RAPPORT DE STAGE Assistante en organisation d’évènements

Mars 2016 – Octobre 2016

DUPONT MARIE Master Communication – D2P3

Enseignant référant : M.CAMILERIE

Superviseur de stage : Mme CASTEL

Entreprise d’accueil : SWIFT Ltd

Etablissement : Université Toulouse Capitole 1, 31000 Toulouse

Analyse de la répartition de bactéries codant le système dedétoxication TPMT (Thiopurine-S-méthyltransférase) en fonction dela présence de médicaments et des résistances conférées parl’expression de l’enzyme

Février- Juillet2018

BOUCHALIRayanMaster2IMHE– HMBA403

Directeurdestage:COURNOYERBenoit(Benoit.Cournoyer@vetagro-sup.fr)

Co-encadrants:EmilieBOURGEOISBenjaminYOUENOU

Laboratoired’accueil:UMRd’écologiemicrobienne– équipeBPOE

SamuelLacaille (slacaille@grandlyon.com)

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Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de stage, Monsieur Cournoyer Benoit

pour m’avoir accueilli dans son laboratoire, mais aussi pour son encadrement et ses conseils

précieux. Merci d’avoir été disponible pour répondre à mes questions et mes besoins à

n’importe quel moment. Je remercie également Monsieur Samuel Lacaille de m’avoir accueilli

au sein de son équipe ainsi que pour avoir encadrer ma formation. Merci à l’équiper d’égoutiers

de la ville de Lyon de m’avoir accueilli sur le terrain et de m’avoir expliqué leurs différentes

fonctions.

Je remercie aussi mes deux co-encadrants, Benjamin Youenou et Emilie Bourgeois,

pour m’avoir formé tout au long de mon stage et avoir répondu à toutes mes questions et pour

les discussions scientifiques ou non. Merci aux collaborateurs Jérome Labanowski (Univ.

Poitiers, UMR 7285) et Agnès Bouchez (INRA Thonon) qui ont rendu disponibles les jeux de

données physico-chimiques et de dosage de médicaments. Merci également pour votre

gentillesse et votre bonne humeur précieuse tout au long de mon stage. Merci également à

Sébastien Ribun et Laurence Marjolet pour leurs contributions dans l’acquisition et l’analyse

des données NGS, mais aussi pour tous leurs conseils techniques au laboratoire et leur

sympathie. Merci à Sylvie Elsen (CEA Grenoble, UMR 1036) pour m’avoir fourni les

constructions de P. aeruginosa PAO1.

Je remercie également toute l’équipe BPOE de m’avoir accueilli amicalement, mais

aussi pour l’ambiance qui régnait au sein du laboratoire.

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Liste des abréviations utilisées

TPMT : Thiopurine Méthyltransferase

bTPMT : Thiopurine Méthyltransferase bactérienne

hTPMT : Thiopurine Méthyltransferase humaine

6-MP : 6-mercaptopurine

ADN : Acide Désoxyribonucléique

ARN : Acide Ribonucléique

ARNm : Acide Ribonucléique messagers

HGPRT : Hypoxanthine Phosphoribosylguanine transférase

PCR : Polymerase Chain Reaction

Se : Sélénium

Te : Tellurium

S : Soufre

DMTe : di-méthylTelluride

DMDTe : di-méthyldiTelluride

DMS : di-méthylSulfur

DMDS : di-méthyldiSulfur

H2S : Sulfure d’Hydrogène

NGS : New Generation Sequencing

Pb : Paire de bases

OTUs : Unité Taxonomique Opérationnelle

°C : Degrés Celsius

tpm : tour par minutes

mL : milliLitre

µL : microLitre

mM : milliMolaire

M : Molaire

ng : nanogramme

V : Volt

min : minute

UV : Ultra-Violets

LB : Luria-Bertani

BET : Bromure d’éthidium

nm : nanométre

CFU : Unité Formant Colonie

Step : Station D’épuration

CMI : Concentration minimales inhibitrice

EU : Eau usées

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1. Introduction 1.1. Les risques liés au métier d’égoutier

Les égoutiers (ou agents d’assainissement) entretiennent et nettoient les canalisations ou transitent les

eaux usées (de différentes provenances, urbaines, hospitalières, industrielles …) de la source jusqu’à la

station d’épuration. Cela inclut les stations de relèvement et de pompage. De nombreuses études font

état d’une baisse significative de l’espérance de vie des personnes exerçant le métier d’égoutiers (jusqu’à

17 ans de moins que le reste de la population). En effet, une étude menée à Paris (sur une cohorte de

1182 sujets, actifs ou à la retraite) indique que la population d’égoutiers montre une surmortalité de 56%

(et jusqu’à 97% pour les tranches d’âge inférieures à 65 ans) par rapport à une population de référence

(Rapport d’étude INRS, 2004). Cette diminution de la durée de vie est très importante et il convient de

déterminer quels sont les facteurs clés pouvant l’expliquer. Les études épidémiologiques montrent que

certaines maladies affectent particulièrement les égoutiers, comme les cancers du foie (+85%, liés ou

non à la consommation d’alcool), de l’œsophage ou du poumon (+47%). Tous confondus, les cancers

présentent un excès de 82% chez la population d’égoutiers. Il existe aussi une forte prévalence de

maladies non malignes telles que des maladies cardiaques ou vasculaires, digestives (ulcère,

pancréatites), respiratoires (asthme, bronchopneumopathie), endocrinienne ou génito-urinaire. Il est à

noter que la population d’égoutiers montre un fort taux de morts violentes (suicides), pouvant être lié

aux conditions de stress et d’insalubrité, et est souvent affectée par des toux grasses et des diarrhées. La

prévalence de toutes ces maladies chez les égoutiers est supérieure à celle observées chez la population

de référence. Ces maladies peuvent s’expliquer par les conditions de travail mais aussi par l’exposition

des travailleurs à divers facteurs comme des polluants chimiques, des toxines ou des agents infectieux

présents dans les eaux usées.

Les toux grasses peuvent être dues à la présence d’endotoxines bactériennes (les lipopolysaccharides

(LPS) présents à la surface des membranes des bactéries Gram négatif) pouvant être projetées dans l’air

sous forme d’aérosols lors des curages (nettoyage à haute pression des réseaux d’eaux usées). La relation

entre symptômes respiratoires et endotoxine a déjà pu être mise en évidence (Smit et al., 2008). Ces

endotoxines sont à l’origine du syndrome des égoutiers, un état pseudo-grippal (fièvre, troubles

gastriques, frissons …). La forte prévalence de diarrhées n’est quant à elle toujours pas expliquée, mais

elles peuvent être dues à la présence de composés chimiques, de toxines, ou de micro-organismes

(bactéries, parasites …). La diversité microbienne présente dans les réseaux d’eaux usées demeurent

mal connues mais des études commencent à s’y intéresser. Certaines montrent qu’il est possible de

retrouver des bactéries pathogènes stricts des genres Salmonella, Shigella ou Campylobacter (Mara and

Horan, 2003). Certains agents pathogènes opportunistes comme Pseudomonas aeruginosa ou

Aeromonas caviae (Wheater et al., 1980 ; Monfort and Baleux, 1990) sont égalment détectés. La

présence de toxine bactérienne ou mycotoxine peut conduire à des allergies et de l’asthme. Des virus

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peuvent également être présents dans ces milieux, principalement de la famille des adénovirus et des

norovirus, (pharyngites, pneumonies, conjonctivites) et des virus parainfluenzae (bronchiolite,

trachéites), ou des virus de l’hépatite A pouvant être responsables d’infections chez les égoutiers

(Montuori et al., 2009). Les taux d’anticorps anti-adénovirus et anti-parainfluenzae virus sont plus

élevés chez les travailleurs en contact avec les eaux usées, suggérant un contact étroit avec ces virus

(Altemyer et al, 1990). La présence de parasites dans les eaux usées a aussi été montrée, comme Giardia

intestinalis, causant de fortes diarrhées (Wallis et al., 1996).

En plus des différents agents microbiens pouvant causer plusieurs types de pathologies, les réseaux

d’eaux usées contiennent une grande diversité de polluants chimiques. Les propriétés et les

concentrations de ces polluants varient en fonction de l’origine des eaux usées (hôpital, industrie, zone

résidentielle …). Des études montrent que les eaux usées sont fortement contaminées par des polluants

chimiques dont certains peuvent avoir un impact sur la santé humaine (Harrison et al., 2006). Ainsi, les

eaux usées peuvent contenir des éléments traces métalliques toxiques (arsenic, cadmium, chrome,

cuivre, nickel, plomb, mercure …) ou des polluants organiques (pesticides, PCB, dioxines …). Chez

l’homme, les métaux lourds se stockent au niveau des os, du foie, des reins et du cerveau. Ils peuvent

induire des dysfonctions rénales, hépatiques, respiratoires, et certains métaux lourds montrent des effets

cancérigènes, tout comme certains pesticides (J.O. et al., 2007). Les PCB, à court terme, vont entrainer

des effets cutanés, oculaires et pulmonaires. Une exposition chronique des effets neuro-

comportementaux ont déjà pu être observés. Une exposition aux dioxines conduira à long termes à une

dégradation du système immunitaire, du système nerveux, du systèmes endocriniens et reproducteur

(Schantz, 1996). Ces molécules sont également cancérigènes. Il est à noter que, même à de faibles doses,

l’espace confiné que représente les canalisations concentrent les polluants, augmentant ainsi leurs effets

toxiques pour l’égoutier. De plus, les effets des cocktails de polluants sur la santé humaine ne sont pas

connus et demeurent peu étudiés. Ces molécules chimiques peuvent être à l’origine du nombre important

de cancers observé chez les égoutiers. En plus de ces polluants chimiques provenant d’une utilisation

par l’homme, on peut retrouver des molécules naturelles cancérogènes, comme les aflatoxines (produite

par des champignons). De plus, bon nombre de canalisations du réseau de la ville de Lyon sont

constituées d’amiantes. Il existe également un risque lié à la présence d’amiante. En effet, certaines

canalisations contiennent cette molécule toxique. Les égoutiers, en effectuant leurs tâches (se déplacer

dans le noir, les curages …), mettent en suspension dans l’air de grande quantité d’amiante. Cette

molécule peut déclencher l’amiantose, une maladie respiratoire, mais peut aussi être cancérigène et

favoriser le cancer du poumon (Hogdson and Darnton, 2000).

En dehors des risques infectieux/chimiques, les agents peuvent souffrir de troubles musculo-

squelettiques (TMS), une maladie professionnelle qui regroupent plusieurs troubles affectant les

muscles, les tendons ou les nerfs (Carayon et al., 1999). C’est la maladie professionnelle la plus

répandue dans les pays développés, notamment en France. Elle se caractérise par des douleurs, raideurs,

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maladresses et une diminution de la force. Ces troubles sont dus à la position prise par les agents dans

les réseaux d’eau usées (diamètres des réseaux visitables : 1 à plus de 1,50 mètres, les agents doivent

progresser le dos courbé), mais sont aussi dus à la manipulation d’objets lourd (pioches, regards d’égouts

…) et à la répétition d’un même geste. Les TMS représentent un quart des effets négatifs observés sur

la santé de l’égoutiers.

Il faut ajouter à ces différentes pathologies le risque lié à la présence du soufre dont le sulfure

d’hydrogène (H2S). Le H2S provient de la dégradation bactérienne de composés organiques soufrés ou

de sulfates (ou autres formes comme celles citées ci-dessus) retrouvées dans les réseaux (Kadota and

Ishida, 1972) mais peut aussi être produit par des activités industrielles (notamment les tanneries et les

industries de caoutchouc). Cette molécule représente un risque de par son effet toxique pour l’homme.

Ce gaz peut conduire, en fonction des concentrations, a des intoxications aigues (troubles respiratoires,

irritations oculaires, céphalées, vertiges, conjonctivites), à des pertes de connaissance (à partir de 500

ppm) et même à la mort (> 1000 ppm) (Guidotti, 2015). La formation d’H2S est problématique dans les

réseaux d’eaux usées, en effet, des poches de gaz peuvent se former et seront libérées lors du curage,

exposant ainsi les agents. De plus, ce gaz, au contact de l’air, va former de l’acide sulfurique très corrosif

qui va dégrader le béton et la ferraille (Parker, 1951). Selon le ministère de la sante, des expositions

répétées peuvent être à l’origine d’intoxications chroniques (bronchites, irritations cutanées) même si

les effets à long termes demeurent inconnus. Les recommandation (CNAM R 420) préconisent des

expositions à un maximum de 5 ppm pour des expositions longues (8 heures) et 10 ppm pour des

expositions courtes (15 minutes). Une analyse des substances autorisées dans le traitement de l’eau

montre que plusieurs molécules soufrées peuvent être présentes dans les réseaux (selon la circulaire

2000/166 du 28 mars 2000 de la Direction Générale de la Santé, France). Les flocculants autorisés sont

le sulfate d’aluminium, chlorure d’aluminium, aluminate de sodium, polyhydroxychlorure d’aluminium,

polyhydroxychlorosulfate d’aluminium, polyhydroxychlorosilicate d’aluminium, chlorosulfate de fer,

et chlorure ferrique (ayant également un effet bactéricide). Les adjuvants de flocculation sont l’acide

sulfurique, le silicate de sodium, et la silice activée. Les désinfectants autorisés sont : le bisulfite de

sodium, le sulfate ferreux, le sulfite de sodium, l’hydrogénosulfite de sodium, le dioxyde de soufre, le

dioxyde de chlore, le chlore, le chlorure de sodium, l’hypochlorite de sodium ou calcium, l’ozone, le

peroxyde d’oxygène, sulfate de cuivre, et le permanganate de sodium. Ces molécules se retrouvent donc

dans les eaux usée, et certaines peuvent se montrer toxique comme le sulfate d’aluminium pouvant

favoriser l’apparition de la maladie d’Alzheimer (Walton, 2014).

Concernant les égoutiers de la ville de Lyon, les services de gestion des eaux usées classent les accidents

en 4 catégories : les chutes/glissades (25% des accidents déclarés), les troubles musculeux squelettiques

(25% des accidents), les coups/chocs (35 % des accidents) et des accidents divers (15 % des accidents)

de natures chimiques ou infectieuses. Les molécules chimiques et les différents micro-organismes

pouvant être retrouvés dans les eaux usées de la ville de Lyon restent largement méconnus, mais des

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diarrhées et toux ont déjà été répertoriées, tout comme à Paris (Rapport d’étude INRS, 2004). Les alertes

gaz H2S (pour des concentrations supérieures à 10 ppm) sur les chantiers d’exploitation des réseaux

d’assainissement sont suivies depuis fin 2012, suite à une intoxication grave ayant eu lieu en surface, le

28 juin 2012, lors d’un curage (sources : ESX Lyon). Ainsi, plus de 163 alertes ont pu être détectées,

dont 31 pour lesquelles les agents ont été exposés et incommodés. En tout, il est répertorié plus de 120

intoxications (allant du mal de tête au malaise) dues au H2S ou à d’autres gaz de nature inconnue. Ajouté

au risque lié au H2S, les canalisations constituées d’amiante ne sont pour la plupart non répertoriées, ne

permettant pas de prendre les précautions nécessaires lors d’interventions dans ces réseaux.

Des observations faites par l’équipe de recherche d’accueil pour ce stage M2 suggèrent qu’une enzyme,

la thiopurine-S-methyltransférase (bTPMT) pourrait avoir une activité de détoxication des substances

soufrées, dont le H2S, et expliquées la présence de certaines formes pathogènes de l’Homme dans les

réseaux. Le spectre des substrats soufrés de la TPMT reste cependant à préciser.

1.2. La bTPMT et ses biais de répartition

La Thiopurine Méthyle Transférase (TPMT) est une enzyme cytoplasmique initialement découverte

chez l’Homme (Rémy, 1963). Cette enzyme permet la détoxication de la 6-mercaptopurine (6-MP ou

Thiopurine) qui est un analogue des purines. L’enzyme permet une méthylation du groupement thiol de

la 6-MP par un transfert du groupement méthyl de la S-adénosyl méthionine (SAM). Les Thiopurines

sont utilisées pour traiter les leucémies lymphoblastiques, les maladies inflammatoires, les maladies

auto-immunes ou pour éviter les rejets de greffons (Kandiel, 2005). Les 6-Mercaptopurines (6-MP)

entrent en compétition avec les purines lors de la synthèse de l’ADN chez les cellules en cours de

multiplication, et bloquent son élongation (Skipper, 1954). Ces molécules ont été découvertes en 1951

par Gertrude Elion (lauréat du prix Nobel pour cette découverte) lors de ces travaux sur l’inhibition de

la croissance de Lactobacillus casei par des analogues des purines (Elion et al., 1951).

Les effets cytotoxiques et immunosuppresseurs des Thiopurines peuvent être fortement

dommageables pour l’organisme en absence d’expression de la TPMT (Lennard, 1992). La TPMT est

exprimée dans tous les organes du corps humain à l’exception du cerveau et des poumons (Ford and

Berg, 2010), et contribue à l’efficacité des traitements en modulant la toxicité de la 6-MP. En effet, Une

fois dans l’organisme, la 6-MP interagira directement avec deux enzymes, l’Hypoxanthine

Phosphoribosylguanine transférase (HGPRT) et la TPMT. L’HGPRT produira de la Thioinosine

monophosphate à partir de la 6-MP, la forme active (inhibiteur de la synthèse de l’ADN) du médicament,

alors que la TPMT produira de la 6-MMP (6-MéthylMercaptopurine), une forme non-toxique pouvant

être éliminée par l’organisme (Baker, 2003). Les niveaux d’activités HGPRT et TPMT conditionnent le

succès des traitements à la 6-MP, et la cytotoxicité chez le patient. Certaines mutations du gène codant

la TPMT peuvent conduire à des changements d’affinité pour la 6-MP, ces modifications augmentent la

toxicité de cette molécule et peuvent conduire au décès des patients (McLeod et al., 2000). Des

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diagnostics PCR ont été développés pour identifier les mutations impactant le fonctionnement de la

TPMT humaine (hTPMT) (Oender et al., 2006).

La TPMT a émergé très tôt dans l’évolution des organismes. Elle est en effet retrouvée chez les

mammifères, les levures, et les bactéries (Krynetski and Evans, 2003). Son évolution est cohérente avec

celles de gènes marqueurs universels utilisés en phylogénie moléculaire dont ceux codant les ARN

ribosomiques (Favre-Bonte et al., 2005). La première observation d’une activité de méthylation des 6-

MP chez les bactéries a été effectuée par Remy (1967) mais la TPMT bactérienne (bTPMT) n’a été

découverte qu’en 1998 (Cournoyer et al., 1998). La bTPMT montre une distribution restreinte chez les

bactéries mais une occurrence chez plusieurs agents pathogènes du groupe des -protéobactéries comme

Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, et Vibrio cholerae (Favre-Bonte et al., 2005). Chez

les bactéries, les substrats de la bTPMT demeurent cependant mal connus. Cette enzyme peut conférer

une résistance aux oxyanions à base de Sélénium (séléniate et sélénite) et Tellurium (tellurate et tellurite)

(Ranjard et al., 2002) mais d’autres substrats expliquent certainement sa conservation. Le Sélénium (Se)

est un métalloïde essentiel à la vie, il peut être un constituant de certains acides aminés, un cofacteur ou

une composante de plusieurs enzymes (Ranjard et al., 2003). Cependant, à forte dose, le Sélénium peut

conduire à des intoxications (Cui et al., 2017). Le sélénite (SeO32-) est toxique, aussi bien pour l’homme

ou l’animal (chez qui il peut causer perte de la vision, coliques, problèmes respiratoires, léthargies) que

chez les bactéries. En effet, de par ses propriétés oxydatives, le sélénite peut interagir avec les protéines

membranaires et provoquer un burst oxydatif de la cellule (Favre-Bonté et al., 2006). Le Tellurium (Te)

est également un métalloïde, cette molécule possède des propriétés chimiques proches du soufre. La

forme oxydée, le tellurite (TeO32-) est toxique pour les micro-organismes, et cela par plusieurs

mécanismes. Premièrement, à l’instar des formes toxiques du Sélénium, cette molécule a un fort pouvoir

oxydatif et peut provoquer un burst oxydatif de la cellule (Turner et al., 2001). Le Tellurium peut

également entrer en compétition avec le Sélénium et le Soufre (S) lors de la synthèse protéique, et donc

être incorporé dans les protéines, les rendant non fonctionnelles et induisant des dysfonctions cellulaires

(Prigent-Combaret et al., 2012). La bTPMT peut méthyler ces espèces toxiques en di-méthylSélénide

(DMSe) ou di-méthylDiSélénide (DMDSe) (Ranjard et al., 2003) et en di-méthylTelluride (DMTe) ou

di-méthyldiTelluride (DMDTe) (Cournoyer et al., 1998). Ces molécules volatiles sont non-toxiques.

Lors de ces analyses sur le Te/Se, une méthylation du Soufre par la bTPMT en di-méthylSulfur (DMS)

et di-méthyldiSulfur (DMDS) a également été observée (B. Cournoyer, Pers. Comm.).

L’affinité de la bTPMT pour les substrats soufrés pourrait donc être liée à un rôle « naturel » dans

la détoxication d’antimicrobiens contenant des atomes de soufre. Une possibilité est le sulfure

d’Hydrogène (H2S), un gaz toxique pour l’homme et les bactéries. L’H2S inhibe la cytochrome c

oxydase et donc la respiration cellulaire (Forte and Giuffrè, 2016). D’autres antimicrobiens pourraient

également être détoxiqués par la bTPMT comme certains antibiotiques, par exemple les sulfamides. En

effet, il a déjà été montré chez l’homme qu’une enzyme proche de la TPMT, la Thiol-S-

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méthyltransférase, était capable de modifier le sulfure d’hydrogène (H2S) en méthanethiol (CH4S)

(Weisiger et al., 1980). Ces substrats de la TPMT pourraient expliquer certains biais de répartition

observés chez les bactéries dans les milieux pollués. Il est à noter que les « Gene Expression Omnibus

profiles » (GEOprofiles, www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles), des archives NCBI regroupant des

données publiées d’expression de gènes, suggèrent que le gène tpm (codant la bTPMT) serait induit en

condition de micro-aérophilie (Alvarez-Ortega and Harwood, 2007) et en présence de sulfates (Tralau

et al., 2007). Ces observations sont cohérentes avec les données d’activité de méthylation des

métalloïdes par la bTPMT. De plus, une relation entre l’expression du gène tpm et la formation de

biofilms (en présence de tobramycine) a été observée (Anderson et al., 2008), confortant l’hypothèse

que l’enzyme est exprimée lorsque les concentrations en oxygène sont faibles.

La première phase de ce travail a donc été d’étudier les biais de répartition des bactéries pouvant

exprimer la bTPMT dans des milieux fortement contaminés par des médicaments et pouvant également

conduire à une production de sulfure d’hydrogène (H2S), c’est à dire les réseaux unitaires. Les réseaux

unitaires sont chargés de collecter les eaux usées (domestiques ou hospitalières) et les eaux de pluies à

travers les mêmes canalisations. Les eaux collectées rejoignent ensuite une station d’épuration pour y

être traitées. Ces biais de répartition ont été étudiés par métabarcoding à partir de données de séquences

d’amplicons tpm qui ont été mis à disposition pour le projet. Ces amplicons tpm ont été produits à partir

d’ADN bactérien extraits de biofilms qui ont été exposés aux effluents hospitaliers ou domestiques de

réseaux d’eaux usées reliés à la station d’épuration de Bellecombe (Scientrier, Haute-Savoie, France).

Lors de la récupération des biofilms, des descripteurs du milieu ont été mesurés par l’INRA de Thonon

(Chonova et al., 2016) ainsi que les concentrations de plusieurs médicaments par Lenanowski et al.

(Pers. Comm., Université de Poitiers / Ecole nationale Supérieure d’Ingénieurs de Poitiers). Les relations

entre ces données et les espèces bTPMT des biofilms collectés ont été recherchées durant ce stage par

bio-informatique en s’inspirant de la trame d’analyses présentées par Bourgeois et al. (2017). Les OTU

tpm ont pu faire l’objet d’allocations taxonomiques. Ceci a permis d’identifier des espèces bTPMT

fortement dominantes dans les prélèvements ainsi que des espèces pathogènes comme Pseudomonas

aeruginosa et Aeromonas caviae. Une sélection d’espèces bTPMT par les effluents hospitaliers

(différentes des espèces de la file urbaine) a pu être mise en évidence. Les implications de la bTPMT

dans les biais de répartition observés restent à préciser, et ont été explorées dans la suite de ce travail.

La deuxième phase de ce stage a été de tester certaines hypothèses concernant les substrats de la

bTPMT et ses conditions d’expression. Pour ces travaux, une espèce modèle a été choisie suite à

l’analyse des données NGS des amplicons tpm obtenus de biofilms (phase 1). Les types tpm de P.

aeruginosa obtenus par NGS ont été comparés à une banque de données de types tpm d’isolats, et ainsi

permis d’observer l’occurrence de formes similaires à celles de génotypes cliniques de référence telles

que PA14 (Kukavica-Ibrulj et al., 2008), PAO1 (Stover et al., 2000), et une souche « hyper-virulente »

isolée chez des patients atteints de mucoviscidose, LESB58 (Kukavica-Ibrulj et al., 2008). Le génotype

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PAO1 a été choisi pour les expérimentations en laboratoire dans un premier temps. Pour préciser les

résistances conférées par cette enzyme et autres propriétés chez cette souche, deux stratégies ont été

retenues : (1) construction d’une souche sur-productrice de la bTPMT et tests de croissance avec

différents anti-microbiens par la procédure omnilog combo (Kerangart et al., 2018) ; et (2) l’analyse

d’expression des transcrits tpm par qRT (quantitative reverse transcriptase) PCR en faisant varier les

conditions de croissance (taux d’oxygène, présence ou non de Tellurite). Les tests de croissance ont

permis d’observer un rôle de la bTPMT dans la résistance au Niaproof (un alkysulfate), à la colistine et

la tylosine (antibiotiques), au chlorure de Fer, à la Patuline (Mycotoxine) et au Bromure de Domiphène

chez P. aeruginosa.

Figure 1 : Présentation du site de la station d’épuration de Bellecombe (Scientrier, Haute-Savoie,

France). Les points d’incubation des roches pour le développement de biofilms sont indiqués en rouge.

Les roches ont été incubées 1 mois sous environ 5 cm d’eau dans les clarificateurs des file urbaines et

hospitalières, ainsi que dans la rivière Arve, en amont et en aval de la station d’épuration. Pour chaque

période de prélèvement des biofilms, les concentrations en médicaments ainsi que plusieurs variables

physico-chimiques ont été mesurées. Les tableaux S1 et S2 présentent les valeurs mesurées. Il y a eu

n=6 période d’échantillonnage : février, mars, avril, mai, juin et juillet 2014.

ARVE AVAL

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2. Matériels et méthodes 2. 1. Les bTPMT des effluents domestiques et hospitaliers 2.1.1. Présentation de la station d’épuration de référence L’étude implique des comparatifs entre les séquences tpm codant des bTPMT pouvant être retrouvées

dans les effluents hospitaliers et urbains de la station d’épuration de Bellecombe (WWTP) ainsi que

dans le milieu récepteur des eaux traitées (EU), c’est-à-dire la rivière Arve. Les points d’échantillonnage

de l’étude font partie du site Sipibel de la Zone Atelier bassin du Rhône (ZABR -

www.graie.org/zabr/index.htm) (Fig. 1). Ce site est localisé à Scientrier (Haute-Savoie, France), et a la

particularité de traiter séparément les eaux usées provenant de la filière domestique et de la filière

hospitalière. Cette station d’épuration reçoit les eaux usées du centre hospitalier Alpes Léman (CHAL)

ouvert depuis février 2012 (Chonova et al. 2018). Ces effluents hospitaliers arrivent à la station

d’épuration sans prétraitement (rapport Sipibel, 2014).

2.1.2. Echantillonnage et analyses chimiques

Cette étude des biais de répartition de séquences tpm est basée sur une analyse de biofilms se

développant sur roches de type amphibolite exposées (sur site) aux eaux usées ou de rivière. Ce choix a

été effectué pour permettre une co-accumulation de polluants chimiques et de micro-organismes, et ainsi

favoriser les phénomènes sélectifs pouvant conduire à une structuration de la diversité en relation avec

les concentrations en médicaments. Avant leur implantation sur site, les roches ont été brossées,

nettoyées à la javel 5% puis stérilisées à l’autoclave. Elles ont ensuite été disposées dans des nasses en

inox qui ont été immergées dans les clarificateurs des filières urbaine et hospitalière, ainsi que dans

l’Arve, en amont et en aval de la zone de rejet de la station d’épuration. Les points de prélèvements sont

décrits en Figure 1. Les roches ont été immergées durant 2 à 4 mois, en fonction de la vitesse de

formation des biofilms. Six campagnes d’échantillonnages ont été réalisées : février, mars, avril, mai,

juin et juillet 2014. Parallèlement, à chaque campagne d’échantillonnage, des paramètres physico-

chimiques et microbiologiques (Tab. S1) ont été mesurés, ainsi que certaines substances chimiques

comme des médicaments (Tab. S2). Quelques caractéristiques (Type d’utilisation) des molécules sont

décrites dans le tableau S6. Les concentrations en médicaments dans les biofilms ont été mesurées

comme décrit dans (Chonova et al., 2018) par Labanowski et al. (U. Poitiers), et les concentrations en

intégrons 1, 2 et 3 ont été mesurées selon (Marti et al., 2017) par Marjolet et al. (VetAgro Sup).

2.1.3. Extraction d’ADN génomique, amplification et séquençage du gène tpm

Les biofilms formés sur les roches ont été grattés à l’aide d’une spatule et d’une brosse à dent stériles et

à usage unique. L’ADN de ces biofilms a été extrait en utilisant le kit GenElute-LPA (Sigma-Alrich,

Saint-Louis, Missouri, Etats-Unis) en suivant les instructions du fournisseur. Les amplicons tpm produits

à partir de ces ADN ont été séquencés en utilisant la technique Miseq Illumina. tpm a été amplifié en

utilisant un mélange équimolaire des couples d’amorces ILMN-PTCF2/ ILMN-PTCR2 et ILMN-

PTCF2m/ ILMN-PTCR2m (Tab. S3) puis séquencé par Biofidal (Vaulx-en-Velin, France). Ces amorces

permettent de bien discriminer, entre autres, les espèces des genres Achromobacter, Aeromonas,

12

Dechloromonas, Nitrosomonas, Nitrospira, Pseudomonas, Xanthomonas, et Xanthobacter. Elles

donnent donc accès à la répartition d’espèces pathogènes de ces genres mais également d’espèces ayant

des propriétés métaboliques particulières comme la production de nitrate à partir de nitrite.

2.1.4. Tri des séquences et analyses de la diversité

Les séquences ont été traitées selon la méthode définie par J. Kozich (Kozich et al., 2013) en utilisant

le logiciel Mothur (Schloss et al., 2009). Les séquences ont été supprimées lorsqu’elles présentaient les

paramètres suivants : (1) plus courtes que 250 pb et plus longues que 270 bp, (2) peu d’identités avec

les séquences de la base de séquences de référence, (3) contenaient plus de huit homopolymères, (4)

contenaient des bases ambigües. Les séquences chimériques ont été supprimées en utilisant la

commande chimera.uchime (Edgar et al., 2011). Le nombre de séquences a été normalisé en réalisant

un ré-échantillonnage aléatoire. Les séquences d’ADN ont ensuite été regroupées en Unité

Taxonomique Opérationnelle (OTUs) lorsqu’elles présentaient 100% d’identité (Schloss and Westcott,

2011). Les OTUs ont été reliées à des groupes taxonomiques en utilisant la base de données

BD_TPM_Mar18_V1 (développée au laboratoire BPOE) lorsque la relation observée était soutenue par

une valeur P de boostrap > 80%. Cette base de données contient 917 séquences, 8 phylas, 15 classes, 36

ordres, 64 familles, 134 genres, 459 espèces et 80 sous-espèces.

Les analyses de la diversité ont été réalisées en suivant la trame proposée par (Marti et al., 2017). Les

calculs d’-diversité (Indice de Shannon, Evenness et Simpson) et de -diversité (matrice de Bray-

Curtis et UniFrac) ont été effectués en utilisant le logiciel Mothur, ainsi que les analyses de similarités

(test statistique Amova). Les différences observées sont considérées comme significatives lorsque la p-

value 0,05. A partir des affiliations des OTUs, les heatmaps ont été réalisées avec le logiciel Explicet.

Les ACP, les PCoA, les RDA et les Corrélogrammes ont été réalisés en utilisant le package Vegan du

logiciel R (https://cran.r-project.org/web/packages/vegan). La structure des communautés bactériennes

a été analysée en utilisant la matrice de distances UniFrac calculée à partir de la matrice OTUs générée

par Mothur. Les analyses de corrélations entre les communautés bactériennes présentes et les paramètres

mesurés à partir du milieu (physico-chimiques et concentrations en médicaments) ont été réalisées avec

le logiciel Cytoscape (http://www.cytoscape.org) en utilisant le test de corrélation de Spearman (1000

itérations) associé à une correction de Bonferroni (P-value = 0,05).

Les séquences de chaque OTU ainsi que leurs affiliations taxonomiques ont été extraites. Les séquences

des Pseudomonas aeruginosa ont été comparées à un alignement multiple de référence regroupant des

séquences « types » de l’espèce pour les grands sous-clades et complexes clonaux. Le logiciel ClustalX

a été utilisé pour la comparaison des séquences, puis un arbre phylogénétique illustrant les relations

observées a été produit avec le logiciel Mega6 en utilisant la méthode de Neighbor Joining.

2.2. Etude fonctionnelle de la bTPMT chez Pseudomonas aeruginosa

2.2.1. Liste des souches utilisées et conditions de culture

souchereceveuse

Vecteur Phénotype kb Atb-R référence

P.aeruginosaPAO1

pEXG2(Sma I)-mut-tpm(PCRSLICtpmsF1-sR1+tpmsF2-sR2)

Mutanttpm 5,9 Gm (Hoangetal .,1998)

P.aeruginosaPAO1D tpm

pIApX2-tpm(pUCP20)(XbaI-HindIII), Dgfp

SurproducteurdebTPMT

7.7 Cb (Köhleretal. ,2014)

P.aeruginosaPAO1D tpm

pIApX2(pUCP20)Dgfp Souchetémoin 7 Cb (Köhleretal .,2014)

P.aeruginosaPAO1

Souchenaturelle / (Stoveretal .,2000)

Tableau1:Souchesutiliséeslorsdustage.Larésistanceauxantibiotiquesconféréeparlevecteurestindiqué(Gm:Gentamycine;Cb:Carbénicilline).Latailledesvecteur(kb)estégalementprésentée.Lesréférencesprésentantlesvecteursoulessouchessontindiquées.

13

Toutes les souches d’E. coli et P. aeruginosa utilisées et leurs caractéristiques sont présentés dans le

Tableau 1. Toutes les souches ont été cultivées à 37°C sur gélose ou bouillon LB additionné ou non de

200 µg/mL de Carbénicilline. Les souches ont été conservées sur milieu gélosé à 4°C pendant quelques

semaines ou à -80°C dans leur milieu de culture additionné de 18% de glycérol. Les sur-producteurs

PAO1 de la bTPMT et la souche témoin ont été construits durant le stage.

Pour la construction d’une souche PAO1 sur-productrice de bTPMT, les cellules compétentes ont été

préparées à partir d’1mL d’une culture de nuit de P. aeruginosa PAO1tpm (Tab. 1 ; Fig. S5). Les

cellules ont été centrifugées à 13000 tpm pendant 30 secondes à température ambiante. Le culot a été

resuspendu dans 1mL de MgCl2 0,1 M froid. Cette solution a été centrifugée à 13000 tpm pendant 30

secondes puis le culot a été resuspendu dans 1 mL de TG (CaCl2 75 mM, MgCl2 6 mM et 15% de

glycérol) froid. Cette solution a été laissée sur glace pendant 10 minutes, puis centrifugée à 13000 tpm

pendant 30 secondes à température ambiante. Le culot a été resuspendu dans 200 µL de TG froid. 100

µL de cellules compétentes ont été mises en présence de 73 ou 219 ng de plasmide pIApX2 natif ou

contenant le gène tpm. Ce mélange a été laissé sur glace pendant 25 minutes et a ensuite été transféré

rapidement à 39 °C (choc thermique). Puis, 500 µL de LB ont été ajoutés, et les cellules ont été incubées

à 37°C pendant 1 heure sous agitation de 200 rpm. 100 µL et 500 µL de cette solution ont été étalés sur

gélose LB contenant 200 µg/mL de carbénécilline.

Pour valider les transformants, des cribles PCR ont été appliqués sur colonie. Une colonie a été mise

dans 200 µL d’H2O Ultra Pure (UP), les tubes ont été chauffés dans un bain marie sec Dry Bath System

(StarLab, Hambourg, Allemagne) à 100°C pendant 5 minutes, puis mis au congélateur à -20°C pendant

2 minutes afin de lyser les cellules. Le lysat a été centrifugé à 13000 tpm pendant 30 secondes à

température ambiante pour culoter les débris cellulaires. 2 µL des lysats bactériens ont été mis dans 23

µL de mix PCR contenant les amorces PTCF2 et PTCR2 (Tab. S3) amplifiant un fragment de 250 pb

du gène tpm. La taille des amplicons PCR a été vérifiée par électrophorèse (voltage = 100 V ; durée de

migration = 30 min) avec un gel à 2% d’agarose contenant 25 µg de bromure d’éthidium. Le gel a été

révélé aux UV à 302 nm.

Pour valider la surproduction de l’enzyme, P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1tpm-

pIApX2::tpm (sur-producteur) et P. aeruginosa PAO1tpm pIApX2 (témoin sans tpm) ont été incubé

en LB en absence ou en présence de 7,5 µg/mL de K2TeO3. La croissance a été arrêtée en phase

exponentielle (t=5h) avec une solution de RNAlater® (AmbionTM, Carlsbad, Etats-Unis) suivant le

protocole fourni par le fabriquant. L’ARN total de ces cultures a été extrait avec le kit RNeasy Mini

kit® (Qiagen, Hilden, Allemagne) en suivant les instructions du fournisseur. L’intégrité de l’ARN a été

vérifiée sur un gel à 1,5% d’agarose contenant 25 µg de BET. L’ARN a été quantifié en mesurant

l’absorbance à 260 nm au Nanodrop-One (Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, France). L’ARN obtenu a

été traité avec de la Turbo DNase-freeTM Kit (Ambion, Carlsbad, Etats-Unis) en suivant les

recommandations du fabriquant pour un traitement rigoureux. 1,5 µL d’enzyme ont été utilisés. La

transcription inverse a été réalisée à l’aide du kit iScriptTM cDNA synthesis kit (Bio-rad, Marne-la-

14

Coquette, France) en suivant les instructions du fabricant. Une PCR sur le gène tpm a ensuite été réalisée

en utilisant les amorces PTCF2/PTCR2 (Tab. S3). Les amplicons PCR ont été vérifiés sur gel comme

indiqué précédemment.

2.2.2. Etude du rôle de la bTPMT dans la résistance de P. aeruginosa a divers antimicrobiens

2.2.2.1. Tellurite

Des suspensions (gouttelettes de 10 µL avec une concentration d’environ 105 CFU/mL) de P.

aeruginosa PAO1 (sauvage), P. aeruginosa PAO1tpm-pIApX2::tpm (surproducteur de bTPMT) ou P.

aeruginosa PAO1tpm pIApX2 (témoin) ont été déposées sur un milieu gélosé LB contenant 1, 5, 10,

20, 40, 80 ou 100 µg/mL de K2TeO3. Les boites ont été incubées à 37°C pendant 24 heures. Le nombre

de gouttelettes déposé montrant une croissance a été compté pour chaque construction testée.

2.2.2.2. Antibiotiques

Les antibiogrammes ont été réalisés en suivant les recommandations de la Société Française de

Microbiologie (SFM) pour l’analyse des résistances chez P. aeruginosa. Les antibiotiques (n=16)

utilisés (par la méthode du disque) et leurs concentrations sont décrits dans le Tableau 2. Les souches

P. aeruginosa PAO1 (sauvage), P. aeruginosa PAO1tpm-pIApX2::tpm (surproducteur de bTPMT) ou

P. aeruginosa PAO1tpm pIApX2 (témoin) ont été utilisées.

2.2.3.3. Autres substrats antimicrobiens

Les croissances des souches P. aeruginosa PAO1tpm-pIApX2::tpm (surproducteur de bTPMT) et P.

aeruginosa PAO1tpm pIApX2 (témoin) exposées à une large palette d’antimicrobiens ont été testées

par la technologie Omnilog microarray (OM) (Biolog, Bernay, France). Ces tests sont basés sur la

réduction par la respiration bactérienne du tétrazolium violet présent dans le milieu en formazan qui

donne une couleur violette. Cela permet de quantifier la croissance bactérienne au cours du temps

(Kérangart et al., 2018). Ces tests sont réalisés en plaque 96 puits contenant une large diversité

d’antimicrobiens (24 molécules par plaque, 240 molécules au total ; Tab. S4) et permettant une

exposition à quatre concentrations différentes (très faible, faible, moyenne, forte). Les inoculums et la

préparation des plaques ont été réalisés en suivant les recommandations du fournisseur. Les plaques ont

été incubées à 37°C pendant 48 heures, les aires sous la courbe de croissance ainsi que les valeurs

maximales ont été récupérées via les logiciels « Parametric » et « Kinetic » (Biolog, Bernay, France).

Les données ont été normalisée en calculant le ratio Aire mesurée/Aire maximal observée. Les ratios

obtenus sont indicatifs de la sensibilité de la souche face à l’antimicrobien présent dans le puit : (1) <0,5

= sensible ; (2) >0,5 = résistante.

3.Résultats

3.1. Les bTPMT des réseaux d’eaux usées domestiques et hospitalières

Figure 2 : PCoA de la répartition des OTU tpm pour le jeu de données complet (A) ou restreint (B – sans les tpm des biofilms de la rivière). Les échantillons sont significativement différenciés en fonction de la zone de prélèvement : Effluents urbain (U), effluents hospitaliers (H) et rivière en amont (RU) ou en aval (RD) de la STEP. Les mois de prélèvement des échantillons, février (Feb), mars (Mar), avril (Apr), mai (May), juin (Jun) et juillet (Jul) sont indiqués sur la figure. Les cercles représentent les ellipses de confiance. L’AMOVA montre que les différences observées sont significatives pour les filières urbaines, hospitalières et la rivière (p-value < à 0,01). Il n’y pas de différence significative dans les structures d’OTU tpm pour les biofilms rivière en amont et en aval de la STEP (p-value > 0,05).

A

B

15

3.1.1. Descriptions générales des données de séquençage tpm à partir de biofilms

Deux jeux de données de séquences d’amplicons tpm ont été utilisées pour inférer l’incidence des

paramètres de terrain et des polluants chimiques sur la structure génétique de la communauté bactérienne

codant le gène tpm : (1) un jeu de données restreint aux effluents urbains et hospitaliers, et (2) un jeu de

données incluant les séquences du point (1) mais complétées de données NGS tpm des biofilms de l’Arve

en amont ou en aval de la STEP. Entre 6211 et 30922 reads ont été obtenus par échantillon.

L’échantillons d’Avril de la filière hospitalière et de juillet de la filière urbaine contenaient les plus

faibles nombres de reads (6211 et 8308), impactant le nombre de séquences pouvant être utilisées pour

certaines analyses. Le Tableau 3 indique le nombre de séquences tpm obtenues par prélèvement pour la

totalité de l’étude, et ayant fait l’objet d’un ré-échantillonnage aléatoire. Ainsi, pour (1), un total de 6211

séquences tpm ont été retenues pour les analyses suivantes, et pour (2) un total de 8867 séquences tpm.

Des analyses d’-diversité ont été réalisées sur les jeux de données produits après ce ré-échantillonnage

aléatoire. Les courbes de raréfaction obtenues montrent que les échantillons prélevés dans les filières

urbaines ou hospitalières étaient plus faibles en nombre de reads que les échantillons prélevés dans la

rivière (Wilcoxon : p-value < 0,05) (Fig. S1). Par contre, le mois de prélèvement n’a pas impacté le

nombre de reads (Kruskal-Wallis : p-value > à 0,05). Les indices de richesse (Shannon, Simpson,

Evenness) sont indiqués dans le Tableau 3. Ils font ressortir une diversité plus élevée dans les biofilms

de la filière urbaine, par rapport à ceux de la filière hospitalière, ce qui est confirmé par un test de

Wilcoxon (p-value < 0,05). La richesse observée dans la rivière est similaire en amont et en aval du

point de rejet des eaux traitées (Wilcoxon : p-value > 0,05).

3.1.2. Structure génétique des communautés de bactéries codant le gène tpm dans les biofilms

Deux types d’analyse ont été effectuées pour comparer la diversité des séquences tpm des biofilms en

fonction de l’origine des prélèvements (filière hospitalière de la STEP ou urbaine ou rivière) et des

périodes d’échantillonnage : (a) le NMDS (non-metric multidimensional scaling) qui permet, par

analyse de rang, d’évaluer la proximité des structures en OTUs (sans considérer les nombres de reads)

entre paires de profils (et groupes) (Oksanen et al., 2018); cette méthode nécessite l’utilisation d’une

matrice de dissimilarités de type Bray-Curtis qui permet de comparer les abondances d’OTUs entre

paires d’échantillons (Beals, 1984) et (b) la PCoA (Principal Coordinates Analysis - metric

multidimensional scaling) impliquant une comparaison des distances entre patron d’OTUs prenant

également en considération le nombre de reads par OTU ; cette méthode nécessite l’utilisation d’une

matrice de distance et celle-ci a été calculée par approche UniFrac (Lozupone and Knight, 2005). La

comparaison des ordinations obtenues par approches NMDS (Fig. S2) et PCoA (Fig. 2) a montré de

fortes similitudes. Seules les représentations graphiques dérivées des analyses PCoA seront donc

décrites dans la suite du rapport. La matrice UniFrac (basée sur les pourcentages de dissimilarités entre

les échantillons) utilisée pour ces analyses est présentée dans le Tableau S5. Les tests AMOVA (analyse

de variances) ont montré une différenciation significative entre les structures des biofilms des files

hospitalières et urbaines de la STEP, ainsi qu’avec les ordinations inférées pour les biofilms de la rivière

(p-value = 0,01). La différenciation entre les structures d’OTUs des biofilms des files hospitalières et

16

urbaines de la STEP a été significative pour les deux jeux de données (avec ou sans les tpm de rivière)

(Fig. 2). Cependant, il n’y a pas eu différenciation des profils d’OTUs des biofilms entre l’amont et

l’aval du point de rejet des eaux traitées de la STEP (p value = 0,192). Cet ensemble « tpm biofilms

rivière » semble donc peu impacté par les bactéries tpm venant de la STEP.

3.1.3. Analyse des relations entre ordinations PCoA des profil d’OTU tpm des biofilms et leur composition chimique

L’effet des variables explicatives sur la structure génétique des profils tpm déduite par PCoA a été

étudié. Ces analyses ont été effectuées à partir des deux types de jeux de données (avec ou sans les

séquences tpm de rivière). Le jeu de données le plus complet en termes de séquences tpm présentait

moins de possibilités de confrontations avec les autres types de données (paramètres physico-chimiques,

concentrations en médicaments dans l’eau et dans les biofilms prélevés). Une première série de tests de

corrélation a été effectuée entre les concentrations en médicaments mesurées dans l’eau ou dans les

biofilms, pour préciser la redondance entre certaines variables (médicaments), pouvant avoir eu des

effets « confondants » sur la structuration des OTUs tpm dans les biofilms (Fig. S3). Ces analyses ont

permis d’observer une certaine complexité dans les relations entre les concentrations mesurées en

médicaments dans l’eau et dans les biofilms pour les molécules suivies dans l’étude. Cela a permis de

confirmer le caractère « intégrateur » des biofilms pour certaines des molécules analysées. Des analyses

plus exhaustives des flux de médicaments seraient nécessaires pour préciser la linéarité des relations

entre concentrations dans l’eau et les biofilms.

Pour cette raison, il a donc été décidé de focaliser la suite des analyses en utilisant uniquement les

concentrations de médicaments mesurés dans les biofilms (Fig. 3). Des ACP ont permis d’observer des

co-occurrences entre médicaments dans les biofilms, et de confirmer que certains étaient principalement

(1) associés aux biofilms de la file hospitalière des EU : Sulfaméthoxazole, Lévofloxacine,

Carbamézépine, Roxithromycine, Ranitidine, Kétoprofène, Iohexol et Clofibrate, et (2) associés aux

biofilms de la file urbaine : Epoxycarbamazépine, Bézafibrate, Métronidazole, Aciclovir, Aténolol,

Diclofénac, Propanolol et Triméthoprime (Fig. 4). L’Iohexol est un produit de contraste triiodé

fortement lié, en termes d’utilisation, au milieu hospitalier. Le corrélogramme a permis de confirmer

une étroite relation entre cette molécule et les antibiotiques Lévofloxacine, Roxithromycine

Sulfaméthoxazole, et la Ranitidine. Une corrélation négative a été observée avec le Triméthoprime

(pourtant associé au Sulfaméthoxazole lors des traitements). En ce qui concerne la file urbaine, les

biofilms ont montré des corrélations positives entre les concentrations en Diclofénac, Caféine, Atenolol,

Propanolol et Diazépame. La ségrégation entre médicaments en fonction de la file d’épuration a donc

été confirmée (Fig. 3 & 4). Ceci a permis de conclure que les molécules suivantes présentaient une co-

occurrence significative dans les biofilms : (I) Aciclovir, Clofibrate, Diazépame, Epoxycarbamazépine,

Métronidazole, (II) Aténolol, Caféine, Diclofénac, Propanolol, Triméthoprime, (III) Iohexol,

Roxithromycine, Kétoprofène, Carbamazépine, Lévofloxacine, Ranitidine, et Sulfamethoxazole. Ces

co-occurrences seront à prendre en considération lors de l’interprétation des relations avec les structures

génétiques tpm des biofilms.

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

Bezafibrate

Jul

Apr

Jun

May

Feb

Mar

May

Apr

Feb

Jun

Mar

Jul

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

CaffeineB

Jul

Apr

Jun

May

Feb

Mar

May

Apr

Feb

Jun

Mar

Jul

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

DiclofenacB

Jul

Apr

Jun

May

Feb

Mar

May

Apr

Feb

Jun

Mar

Jul

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UHJul

Apr

Jun

May

Feb

Mar

May

Apr

Feb

Jun

Mar

Jul

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

Jul

Apr

Jun

May

Feb

Mar

May

Apr

Feb

Jun

Mar

Jul

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

LevofloxacineB

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

Atenolol

-0.4 -0.2 0.0 0.2

-0.3

-0.1

0.10.2

mds2[,1]

mds2[,2]

UH

Propranolol

Figure 5 : PCoA de la répartition des OTU tpm pour le jeu de données restreint aux séquences des biofilms de clarificateurs. Les échantillons sont discriminés en fonction de leur site de prélèvement : file urbaine de la STEP (U) ou hospitalière (H). Les mois de prélèvement des échantillons, février (Feb), mars (Mar), avril (Apr), mai (May), juin (Jun) et juillet (Jul) sont indiqués. Les gradients de concentrations (mesurées dans les biofilms) de 8 molécules (Bezafibrate, Caféine, Atenolol, Levofloxacine, Diclofenac, Propanolol et Ranitidine, Iohexol) sont présentés et exprimées en ng/mL. La flèche représente les corrélations significatives entre ordination des profils des OTU tpm et les concentrations en médicaments.

Ranitidine

Iohexol

Jun

May

Mar

Feb

Apr Jul

Mar

Feb

Apr

May

Jun

Jul

Jun

May

Mar

Feb

Apr Jul

Feb

Apr

May

Jun

Jul Mar

Jun

May

Mar

Feb

Apr Jul

Feb

Apr

May

Jun

Jul Mar

17

Les relations entre concentrations de ces médicaments (mesurées dans les biofilms) et les ordinations

PCoA ont été explorées (Fig. 5). Des relations significatives ont été observée pour les molécules des

groupes II (Caféine, Atenolol, Diclofenac, Propanolol) et III (Iohexol, Levofloxacine, et Ranitidine).

Ces analyses montrent également de plus fortes concentrations en Carbone organique dissous (COD),

en matière solide en suspension (TSS), en Nitrites, Nitrates et Phosphate ainsi qu’une plus forte

occurrence de l’intégron 3 dans la filière hospitalière.

3.1.4. Allocation taxonomique des séquences tpm des biofilms

Les séquences tpm des biofilms ont été comparées en utilisant le package Mothur et un alignement

multiple regroupant les principales lignées tpm disponibles dans les banques de données. Ceci a permis

la classification d’environ 50% des séquences tpm de biofilms. La résolution, en termes de classification,

a été améliorée en réactualisant la banque de données via une recherche par blastN avec les principales

OTUs non-classées (n=100) du jeu de données. Ceci a permis de classer certaines OTUs dominantes au

sein du jeu de données dont l’Otu0001 (n=44049 reads), retrouvée dans les biofilms H_Apr-H_Jul-

H_Jun-H_May-U_Jun, qui a ainsi pu être reliée (74% de similarités – couverture de 96%) à un

endosymbionte non-isolé (sulfur-oxidizing symbionts of Riftia pachyptila - un ver tubicole géant) du

groupe des -protéobactéries. Cette inférence est une observation majeure lorsque mise en relation

avec les fonctions de détoxication de substances soufrées de la bTPMT. Pour illustrer les principales

inférences taxonomiques au niveau espèce, des représentations par « heat map » ont été réalisées (Fig.

6). Les séquences NGS des amplicons tpm des biofilms ont ainsi été classées principalement dans trois

genres : Herbaspirillum, Pseudomonas et Aeromonas. Les affiliations au niveau des espèces ont fait

ressortir Herbaspirillum aquaticum comme étant le taxon ayant le plus de séquences dans le jeu de

données (abondance relative de 12 à 81%). Cette espèce était davantage présente dans les effluents

hospitaliers et urbains que dans la rivière (test de Wilcoxon : p-value < 0,05). La présence de séquences

tpm de P. anguilliseptica était également récurrente (de 0,2 à 5%), mais leur nombre était plus abondant

dans la rivière (Wilcoxon : p-value < 0,01). Des différences dans la répartition des séquences tpm entre

les compartiments ont également été observées pour l’espèce candidatus Nitrospira defluvii avec une

occurrence élevée dans les biofilms des files urbaines et hospitalières mais une absence dans les biofilms

de la rivière (Wilcoxon : p-value < 0,001). Des tpm de type A. caviae ont été détectés dans les eaux de

la file hospitalière et dans la rivière, en aval de la STEP, comme P. aeruginosa mais qui était également

présent dans un échantillon de la file urbaine. Pour mettre en évidence les séquences tpm des taxons

pouvant être sélectionnées par les effluents hospitaliers, une figure présentant les ratios d’abondance

relative entre les biofilms des files d’eau usées hospitalière/abondance relative dans la filière urbaine en

fonction de l’abondance dans la filière hospitalière a été réalisée (Fig. 7). Cette analyse de répartition

des séquences tpm et taxons confirme une occurrence plus élevée de plusieurs espèces de Pseudomonas

dans les biofilms de la file hospitalière (Fig. 7). Les espèces observées peuvent être des formes

pathogènes opportunistes de l’homme comme Aeromonas sobria, Aeromonas caviae, Pseudomonas

putida et Pseudomonas flavescens ou de plantes comme Pseudomonas viridiflava. Les Pseudomonas

Figure 6 : Heatmaps illustrant les inférences taxonomiques déduites des séquences tpm obtenues des biofilms des files hospitalières et urbaines pour le jeu de données restreints (A – sans tpm des biofilms « rivière) ou avec les données concernant les biofilms de l’Arve en amont et en aval de la STEP (B). Les résultats sont présentés en abondance relative.

A

B

Abondance relative (%)

Abondance relative (%)

18

aeruginosa ressortent comme étant distribués de façon similaire dans les biofilms des files urbaines et

hospitalières. Ceci est en accord avec la heat map qui montrait une occurrence dans les deux files (Fig.

6). Une analyse phylogénétique a été réalisée pour préciser la proximité des types tpm de P. aeruginosa

du jeu de données NGS des biofilms avec les séquences décrites pour cette espèce dans les banques de

données. Cette analyse montre que deux des OTU présents dans les échantillons appartiennent aux sous-

clades PA14 (exoU+) et LESB58 (exoS+) (Fig. 8). Les OTU #1159 (22 reads), #2886 (5 reads), #7389

(2 reads) et #5321 (2 reads) des biofilms en aval de la zone de rejet de la STEP de la rivière ont montré

une proximité avec le clade PAO1 mais étaient différenciées. L’OTU #2886 (5 reads) était identique à

des tpm d’isolats cliniques et d’isolats de la ville (eaux urbaines).

3.1.5. Relation entre les abondances des séquences tpm et les concentrations en médicaments

Des corrélogrammes montrant les relations entre les OTUs tpm et les concentrations mesurées en

médicaments sont présentés en Figure 9. La présence de P. aeruginosa était peu corrélée aux

concentrations mesurées en médicament du groupe III (file hospitalière) (voir section 3.1.3.), et était

négativement corrélée aux molécules de la file urbaine. Une forte corrélation négative était observée

avec le triméthoprime malgré une résistance reconnue de cette espèce à cette molécule (Eliopoulos and

Huovinen, 2001). Les nombres de reads tpm de P. putida étaient corrélés à plusieurs concentrations en

médicaments de la file hospitalière, et étaient négativement corrélés à deux molécules (caféine et

diclofénac) liées à la file urbaine. Les nombres de reads tpm de P. flavescens étaient corrélés

positivement à plusieurs molécules liées à la file hospitalière, et ce type de tpm n’était pas lié à la

présence de Bézafibrate et Propanolol, des molécules de la file urbaine (Fig. 9). Ces résultats font

ressortir une cohérence entre répartition des médicaments et présence de certaines espèces de

Pseudomonas. Pour les espèces d’Aeromonas, des relations similaires ont été observées. La présence de

tpm d’A. caviae et A. sobria était plus fortement liée à la présence de molécules de la file hospitalière

(dont la Roxithromycine et la Lévofloxacine), que de la file urbaine (Fig. 9). Les nombres de reads tpm

d’A. allosaccharophila étaient plus fortement liés aux molécules de la file urbaine.

Les analyses faites avec le logiciel Cytoscape (Spearman –avec correction de Bonferonni) ont permis

d’observer des corrélations positives entre les dates de prélèvement des biofilms, et la température,

l’exposition solaire, ou la quantité pluie et les niveaux de décharge en eau traitée par la STEP. Des

corrélations négatives entre le temps de rétention des eaux et la quantité de pluie ont pu être observées

(non présentée).

3.2 . Rôle de la bTPMT dans la résistance aux antimicrobiens Les données de la section précédente ont fait ressortir plusieurs associations entre médicaments, file

d’épuration et présence de certaines bactéries arborant le gène tpm. L’importance de la bTPMT dans les

répartitions observées reste à préciser malgré une forte association avec une OTU ayant un

développement lié à la présence de molécules soufrées dont le sulfure d’Hydrogène. Pour explorer ces

relations, des manipulations génétiques ont été effectuées sur une souche modèle de l’espèce P.

aeruginosa ayant un gène tpm similaire à ceux retrouvés dans les eaux usées du site d’étude. Deux types

Abondance relative H

Abondance H / Abondance U

19

de souches PAO1 ont été produites : (a) une souche mutante délétée du gène tpm, et (b) une souche sur-

productrice de la bTPMT exprimant constitutivement le gène tpm à partir d’un plasmide.

Ces souches ont été utilisées dans un premier temps pour évaluer l’incidence du gène tpm dans la

résistance au tellurite. La souche délétée du gène tpm (tpm) (témoin) et la souche sur-productrice de

bTPMT (tpm::pIApX2-tpm) ont été exposées à différentes concentrations de tellurite. Aucune

différence de résistance à ce métalloïde n’a pu être observée entre ces deux souches. En effet elles

montraient le même profil de résistance, avec une Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) égale à 40

µg/mL de tellurite. Cependant, la souche sauvage P. aeruginosa PAO1 a montré une CMI plus élevée

de 80 µg/mL de tellurite, pour 42% des tests effectués. Ceci indique une probable acclimatation

fonctionnelle au tellurite. Une forte odeur métallique a toutefois été détectée à partir des boîtes de la

souche surproductrice de bTPMT. Cette odeur n’était pas détectable chez les cultures de la souche

(tpm). Dans tous les cas, les bactéries produisaient des cristaux noirs indicatifs d’une réduction du

tellurite en cristaux de Te. Ces analyses ont indiqué que le sur-producteur était bien fonctionnel. Ceci a

été confirmé par qRT-PCR avec la détection d’ARNm tpm chez le sur-producteur.

Suite à cette validation, la résistance envers différents antibiotiques (Tab. 2) et autres antimicrobiens

(Tab. S4) a été étudiée afin de préciser certains substrats de la bTPMT. Premièrement, la souche délétée

du gène tpm, la souche sur-productrice de bTPMT et la souche sauvage ont été exposés à des disques de

différents antibiotiques sélectionnés selon les recommandations de la Société Française de

Microbiologie pour l’étude de l’antibio-résistance. Sur les 16 antibiotiques testés, seule une différence

a été observée pour la Ticarcilline, de la famille des pénicillines, pour laquelle le surproducteur de

bTPMT et mutant tpm arborant le pIApX2 natif étaient résistants (Tab. 4). Cela était liée à l’expression

du gène bla de pIApX2 (Fig. S4). Sinon, les souches étaient sensibles à tous les antibiotiques testés dont

la Lévofloxacine présente dans les biofilms de la section précédente.

Dans un second temps, cette étude a été complétée par analyses Omnilog combo de plusieurs

antimicrobiens dont des éléments traces métalliques (Tab. S4). Sur les 240 molécules testées, 64 ont

montré un effet négatif sur la croissance des souches mutées (témoin) ou surproductrices de bTPMT.

Des différences de résistance entre ces souches ont pu être observées pour 7 molécules. La souche

surproductrice a montré une résistance plus élevée au chlorure de Fer (FeCl3.6H2O; un floculant

bactéricide pour le traitement des eaux usées et potables), au Niaproof (Détergent à base de soufre / sels

de sodium), à la colistine et la tylosine (Antibiotiques) (Fig. 10.A). Par contre, cette souche sur-

productrice était plus sensible que le mutant à la Patuline (Mycotoxine), au Bromure de Domiphène

(Antiseptique) et au 2,2'-Bipyridine (Bipyridine) (Fig. 10.B).

4. Discussions/Conclusions Le rôle de la bTPMT reste à préciser malgré des relations évidentes avec la détoxication de substances

soufrées et autres molécules à base de Se et Te. De plus, l’analyse des biais de répartition du gène tpm

codant cette enzyme a révélé une prévalence élevée chez des -protéobactéries pathogènes souvent

10,90,80,70,60,50,40,30,20,10-1 -0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1

Figure 9 : Corrélogrammes présentant les corrélations de Spearman positives ou négatives entre les concentrations mesurées en médicaments dans les biofilms et les nombres de séquences tpm pour certaines espèces de Pseudomonas (A) ou d’Aeromonas (B). Seules les corrélations significatives sont représentées (p-value < 0,05). Les cercles verts représentent des corrélations positives, les cercles rouges représentent des corrélations négatives. Plus le coefficient de corrélation est proche de la valeur absolue 1 plus la corrélation est forte. Le cercle rouge indique les molécules retrouvées principalement dans les biofilms de la file hospitalière, et le jaune, les molécules plutôt associées à la file urbaine. Les couleurs classent les molécules dans les 3 différents groupes (vert : I ; violet : II ; orange : III).

MedicamentsBiofilms

AciclovirAténololBézafibrateCaféineCarbamazépineClofibrateDiazépameDiclofénacEpoxycarbamazépineIohexolKetoprofèneLévofloxacineMétronidazolePropanololRanitidineRoxithromycineSulfaméthoxazoleTriméthoprime

AciclovirAténololBézafibrateCaféineCarbamazépineClofibrateDiazépameDiclofénacEpoxycarbamazépineIohexolKétoprofèneLévofloxacineMétronidazolePropanololRanitidineRoxithromycineSulfaméthoxazoleTriméthoprime

MedicamentsBiofilms

AciclovirAténololBézafibrateCaféineCarbamazépineClofibrateDiazépameDiclofénacEpoxycarbamazépineIohexolKetoprofèneLévofloxacineMétronidazolePropanololRanitidineRoxithromycineSulfaméthoxazoleTriméthoprime

AciclovirAténololBézafibrateCaféineCarbamazépineClofibrateDiazépameDiclofénacEpoxycarbamazépineIohexolKétoprofèneLévofloxacineMétronidazolePropanololRanitidineRoxithromycineSulfaméthoxazoleTriméthoprime

AciclovirAténololBézafibrateCaféineCarbamazépineClofibrateDiazépameDiclofénacEpoxycarbamazépineIohexolKétoprofèneLévofloxacineMétronidazolePropanololRanitidineRoxithromycineSulfaméthoxazoleTriméthoprime

MedicamentsBiofilms

AciclovirAténololBézafibrateCaféineCarbamazépineClofibrateDiazépameDiclofénacEpoxycarbamazépineIohexolKetoprofèneLévofloxacineMétronidazolePropanololRanitidineRoxithromycineSulfaméthoxazoleTriméthoprime

Coefficient de corrélation

20

présentes dans les eaux usées (Matyar et al., 2010). Pour mieux apprécier l’importance de la bTPMT,

deux stratégies ont été explorées lors de ce stage : (4.1) une analyse de la diversité génétique de cette

famille en fonction de l’origine des biofilms récoltés à partir d’une station d’épuration et d’un cours

d’eau, et (4.2) des tests de croissance avec des antibiotiques, des biocides, des substances chlorées, et

des éléments traces métalliques.

4.1. Les bTPMT des réseaux d’eaux usées domestiques et hospitalières

Tout d’abord, ces études ont confirmé, via l’utilisation du gène tpm comme marqueur de diversité, une

richesse bactérienne moins importante dans les effluents hospitaliers qu’urbains, comme déjà observé

(Stalder et al., 2014). Cela laisse à penser que ces milieux pollués par des molécules médicamenteuses

sélectionnent certaines OTUs tpm ; donc certaines espèces. Les profils OTUs tpm des biofilms de la

rivière en amont et aval de la STEP n’étaient pas différenciés. L’effet dilution des effluents de STEP est

certainement un phénomène explicatif. Dans un cours d’eau, les médicaments et biocides sont fortement

dilués limitant ainsi leur rôle dans la sélection des bactéries présentes dans un biofilm. Par contre, les

OTUs tpm présentes dans les biofilms des effluents urbains étaient différentes de celles des biofilms de

la file hospitalières. Il semble que cette différenciation entre files serait liée au différentiel dans le

contenu en substances médicamenteuses. Différentes OTUs tpm auraient été sélectionnées en fonction

de leur résistance et de leur capacité de détoxification des cocktails de médicaments présents dans ces

deux files d’épuration. De plus, des synergies entre molécules peuvent exister (Acar et al., 1975).

Comme observé lors de ce stage, toutes les molécules ne sont pas retenues de la même manière par les

biofilms, et ceci peut conduire à des cocktails très différents entre file d’épuration (Davies, 2003). La

pénétration des molécules au sein des biofilms dépend de leurs propriétés mais aussi de celles de la

matrice du biofilm. Les relations entre OTUs et ces molécules peuvent donc expliquer les différences

de structure des communautés de bactéries bTPMT+ au sein des biofilms de cette étude. Toutefois, il

est à noter que les volumes d’eau de la file hospitalière étaient beaucoup plus faibles que ceux de la file

urbaine. Ceci a donc induit un temps de résidence des eaux en cours d’épuration plus long dans le

clarificateur de la file hospitalière, pouvant impacter le développement des biofilms mais également les

temps d’exposition aux polluants chimiques.

L’espèce la plus retrouvée par inférences taxonomiques via l’analyse des séquences tpm, H. aquaticum

a souvent été retrouvée dans les milieux hydriques (Ding, 2004). Dans cette étude, cette espèce était

davantage présente dans les effluents hospitaliers et urbains que dans la rivière. Cependant, elle est

connue pour être sensible aux antibiotiques présents dans le milieux de prélèvement, notamment la

Lévofloxacine, le Triméthoprime et le Sulfaméthoxazole (Regunath et al., 2015). Les génotypes tpm

observés dans la file hospitalière pourraient être reliés à des formes résistantes aux antibiotiques. Ces

formes pourraient avoir émergé grâce à des acquisitions de gènes de résistance aux antibiotiques (GRA)

ou à la sélection de mutations génétiques. En effet, les hôpitaux sont des sources de multi-résistances

aux antibiotiques (Norrby, 1991). Des résistances aux antibiotiques ont déjà été décrites dans les STEP

(Chagas et al., 2011) ainsi que la dissémination d’intégrons qui sont des supports génétiques explicatifs

Figure 10 : Test de croissance utilisant le tachnologie Omnilog combo basée sur des mesures de respiration de l’INT-formazan. Les molécules favorisant (A) ou défavorisant (B) la croissance des souches de P. aeruginosa PAO1 sur-exprimant la bTPMT (en vert) sont présentées. La souche mutée au niveau du gène tpm est représentée en rouge. Les concentrations sont celles des 4 puits de la plaque Omnilog et sont croissantes. Un ratio inférieur à 0,5 est considéré comme une inhibition significative de la croissance.

A

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Patuline2,2’-dipyridil

Bromure�de�Domiphène

2,2’-dipyridil

Patuline

Bromure�de�Domiphène

Ratio aire observée/aire maximale de production d’INT formazan

Ratio aire observée/aire maximale de production d’INT formazan

Gradient de concentration

Gradient de concentration

21

d’une partie des disséminations rapides de ces résistances (Stalder et al., 2014). De plus, cette espèce a

déjà été associée à des bactériémies humaines (Regunath et al., 2015). La présence de tpm de candidatus

N. defluvii, peut par contre s’expliquer par un rôle fonctionnel majeur dans l’épuration via la

transformation du nitrite en nitrate durant le traitement des eaux usées (Lücker et al., 2010). Les tpm de

cette espèce ont été uniquement retrouvés dans les biofilms des files urbaines et hospitalières. Il est

également à noter que l’OTU tpm la plus abondante de la file hospitalière était clairement liée à un

groupe fonctionnel ayant un rôle dans la transformation des substances soufrées dont probablement les

sulfites et sulfure d’Hydrogène (H2S). Plusieurs espèces pathogènes opportunistes de l’homme arborant

le gène tpm semble avoir été favorisées par la file hospitalière, comme A. caviae, A. sobria, P. flavescens

ou P. putida. Cela peut être dû à une acquisition de GRA, ou aux plus fortes tolérances aux antibiotiques

présents dans les effluents hospitaliers. La présence de tpm d’A. caviae dans les biofilms de rivière, en

aval de la STEP, semble résulter de la non élimination de cette bactérie par le système de traitements de

la STEP. Cette bactérie a déjà été mise en évidence dans les eaux usées, et des défauts d’abattement ont

été reliés aux facteurs climatiques (Monfort and Baleux, 1990).

D’autres molécules liées au milieu hospitalier pourraient expliquer les biais de répartition des OTU tpm

observés avec la file urbaine. Par exemple, l’Iohexol (utilisé à l’hôpital) peut augmenter l’effet des

antibiotiques (Klessig et al., 2003). L’Iohexol est mal éliminé par les traitements conventionnels des

eaux usées (Papoutsakis et al., 2015). Cette molécule a donc été retrouvée dans les biofilms de la file

hospitalière. Il est à noter que l’Iohexol est un indicateur de la présence d’eaux usées d’origine

hospitalière. Pour le reste des polluants, les concentrations mesurées dans les deux types d’effluents

semblent dépendre de leur utilisation en amont, mais aussi de la capacité des biofilms à les concentrer.

4.2. Rôle de la bTPMT dans la résistance aux antimicrobiens Pour comprendre les phénomènes associés aux biais de répartition des bactéries TPMT+ observés dans

la section précédente, il sera essentiel d’approfondir l’étude des co-occurrences (ou déséquilibre de

liaison) entre tpm et des GRA comme dans le cas des espèces H. aquaticum, P. putida et A. caviae plus

fortement présentes dans les biofilms de la file hospitalière. Toutefois, il est également essentiel

d’explorer les résistances conférées directement par les bTPMT en fonction des cocktails chimiques

observés. Ces tests ont débuté par une validation d’une implication dans les phénomènes de résistance

au tellurite (te-r) en utilisant P. aeruginosa PAO1 comme souche modèle. Ces tests n’ont pas permis de

montrer de différence de sensibilité entre la souche surproductrice de bTPMT et le mutant délété du

gène tpm. Ceci est lié au fait que les bactéries te-r expriment un résistome complexe lorsqu’exposées au

tellurite incluant l’expression de plusieurs réductases (Cournoyer et al., 1998). Ces réductases réduisent

le tellurite en Te, une forme non-toxique. Ce Te s’accumule dans le périplasme, et donne une couleur

noire aux colonies (Prigent-Combaret et al., 2012). L’odeur d’ail métallique du DMTe a cependant été

détectée chez la souche surproductrice de bTPMT exposée au Tellurite. Cette odeur provient des gaz

émis lors de la méthylation du tellurite par la bTPMT sous la forme de DMTe et DMDTe non toxiques

(Cournoyer et al., 1998). L’antibiogramme de la souche P. aeruginosa surproductrice de bTPMT a, par

22

la suite, été réalisé et comparé avec celui de la souche avec un tpm muté. Aucune différence n’a été

observée. La bTPMT ne peut donc expliquer les biais de répartition des séquences tpm en fonction de

la présence des antibiotiques testés et potentiellement présents dans les biofilms de l’étude.

D’autres molécules seraient donc liées aux changements de communautés bTPMT+. Pour identifier ces

molécules, les phenotypic microarrays de l’Omnilog ont été utilisés. Ainsi, la souche surproductrice a

montré une résistance plus élevée au chlorure de Fer (FeCl3.6H2O ; un floculant bactéricide pour le

traitement des eaux usées et potables), au Niaproof (détergent à base de soufre), à la colistine et la

tylosine (antibiotiques). Par contre, cette souche sur-productrice était plus sensible que le mutant à la

Patuline (mycotoxine), le Bromure de Domiphène (antiseptique) et au 2,2'-dipyridil (bipyridine). La

plus forte résistance au Niaproof de la souche surproductrice peut s’expliquer par des transformations

de la molécule par la bTPMT. En effet, le Niaproof contient un groupement sulfate dont l’atome de

Soufre pourrait être méthylé par la bTPMT. Ce type de réaction a déjà été observé mais sans préciser le

rôle de la bTPMT (Kiene, 1988). Des résistances des bactéries du genre Pseudomonas avait été

rapportées (Timothy, 1999). Ces bactéries pourraient dégrader ces molécules et les utiliser comme

source de Soufre et d’énergie pour leur croissance (Kahnert and Kertesz, 2000). Cette résistance au

Niaproof conférée par la bTPMT conforte l’idée d’un rôle dans la détoxication de substances soufrées

retrouvées dans les réseaux d’eaux usées.

Une analyse des substances autorisées pour la potabilisation de l’eau montre que plusieurs molécules

soufrées peuvent être utilisées (selon la circulaire 2000/166 du 28 mars 2000 de la Direction Générale

de la Santé, France). Seul l’Aluminium sulfate et le chlorure ferrique ont ainsi pu être testés par

l’approche Omnilog. La souche PAO1 sur-productrice de la bTPMT n’a pas montré de différence de

croissance avec le sulfate d’Aluminium. Par contre, une croissance plus forte a été observée en présence

de chlorure ferrique. Cette molécule présente un caractère bactéricide en raison des atomes de chlore.

Les raisons d’une modification de la sensibilité de P. aeruginosa face à cette molécule via la bTPMT

sont actuellement difficiles à établir mais pourraient être liées aux interactions Cl et S pouvant conduire

à la production de chlorosulfate de fer. La bTPMT agirait donc potentiellement sur des sous-produits

d’interactions chimiques entre les composantes du milieu, et diminuerait la toxicité de ces sous-produits

par méthylation du soufre.

D’autres molécules ont montré une toxicité moindre sur la souche sur-productrice de bTPMT de P.

aeruginosa. La Colistine est un médicament de dernier recours face à Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii (Berlana et al., 2005). C’est un antibiotique

polypeptidique du groupe des polymyxines E (Vidaillac et al., 2012). Il a été rapporté que la Colistine

peut être sulfométhylées par des mécanismes qui sont toujours mal connus (Li, 2004). Cet antibiotique

a été utilisé pour traiter des infections à Pseudomonas aeruginosa chez des patiaents atteints de

mucoviscidose (Schneider-Futschik et al., 2018). La présence d’une enzyme pouvant modifier

l’efficacité de la Colistine chez ces bactéries est donc très préoccupante mais le changement de

sensibilité induit par la bTPMT semble limité. La Tylosine est un antibiotique bactériostatique qui vient

23

se fixer sur le ribosome, inhibant ainsi la traduction (Gaynor and Mankin, 2003). Cet antibiotique est du

groupe des macrolides. Le mode d’action de la bTPMT permettant de modifier la sensibilité face à cet

antibiotique est difficile à inférer avec les informations actuelles. Il est cependant possible que la bTPMT

puisse modifier certaines interactions avec les ribosomes en méthylant certaines composantes. Un

mécanisme de résistance impliquant des méthyltransférases a déjà été observé chez l’actinomycete

Streptomyces fradia (Liu and Douthwaite, 2002).

Les souches PAO1 sur-productrices de bTPMT étaient plus sensibles à la Patuline (mycotoxine), au

Bromure de Domiphène (antiseptique) et au 2,2'-dipyridil (bipyridine) que le mutant délété du gène tpm.

La Patuline, une mycotoxine, a une forte affinité pour les groupements thiols (Puel et al., 2010), comme

la bTPMT qui méthyle le groupement thiol de la 6-MP. Il faut noter que la Patuline perd son effet

bactéricide lorsqu’elle interagit avec la cystéine, un acide aminé qui possède un groupement Thiol

(Lindroth and von Wright, 1990). Si la bTPMT méthyle le groupement Thiol de la cystéine, il ne pourrait

donc plus interagir avec la Patuline qui conserverait alors ses propriétés toxiques. Cela pourrait expliquer

le fait que la souche surproductrice de bTPMT résiste moins à la Patuline. Pour le Bromure de

Domiphène et la 2,-2’dipyridil, des modifications de leurs modes d’action via la bTPMT n’ont pu être

inférées en fonction des éléments actuellement disponibles dans la littérature.

Pour poursuive ces études, des analyses complémentaires seront nécessaires pour valider les

changements de résistance observés. Plusieurs pistes très intéressantes ont été identifiées dont des

transformations possibles via la bTPMT de désinfectants utilisés dans les filières de traitements des eaux

usées, et un rôle de la bTPMT dans la résistance aux Colistines et Tylosines. Des tests de résistances

(avec détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices) par méthodes de cultures classiques

seront nécessaires pour valider ces résultats. Par la suite, il serait intéressant de rechercher les molécules

identifiées dans la 2e partie de ce projet au sein du site d’étude (STEP de Bellecombe).

Il sera ensuite nécessaire d’étudier les conditions d’expression du gène tpm chez ces bactéries. Ces

études pourraient débuter par des analyses en RT qPCR avec la souche P. aeruginosa PAO1 naturelle

poussant en conditions de micro-aérophilie (2% d’oxygène) et en présence de Tellurite, mais à des

concentrations assez faible (7,5 µg/mL) pour éviter la dégradation des ARNm. En effet à 40 µg/mL, les

propriétés oxydatives de ce métalloïde dégradent les transcrits (Prigent-Combaret et al., 2012). Des

analyses d’expression de tpm en présence d’autres substrats comme la Colistine seront également à

effectuer.

24

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Effluents hospitaliers et stations d’épuration urbaines : caractérisation, risques et traitabilité-Presentation et premiers resultats. Rapport sipibel.

Annexes

Figure S1 : Courbes de raréfaction des nombres d’OTU tpm en fonction des nombres de reads tpm analysés pour le jeu de données complet (A – biofilms de STEP et rivière) ou restreint (B – uniquement STEP). U = file urbaine de la STEP de Bellecombe (voir Fig. 1) ; H= file hospitalière de la STEP ; RU = biofilms de la rivière en amont du point de rejet de la STEP, et RD= biofilms de la rivière en aval du point de rejet de la STEP.

A

B

Tableau S1 : Concentrations en paramètres microbiologies mesurés dans les biofilms. Les biofilms étaient placés à environ 5cm de profondeur dans les clarificateurs des files urbaines et hospitalières de la STEP de Bellecombe ainsi que dans le milieu récepteur, l'Avre, en amont ou en aval de la STEP. Les paramètres phyco-chimiques mesurés dans l'eau ainsi que les paramètres climatiques sont également présentés. Les P. aeruginosa et A. caviae ont été dénombrés, les autres données microbiologiques ont été quantifiées par qPCR par Marjolet et.,al. Les mesures des paramètres climatiques ont été fournies par l'INRA de Thonon.

Tableau S2 : Concentrations en médicaments mesurés dans les biofilms (B) ou dans l'eau (W). Les biofilms étaient placés à environ 5cm de profondeur dans les clarificateurs des files urbaines et hospitalières de la STEP de Bellecombe ainsi que dans le milieu récepteur, l'Avre, en amont ou en aval de la STEP. Les concentrations e médicaments ont été mesurées par Labanowski et al. (U. Poitiers).

Suite du tableau S2 :

Tableau S4 : Liste des molécules utilisées pour les tests de croissance Omnilog Combo de P. aeruginosa PAO1 surproducteur de la bTPMT ou muté au niveau du gène tpm. Les phenotypic microarray (PM) 11 à 20 ont été utilisée.

PM11 PM12 PM13 PM14 PM15 PM16 PM17 PM18 PM19 PM20

Amikacine Penicilline�G Ampicilline Acriflavine Procaine Cefotaxime D-Serine Ketroprofène Josamycine Amitriptyline

Chlortetracycline

TetracyclineDequalinium�

chlorideFuraltadone

Ganidine�hydrochloride

Phosphomycine

B-Chloro-L-alanine

Sodium�pyrophospha

te

Acide�gallique

Apramycine

Lincomycine Carbenicilline Nickel�chloride Sanguinarine Cefmetazone

5-Chloro-7-Iodo-6-hydroxy-quinoline

ThiosalicylateThiamphenic

olCoumarine Benserazide

Amoxicilline Oxacilline Aziocilline 9-Aminoacridine D-Cycloserine NofloxacineHygromycine�

B

3,4,4'-Trichlorocarb

anilide

Methyltroctyl�ammonium�

chloride

Orphenadrine

Cloxacilline Penimepicycline 2,2'-Dipyridyl Acide�Fusarique EDTA Sulfanilamide EthionamideAcide�

pipemidiqueHarmane

d,L-propranolol

Lomefloxacine

Polymyxine�B Acide�oxolinique

Sodium�arsenate

5,7-Dichloro-8-Hydroxy-

Trimethroprime

4-Aminopyridine

Azathioprine2,4-

DintrophenolTetrazolium�

violet

Bleomycine Paromomycine6-Mercapto-

purineAcide�Borique

5,7-Dichloro-8-Hydroxy-quinoline

Dichlofuanide

Sulfachloro-pyridazine

Poly-L-lysineChlorhexidin

eThioridazine

Colistine Vancomycine Doxycycline1-Hydroxy-pyridine-2-

Acide�fusilique Protamine�sulfate

Sulfamono-methoxine

SulfisoxazoleUmbelliferon

eAtropine

MinocyclineD,L-Serine�

hydroxamatePotassiul�chromate

Sodium�cyanate A,10-Phenanthroline

Cetylpyridinium

OxycarboxinePentachlorop

henolAcide�

cinnamiqueOrnidazole

Capreomycine

Sisomicine CefuroxineCadmium�chloride

Phleomycine1-Chloro-2,4-dinitrobenze

ne

AminotriazoneSodium-m-arsenite

Disulphirame3,6-Diamino-

acridine

Demeclocycline

Sulfamethazine 5-Fluorouracii IodoacetateDomiphen�bromide

DiamineChlorpromazin

eSodium�Bromate

INTCiprofloxacin

e

Nafcilline Novoblocine RolitetracyclineSodium�

dichromateAcide�nordihydro-

guaiaretiqueCinoxacine Niaproof

Sodium�cyanide

Phenyl-methylsulfonyl�fluoride

18-Crown-6�ether

Cefazoline2,4-Diamino-

6,7,diisopropylpteriCytosine-1-beta-

D-arabino-Cefoxitine Alexidine

Streptromycine

Compound�48/80

Sodium�Metasilicate

FCCP Crystal�violet

Enoxacine Sulfadiazine Geneticine Nitrofurantoine Nitrofurazone 5-Azacytidinesodium�

tungstateSodium�

periodateAcide�D,L-Thioctique

Dodine

Acid�Nalidixique

Benzethonium�chloride

Rouge�de�Ruthenium

Sodium�metaborate

Methyl�viologenRifamycine�

SVLithium�chloride

Antimony�chloride

LawsoneHexa-

chlorophene

cefotaxime Tobramycine Cesium�chlorideChloramphenico

l3,4-Dymethoxy-benzyl�alcohol

Potassium�Tellurite

DL-Methionine�hydroxamate

Semicarbazide

Phenethicilline

4-Hydroxy-coumarine

Erythromycine

Sulfathiazone Glycine Piperacilline OleandomycineSodium�Selenite

Acide�tannique

Tinidazole Blasticidine�SOxytetracycli

ne

Neomycine Acide�5-FluorooroticThallium�acetate

Sodium�metavanadate

PuromycineAluminium�

sulfateChloracmbucil Aztreonam

Sodium�caprylate

Pridinol

Ceftriazone Spectinomycine Cobalt�chloride Chlorythrine CCCPChromium�chloride

Cefamandole NifedipineLauryl�

sulfobetaineCaptan

Gentamicine SulfamethoxazoleManganese�

chlorideCarbenicilline Sodium�azide Ferric�

chlorideCefoperazone Guanazole

Dihydro-streptromyci

ne

3,5-Dinitro�benzene

NorfloxacineL-Aspartic- b -hydroxamate

Trifluoperazine Sodium�nitrite MenadioneL-Glutamic�acide�y-

hydroxamateCefsulodine Myricetine

Hydroxylamine

Hydroxy-quinoline

Cephalothine Spiramycine Cupric�chloride EGTA 2-NitroimidazoneGlycine�

hydroxamateCaffeine Colchicine

Hexamine�cobalt�

chloridePatuline

Kanamycine Rifampicine Moxalactam Promethazine HydroxyureaChloroxyleno

lPhenylarsine�

oxyde2-

PhenylphenolThioglycérol Tolyfluanide

OfloxacineDodecyltrimethyl�

ammonium�bromideTylosine

Sodium�orthovanadate

Zinc�chloride Acide�Sorbique

Salicylate Plumbagine Polymyxine�B Troleandomycine

Tableau�S4�: �Liste�des�molécules�utilisées�pour�les�tests�de�croissance�Omnilog�Combo�de� P.�aeruginosa �PAO1�sur-producteur�de�la�bTPMT�ou�mutée�au�niveau�du�gène�tpm .�Les�phenotypic�microarray�(PM)�11�à�20�ont�été�utilisées.�

>séquence d’ADN obtenue à partir d’une amorce interne tpm (pIApX2-F) : GGGCATCCGGWCCTGMTCCTGTACCTCCGCATTCGTGGGAAAAACCGCAAGGTGGCGACA ATCGG TCTAGAGGATCC GCACGCCCCACCCGGTGTTGTAGCGTGCTTACAGTTTGGCGATGAGGCGAACCTGCATCA CCAGGGCGCTACTGATGACCGTCAGTAGCCAGCGGGGTGAAATCAAAGTTGATGGCATTA TGTGTTCAGAAGGCCGGTTTATCAAGCAGCGCCGGGGTTTACTGGCCTCTGGAGGTTATT TGACCGCGACCACCGCGCCCTCGGGGATGGGAGCAGGGAGCGCAATGGCAGTGGCTCCGA GGCGGCGTGTGACTAACTGGCCGTTGCGCCTGACGCCAACTAGGTCGGATTCCGTACCGG CATCCACGGCTGCCGCCAGCCCTGCCGGCGGCGAGGCGATGAAGGCGTAGCTGGTGCCGG CGGCGATGTAGCCCTGAAGCCGCACTGGCTTGCGGAACCAGGCCGGTAGACCAAGAGCGG AGTCCGCCGGCGAACCGCTGAAACCGGGGTTGGCGTGTGCGTACTCCGCCAGCCTGGAGC GGTAGAGCAGCAAGCTCCTGGCCAGGGTGTCGACCTCGGCCAGTTCGGCGCTCGAGGTCG CGTGGTTGCTTTGTACACTCAGCCAGGTCCCGGTGATCAGCGCGAGCACCAGGACGATCC ACATCAGCGGCATATGGCAGTCCTTGAGTCGTGGCGACCTGCTAGTTCACGCAGGTAACG GTGACGTTGGTCGAGTCGGGGGTCTTGTAGGGCTCCGGATAGTTGAAGCCCGGGCCGATC TCGGTGATCAGGCCGAACGAAGTAGTTGGTGCCAAAGGTCTGGTTGAAGCCCACCGCGCA GAATCGGCCGCCGCAGGTGATCGCGTAGCGGACATAGTCGTAATACATCATGCCGCTGTC CTGGCCGTGCAACGTAMACCAGTCCTTGATC CCCGGGTACCGAGCTCAAATCGAATCATGTCATACCTGTTTCCTGGGGAAATTGTTATC GTCCAATTCCCACCCCAACCCGGAAACTAAAGGGTAAGCCGGGGGGGCCAAAGGAGGGA CCACCCCCATTATTTGGTTGGCWCACTGGCCCCTTTCTATCGGRAAACTGTCGTGCCCT ATGTTWAAAAAAATGCCAACCWCGGGGAAAGGGGTTTTATAGGGACTCTTCGATTACAA ACAGAACAAAACCATAGGGTTGGAGGGAAAAATATAAYATAGGGGRATGKTTTYAMTAG GGGGAGAGAAAAAATTTAGAAGCCAAAGAAAAAAAAAGTKTTGRTTTTTTCCCCCCGAA AATACAAACGGAAAMTAAAGAAAACCMDCCCAGCCCCATACATAATACTATMCGG Figure S4 : Carte et analyse des séquences du vecteur pIApX2::tpm pour valider le positionnement du gène tpm.

pIA (séquence du plasmide)

tpm

pX2 (Promoteur constitutif fort)

SmaI KpnI SacI

XbaI BamHI

Figure S5 : Construction du vecteur contenant le gene tpm tronqué de 531 bp, utilisé pour la construction du mutant tpm Pseudomonas aeruginosa PAO1'tpm. Le mutant a été construit par conjugaison avec E. coli pEXG2 (SmaI) 'tpm puis par recombinaison homologue. Les mutants P. aeruginosa PAO1'tpm ont été sélectionnés grâce au marqueur suicide sacB.

PCR

Insertion dans le vecteur plasmidique par technique SLIC en utilisant l’ADN Polymérase T4.

Tableau S6 : Utilisation des molécules dont les concentrations ont été mesurées dans les biofilms des clarificateurs de la STEP de Bellecombe.

molécule fonctions

Aciclovirinhibiteur spécifique des virus de l’ herpes dont Herpes simplex (HSV) types 1 et 2, et varicelle-

zona (VZV)

Atenolol Anti-dépresseurBézafibrate HypolipidéminantsClofibrate Hypolipidéminants

Diazépame AnxiolytiqueDiclofénac anti-inflammatoires non stéroïdiens

Epoxycarbamazépine Anti-convulsif

Iohexol Utilisé en milieu hospitalier, produit de contraste

Kétoprofène Anti-inflammatoire non stéroïdien

Métronidazole antibiotique - bactéries anaérobies, surtout les bacilles Gram - et les bacilles Gram + sporulés

Propanolol Anti-dépresseursRanitidine antihistaminique H2 qui inhibe la production d'acide gastrique

Roxithromycinemacrolides, spectre assez comparable à celui de la pénicilline G : cocci Gram + et -, bacilles

Gram +. Totalement inactifs sur les entérobactéries et sur Pseudomonas )

Sulfaméthoxazole sulfamides ; utilisé en association avec le triméthoprime

Résumé : Les effluents hospitaliers sont des milieux fortement pollués par des médicaments, antiseptiques,

détergents et biocides. Ces eaux représentent un cocktail favorable aux échanges génétiques entre

espèces bactériennes dont des formes pathogènes. Une enzyme bactérienne, la Thiopurine-S-Méthyl

transférase (TPMT), codée par le gène tpm, pourrait être impliquée dans la détoxication de certaines de

ces molécules, et expliquer l’occurrence de Pseudomonas aeruginosa et Aeromonas caviae dans ces

réseaux. Pour vérifier cette hypothèse, la diversité des gènes tpm dans des biofilms bactériens présent

dans les clarificateurs d’une station d’épuration a été comparée entre des files urbaines ou hospitalières.

Après amplification et séquençage NGS des amplicons tpm, l’occurrence des OTUs tpm a été confrontée

aux concentrations mesurées en médicaments. Ces OTUs ont pu être classées au sein de certains taxons

bactériens. Ceci a permis d’observer une association entre le nombre de séquences tpm affiliées aux

espèces P. putida et A. caviae au sein des biofilms de la file hospitalière, et la présence de certains

médicaments. Pour préciser le rôle de la TPMT dans la résistance ou tolérance aux antimicrobiens

présents, des tests de croissance ont complété cette étude. Ces tests ont permis d’observer une relation

entre la résistance à un biocide et un floculant avec effet bactéricide.

Abstract : Hospital wastewaters are highly contaminated by drugs, antiseptics, detergents and biocides. These

waters represent a supportive environment for genetic exchanges between bacterial species including

pathogens. A bacterial enzyme, the Thiopurine-S-Methyltransferase (TPMT), encoded by the tpm gene,

could be involved in the detoxification of some of these molecules. This can explain the Pseudomonas

aeruginosa and Aeromonas caviae occurrence. To verify this hypothesis, the diversity of tpm gene in

bacterial biofilm presents in a wastewater epuration station was compared. These biofilms have been

developed in the urban or hospital treatment files. After tpm amplicons amplification and NGS

sequencing, the tpm OTUs occurrence was compared with the measured drugs concentrations. These

OTUs could be classified within certain bacterial taxa. This allowed to observe an association between

tpm sequences number affilied with P. putida and A. caviae present in the hospital biofilms, and the

presence of certain drugs. To clarify the role of TPMT in antimicrobial resistance, growth tests

completed this study. These tests showed a relation between the resistance to a biocide and a flocculant

with a bactericidal effect.