.Chaque compos noccupant quun espace limit de la colonne et de plus avec une concen-tration variable, les valeurs vraies de CM et de CS ne sont pas accessibles mais leur rapportest constant.

Chromatographie et thermodynamique. Les relations de la thermodynamique sap-pliquent aux quilibres de distribution ci-dessus. K , (CS/CM ), constante dquilibre rela-tive aux concentrations C du compos en prsence des deux phases mobile (M) et station-naire (S), est calculable partir dexpriences de chromatographie. On peut donc accder,connaissant la temprature de lexprience, la variation dnergie libre standard DG0 decette transformation :

CM CS DG0 = RT ln KSi, en chromatographie en phase gazeuse, par exemple, on dtermine K deux tempra-

tures, il est possible de calculer (en admettant que lenthalpie et lentropie nont pas chang),les variations denthalpie standard DH 0 et dentropie DS0 :

DG0 = DH 0 T DS0

Les valeurs de ces trois paramtres sont ngatives, en accord avec la spontanit de cettetransformation. Il est galement logique que lentropie diminue quand le compos quitte laphase mobile pour se fixer sur la phase stationnaire. De mme lquation de vant Hoff per-met, entre autres, une approche plus rigoureuse de leffet de la temprature sur les temps dertention dun compos. On comprend donc que dans toute tude complte de la chromato-graphie, on fasse appel la thermodynamique classique.

d ln K

d T=

DH

RT 2

1 Chromatographie, aspects gnraux 15

1.6 EFFICACIT DUNE COLONNE

1.6.1 Efficacit thorique (nombre de plateaux thoriques)

mesure que le solut migre dans la colonne, il occupe une zone allant slargissant(fig. 1.6). Cette dispersion linaire sl , repre par la variance s

2l crot avec la distance

parcourue. Lorsque cette distance vaut L , longueur de la colonne, on pose :

s2L = H L (1.7)

En rappel du modle de la thorie des plateaux, cette approche conduit la valeur de lahauteur quivalente un plateau thorique H et au nombre N de plateaux thoriques(N = L/H ).

Donc, pour tout chromatogramme, partir dun pic dlution dun compos, dont onpourra mesurer la variance temporelle s2, on pourra calculer pour le compos en questionlefficacit thorique N (1.8) et en dduire la valeur de H sachant que H = L/N .

N =L2

s2Lou N =

t2Rs2

(1.8)

Ces deux paramtres sont accessibles de manire indirecte partir du pic dlution ducompos. On mesure tR et s dont le rapport mme valeur que celui de L et de sL (1.8).

chromatogramme

luant

dtecteur

sig

na

l

tR0

0

temps t

conc. dans colonne

L

Figure 1.6 Dispersion dun solut dans une colonne et traduction sur le chromatogramme.La courbe de gauche correspond une image isochrone de la concentration du com-pos lu linstant considr, et le chromatogramme de droite, la variation de laconcentration en sortie de colonne en fonction du temps. tR et s sont dans le mmerapport que L et sL. Lefficacit N peut tre calcule partir du chromatogramme en uti-lisant un double dcimtre. Sur le graphe ci-dessus on trouverait environ 100 plateauxthoriques.

Sur le chromatogramme, s reprsente la demi-largeur du pic 60,6 % de sa hauteur et tRle temps de rtention du compos. tR et s doivent tre mesurs dans la mme unit (temps,distances ou volumes couls, si le dbit est constant). Si on exprime s en units de volume(en faisant intervenir le dbit), 4s correspond au volume du pic soit 95 % du composinject. Par suite des proprits de la courbe de Gauss (v = 4s), il en rsulte la formule 1.9.Les pics tant assez souvent dforms la base, cette dernire est rarement employe : onutilise de prfrence la formule quivalente 1.10.

N est un paramtre relatif, puisquil dpend la fois du solut et des conditions op-ratoires suivies. On choisit gnralement un constituant qui apparat en fin ce chromato-

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16 Partie 1 Mthodes sparatives

gramme pour avoir une valeur repre, dfaut de savoir si la colonne permet de russir unesparation donne.

N = 16t2Rv2

(1.9)

N = 5,54t2Rd2

(1.10)

1.6.2 Efficacit relle (nombre de plateaux thoriques effectifs)

Afin de comparer les performances de colonnes de conceptions diffrentes, vis--vis dunmme compos, ctait notamment le cas en CPG lorsquon voulait comparer les perfor-mances dune colonne capillaire et dune colonne remplie on remplace le temps total tRqui figure dans les expressions 1.8 1.10 par le temps de rtention rduit t R qui ne tient pascompte du temps mort tM pass par le compos dans la phase mobile. Les trois prcdentesexpressions deviennent :

Neff =t 2Rs2

(1.11)

Neff = 16t 2Rv2

(1.12)

Neff = 5,54t 2Rd2

(1.13)

On considre actuellement que ces trois dernires relations ne sont plus de grande utilit.

1.6.3 Hauteur de plateau

La hauteur quivalent un plateau thorique H a dj t dfinie (formule 1.5). Ce para-mtre est calcul pour des composs de rfrence car il permet de comparer des colonnesde longueurs diffrentes, bien quil ne sagisse en aucune faon dune constante. Sa valeurdpend du compos choisi et des conditions de lexprience.

En chromatographie gazeuse, on a longtemps utilis une valeur corrige appele hauteurde plateau effectif Heff faisant intervenir lefficacit relle la place de lefficacit thorique.

Le calcul de Heff partir de lefficacit relle utilise lexpression 1.14 :

Heff =L

Neff(1.14)

Hauteur de plateau rduite. En chromatographie dont la phase mobile est un liquideet pour les colonnes dont le remplissage est form de particules sphriques, on rencontreassez souvent la hauteur de plateau rduite, h, qui tient compte du diamtre moyen dm desparticules. On limine en quelque sorte leffet de la taille des particules. Des colonnes pr-sentant le mme rapport (longueur de la colonne)/(diamtre des particules) conduisent desperformances semblables.

h =H

dm=

L

N dm(1.15)

1 Chromatographie, aspects gnraux 17

1.7 GRANDEURS DE RTENTION

1.7.1 Temps de rtention

La dfinition du temps de rtention a t prcdemment donne dans le paragraphe 1.2.

1.7.2 Volume dlution ou volume de rtention VRLe volume dlution (de rtention) VR de chaque solut reprsente le volume de phasemobile ncessaire pour le faire migrer dune extrmit lautre de la colonne. Il correspondsur le chromatogramme au volume de la phase mobile qui sest coul entre linstant delinjection et celui correspondant au maximum du pic. Si le dbit D est stationnaire,

VR = tR D (1.16)Volume dun pic, Vpic. Il correspond au volume de phase mobile dans lequel le compos

est dilu en sortie de colonne. Il vaut par dfinition :

Vpic = vD (1.17)

1.7.3 Volume de la phase mobile dans la colonne (volume mort VM)

Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appel volume mort) VM corres-pond au volume interstitiel accessible. Il peut tre calcul daprs le chromatogramme, condition dintroduire un solut non retenu par la phase stationnaire. On peut lexprimer enfonction de tM et du dbit D :

VM = tM D (1.18)

1.7.4 Volume de la phase stationnaire

Ce volume dsign par VS napparat pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples onle calcule en retranchant du volume total interne de la colonne vide le volume de la phasemobile.

1.7.5 Facteur de rtention k (ou de capacit)

Quand un compos de masse totale mT est introduit dans la colonne, il se rpartit en deuxquantits : mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire. Si on ne change pasles conditions opratoires, ces deux quantits demeurent constantes au cours de sa migrationdans la colonne. Leur rapport, appel facteur de rtention, est indpendant de mT :

k =mSm M

=CS VS

CM VM= K

VSVM

(1.19)

Le facteur de rtention, encore appel facteur de capacit k, est un paramtre trs impor-tant de la chromatographie. Il est dfini en rgime isocratique. Ce nest pas une constante,bien quil ne varie pas avec le dbit ou la longueur de la colonne, car il dpend des condi-tions opratoires. Pour cette raison il est quelque fois dsign par k au lieu de k.

Ce paramtre rend compte de la facult plus ou moins grande de la colonne retenirchaque compos (capacit). Dans la mise au point des sparations on fait en sorte que k nedpasse pas 10, afin de ne pas trop allonger le temps de passage des composs.

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18 Partie 1 Mthodes sparatives

Approche exprimentale du facteur de rtention k

En sappuyant sur le modle de Craig, on imagine que chaque molcule dun compos passealternativement de la phase mobile (o elle progresse la vitesse de celle-ci), la phasestationnaire (o elle est alors immobile). Sa vitesse moyenne de progression dans la colonneest donc dautant plus lente que le cumul des temps passs dans la phase stationnaire est plusgrand.

Si on extrapole maintenant au cas de n molcules semblables de ce compos (lchan-tillon de masse mT ), on admettra qu chaque instant, le rapport du nombre des nS mo-lcules fixes sur la phase stationnaire (masse mS) et des nM molcules prsentes dans laphase mobile (masse mM ), est le mme que celui des temps passs dans chaque phase pourune molcule isole. Les trois rapports suivants ont donc mme valeur :

nSnM

=mSm M

=tStM

= k

Prenons le cas dune molcule qui passe les 3/4 de son temps dans la phase stationnaire.Sa vitesse moyenne sera 4 fois plus lente que si elle restait en permanence dans la phasemobile. Par consquent si 4 mg de compos ont t introduits dans la colonne, il y aura enmoyenne et en permanence 1 mg dans la phase mobile et 3 mg dans la phase stationnaire.

Sachant que le temps de rtention dun compos tR est tel que tR = tM + tS , la valeur dek est donc accessible partir du chromatogramme (tS = t R) (voir figure 1.7) :

k =t RtM

=tR tM

tM(1.20)

Cette relation importante est galement souvent rencontre sous la forme :

tR = tM (1 + k) (1.21)

Compte tenu des relations 1.16 et 1.18, le volume de rtention VR dun solut pourrascrire :

VR = VM (1 + k) (1.22)ou :

VR = VM + K VS (1.23)

Cette dernire expression qui relie les paramtres exprimentaux au coefficient thermo-dynamique de distribution K est valable pour une chromatographie idale.

1.8 FACTEUR DE SPARATION (OU SLECTIVIT)ENTRE DEUX SOLUTS

Le facteur de sparation a (1.24) permet de prciser les positions relatives de deux picsadjacents 1 et 2 sur un chromatogramme (fig. 1.7). Il est dfini par les relations suivantes(1.24 et 1.25). Il ne peut, par dfinition, tre infrieur 1 :

a =t R(2)t R(1)

(1.24)

1 Chromatographie, aspects gnraux 19

ou

a =k2k1

=K2K1

(1.25)

tM (ou t )0tR1 tR20 temps

ici, on a :

= = 1,3t'R2t'R1

k =1t'R1tM

k = 42

k = 3,081

k =2t'R2tM

1

2t'R2

t'R1

tM

Figure 1.7 Facteurs de rtention et de sparation entre deux composs adjacents.Chaque compos a un facteur de rtention qui lui est propre. a lui seul, ne permetpas de savoir si la sparation est rellement possible. Sur cette figure, le facteur desparation est denviron 1,3.

Pour des pics non adjacents, on dfinit le facteur de rtention relative r , qui, calculcomme a, ne peut tre infrieur 1.

1.9 FACTEUR DE RSOLUTION ENTRE DEUX PICS

Pour traduire numriquement la plus ou moins bonne sparation entre deux composs, onutilise le facteur de rsolution R qui est calcul partir du chromatogramme (fig. 1.8) :

R = 2tR(2) tR(1)

v1 + v2(1.26)

Il existe, pour exprimer la rsolution, dautres relations drives des prcdentes, tabliesen vue de remplacer un paramtre par un autre, ou admettant des hypothses simplificatrices.Ainsi les deux expressions 1.27 et 1.28 sont-elles trs souvent employes.

La relation 1.28 montre linfluence, sur la rsolution, de lefficacit, du facteur de capacitet de la slectivit. La figure 1.9 en est une vrification exprimentale.

R = 1,177tR(2) tR(1)

d1 + d2(1.27)

R =1

4

N2

a 1a k21 + k2

(1.28)

R =

N

2 k2 k1

k1 + k2 + 2(1.29)

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20 Partie 1 Mthodes sparatives

0,27

0,02

0,65

R = 0,75 R = 1 R = 1,5

1 1 1

Figure 1.8 Facteur de rsolution.Simulation de pics chromatographiques par juxtaposition plus ou moins rapprochede 2 courbes gaussiennes identiques. Aspect visuel correspondant aux valeurs de Rindiques sur les diagrammes. partir de R = 1,5 on considre que les pics sont rsolus,la valle entre les pics tant denviron 2 %.

R = 4,15

0 5 10 15 20 min

15,3 min

7,5 min

R = 2,91

3,7 min

R = 2,05

15 m

30 m

60 m

Figure 1.9 Effet de la longueur de la colonne sur la rsolution.Expriences faites en chromatographie en phase gazeuse en modifiant seulement la lon-gueur de la colonne capillaire On illustre ainsi quen doublant la longueur de la colonnela rsolution est multiplie par 1,41 (adapt dun document de la socit Waters).

1.10 INFLUENCE DE LA VITESSE DE LA PHASE MOBILE

Dans tout ce qui prcde, en particulier dans les diffrentes expressions caractrisant lessparations, la vitesse de la phase mobile dans la colonne nest pas prise en compte. Or, detoute vidence, cette vitesse doit avoir une incidence sur la progression des analytes dans lacolonne, donc sur leur dispersion, en bref sur la qualit de lanalyse en cours.

Linfluence de la vitesse de la phase mobile a t mise en vidence par Van Deemter quia propos la premire quation cintique, dans le cas des colonnes remplies en chromato-graphie en phase gazeuse.

1 Chromatographie, aspects gnraux 21

1.10.1 quation de Van Deemter

La forme simplifie, propose par cet auteur en 1956, est trs connue en chromatographie enphase gazeuse, pour les colonnes remplies (1.30). Elle relie H (HEPT) la vitesse linairemoyenne dcoulement de la phase mobile u dans la colonne (fig. 1.10) :

H = A +Bu

+ C u (1.30)

Cette quation montre quil existe un dbit optimal pour chaque colonne, correspondantau minimum de H , tel que le prvoit la courbe reprsentant lquation 1.30. La diminutionde lefficacit, quand le dbit crot, correspond un rsultat que chacun a pu dcouvrir sesdpens en voulant acclrer une sparation chromatographique par augmentation du dbitde la phase mobile. Ce qui est moins intuitif par contre, est la perte defficacit due undbit trop lent. Pour expliquer ce phnomne, il faut revenir sur lorigine des termes A, Bet C dont chacun a un domaine dinfluence qui peut tre repr sur le graphe (fig. 1.10).

Les trois coefficients numriques exprimentaux A, B et C sont relis divers paramtresphysico-chimiques, la colonne et aux conditions opratoires. Si on choisit dexprimer Hen cm, A sera en cm, B en cm2/s et C en s (la vitesse tant en cm/s). La courbe reprsentativede cette fonction est une branche dhyperbole qui passe par un minimum (Hmin) pour :

uopt. =

BC

(1.31)

A, terme de remplissage A = 2 lll dpLe terme A est en relation avec le profil dcoulement de la phase mobile travers la phasestationnaire. La taille des particules (de diamtre dp), leur rpartition dimensionnelle etla rgularit du remplissage (paramtre l) sont lorigine de chemins prfrentiels quipeuvent conduire des changes imparfaits entre les deux phases. Cest le facteur de diffu-sion dEddy, ou diffusion turbulente, considr comme peu important en chromatographieliquide et absent par nature pour les colonnes capillaires WCOT en CPG (quation de Golaysans terme A, cf. 1.10.2).

B, terme de diffusion dans la phase mobile B = 2ggg DGLe second terme B, qui peut tre exprim partir de DG , coefficient de diffusion de lana-lyte dans la phase mobile et g, facteur de tortuosit, est considrer surtout si la phasemobile est un gaz. La diffusion longitudinale dans la colonne est, en effet, rapide. Cest uneconsquence de lentropie qui nous rappelle quun systme volue spontanment vers unplus grand dsordre, telle la goutte dencre qui diffuse dans le verre deau o elle vient detomber. En consquence, si le dbit est trop faible, les produits en cours de sparation semlangent nouveau plus vite quils ne migrent. On retiendra ce propos quon ne doitjamais interrompre provisoirement une chromatographie en cours, au risque de perdre touteefficacit.

C, terme de transfert de masse C = CG + CLLe terme C , d la rsistance au transfert de masse du solut entre les deux phases, de-vient prpondrant lorsque le passage est trop rapide pour que lquilibre soit atteint. Des

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22 Partie 1 Mthodes sparatives

turbulences locales au sein de la phase mobile et des gradients de concentration ont pourconsquence de retarder la mise en quilibre (CS CM ). La diffusion entre les deux phasesnest pas instantane, si bien que le solut sera entran hors quilibre. Il nexiste pas de for-mule simple rendant compte des diffrents facteurs intgrs dans le paramtre C . Le termeCG dpend du coefficient de diffusion du solut dans la phase mobile gazeuse, alors que leparamtre CL dpend du coefficient de diffusion dans la phase stationnaire liquide.

A, terme de remplissage

B longitudinale, terme de diffusion

C, terme de transfert de masse

0 20 40 60 80 100 cm/s.

Hm

in.

H (HEPT) m

H = A+ Cu

0

2

4

6

8

10

12

14

colonne

uopt. u moyenne

C

A

B

HA

H = H + H + HA B C

HB

HC

phasemobile

B

C

Figure 1.10 Courbe de Van Deemter en chromatographie gazeuseavec indication des domaines propres A, B et C. Il existe galement une quation semblable celle de

Van Deemter qui fait intervenir cette fois la temprature : H = A + B/T + C T.

Dans la pratique on accde aux valeurs des coefficients A, B, C , en faisant plusieurs me-sures defficacit pour un mme compos chromatographi des dbits diffrents, puisquedbit et vitesse linaire moyenne sont relis. On calcule ensuite lquation de lhyperbolequi satisfait au mieux les valeurs exprimentales, de prfrence par la mthode de rgres-sion linaire multiple.

1.10.2 quation de Golay

En 1958, Golay a propos une quation comparable rserve aux seules colonnes capillairesde la chromatographie en phase gazeuse.

H =Bu

+ CL u + CG u (1.32)

La relation 1.32 permet dtablir une HEPT minimum pour toute colonne de rayon r silon connat le facteur de rtention du compos test.

On peut calculer alors lefficacit dimprgnation (coating efficiency) de la colonne quiest gale au produit par 100 du rapport de la valeur ainsi trouve et de celle qui est dduitede lefficacit (H = L/N ) obtenue partir du chromatogramme.

Hmin. tho. = r

1 + 6 k + 11 k2

3(1 + k)2(1.33)

1 Chromatographie, aspects gnraux 23

1.10.3 quation de Knox

Une autre quation connue sous le nom dquation de Knox plus rcente (1977), est ap-plicable aux divers types de chromatographie liquide. Elle fait intervenir la hauteur rduite :

h = A u1/3 +Bu

+ C u (1.34)

1.11 OPTIMISATION DUNE ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE

La chromatographie analytique est essentiellement utilise en analyse quantitative. cettefin, il faut pouvoir dterminer les aires des pics des espces doser, donc les sparer. Poury parvenir on fait de plus en plus souvent appel des logiciels doptimisation bass sur laconnaissance du processus chromatographique. Cest ltape de loptimisation de lanalysequi met profit les connaissances de lanalyste et les ressources de lappareil pour simulerles rsultats attendre des modifications de la composition de la phase mobile et dautresparamtres physico-chimiques tels la temprature ou le pH dans le cas de substances ioni-sables.

En chromatographie en phase gazeuse, les sparations peuvent tre si complexes quonne peut dterminer par avance sil est prfrable de baisser ou dlever la temprature. Lechoix de la colonne, de sa longueur, de son diamtre, de la phase stationnaire, du rapport dephase ainsi que des paramtres de sparation (temprature et dbit), sont autant de facteursqui interagissent les uns sur les autres.

La rsolution et le temps dlution sont les deux variables dpendantes les plus impor-tantes considrer. Dans toute optimisation, le but est de russir une sparation suffisantedu ou des composs intressants en un minimum de temps. Dans certains cas, il ne faut tou-tefois pas oublier le temps ncessaire la colonne pour revenir aux conditions initiales avantdeffectuer lanalyse suivante. La chromatographie correspond en effet un type danalyselente. Si la rsolution est trs bonne, loptimisation aura encore sa raison dtre pour gagnerdu temps en utilisant une colonne plus courte sachant que la rsolution est affecte dunfacteur faisant intervenir la racine carre de la longueur de la colonne (cf. le paramtre Nde la formule 1.28 et la figure 1.9).

Quand on modifie le dbit dans une sparation avec gradient on observe des change-ments importants sur le chromatogramme. La slectivit entre pics est perturbe, comme lesont bien sr les temps de rtention. La figure 1.11 illustre par un exemple loptimisationdune sparation, en chromatographie liquide, dun mlange dhydrocarbures aromatiquespar modification de la composition de la phase mobile. On remarquera que cette optimi-sation saccompagne dune augmentation importante du temps danalyse pour boucler lecycle .

Si on ne sintresse qu certains des composs prsents, on peut faire appel un dtec-teur slectif qui ne verra, la limite, queux seuls. Dans dautres cas, par contre, on sattache sparer le plus grand nombre possible de composs du mlange initial.

Suivant les types de chromatographie, loptimisation est plus ou moins rapide. En chro-matographie en phase gazeuse elle est plus facile quen chromatographie liquide o inter-vient la composition de la phase mobile : des logiciels ont t spcialement crs pour aider

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24 Partie 1 Mthodes sparatives

910 2 3 4 5 6 7 8

2 6410 53 8 100 2 1612 144 6min

0 41 2 3 min

a

b

c

d

Figure 1.11 Chromatogrammes dune sparation.La phase mobile est un mlange binaire eau/actonitrile : a) 50/50 ; b) 55/45 ; c) 60/40 ;d) 6/35. La flche indique le temps mort tM (min), (selon J.W. Dolan, LC-GC Int, 1994,7(6), 333).

au meilleur choix de la composition de la phase mobile. Moyennant certaines hypothses(pics gaussiens ou non), on peut calculer avec assez de prcision les aires des pics malrsolus.

Le chromatographiste est toujours prisonnier dun triangle dont les sommets corres-pondent la rsolution, la vitesse et la capacit, trois paramtres qui sopposent(fig. 1.12). Une chromatographie analytique optimise utilise plein le potentiel du para-mtre le plus efficace : la slectivit. Dans ce triangle elle se situe donc prs du sommetrsolution.

rsolution

capacit vitesse

1

2 3

Figure 1.12 Le triangle des chromatographistes.La zone ombre indique le domaine qui correspond la chromatographie analytique.Celle-ci tire profit des 5 paramtres : K, N, k, a et R.

1.12 LES DIVERSES TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

Les techniques chromatographiques peuvent tre rparties suivant plusieurs critres : enfonction de la nature des deux phases en prsence, ou du procd utilis, ou du phnomnephysico-chimique responsable du coefficient de distribution K vu prcdemment (fig. 1.6).

Le classement suivi ci-aprs est tabli partir de la nature physique des phases (fig. 1.13).

1 Chromatographie, aspects gnraux 25

hydrosoluble

ionique

CEI

CLHPappariement d'ions

CLHPphase normale

CLHPphase normale

CLHPphase normale

CLHPphase inverse

CLHPphase inverse

CLHPphase inverse

CLHPphase inverse

nonionique

polaire

M 2000

organosoluble

ECHANTILLON CES

filtration sur gel

CESpermation de gel

Figure 1.13 Guide de slection se rapportantaux diffrentes techniques chromatographiques utilisant une phase mobile liquide.On choisira en fonction de la sparation effectuer, la technique la mieux adapte.

1.12.1 Chromatographie en phase liquide (CPL)

Ici la phase mobile est un liquide. Cest ce type de chromatographie auquel appartient laforme la plus anciennement connue en tant que mthode prparative de sparation. Cettecatgorie trs rpandue peut tre subdivise daprs le phnomne mis en jeu :

Chromatographie liquide/solide (ou dadsorption). La phase stationnaire est un milieusolide permable sur lequel les molcules adhrent par un double effet de physisorption et dechimisorption. Le paramtre physico-chimique concern est le coefficient dadsorption. Lesphases stationnaires ont fait beaucoup de progrs depuis Tswett, qui utilisait le carbonatede calcium ou linuline (un polymre en poudre trs fine du sucre ordinaire).

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26 Partie 1 Mthodes sparatives

Chromatographie ionique. La phase stationnaire solide comporte en surface des sites io-niques et la phase mobile est une solution-tampon aqueuse. La sparation met en jeu deschanges entre les ions de lchantillon avec ceux de la phase stationnaire. La sparationrepose sur les coefficients de distribution ionique .

Chromatographie dexclusion. La phase stationnaire est un matriau comportant despores dont les dimensions sont choisies en rapport avec la taille des espces sparer.On ralise ainsi une sorte de permation slective lchelle molculaire. Selon la nature,aqueuse ou organique de la phase mobile, cette technique est dsigne par filtration sur gelou permation de gel. Le coefficient de distribution prend le nom de coefficient de diffusion.

Chromatographie liquide/liquide ou de partage (CLL). La phase stationnaire est un li-quide immobilis sur un matriau inerte et poreux qui na quun rle de support. Limpr-gnation, le procd le plus ancien pour immobiliser un liquide, est une voie maintenantabandonne, par suite dun risque important de lessivage de la colonne.

Chromatographie liquide/phase greffe. Pour immobiliser la phase stationnaire (il sagitgnralement dun polymre de type liquide), on fixe de manire dfinitive les espces qui lacomposent par des liaisons covalentes : cest la technique du greffage. La sparation reposesur le coefficient de partage K du solut entre les deux phases, un phnomne comparable lextraction dune phase aqueuse avec un solvant dans une ampoule dcanter.

1.12.2 Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

La phase mobile est un gaz inerte et, comme prcdemment, ce type de chromatographiepeut tre subdivis selon le phnomne mis en uvre :

Chromatographie gaz/liquide (CGL). La phase mobile est un gaz et la phase stationnaireest un liquide immobilis soit par imprgnation, soit par greffage sur un support inerte lequelpeut tre tout simplement la paroi de la colonne. dfaut dtre un gaz, lchantillon doitdonc tre port ltat de vapeur. Ce sont Martin et Synge qui ont suggr le remplacementde la phase mobile liquide par un gaz afin damliorer les sparations. Cest partir de cettepoque quon assista au vritable dmarrage de la chromatographie analytique. Ici encorecest le coefficient de partage K qui est concern.

Chromatographie gaz/solide (CGS). La phase stationnaire est un solide poreux (carbonegraphite ou gel de silice ou alumine) et la phase mobile est un gaz. Ce type de CPG est trsperformant pour les analyses de mlanges de gaz ou de composs bas point dbullition.Le paramtre concern est le coefficient dadsorption.

1.12.3 Chromatographie en phase supercritique

La phase mobile est un fluide ltat supercritique, tel le dioxyde de carbone vers 50 Cet 150 bars (15 MPa). La phase stationnaire peut tre un liquide ou un solide. On runitainsi les avantages propres aux techniques prcdentes (gaz/phase greffe ou liquide/phasegreffe).

1 Chromatographie, aspects gnraux 27

ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE

Le dveloppement considrable pris par la chromatographie en analyse quantitative est dessentiellement sa fiabilit et sa prcision. La relation entre la masse injecte de lana-lyte dans la colonne et laire du pic correspondant sur le chromatogramme conduit unemthode comparative, utilise dans beaucoup de protocoles normaliss de dosages. La re-productibilit des sparations allie des logiciels de traitement de donnes permet dauto-matiser les tches de calcul associes ces analyses. Les dosages de traces et dultratracespar chromatographie sont reconnus en particulier dans les mthodes EPA de lenvironne-ment, bien que leur prix de revient soit assez lev. Les trois mthodes les plus utilises sontdcrites ci-aprs dans leur configuration la plus simple.

1.13 PRINCIPE ET RELATION DE BASE

Pour calculer la concentration massique dun compos responsable dun pic sur le chroma-togramme il faut runir deux conditions : disposer dun chantillon authentique du composque lon veut doser, usage de rfrence, pour dterminer la sensibilit du dtecteur songard, et disposer dun moyen logiciel ou autre pour connatre soit les hauteurs soit les airesdes diffrents pics dlution dintrt. Toutes les mthodes de quantification en chromato-graphie sont donc des mthodes comparatives et non pas absolues.

Pour un rglage donn de lappareil, on admet quil existe pour chaque pic du chroma-togramme une relation linaire entre son aire (ou sa hauteur) et la quantit du composresponsable de ce pic dans lchantillon inject. Cette relation est valable pour une plage deconcentrations qui dpend du dtecteur employ. On traduit cette hypothse par :

mi = Ki Ai (1.35)

mi masse du compos i injecte dans la colonneKi coefficient de rponse absolu du compos iAi aire du pic dlution du compos i

Le coefficient absolu Ki ( ne pas confondre avec le coefficient de partition), dpend durglage du chromatographe. Ce nest pas un paramtre intrinsque du compos.

Pour calculer le coefficient Ki dun compos i , il faut, daprs cette relation, connatrelaire Ai et la masse mi traversant la colonne. Or cette masse est difficile dterminer avecprcision, car elle dpend la fois de la seringue et de linjecteur (en CPG) ou de la boucledinjection (en CPL). Cest pourquoi les mthodes utilises en analyse quantitative, prpro-grammes dans les enregistreurs-intgrateurs ou logiciels divers, vitent de faire intervenirles coefficients de rponse absolus Ki .

1.14 AIRES DES PICS ET LOGICIELS DE CHROMATOGRAPHIE

Pour dterminer les aires des pics, on utilise les fonctions spcialement prvues des logicielsde chromatographie, qui assurent non seulement le pilotage du chromatographe, mais qui

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28 Partie 1 Mthodes sparatives

peuvent, en plus de lacquisition des chromatogrammes, analyser les donnes, quantifieret fournir le rapport danalyse correspondant lune des mthodes danalyse quantitativeprprogrammes (fig. 1.14).

Le signal analogique rcupr au niveau du dtecteur est chantillonn par un circuitADC, au rythme dune centaine de fois par seconde afin de pouvoir reproduire correctementles pics les plus fins des chromatogrammes obtenus notamment en CPG avec les colonnescapillaires. Tous les logiciels permettent deffectuer des corrections de ligne de base, deprendre en compte les pics ngatifs et de choisir une mthode dintgration pour les pics.

La mthode manuelle de calcul de la surface dun pic par triangulation nest plus em-ploye. Il est utile cependant de savoir que pour un pic gaussien, le produit de sa largeur mi-hauteur par sa hauteur, correspond environ 94 % de la surface totale du pic. De mmelusage dun enregistreur-intgrateur pour mesurer laire des pics nest plus gure employ.

Figure 1.14 Un logiciel danalyse quantitative en chromatographie.Le signal du dtecteur ntant pas numris la sortie du chromatographe, sa conver-sion analogique/numrique est assure lentre du micro-ordinateur. Le chromato-gramme, mmoris sous forme de nombres sert de base lexploitation par le logiciel.Diffrentes fentres de travail affichent aires, droite dtalonnage, type de mthode etc.(Logiciel Chem-station de la socit Agilent Technologies).

1.15 MTHODE DE LTALONNAGE EXTERNE

Cette mthode permet de calculer la teneur (en termes de concentration ou de pourcen-tage massique) dun ou plusieurs constituants apparaissant spars sur le chromatogramme,

1 Chromatographie, aspects gnraux 29

mme en prsence dautres composs donnant des pics non rsolus. Facile de mise enuvre, elle correspond lapplication dun principe commun beaucoup de dosages.

Le procd repose sur la comparaison de deux chromatogrammes obtenus successive-ment sans changer les conditions de rglage de lappareil (fig. 1.15). Le premier est unchromatogramme de rfrence acquis partir dune solution de rfrence (conc. Crf) dansun solvant, du compos qui fait lobjet du dosage. On injecte un volume V de cette solu-tion et on repre sur le chromatogramme laire Arf du pic correspondant. Le second rsultede linjection dun volume identique V de lchantillon en solution, contenant le compos doser (conc. Cch). Soit Ach laire du pic correspondant. Puisque les volumes injectssont gaux, il y a proportionnalit entre les aires, qui dpendent des masses injectes, et lesconcentrations correspondantes (mi = Ci V ). La relation 1.35 applique aux deux chroma-togrammes conduit la relation 1.36 caractristique de cette mthode :

mrf = Crf V = K Arf et mch = Cch V = K Achsoit :

Cch = CrfAchArf

(1.36)

chromatogramme d'talonnage (C )rf.

pic

solv

ant

pic

solv

ant

Ach.Arf.

chromatogramme de la solution doser (C )ch.

0 0

Figure 1.15 Mthode de dosage par talonnage externe.La prcision de cette mthode est amliore lorsquon utilise plusieurs solutions afinde tracer la droite dtalonnage. Pour lanalyse de traces, il est parfois conseill, enchromatographie liquide, de remplacer les aires des pics par leurs hauteurs qui sontmoins sensibles aux variations de dbit de la phase mobile.

Ltalonnage est possible, comme ici sur la figure 1.15, avec un seul point de mesure (la droite dtalonnage passe donc par lorigine). La prcision sera meilleure si les concen-tra