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Analyse statistique des séquences génomiques
DEA en bioinformatique
Marseille 10 Novembre 2000Laurent Duret
Plan• Taille des génomes, paradoxe de la valeur C
• Contenu informationnel
• Séquences répétées
• Organisation en isochore des génomes de vertébrés
• Projets génomes: état des lieux
• Recherche de gènes protéiques– Méthodes ab initio
– Utilisation des EST
– Approche comparative
• Recherche de régions régulatrices non-codantes– Méthodes ab initio
– Approche comparative
What is a genome ?1911 - gene:
Elementary unit, responsible for the transmission of hereditary characters
1920 - genome:
Set of genes of an organism
1944 - Avery et al.
DNA is the molecule of heredity
1950-70 :
Double helix
Genetic code
Mycoplasma genitalium0,6 Mb
Genomes sizes E. coli 4,7 Mb
YeastS. cerevisiae
13,5 Mb
NematodeC. elegans
100 Mb
ProtozoaAmoeba dubia
700 000 Mb
PufferfishFugu
rubripes400 Mb
Man3400 Mb
Xenopuslaevis
3100 Mb
AmphibiaNewt
100 000 Mb
DipnoiLungfish
150 000 Mb
ProkaryotesEukaryotes
13%2%85%Drosophila85%2%13%E. coli70%2%28% YeastS. cerevisiae
5%2%93%Man27%2%71%NematodeC. elegansProportion of functional elements within genomes
2%98%0,01%Lunfish (dipnoi)Coding (protein)RNANon-coding
Functional elements in the human genome
3.4 109 nt 50,000-100,000 protein-coding genes
81% no known function43%38%introns4%12%protein-coding regions
centromeres, telomeres,
RNA2%intergenic
Untranslated RNAs: Xist, H19, His-1, bic, etc.
Regulatory elements: promoters, enhancers, etc.
2% ??
How many genes in the human genome ?Fields et al. 1994
Technique Gene estimate Comments/assumptions
Estimation 100,000 if average size = 30 kb
Estimation 300,000 if average size = 10 kb
Transcribed genome 20,000
RNA reassociation 20,000 - 92,000
Genomic sequencing (1994) 71,000 biased toward gene-rich region?
CpG islands 67,000 assumes 66% human genes have CpG islands
EST analysis (1994) 64,000 matching with GenBank; 50% EST redundancy
Chromosome 22 (1999) 45,000 correction for high gene density on chrom. 22
Chromosome 21 (2000) + 22 40,000
Liang et al. (2000) 120,000 ESTErwing & Green (2000) 34,000 EST + chrom. 22Roest Crollius et al. (2000) 31,000 Fish / human
Structure of human protein genes
• 1396 complete human genes (exons + introns) from GenBank (1999)
• Average size (25%, 75%)
– Gene 15 kb ± 23 kb (4, 16) (10% > 35 kb)
– CDS 1300 nt ± 1200 (600, 1500)
– Exon (coding) 200 nt ± 180 (110, 200)
– Intron 1800 nt ± 3000 (500, 2000)
– 5'UTR 210 nt (Pesole et al. 1999)
– 3'UTR 740 nt (Pesole et al. 1999)
• Intron/exon
– Number of introns: 6 ±3 introns / kb CDS
– Introns / (introns + CDS): 80%
– 5' introns in 15% of genes (more ?), 3 ’introns very rare
• Alternative splicing in more than 30% of human genes (Hanke et al. 1999)
Structure of human protein genes
• GenBank: bias towards short genes
• 1396 complete human genes (exons + introns)
≤949596979899Publication date48121620Gene size (coding exons+introns) kb
5101520253035≤949596979899Publication dateGene size (coding exons+introns) kb
Structure of human protein genes
• GenBank: bias towards short genes
• 1396 complete human genes (exons + introns)
• 9268 complete human mRNA
Sequence:cDNA
complete gene (exons+introns)
400800120016002000889092949698Average CDS size (nt)Publication date
Overlapping genesN-myc geneN-cym geneIA IB II IIIIII II IPOL II
promoter
polyadenylationsite
transcriptionmaturation5'pm7GpppAAAAAAAAAAsmall nucleolar
RNA
mRNAoverlapping protein genessmall nucleolar RNA genes within intronsof protein genes
Tandem repeatsRepeated sequencesInterspersed repeatsDNA transposons retroelementsRecombination- DNA polymerase slippage:
CACACACACACA
- unequal crossing-over
motif bloc size % humangenome
satellite: 2-2000 nt up to 10 Mb 10%minisatellite: 2-64 nt 100-20,000 bp ?microsatellite: 1-6 nt 10-100 bp 2%
ADN satellite: centromères
CTTCGTTGGAAACGGGAsatellite α (171 )pb
(17 )site CenpB pb répétitions de satelliteα
répétitions d'ordre, supérieur spécifiques
de chaque chromosome( 10 )jusqu'à Mb
centromèrechromosome
Reverse transcriptase:RetroelementsNucleusCellRNADNAtranscriptionreverse transcriptionintegrationLINEs (long interspersed elements): 6-8 kbretroposons
SINEs (short interspersed elements):80-300 bpsmall-RNA-derived retrosequences (tRNA), pol III
Endogenous Retroviruses: 5-10 kb
LTR gag pol env LTRRetrovirusRetrotransposonRetroposonRetroséquenceRetrovirus
NucleusCellLINE reverse transcriptaseRetrosequences:opportunist retroelements
reverse transcriptionDNARNALINERNART protein
Pseudogenes1 - gene duplication generepeated elementinequal crossing-over2 - gene inactivation mutationA - pseudogenes derived from recombinationB - retropseudogenesgenepromoterAAAAAAtranscription + maturationmRNADNAretrotranscription + integrationAAAAAADNA
Retropseudogènes
• 23,000 à 33,000 retropseudogènes dans le génome humain
• Les gènes qui génèrent des retropseudogènes sont généralement de type housekeeping
• Gonçalves et al. 2000
Fréquence des éléments transposables dans le génome humain
• Total = 42% (Smit 1999)
0%4%8%12%AluLINE1MIRLINE2LTR elementsDNAtranposon
Fréquence des éléments transposables dans le génome humain (Smit 1999)
0%5%10%15%20%25%30%AluLINE1AutosomesChromosome X
Isochore organization of vertebrate genomes
Organisation en isochore des génomes de vertébrés: mise en évidence expérimentale
densité à l'équilibre, g/cm31,6901,7001,71030%41%51%satellitetaux C+Gcomposantmajeur
Fractionnement du génome de la souris par centrifugation en gradient de densité (Bernardi et al. 1976)
Analyse statistique des séquences publiées dans les banques de données.
Corrélation entre la composition en base en position 3 des codons et celle de l'envirronement génomique dans lequel se trouve le gène
Analyse statistique des séquences publiées dans les banques de données.
Distribution en fréquence des gènes dans les différentes classes d'isochores
CDS GC3%
0
1
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100
Moy = .612Ecart-t = .1585447 séq
0
1
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100
Moy = .639Ecart-t = .171818 séq
Homme Poulet
Nb
de
gèn
es (
%)
0
2
4
6
8
10
12
0 20 40 60 80 100
Moy = .509Ecart-t = .106703 séq
Xénope0 20 40 60 80 100
Danio
Moy = .580Ecart-t = .103173 séq
0
2
4
6
8
10
12
14
Evolution de la structure en isochore chez les vertébrés
Isochore organization of vertebrate genomes
• Insertion of repeated sequences (A. Smit 1996)
• Recombination frequency (Eyre-Walker 1993)
• Chromosome banding (Saccone, 1993)
• Replication timing (Bernardi, 1998)
• Gene density (Mouchiroud, 1991)
• Gene expression ?? -> No
• Gene structure (Duret, 1995)
isochore %C+G % total genomic DNA
L1+L2 : 33%-44% 62 %
H1+H2 : 44%-51% 31%
H3 : 51%-60% 3-5%
H1+H2L1+L2H3H1+H2L1+L2L1+L2>300 kbBernardi et al. 1985
Isochores and insertion of repeat sequences (Smit 1999)
4%8%12%16%20%AluLINE-1LTR-
elements
Density in repeat sequencesG+C content of genomic sequence:G+C < 39%G+C > 47%G+C 39%-47%
4419 human genomic sequences > 50 kb4419 human genomic sequences > 50 kb
Isochores and gene density
MHC locus (3.6 Mb) MHC locus (3.6 Mb) (The MHC sequencing consortium 1999)(The MHC sequencing consortium 1999)
Class I, class II (H1-H2 isochores): 20 genes/Mb, many pseudogenesClass I, class II (H1-H2 isochores): 20 genes/Mb, many pseudogenesClass III (H3 isochore): 84 genes/Mb, no pseudogeneClass III (H3 isochore): 84 genes/Mb, no pseudogene
Class II boundaries correlate with switching of replication timingClass II boundaries correlate with switching of replication timing
Chromosome 21Chromosome 21
isochore % total genomic DNA %total genes
L1+L2 : 62 % 31%
H1+H2 : 31% 39%
H3 : 3-5% 30%
2060100140Number of genes / MbL1+L2H1+H2H3Mouchiroud et al. 1991
Isochores and introns length
• 760 complete human genes• L1L2: intron G+C content < 46%• H1H2: intron G+C content 46-54%• H3: intron G+C content >54%
Average intron length (bp)Gene compaction (intron length/coding region length)40080012001600200024681012L1L2H1H2H3L1L2H1H2H3
Duret, Mouchiroud and Gautier, 1995
Projets Génome: état des lieux
• Les différents projets génome
• Nature et qualité des séquences produites
• Annotation des séquences génomiques: recherche de régions fonctionnelles
Les projets génomes: objectifs
• faire l'inventaire de l'information génétique nécessaire au développement et à la reproduction des organismes
• comprendre l'organisation du génome (système d'information intégré ?)
• comprendre l'évolution des génomes
• applications médicales, agronomiques, industrielles
Sequencing Projects :Genome / Transcriptome
gene (DNA)messenger RNA (mRNA)proteinexonintrontranscription, maturationtranslationchromosome (DNA)AAAAAAAA50-250 106 nt5-50 103 nt1-10 103 ntGenomeprojectsTranscriptomeprojects (ESTs)
Projets Génome
• Eubacteria: 29 génomes complets (dont 19 dans les 12 derniers mois !)
• Archaea: 6 génomes complets• Eukaryotes: 3 (4) génomes complets
– levure: 13 Mb 100%
– P. falciparum 30 Mb 24%
– C. elegans (nematode) 100 Mb 95%
– A. thaliana 120 Mb 60%
– Drosophila 170 Mb 60% (100%)
– homme 3200 Mb 25%• « draft » 90% complete in 2000, finished in 2003
– souris 3000 Mb 1%
Stratégie de séquençage du génome humain (projet public)
Génome
Clonage dans un vecteur pour inserts longs (100-200 kb exemple: BAC)
Construction d’une carte génomique
Sélection des clones à séquencer
Sous-clonage dans un vecteur pour inserts courts (2-10 kb exemple: M13)
Séquençage des clones
Construction des contigs: ré-ordonner les séquences
Finitions: fermeture des trous
Etapes du séquençage génomique
ébaucheébauche(draft)(draft)
Phase 0
Phase 1
Phase 2
Phase 3
Clone BAC (150-200 kb)Séquençage des clones M13AssemblageSous-clonage dans M13 (1-2 kb)
Phase 0-1: séquence non-terminée; contigs non-ordonnés, non-orientés; gapsPhase 0-1: séquence non-terminée; contigs non-ordonnés, non-orientés; gapsPhase 2: séquence non-terminée; contigs ordonnés, orientés; gapsPhase 2: séquence non-terminée; contigs ordonnés, orientés; gapsPhase 3: séquence terminéePhase 3: séquence terminée
Phase 0-2: séquences mentionnées HTG (High Throughput Genome Phase 0-2: séquences mentionnées HTG (High Throughput Genome sequences) dans les banques de donnéessequences) dans les banques de données
Projets EST (transcriptome)
• Expressed Sequence Tags (EST)
• Inventaire des ARNm exprimés par un organisme, dans différents tissus, stades de développement, pathologies, …
• Extraction et clonage des ARNm (banques d ’ADNc)
• Séquençage systématique des clones– Séquences partielles d ’ARNm (300-500 nt)
– Erreurs de séquence (1-3%)
– Redondance (gènes fortement exprimés)
– Qualité suffisante pour identifier un gène
• Automatisation
Projets EST à grande échelle
• Homo sapiens 1,611,810
• Mus musculus (souris) 697,486
• Rattus sp. (rat) 124,378
• Caenorhabditis elegans (nématode) 101,232
• Drosophila melanogaster 86,121
• Oryza sativa (riz) 47,083
• Arabidopsis thaliana (arabette) 45,752
• Danio rerio (poisson zèbre) 40,001
• Zea mays (maïs) 39,285
• Lycopersicon esculentum (tomate) 38,047
Nombre d'EST (Nov. 99)Nombre d'EST (Nov. 99)
Projets GSS
• Genome Survey Sequence (GSS)
• Echantillonage aléatoire de séquence génomiques: donner un premier aperçu du contenu d'un génome
• Banques d ’ADN génomique
• Séquençage systématique de clones– Séquences courtes (< 1kb)
– Erreurs de séquence (1-3%)
– Qualité suffisante pour identifier un gène
• Automatisation
Projets GSS à grande échelle
• Homo sapiens 863,041
• Mus musculus (souris) 452,033
• Tetraodon nigroviridis 188,963
• Oryza sativa (riz) 93,107
• Strongylocentrotus purpuratus (oursin) 76,019
• Arabidopsis thaliana (arabette) 61,265
• Trypanosoma brucei 48,123
• Drosophila melanogaster 44,785
• Takifugu rubripes 42,929
Nombre de GSS (Nov. 2000)Nombre de GSS (Nov. 2000)
Genome Sequence Data• Traditional sequences: correspond to biologically
characterized genes, annotated by reearchers or database curators, usually relatively short (<20,000).
• Finished genome sequences: long contiguous sequences, correspond to clones (cosmid, BAC, PAC); partly automatically generated annotations covers repetitive elements, kown and predicted genes, EST matches
• Unfinished genome sequences (draft): large sequence entries consisting of unordered pieces separated by runs of N's, correspond to clones, contain minimal annotation.
• Genome survey sequences: low-quality, single pass sequences from a variety of different projects (BAC end sequencing, polymorphism studies, CpG islands, etc.), minimal annotation.
Different types of nucleotide sequences in current databases
StandardHigh throughput genome (HTG)
Genome survey sequence (GSS)
Expressed sequence tags (EST)
Contents
biologically characterized genes and RNAs, finished clones from genome projects
unfinished clones from genome projects
single pass sequences from random genomic clones
single pass sequences from random cDNA clones
Length variable >20,000 bp <1,000 bp <1,000 bp
Accuracy medium-high high low low
Annotation
medium to high, rich biological annotation
technically use- ful, biologically poor
technically use- ful, biologically poor
technically use- ful, biologically poor
GenBank release 119 (September 28, 2000)
Division Entries Nucleotides % nt
EST 5,843,794 2,337,244,350 23%
HTG 77,960 4,373,497,668 44%
GSS 1,724,845 951,450,849 9%
PRI 135,144 1,073,472,484 11%
Other 882,631 1,296,473,741 13%
Total 8,664,374 10,032,139,092 100%
Human 3,518,824 6,253,704,359 62%
The human genome sequencing projectWhere are we today (July 17 2000) ?
• According to Phillip Bucher (SIB, Lausanne) statistics and genome coverage estimates (see also EBI's statistics: http://www.ebi.ac.uk/~sterk/ genome-MOT)
Estimated size of human genome 3260 MB 100.00%
EMBL sequences in HUM division: 770 MB 23.60%(7858 entries, ave. Size: 101.3 kb)
Human sequences in HTG division: 3629 MB 111.30%(23681 entries, ave. Size: 153.3 kb)
Total: 4399 MB 134.90%
Estimated redundancy (35%) -1540 MB -47.70%
Corrected total: 2859 MB 87.90%
Exponential growth of sequence data
• Doubling time: 13 mounths (8 mounths)
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
82 86 90 94 98Date
0.1
1
10
100
1000
10000
82 86 90 94 98Date
Publicly available sequences (Mb)
Contenu des banques de séquences nucléiques• Avril 2000:
– 6.106 séquences
– 7.109 bases
– 60 000 espèces
• 9 espèces (0.02%) représentent à elles seules 85% des séquences– Homo sapiens 62.1%
– Mus musculus 7.7%
– Drosophila melanogaster 6.1%
– Caenorhabditis elegans 3.3%
– Arabidopsis thaliana 2.9%
– Oryza sativa 1.3%
– Rattus norvegicus 0.8%
– Danio rerio 0.6%
– Saccharomyces cerevisiae 0.6%
Next steps in genome projects
• Identify genes and other functional elements within genomic sequence (where are the genes ?)
• Determine the function of genes (what do they do ?)
Structure of human protein genes
• 1396 complete human genes (exons + introns) from GenBank
• Average size (25%, 75%)
– Gene 15 kb ± 23 kb (4, 16) (10% > 35 kb)
– CDS 1300 nt ± 1200 (600, 1500)
– Exon (coding) 200 nt ± 180 (110, 200)
– Intron 1800 nt ± 3000 (500, 2000)
– 5'UTR 210 nt (Pesole et al. 1999)
– 3'UTR 740 nt (Pesole et al. 1999)
• Intron/exon
– Number of introns: 6 ±3 introns / kb CDS
– Introns / (introns + CDS): 80%
– 5' introns in 15% of genes (more ?), 3 ’introns very rare
• Alternative splicing in more than 30% of human genes (Hanke et al. 1999)
Prédiction de gènes eucaryotes (1)méthodes ab initio
• Prédiction d ’exons codants– Recherche de phases ouvertes de lecture (ORF: open reading frame)
• Taille moyenne des exons: ± 150 nt
– Statistiques sur les nucléotides, usage des codons• Périodicité d'ordre 3, fréquence d ’hexamères
– Signaux d ’épissage
• Construction d ’un modèle de gène protéique– Combinaison d ’exons de phases compatibles (pondération en fonction des scores de chaque
exon potentiel)– Recherche de limites de gènes
• Exons terminaux (5 ’, 3 ’)• Promoteur• Signal de polyadénylation
• Epissage alternatif ?? Exons non codants ?? Gène transcrits non codants (Xist, …) ??
Prédiction de gènes eucaryotes: qualité de la prédiction
• Comparaison des différents logiciels: sensibilité/spécificité– Sn: sensibilité Sp: spécificité par exon (sn_e, sp_e) ou par nucéotide (sn_e, sp_e)
– Jeu de données Burset-Guigo (1996): 570 gènes de vertébrés
– Jeu de données Salamov et al (1998): 660 gènes humains
Sn_e Sp_e Sn_n Sp_nGenScan 0.78 0.81 0.93 0.93FGENES 1.6 0.83 0.82 0.92 0.93Grail2 0.36 0.43 0.72 0.87
Sn_e Sp_e Sn_n Sp_nGenScan 0.70 0.71 0.92 0.90FGENES 1.6 0.77 0.77 0.90 0.91
Prédiction de gènes eucaryotes: qualité de la prédiction
• Comparaison des différents logiciels: sensibilité/spécificité– Sn: sensibilité Sp: spécificité par exon (sn_e, sp_e) ou par nucéotide (sn_e, sp_e)
– Locus BRCA2 (1.4 Mb, chrom. 13q) (Sanger Centre 1999): région "difficile" pour les logiciels de prédiction. 159 exons
Sn_e Sp_e Sn_n Sp_nGenScan 0.66 0.36 0.81 0.44FGENES 1.6 0.69 0.57 0.79 0.66FGENES 1.6 masked 0.69 0.65 0.79 0.74GenScan+FGENES 0.61 0.82 0.67 0.90
Prédiction de gènes protéiques complets• C. elegans: la plupart des ‘ gènes ’ annotés sont seulement des prédictions:
– 50% de prédictions fausses (dont la moitié sont exploitables) (J. Thierry-Mieg)
• Peut-on utiliser ces méthodes pour annoter les séquences génomique humaines ?
– + les faux positifs ! + épissage alternatif
00.20.40.60.8113579111315Sensibilité par exon:90%80%
Probabilité de détecter tous les exons d’un gènesNombre d’exons du gène
Un peu d ’optimisme
• Fraction de la longueur des gènes correctement prédits:
70-80%
• Probabilité que deux exons potentiels consécutifs soient réels (et donc positifs en RT-PCR)
0.5
Prediction of functional elements (2): ESTs
Large scale transcriptome projects: ESTs, full-length cDNA Identification of transcribed genes (protein or non-coding RNA) Information on alternative splicing, polyadenylation (Hanke et al.
1999, Gautheret et al. 1998), expression pattern SIM4: align a cDNA to genomic DNA Very useful but ...
Problems with genes expressed at low level, narrow tissue distribution, stage-specific expression, …
Limited tissue sampling Artifacts in ESTs (introns, partially matured RNA, …) Limited to polyadenylated RNA
Prédiction de gènes eucaryotes (suite): approche comparative
tirer des informations de l'histoire évolutive des gènes
3,5 milliard d'années d'évolution
MUTATIONS:
- substitutions- insertions ou délétions locales- recombinaisons intergéniques, brassage d'exons- duplications ou pertes de gènes- pertes ou duplications de chromosomes- duplications de génomes- transgénèse (transfert horizontal de gènes)- etc.
EVOLUTION MOLECULAIRE
"Nothing happens, but if it does it's not important"Dan Graur
- les individus qui portent des mutations délétères n'ont pas ou peu de descendance. Ces mutations disparaissent rapidement de la population: sélection
- les individus qui portent des mutations non (ou faiblement) délétère peuvent transmettre ces mutations à leur descendance. Ces mutations, dites "neutres", sont fixées aléatoirement dans la population (i.e. la majorité des individus portent ce génotype mutant): dérive génétique
- les très rares mutations avantageuses sont positivement sélectionnées
Les génomes sont le fruit de ces deux forces évolutives:
sélection
dérive génétique
Prédiction des régions fonctionnelles (gènes protéiques,
ARN, régions régulatrices) (2) Comparative sequence analysis (phylogenetic footprinting)
Function => selective pressure
Corollary Sequence conservation = selective pressure = function
provided the number of aligned homologous sequences represents enough evolutionary time for the accumulation of mutations at the less constrained (presumably selectively neutral)
base positions.
• Evolutionary rate in non-functional DNA: ~ 0.3% / My (± 0.069)
Man/Mouse: ~ 80 Myrs 46-58% identity
Mammals/Birds: ~ 300 Myr 26-28% identity
Random sequences 25% identity
Prédiction de gènes eucaryotes (3)
• Approche comparative– Comparaison d ’une séquence génomique avec des gènes déjà caractérisés dans d ’autres
espèces • BLASTX• WISE2: alignement ADN/protéine avec épissage)
– Comparaison de séquences génomiques (non-annotées) homologues• Locus mnd2 (homme souris) (Jang et al. 1999): >80 kb• Prédiction d ’exons internes basée sur la conservation de séquence
ORF ≥ 80 nt
Séquence protéique ≥ 70% similarité
Séquence ADN ≥50% identité
GT AG conservés
=> détection de tous les exons internes du gène D6Mm5e
• Généralisation de la méthode:– ROSETTA (Genome Res. 2000 10:950)
– ALFRESCO (Genome Res. 2000 10:1148)
– WABA (Genome Res. 2000 10:1115)
TsxXISTMouseHumanMouseHumanTsxComparison of human and mouse TSX-XIST genomic locus:gene-poor, repeated-element rich, G+C-poor region (39.9%)mouse TSX gene: 10,100 bp mRNA 794 bpexon 1: 165 bpexon 2: 36 bpexon 3: 37 bpexon 4: 82 bp
(repeated elements filtered)
exon 5: 101 bpexon 6: 59 bpexon 7: 317 bp
TSX pseudogene ?XISTXistXistcoding exon: 0.2%repeated elements: 53%promoter
coding exon: 12%repeated elements : 21%promoterComparison of human and mouse CD4-C9 locus:gene-rich, repeated-element poor, G+C-rich region (50.5%)
Human chromosome 12p13Mouse chromosome 6
8 genes: CD4, A, B, GNB3, C8, ISOT, TPI, C9
CD4AMouseHumanBGNB3ISOTTPIC9C8
Prédiction de régions régulatrices
• Méthodes ab initio
– Prédiction de promoteurs
– Îlots CpG
• Approche comparative
Prédiction de promoteurs eucaryotes
• Combinaison de sites de fixation de facteur de transcription (ordre, orientation, distance)
• Motifs courts, dégénérés– Difficile de distinguer les vrais sites des faux positifs:– Motif à 4 bases: ≈1/256 pb (1/128 pb sur les deux brins)
• Boîtes TATA, CAAT , GC: absents dans beaucoup de promoteurs
• Banques de données de sites de fixation de facteurs de transcription (TRANSFAC), de promoteurs caractérisés expérimentalement (EPD)
• PromoterScan (Prestridge 1995): Mesure de la densité en sites potentiels de fixation de facteurs de transcription de long de la séquence (pondération en fonction de la fréquence des sites dans ou en dehors des vrais promoteurs)
Prédiction de promoteurs: sensibilité, spécificité
• Sensibilité: fraction des promoteurs qui sont trouvés par le logiciel
– PromoterScan: sensibilité = 70% (promoteurs à boîte TATA)
• Spécificité: fraction des vrais promoteurs parmi ceux qui ont été prédits
– PromoterScan: spécificité = 20%– Un faux positif / 10 kb
• Génome humain: ≈100 000 gènes, ≈1 promoteur/30 kb
sensibilité=vrais_positifs
vrais_positifs+faux_négatifs
spécificité=vrais_ positifs
vrais_ positifs+faux_ positifs
SpécificitéSensibilité1000Seuil
Prédiction de promoteurs eucaryotes: recherches en cours
• Prise en compte de l'orientation relative et des distances entre sites de fixation de facteurs de transcription– COMPEL (Kolchanov 1998): banque de données d'éléments composites– FastM : recherche dans une séquence génomique d'une combinaison de deux sites
de fixation de facteurs de transcription à une distance définie l'un de l'autre
• Recherche de corrélations entre sites– PromoterInspector (Werner 2000)
• Sensibilité: 40%• Spécificité: 45%
http://www.gsf.de/biodv/index.html
• Combinaison recherche ab initio / approche comparative: recherche de sites potentiels parmi les régions conservées
Îlots CpG• Génome de vertébrés :
– méthylation des C dans les dinucléotides 5 ’-CG-3 ’(CpG)
• Me-C fortement mutable -> T5 ’-CG- 3 ’ 5 ’-TG-3 ’ 5 ’-CA-3 ’
3 ’-GC- 5 ’ 3 ’-AC-5 ’ 3 ’-GT-5 ’
• Génome des vertébrés: globalement dépourvu en CpG (excès de TG, CA)
• Certaines régions (200 nt à plusieurs kb) échappent à la méthylation– Pas de déplétion en CpG: CpGo/e proche de 1
– Riche en G+C
– Îlot CpG:Longueur > 500 nt
CpGo/e > 0.6
G+C > 50%
ouou
CpGo /e =Nombre_de_CpG_observéNombre_de_CpG_attendu
=0.25
01CpGo/e
La déamination des cytosines
Cytosine
N
C
CH
C
NH
NH2
O
CH
réparation
Cytosine
N
C
CH
C
NH
NH2
O
CH
Cytosine méthylée
N
C
CH
C
NH
NH2
O
CH
CH3
Uracile
HN
C
CH
C
NH
O
CH
O
déamination
Thymine
HN
C
CH
C
NH
O
CH
O
CH3
déamination TpGou
CpA
Îlots CpG: associé aux régions promotrices ?
• Bird (1986), Gardiner-Garden (1987) Larsen (1992) ref– 40% des gènes tissu-spécifiques possèdent un îlot CpG en 5 ’
– 100% des gènes ‘ housekeeping ’ possèdent un îlot CpG en 5 ’
• Rechercher des îlots CpG pour prédire des régions promotrices ?– Sensibilité: 40-100%
– Spécificité ?? (Quelle fraction des îlots CpG correspond effectivement à des régions promotrices ?)
• Ioshikhes & Zhang (2000): comparaison des îlots CpG qui recouvrent ou non le site d ’initiation de la transcription
Fréquence des gènes humains avec un îlot CpG recouvrant le site d ’initiation de la transcription
– 800 gènes humains avec promoteur décrit
– Mesure de la distribution tissulaire à l ’aide d ’EST (20 tissus)
0%20%40%60%80%0-23-67-20Nombre de tissus où le gène est exprimé
Comparaison des îlots CpG recouvrant ou non le site d ’initiation de la transcription
– 272 îlots start CpG recouvrant le site d ’initiation de la transcription (start)
– 1078 îlots CpG en dehors d ’un promoteur connu (other) (en excluant les séquences répétées)
0 2460.50.70.91.11.350%60%70%80%otherstartG+C%CpGo/eLongueur(kb)
Prediction of functional elements (2) Comparative sequence analysis (phylogenetic footprinting)
Function => selective pressure
Corollary Sequence conservation = selective pressure = function
provided the number of aligned homologous sequences represents enough evolutionary time for the accumulation of mutations at the less constrained (presumably selectively neutral)
base positions.
• Evolutionary rate in non-functional DNA: ~ 0.3% / My (± 0.069)
Man/Mouse: ~ 80 Myrs 46-58% identity
Mammals/Birds: ~ 300 Myr 26-28% identity
Random sequences 25% identity
Analyse comparative des gènes de -actine de l'homme et de la carpe
CarpeHomme5’UTR 3’UTR site polyA échelle de similarité: pas de similarité significative70 - 80% identité80 - 90% identitérégions codantes: éléments régulateurs:introns:ATGcodon stop
Recherche de régions régulatrices par analyse comparative (empreintes phylogénétiques)
• Goodman et al. 1988: régulation de l’expression des gènes du cluster -globine au cours du développement
• Alignement de séquences orthologues de 6 mammifères (> 270 Ma d’évolution)
• 13 empreintes phylogénétiques: ≥ 6 nt, conservation 100%
• Analyse par retard de bande sur gel:
• 12/13 (92%) correspondent à des sites de fixation de protéines
• 1996: 35 empreintes phylogénétiques avec protéines fixatrices identifiées
• Enhancers de gènes HOX (Fugu/souris) (Aparicio et al. 1995)
• enhancer TCR α (homme/souris) (Luo, 1998)
• promoteur COX5B (11 primates) (Bachman, 1996)
• promoteur uPAR (homme/souris) (Soravia, 1995)
Large scale phylogenetic footprinting
Non-coding sequences : 325,247 sequences 145 Mb
everything except protein-coding regions and structural RNA genes (rRNA, tRNA, snRNA, scRNA)
Introns, 5' and 3' untranslated regions, intergenic sequences
Filtering of microsatellite repeats and cloning vectors: XBLAST
Similarity search: BLASTN + LFASTA
Vertebrates, insects, nematode
Metazoan Genome ProjectsMillion yearsPorifera (sponge)Nematodes (C. elegans)Arthropods (Drosophila)EchinodermsUrochordataCephalochordata (amphioxus)Jawless fisheschondrichthyes (ray, shark)actinopterygii (bony fishes)amphibians mammals birds reptiles600400200800VertebratesSequencing effort: 9 to 100 Mb 0.8 to 2.4 Mb less than 0.2 Mb
Sequence Similarities1- Identification of new genes
protein-genes, RNA-genes: intronic snoRNA genes
2- Retroviral elements, retrotransposons
3- Low complexity sequences:
GC-rich, AT-rich, cryptic microsatellites
4- Artefacts:
annotation errors, sample contamination (sponge insulin, ascidian RNA, chicken TGFB1)
5- 326 highly conserved regions (HCRs)
- do not code for proteins
- do not correspond to any known structural RNA
326 Highly Conserved Regions (HCRs)
• > 70% identity over 50 to 2000 nt after more than 300 Myrs
• Unique sequences
• Generally specific of only one gene
• Longest HCR:
84% identity over 1930 nt after 300 Myrs
3’UTR deltaEF1 transcription factor
• Oldest HCRs: 500 to 600 Myrs
• No HCR between vertebrates and insects or nematode
Oldest HCRsMillion yearsPorifera (sponge)Nematodes (C. elegans)Arthropods (Drosophila)EchinodermsUrochordataCephalochordata (amphioxus)Jawless fisheschondrichthyes (ray, shark)actinopterygii (bony fishes)amphibians mammals birds reptiles600400200800Sequencing effort: 9 to 100 Mb 0.8 to 2.4 Mb less than 0.2 MbHistone 3’UTRα- actin3’UTR
3 5’HOX UTRVertebrates
Conservation pattern in 3’UTRsposition relative to the stop codon (nt)10005000150020002400c-fosTransferrin receptorbirdmammalEndoplasmic-reticulum Ca2+ ATPase birdmammalbirdmammalsimilarity: <60% ≥60% ≥70% ≥80%
Distribution of HCRs within genes3'-non-coding5'-non-codingintrons0%10%20%30%40%mammals / birdsmammals / amphibiansmammals / bony fishes2841917296512563812 Frequency of orthologous
genes containing HCRs
HCRs and multigenic familiesHistone replacement variant H3.3A0400600100014001800AAAAAAAAUGStopAUGStopAAAAAAAHistone replacement variant H3.3BHistone replacement variant H3.3A and H3.3B, Calmodulinsnt• several genes coding for a same protein
• non-coding sequences are distinct, and conserved
Function of 3’HCRs: mRNA stability, translation
A+U-rich element: stability, translationposition relative to the stop codon (nt)10005000150020002400c-fosTransferrin receptorbirdmammalbirdmammalsimilarity: <60% ≥60% ≥70% ≥80%IRE : Iron Responsive Element
IRP : Iron Regulatory Protein
CCAGUGN5'3'
Function of 3’HCRs:mRNA subcellular localization
Myosin heavy chain, c-myc, vimentin, -actin
chickencarp (bony fish)site poly(A)site poly(A)0200400600800position relative to the stop codon (nt)localization signalssimilarity: <60% ≥60% ≥70% ≥80%- 3’actin UTR
Comparaison des régions non-codantes de 77 gènes orthologues homme/souris (Jareborg et al. 1999)
0.20.40.60.81Upstream(1 kb)5’UTRIntrons3’UTRs
Upstream015’UTRcoding exon
intron3’UTR
Fraction des régions non-codantes conservées entre homme et souris
Phylogenetic footprinting Advantages
Works for all kinds of functional elements (transcribed or not, coding or not) as far as the information is in the primary sequence
Does not require any a priori knowledge of the functional elements
Limits Absence of evolutionary conservation does not mean absence of function No efficient method to detect unknown conserved secondary structure in RNA Function, but what function ? Depends on the sequencing status of other genomes
Human, mouse, fugu, C. elegans, drosophila, yeast, A. thaliana
Number of sequences to compare : > 200 Myrs of evolution Mammals/birds: 310 Myrs Human + mouse + bovine : 240 Myrs
