Analyse, Des Sirops

Projet de recherche: Rapport final

Programme de dveloppement des marchs des produits de lrable.(pdmp)-agriculture canada.

Projet #003Cooprative les producteurs de sucre drable du Qubec

Caractristiques chimiques et nutritives du sirop drable.Les acides amins de la sve et du sirop drable.

Par: Johanne Dumont, chimisteJacqueline Beaupr, technicienneCollaborateur

Publication no : 300-FIN-0394 St-Hyacinthe, mars 1994

Bureau de Qubec1140, rue TaillonQubec, Qc, G1N 3T9

Sige social3600, boul Casavant OuestSaint-Hyacinthe, Qc, J2S 8E3Tel : (450) 773-1105 Tel : (418) 643-8903Fax : (450) 773-8461 Fax : (418) 643-8350

Cent

Rsum

Des chantillons de sve, de concentr dosmose invers et de sirop drable rcolts chez troisproducteurs lors du printemps 1993 ont t analyss pour en dterminer la teneur en acides aminslibres.

Les acides amins les plus souvent dtects dans ces chantillons sont lacide aspartique,

larginine, la tyrosine et la cistathionine. Les chantillons les plus riches peuvent en compter plusde 10 diffrents des teneurs variant de 1 100 nmol/g de sucre alors que certains sirops nencomptent aucun.

On note un enrichissement en teneur et en varit en fonction de la saison, que lon peut relier deux facteurs, soit, la contamination microbienne accrue lorsque la temprature ambiante serchauffe et laugmentation du mtabolisme de larbre lapproche de lclosion des bourgeons.On peut dailleurs lier les dfauts de got dit de bourgeon une teneur accrue dacides amins dansla sve.

On note aussi des variations dans les profils dacides amins de la sve au sirop. Ces variationspeuvent aussi tre lies au traitement thermique, les acides amins ayant des ractivits variables,alors que dautres acides amins peuvent tre librs lors de lhydrolyse de rsidus protiquesprsents dans la sve.

Le rle des acides amins dans les produits drable, par leur faible teneur et les faibles varits,demeurent avant tout, un rle de prcurseur de got, bon ou mauvais, par leur participation auxractions de Maillard, pour former des armes plus ou moins souhaitables dans le sirop selon leuridentit et leur concentration. Il serait donc intressant de relier les profils dacides aminsobservs aux autres proprits de ces chantillons comme les profils darmes et leur qualitgustative.re de recherche, de dveloppement et de transfert technologique en acriculture (Le Centre ACER Inc.) Page ii

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Table des matires

Introduction ...................................................................................................................................................1

Matriel et mthode.......................................................................................................................................2

chantillons de sirop de concentr d'osmose inverse et deau drable ..................................................2Mthodes danalyses .................................................................................................................................2

Particularits de la mthode: .................................................................................................................3Prparation des sirops drable..............................................................................................................3Prparation des sves drable. .............................................................................................................3

Rsultats et discussion...................................................................................................................................4

Conclusion.....................................................................................................................................................5

Remerciements ..............................................................................................................................................5

Bibliographie.................................................................................................................................................9

Centre de recherche, de dveloppement et de transfert technologique en acriculture (Le Centre ACER Inc.) Page 1

Introduction

Les constituants des protines sont les acides amins communs au nombre de 20. Dans les plantes,comme dans le rgne animal, on rencontre au moins une centaine dautres acides amins, que lonrencontre habituellement sous forme dacides amins libres ou de petits peptides et de trs faiblesconcentrations. Ils peuvent alors avoir diffrentes utilisations, comme dulcorant ou mme comme agentbactriostatique (Bodwell et Lipton, 1978).

Ds 1963, Underwood (1963) avait reli le got particulier du sirop drable de fin de saison (sirop debourgeon) une augmentation en composs azots dans la sve. Le test la ninhydrine tant positif, cescomposs azots seraient donc de type amin. Plus tard, Morselli et Whalen (1986) observent aussi que lateneur en acides amins totaux augmente juste avant lclosion des bourgeons. Plus tard, Waseem et coll.1991 rapporte laugmentation en concentration de composs azots, comme les cytokinines et lacideabscisique, qui peuvent aussi avoir des effets sur le got (Kuninaka, 1981).

Dautre part, la prsence dacides amins peut aussi avoir un effet positif sur le dveloppement du got.On connat leur rle dans les ractions de Maillard (Danehy, 1986). Lidentit des acides amins a alorsune importance prpondrante, les armes dvelopps variant selon le type dacide amin, allant du gotde caramel, au got de noisette, de viande ou de pain grill.

Les acides amins libres sont prsents de trs faibles concentrations dans les vgtaux et dans lesproduits dorigine vgtale. Ainsi, Astonen et Kallio (1989) ont dtect des teneurs de lordre de1 mg/litre dans la sve de bouleau. Dans le miel, les teneurs sont un peu plus importantes, de lordre dequelques dizaines de mg/100 g (Gilbert et coll., 1981). Mis part les sirops de fin de saison, les acidesamins libres seraient prsents des concentrations beaucoup plus faibles dans la sve drable, soit delordre du nanomole par gramme de matire sche (Morselli et Whalen, 1986).

Pour dtecter et caractriser de si faibles concentrations dacides amins, nous devons donc utiliser unemthode sensible. Les mthodes habituelles de chromatographie gazeuse ou liquide, ncessitent unedrivation des acides amins pour les rendre plus facilement dtectables (Robert et coll., 1987, Winspearet Oaks, 1983, Bindlingmeyer et coll., 1987).

Dans le prsent travail, nous avons choisi la mthode Picotag, parce quelle correspond nos exigencesde sensitivit, quelle est relativement rapide et que le systme de chromatographie ncessaire pour cetype danalyse tait dj partiellement en place dans notre laboratoire (White et coll., 1986).

Des analyses dacides amins seront donc effectues dans des chantillons deau, de concentr dosmoseinverse et de sirop drable pour en vrifier la variation de teneur et didentit. Leffet du procd detransformation sur ces teneurs sera pris en compte. Le rle et le potentiel possibles des acides aminsidentifis pourront tre proposs.


Matriel et mthode

chantillons de sirop de concentr d'osmose inverse et deau drable

Les chantillons deau, de concentr dosmose inverse et de sirop drable provenant de 2 producteursdiffrents furent rcolts durant une partie de la saison 1992 et ont servi dvelopper la mthodedanalyse dacides amins. Des chantillons rcolts lors de la saison 1993 (3 producteurs) ont par la suitet analyss par cette mthode. Les chantillons deau et de concentr dosmose inverse ont t prlevsdans des bouteilles de matire plastique de 4 litres et placs au conglateur jusqu leur transport aulaboratoire. Au laboratoire, les chantillons ont t placs -40 C jusqu lanalyse. Le sirop a tconditionn chaud (85C) lrablire, et entrepos 4 C au laboratoire, jusqu lanalyse.

Mthodes danalyses

Un systme HPLC (chromatographie liquide haute performance) compos de 2 pompes 510 Waters, duninjecteur automatique 717 Waters, dun chauffe-colonne Waters, dun dtecteur U.V. variable 490EWaters, dune colonne AminoTag Waters et dun systme de contrle informatis permettant de contrlerle gradient de dbits des luants et de faire lacquisition des donnes et les calculs, constituelappareillage principal ncessaire pour faire les analyses requises.

Les autres pices dquipement requises sont un systme dvaporation sous-vide Picotag, un agitateur vortex et diverses pipettes automatiques pouvant dlivrer de 1 1000 l.

Les conditions danalyse chromatographique sont les suivantes :gradient des luants A et B dcrits ci-aprs, injection de 20 l, dtection U.V. une longueur donde de245 nm et une sensibilit de 0.05 AUFS et une temprature de colonne de 46 C

Des prcautions sont ncessaires pour prserver le bon fonctionnement de lappareil: on doit apprter lespompes chaque dmarrage et purger la cellule du dtecteur ainsi que linjecteur chaque semaine. Ondoit toujours laisser un dbit minimum surtout pour la pompe A car le tampon corrode srieusement lescomposantes. On doit aussi laisser un dbit minimum la pompe B pour viter le choc de mlange desluants qui peut crer des bulles dair.

La phase mobile est constitue dun gradient des luants suivant:

luant A: 19.0 g dactate de sodium tri-hydrat et dilu avec de leau ultra-pure dans une fiolejauge dun litre et ajust un pH de 6.10. Neuf-cent-quarante ml de cette solution sontmlangs 60 ml dactonitrile et filtr sur filtre 0.45 et conserv au rfrigrateur(maximum 1 mois). Juste avant lusage, la solution est dgaze au bain ultrasonspendant 30 minutes.

luant B: 600 ml dactonitrile et 400 ml deau ultra-pure sont mlangs et filtrs sur membrane0.45 et conservs au rfrigrateur (maximum 1 mois) jusqu utilisation. Juste avant desen servir, la solution est dgaze au bain ultrasons pendant 30 minutes.


Particularits de la mthode:

Il faut toujours porter des gants car les acides amins de nos mains sont le plus grand risque decontamination. On peut congeler les chantillons aprs chaque tape de schage.

La sarcosine forme un compos instable et ne peut pas tre dos quantitativement parla mthode PicoTag.

L'ansrine sort entre la 1-mthyl histidine et la 3-mthyl histidine mais nest pas bienrsolue. On suggre de jouer avec le pH.

L'thanolamine ne peut pas tre analyse car elle est volatile et svapore pendant lesecond schage.

Lure ne se drive pas et nest donc pas dtecte.

Un exemple de chromatogramme est donn en annexe.

Prparation des sirops drable.

Environ 40 l de sirop est pes exactement dans une fiole de 350 l identifie au stylo indlbile. On yajoute ensuite 10 l de solution dtalon interne (acide -amino-caproque) et on agite vigoureusement auvortex. Quarante l deau ultra-pure sont ajouts et lchantillon est nouveau pass au vortex.

Les fioles de 350 l (environ 13) sont places dans un tube vide lequel est plac sous-vide dans lesystme Picotag muni dune trappe solvants propre et contenant suffisamment de glace sche. Le videest dabord ajust environ 500 millitorrs pour viter de faire bouillir les chantillons. Le sirop ayanttendance former une crote de sucre, il faut faire monter la lecture jusqu 1 torr pour quelquessecondes peine avant de laisser les chantillons pour la nuit. Ceci aura pour effet de faire mousser lesirop redevenu visqueux, vitant ainsi la formation de la crote. Lchantillon doit scher toute la nuit.

Le matin, quand les chantillons sont secs, le robinet vide est ferm en laissant la pompe fonctionner.On ajoute 20 l de solution de schage (mthanol: actate de sodium tri-hydrat 1M : trithanolamine(TEA), 2:2:1) et la prparation est passe vigoureusement au vortex. On sche sous vide jusqu 65millitorrs (environ 2 heures), puis on ajoute 20 l de solution de drivation (mthanol:phnylisothiocyanate (PICT):eau : TEA, dans les proportions de 7:1:1:1) et le tout est nouveau passvigoureusement au vortex. On laisse ragir ainsi temprature de la pice pendant 30 minutes puis onsche sous vide 65 millitorrs, environ 2 heures.

Enfin, on ajoute 200 l de diluant chantillon (luant B) et on agite au vortex. Lchantillon est ainsiprt tre inject dans le systme de chromatographie pour tre analys. La prparation reste stablependant 10 heures la temprature de la pice et jusqu 60 heures, si rfrigre.

Prparation des sves drable.

Pour les sves et les concentrs, on procde comme pour les sirops en pesant exactement 300 l de sveou 100 l de concentr.


Rsultats et discussion

Des essais prliminaires ont t effectus avec les chantillons du printemps 1992 pour mettre au point lamthode dcrite ci-haut. Les rsultats sont prsents en annexe et montrent que lon peut dtecter desquantits traces (nanomole, soit 10-9 mole, soit environ 0.0000002 gramme par ml de sve 2Brix). ces concentrations, la reproductibilit est variable dun compos lautre et dun chantillon lautre,lcart type relatif pouvant varier de 2 20%.

Au tableau 1, 2 et 3 on prsente les analyses des chantillons du printemps 1993. Les principaux acidesamins dtects dans la sve sont larginine, la proline lansrine, la 3-mthyl-histidine, et la tyrosine. Ondtecte aussi des frquences moindres, lacide aspartique, lacide glutamique, la 1-mthyl-histidine,lacide a-amino-n-butyrique, la valine, la cystathionine, la cystine et la lysine. Les concentrations sont engnral, de lordre de 0,5 nanomol/g dchantillon 1 Brix avec quelques exceptions dont lesconcentrations dpassent les 100 nanomol/g. Ce profil est un peu diffrent de celui que nous obtenionsavec les chantillons ayant servi au dveloppement de la mthode (1992), o on observait principalementlacide aspartique, lacide glutamique, larginine, lacide a-amino-n-butyrique et la mthionine desconcentrations qui ont tendance tre un peu plus leves. Sachant que les acides amins peuvent lafois provenir du mtabolisme de larbre et de celui des contaminations microbiennes et que lemtabolisme de larbre de mme que lactivit microbienne augmentent avec la temprature, on sattendeffectivement observer des concentrations plus importantes dacides amins en fin de saison.

Le tableau 2 illustre les profils dacides amins observs dans les chantillons de concentr dosmoseinverse. On observe une variation du profil des acides amins par rapport ceux observs dans la sve.Les principaux acides amins sont alors lacide a-amino-adipique, lhydoxy-proline, larginine, la 3-mthyl-histidine, la tyrosine et la lysine. On observe aussi la b-alanine, la proline, la 1-mthyl-histidine, lavaline, la cystathionine, la cystine et la d-hydroxylysine. Les concentrations ont tendance tre plusfaibles que dans les sves suggrant.une perte de ces composs lors de ltape de concentration parosmose inverse, soit par ractions chimiques, consommations par les microorganismes ou par affinitpour la membrane dosmose inverse.

Au tableau 3, on retrouve les profils dacides amins des sirops. Les principaux acides amins observssont alors, lacide aspartique, larginine, la tyrosine et la cystathionine. On dtecte aussi lacide a-amino-adipique, la glycine, la proline, la 3-mthyl-histidine et lacide a-amino-n-butyrique. Les concentrationsnormalises par gramme de saccharose ont tendance tre plus importantes que dans le concentrdosmose inverse. On observe aussi une augmentation de la concentration totale en fonction de la saison.Le traitement thermique agirait ainsi de deux faons sur le profil et la concentration en acides amins dansles sirops drable. Premirement, la disparition de certains composs peut sexpliquer par leurparticipation des transformations chimiques provoques par le traitement thermique subi danslvaporateur. En effet, on connat le rle que joue les acides amins dans les ractions de brunissementnon-enzymatique, telles que les ractions de Maillard (Danehy, 1986) o ils servent de catalyseur pour laformation de composs de type caramel. Ils participent aussi la formation de pyrazines, composs ayantdes gots assez relevs dont la prsence a dj t dtecte dans le sirop drable (Alli et coll., 1990).

Deuximement, laugmentation de la concentration globale en acides amins pourrait provenir delhydrolyse de protines prsentes dans leau drable, dont la prsence a dj t dtecte dans la sve(Bois et Nadeau, 1938) et qui peut tre de lordre de 50 100 ppm (Dumont et coll., 1993).


Conclusion

Les acides amins dtects dans les divers chantillons sont principalement des acides amins communscomposants des protines, sauf Iansrine, lacide amino-n-butyrique, lacide a-amino-adipique et lacystathionine. Les acides amins communs participent aux ractions de Maillard. Par exemple, larginineragirait avec les sucres prsents pour donner des gots sapparentant au pain, alors que la proline donnedes gots de craquelin. Lacide amino-n-butyrique pourrait donner des gots de noisette et lacideaspartique gote simplement sucr (Danehy, 1986). Lansrine et la cystathionine sont connus pour tredorigine animale. Ils peuvent alors provenir dune contamination ou bien sont des artefact de la mthodedanalyse (Merk,1983).

Le rle des acides amins dans les produits drable, par leur faible teneur, demeure avant tout, un rle deprcurseur de got, bon ou mauvais. Bien que lon peut dores et dj lier les fortes teneurs en acidesamins des sves de fin de saison au got de bourgeon, il serait intressant de relier les variations plussubtiles des profils dacides amins des autres chantillons aux autres observations obtenues dans lesautres volets du prsent projet, comme le profil darmes et la qualit gustative.

Remerciements

Nous dsirons dabord souligner la contribution financire du programme de dveloppement des marchsdes produits drable dAgriculture Canada ce projet et nous remercions les producteurs pour leurcollaboration lchantillonnage de mme que le personnel technique du Service des technologiesalimentaires pour leur assiduit au travail.


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