ANALYSE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DU RÉCEPTEUR … · 2009-03-23 · NOR-1 is a member of the nuclear receptor superfamily which comprises a great diversity of transcription factors

ANNIE MALTAIS

ANALYSE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE ORPHELIN NOR-1 ET INACTIVATION DU GÈNE CHEZ LA SOURIS

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Philosophiæ Doctor (Ph.D.)

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2006 © Annie Maltais, 2006

Résumé

NOR-1 appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires qui regroupe une variété de

facteurs de transcription, dont les récepteurs des hormones thyroïdiennes, des hormones

stéroïdiennes, des acides rétinoïques, de la vitamine D. Ces protéines produisent une

multitude de réponses biologiques via la régulation de gènes cibles. Ils régulent différentes

fonctions cellulaires, dont la prolifération, la différentiation, l’apoptose et l’homéostasie. Ils

peuvent également être impliqués dans la tumorigénèse.

NOR-1, NGFI-B et NURR1 forment une sous-famille de récepteurs nucléaires orphelins.

Ces protéines sont plus spécifiquement associées au développement et à l’homéostasie du

système nerveux central. Elles sont codées par des gènes de réponse précoce, dont la

transcription est rapidement induite, dans différents types cellulaires, lorsque stimulée par

des facteurs de croissance. NGFI-B et NOR-1 exerceraient une fonction importante dans le

processus de sélection négative des cellules T lors de l’apoptose induite par l’activation des

récepteurs TCR. De plus, NGFI-B, NOR-1 et NURR1 seraient impliqués dans le contrôle

de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien. L’inactivation du gène NURR1 chez la

souris a permis de révéler son rôle essentiel dans le développement des neurones

dopaminergiques du mésencéphale. Aucun phénotype majeur n’a été observé à ce jour chez

la souris homozygote mutante pour NGFI-B.

La fusion des gènes EWS et NOR1 a été mise en évidence dans des tumeurs osseuses de

type chondrosarcome myxoïde extrasquelettique. Cette translocation chromosomique est à

l’origine de la synthèse d’une protéine hybride formée de l’extrémité N-terminale de EWS

et de la séquence de NOR-1 complète. Cette protéine de fusion, appelée EWS/NOR-1,

jouerait un rôle crucial dans le développement tumoral. EWS n’est pas l’unique partenaire

de NOR-1 dans les chondrosarcomes myxoïdes estrasquelettiques. Trois autres protéines

liées au récepteur nucléaire selon le même patron ont été identifiées, soit TAF 2N, TCF12

et TFG. Nous avons comparé l’activité transcriptionnelle des protéines NOR-1 et

EWS/NOR-1. Le domaine d’activation AF2 du récepteur nucléaire NOR-1 serait essentiel à

l’activité transcriptionnelle de l’oncogène EWS/NOR-1. Ces résultats suggèrent le

ii

recrutement de coactivateurs spécifiques à NOR-1 lors du processus tumoral menant au

développement des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques.

Au moment d’initier nos travaux, aucune souris déficiente pour le récepteur NOR-1 n’avait

encore été produite. Afin de mieux comprendre le rôle du récepteur nucléaire orphelin

NOR-1, plus particulièrement chez les mammifères, nous avons inactivé le gène chez la

souris. Au préalable, l’analyse de la structure du gène, de son patron d’expression ainsi que

des différentes isoformes de la protéine a été effectuée. Nos résultats montrent une absence

de phénotype majeur qui pourrait découler en partie d’une redondance fonctionnelle

exercée par NGFI-B et/ou NURR 1.

iii

Abstract

NOR-1 is a member of the nuclear receptor superfamily which comprises a great diversity

of transcription factors. The steroid, thyroid, retinoid, and vitamin D receptors represent

some widely-know members of this superfamily. The nuclear receptors induce a vast

number of biologic responses by the regulation of target genes. They are involved in the

control of different cell functions like growth, differentiation, metabolism and apoptosis.

They also play roles in tumorigenesis.

NOR-1, NGFI-B and NURR1 form a subfamily of orphan nuclear receptors. They are

associated to the central nervous system development and homeostasy. These proteins are

coded by immediate-early genes which are rapidly induced by growth factors in different

cell types. NOR-1 and NGFI-B have an important function in T-cell receptor (TCR)-

mediated apoptosis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 could be involved in neuroendocrine

control at the level of the hypothalamic/pituitary/adrenal axis. A NURR1 knock-out mouse

has been created and shows the essential role of this nuclear receptor in the development of

mesencephalic dopamine neurons. The NGFI-B knock-out mouse shows no significant

phenotype both at the level of thymocyte apoptosis and on the regulation of the

adrenocortical function.

The EWS and NOR-1 gene fusion was discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcoma

bones tumors. This chromosom translocation is at the origin of a hybrid protein composed

of the N-terminal of EWS fused to the full length nuclear receptor NOR-1. It is presumed

that the EWS/NOR-1 fusion protein plays a central role in the tumoral process. Threes

other NOR-1 fusion partners were discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcomas.

TAF2N, TCF12 and TFG are fused to the nuclear receptor by a similar pattern. We have

compared the NOR-1 and EWS/NOR-1 transcriptional activity in different chondrocyte cell

lines. The AF2 domain of NOR-1 is essential for the transcriptional activity of the

EWS/NOR-1 fusion protein. This result suggests that some NOR-1 specific co-activators

participate to the tumorigenic process involved in the development of extraskeletal myxoid

chondrosarcomas development.

iv

In order to better understand the orphan nuclear receptor NOR-1, we have created a NOR-1

knock-out mouse. Analysis of this mouse indicate an absence of significant phenotype.

These observations suggest functional redundancy between NGFI-B or NURR1 (or both)

and NOR-1.

Remerciements

C’est avec beaucoup de reconnaissances que je souhaite remercier mon directeur de

recherches, le Dr. Yves Labelle, pour la formation scientifique de qualité qu’il ma

généreusement donné. J’aimerais également témoigner de ma gratitude envers Christine

Filion, professionnelle de recherche, pour sa contribution à mes travaux de doctorat. Je

désire, de plus, soulignier à quel point j’ai apprécié sa compagnie en tant que collègue de

travaille.

Je ne serais jamais parvenue à cette étape majeure de mon cheminement personnel et

professionnel, le dépôt de ma thèse de doctorat, sans le support de ma famille. Je tiens à

remercier de tout coeur Reina Gauthier, Julien Maltais et Alain Maltais.

J’aimerais faire part de ma reconnaissance particulière à Pierre Lasou qui a su insuffler, par

sa présence, de la légèreté aux labeurs quotidiens que représente la réalisation d’un

doctorat.

Je remercie sincèrement mes amis, parents et compagnons de paillasse, tout

particulièrement Caroline Fortier et Véronique Mercier.

Contribution scientifique:

Je désire souligner la contribution importante à mon projet de doctorat du Dr Jean Charron

qui a réalisé deux étapes importantes de la création de la souris NOR-1 : l’injection des

cellules ES dans les blastocytes et la production des souris chimériques.

Les expériences portant sur les antipsychotiques ont été effectuées dans le cadre des

recherches du Dr. Daniel Lévesque que je tiens à remercier pour nous a permis de présenter

ses résultats.

Contribution financière:

J’aimerais mentionner le rôle important qu’ont joué la Fondation de l’Université Laval et le

Centre de Recherche de Saint-François d’Assise pour le support financier qu’ils m’ont

octroyé au cours de mes études.

À Reina Gauthier et Julien Maltais

Table des matières Résumé.....................................................................................................................................i Abstract................................................................................................................................. iii Remerciements........................................................................................................................v Table des matières ............................................................................................................... vii Liste des tableaux....................................................................................................................x Liste des figures .....................................................................................................................xi Introduction.............................................................................................................................1

1. La superfamille des récepteurs nucléaires ......................................................................1 1.1 Liaison à l’ADN........................................................................................................2

1.1.1 Monomère..........................................................................................................3 1.1.2 Homodimère ......................................................................................................4 1.1.3 Hétérodimère .....................................................................................................4

1.2 Évolution des récepteurs nucléaires..........................................................................8 1.3 Rôles physiologiques des récepteurs nucléaires .....................................................10

1.3.1 Hormones stéroïdiennes...................................................................................10 1.3.2 Hormones thyroïdiennes ..................................................................................11 1.3.3 Vitamine D et acides rétinoïques .....................................................................11 1.3.4 Récepteurs du métabolisme .............................................................................12

1.4 Cofacteurs & domaines AF-1 et AF-2....................................................................14 1.4.1 Catégories de cofacteurs ..................................................................................15 1.4.2 Domaine AF-2 .................................................................................................15 1.4.3 Domaine AF-1 .................................................................................................17 1.4.4 Domaine de liaison à l’ADN et cofacteurs ......................................................17 1.4.5 Échange des complexes coactivateurs et corépresseurs ..................................18

2. La sous-famille NOR-1/NGFI-B/NURR1 ....................................................................18 2.1 La propriété de gène à induction précoce de NOR-1, NGFI-B et NURR1 ............18

2.1.1 NOR-1..............................................................................................................19 2.1.2 NGFI-B ............................................................................................................21 2.1.3 NURR1 ............................................................................................................23

2.2 Patron d’expression de NGFI-B, NURR 1 et NOR-1.............................................24 2.2.1 Au cours du développement embryonnaire .....................................................24 2.2.2 A la Naissance et à l’âge adulte .......................................................................25

2.3 Liaison à l’ADN et éléments de réponses...............................................................28 2.3.1 NBRE, « NGFI-B response element ».............................................................28 2.3.2 NurRE, « Nur response element » ...................................................................28 2.3.3 Hétérodimérisation de RXR avec NGFI-B et NURR-1...................................29

2.4 Cofacteurs des récepteurs nucléaires NOR-1, NGFI-B et NURR1 ........................32 2.4.1 Domaine AF-1 du récepteur nucléaire NOR-1 ................................................32 2.4.2 Domaine AF-1 du récepteur nucléaire NGFI-B ..............................................34 2.4.3 Domaine AF-2 du récepteur nucléaire NURR1...............................................35

2.5 Isoformes ................................................................................................................36 2.5.1 Isoformes NOR-1 et structure du gène ............................................................36 2.5.2 Activité transcriptionnelle de NOR-1, NOR-1ΔC et NOR-1ΔN.....................38 2.5.3 Isoformes NURR1 ...........................................................................................38

viii

2.6 Rôles physiologiques ..............................................................................................39 2.6.1 Régulation de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien...............................39 2.6.2 Apoptose ..........................................................................................................41 2.6.3 Chondrosarcome myxoïde extrasquelettique...................................................52 2.6.4 Récepteurs nucléaires et protéines homéotiques .............................................68 2.6.5 Système nerveux central et sous-famille NOR-1/NGFI-B/NURR1 ................71

3. Objectif : Inactivation du gène NOR-1 chez la souris ..................................................77 4. Article 1 STRUCTURE AND EXPRESSION OF THE MOUSE GENE ENCODING THE ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR TEC ...................................................................79 5. Article 2 THE AF2 DOMAIN OF THE ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR TEC IS ESSENTIAL FOR THE TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF THE ONCOGENIC FUSION PROTEIN EWS/TEC..........................................................................................106 6. Inactivation du gène NOR-1 chez la souris par recombinaison homologue...................124

6.1. Construction du vecteur de recombinaison homologue...........................................124 6.2. Obtention des cellules embryonnaires souches recombinées ..................................129 6.3 Génération des souris mutantes pour le gène NOR-1...............................................131 6.4 Analyse phénotypique des souris NOR-1.................................................................134

6.4.1 Analyse histologique..........................................................................................134 6.4.1.1 Cerveau .......................................................................................................137 6.4.1.2 Embryon......................................................................................................138 6.4.1.3 Muscles squelettiques et cardiaque.............................................................138 6.4.1.4 Thymus .......................................................................................................138 6.4.1.5 Poumons......................................................................................................139 6.4.1.6 Testicules ....................................................................................................140 6.4.1.7 Conclusion ..................................................................................................140

6.4.2 Test d’orientation...............................................................................................140 6.4.3 Réponse aux antipsychotiques ...........................................................................143

6.5 Culture primaire de fibroblastes de souris ................................................................146 6.5.1 Caractérisation des lignées de fibroblastes ........................................................147 6.5.2 Prolifération cellulaire .......................................................................................149

6.5.2.1 Induction du récepteur nucléaire NOR-1....................................................149 6.5.2.2 Expression du gène NOR-1 ........................................................................152 6.5.2.3 Croissance cellulaire ...................................................................................152 6.5.2.4 Induction de NGFI-B et NURR 1 ...............................................................155

6.6 PARP et caspase 8 ....................................................................................................157 PARP ......................................................................................................................158 Caspase-8 ................................................................................................................158

Discussion Générale ...........................................................................................................162 7.1 Rôles du récepteur nucléaire NOR-1 ........................................................................162

7.1.1 Rôle essentiel de NOR-1 dans le développement de l’oreille interne et de l’hippocampe ..............................................................................................................162

7.1.1.1 Souris NOR-1 hétérozygotes et patron d’expression..................................162 7.1.1.2 Souris homozygotes -/- et développement vestibulaire ..............................163 7.1.1.3 Régulation de la croissance axonale des fibres moussus et survie des cellules pyramidales dans l’hippocampe..............................................................................163

7.1.2 Fonction essentielle de NOR-1 dans la gastrulation..........................................165 7.2 Souris NOR-1 déficientes créées dans notre laboratoire ..........................................166

ix

7.3 Apoptose ...................................................................................................................173 7.4 Promoteur de NOR-1 ................................................................................................175 7.5 Cofacteurs de NOR-1 et domaine AF2.....................................................................177 7.6 Isoformes ..................................................................................................................183 7.7 Prolifération cellulaire ..............................................................................................184

Conclusion et perspectives..................................................................................................188 Bibliographie ......................................................................................................................191

Liste des tableaux Tableau 1 Récepteurs nucléaires chez les mammifères..........................................................7 Tableau 2 Cofacteurs des récepteurs nucléaires ...................................................................16 Tableau 3 Expression de NOR-1 chez la souris, le rat et l’humain ....................................137

Liste des figures Introduction générale

Fig. 1 Représentation schématique des domaines fonctionnels des récepteurs nucléaires.....2 Fig. 2 Illustration des différents modes de liaison des récepteurs nucléaires à l’ADN. .........3 Fig. 3 Représentation schématique des mécanismes d’action des récepteurs nucléaires. ......5 Fig. 4 Inhibition de l’activité proapoptotique de NGFI-B dans les cellules-T par AKT......45 Fig. 5 Modèles de mécanismes apoptotiques........................................................................50 Fig. 6 Illustration schématique des protéines NOR-1, EWS et EWS/NOR-1. .....................61

Article 1

FIG. 1. Schematic drawing of the genomic locus containing TEC. .....................................97 Table 1. Exon/intron organization of the mouse TEC gene. ................................................98 FIG. 2. Schematic drawing illustrating the full-length TEC and carboxyl-truncated TEC∆C

isoforms. .......................................................................................................................99 FIG. 3. A. Agarose gel analysis of a nested RACE experiment using mouse brain poly A+

RNA…........................................................................................................................100 FIG. 4. Northern blot analyses of TEC...............................................................................101 FIG. 5. RT-PCR analyses of TEC and TEC∆C isoforms in various mouse tissues. ..........102 FIG. 6. Homology analysis of the mouse, rat and human amino acid sequences of TEC, as

well as the mouse NURR1 and rat NGFI-B amino acid sequences............................103 FIG. 7. In vitro translation, band-shift assay and transcriptional activation of the various

TEC isoforms. .............................................................................................................105

Article 2

Fig. 1. (A) Sequence alignment of the AF2 domains of various nuclear receptors representing different subfamilies within the superfamily (ER, RAR, RXR and VDR) as well as the three members of the TEC subfamily (NGFI-B, NURR1 and TEC). ..118

Fig. 2. Transient co-transfection assays of TC28 and C20 cells with a luciferase reporter vector, a beta-galactosidase normalizing vector and expression vectors encoding either the full-length EWS/TEC receptor (black bars) or a truncated mutant lacking the last 15 amino acids, EWS/TEC∆AF2 (grey bars). ............................................................119

Fig. 3. Transient co-transfection assays of TC28 and C20 cells with a luciferase reporter vector, a beta-galactosidase normalizing vector and the indicated EWS/TEC expression vectors.......................................................................................................120

Fig. 4. Transient co-transfection assays of TC28, COS and NIH 3T3 cells with a luciferase reporter vector, a beta-galactosidase normalizing vector and the indicated TEC expression vectors.......................................................................................................122

Fig. 5. Band-shift assays with a 32P-labeled NBRE oligonucleotide and in vitro-translated TEC receptors. ............................................................................................................123

xii

Chapitre 6

Fig. 1 Criblage d’une banque d’ADN génomique clonée dans des BAC et isolation du locus NOR-1.........................................................................................................................126

Fig. 2 Représentation schématique du vecteur de recombinaison homologue. ..................127 Fig. 3 Inactivation du gène NOR-1 chez la souris par recombinaison homologue. ...........128 Fig. 4 Analyse génotypique des cellules ES. ......................................................................130 Fig. 5 Établissement du génotype des souris NOR-1. ........................................................132 Fig. 6 Absence du transcrit NOR-1 chez les souris NOR-1 -/-...........................................133 Fig. 7 Analyse histologique des différents tissus chez la souris NOR-1. ...........................136 Fig. 8 Trouble de l’orientation en absence d’indice tactile chez les souris NOR-1 -/-.......142 Fig. 9 Réponse cataleptique induite par l’administration d’halopéridol chez les souris NOR-

1 -/- et +/+. ..................................................................................................................145 Fig. 10 Caractérisation du génotype des cultures primaires de fibroblastes NOR-1. .........148 Fig. 11 Induction du récepteur NOR-1 dans les fibroblastes en prolifération. ...................151 Fig. 12 Analyse du cycle cellulaire des fibroblastes NOR-1 -/- en culture primaire..........154 Fig. 13 Réponse de NURR1 et NGFI-B à une stimulation de la prolifération dans des

fibroblastes NOR-1 +/+ et -/-......................................................................................156 Fig. 14 Comparaison du profil de clivage de la PARP et de la caspase 8 entre les

fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- en cours d’apoptose.....................................................161

Discussion générale

Fig. 1. Modèle expliquant le rôle du domaine AF-2 du récepteur nucléaire NOR-1 et de la protéine de fusion EWS/NOR-1. ................................................................................183

Introduction

1. La superfamille des récepteurs nucléaires Les récepteurs nucléaires forment une superfamille de facteurs de transcription. Ils régulent

une variété de fonctions biologiques, dont la croissance, le développement, la reproduction,

le métabolisme, et ce, chez une multitude d’organismes vivants. Ces protéines exercent un

contrôle direct sur l’expression de gènes cibles en réponse à différents signaux. Elle

participent ainsi au contrôle de différents mécanismes cellulaires dont la prolifération,

l’apoptose, la différentiation et l’homéostasie. Parmi les récepteurs nucléaires connus on

retrouve les récepteurs des hormones stéroïdiennes, des hormones thyroïdiennes, des acides

rétinoïques, et de la vitamine D. Bien que pour plusieurs de ces facteurs de transcription

une interaction à un ligand soit nécessaire à leur activation, il existe un ensemble de

récepteurs, définis comme orphelins, pour lesquels aucun ligand n’a été identifié.

Les récepteurs nucléaires possèdent une structure typique constituée de différents domaines

fonctionnels (Fig. 1). Ils se caractérisent principalement par leur domaine de liaison à

l’ADN formé de deux doigts de zinc. Chacune de ces structures contient quatre cystéines

conservées qui interagissent avec une même molécule de zinc ionique. On retrouve dans

ces séquences deux motifs, une boîte P, dans le premier doigt de zinc et une boîte D dans le

second. Le domaine de liaison à l’ADN est formé de 66-70 acides aminés et contient une

troisième portion, l’extension C-terminale (Carboxy Ternminal Extension [CTE]) (Giguere

1999). Le CTE est composé d’environ 25 acides aminés incluant les boîtes T et A. Trois

hélices-α forment le domaine de liaison à l’ADN. L’extrémité N-terminale des récepteurs

nucléaires contient le domaine d’activation de la transcription ligand-indépendant

(Activation Function-1[AF-1]). Cette région constitue un site d’interaction pour différents

cofacteurs. La phosphorylation de résidus dans la portion N-terminale donne également lieu

à une forme de régulation de l’activité des récepteurs. Le domaine de liaison à l’ADN est

suivi d’une région charnière qui peut contenir des signaux de localisation nucléaire et

procure une flexibilité à la protéine. Les récepteurs nucléaires sont finalement constitués

d’un domaine de liaison au ligand multifonctionnel dans la portion C-terminale. Cette

région possède une structure canonique constituée de 11-13 hélices-α (Moras and

2

Gronemeyer 1998). Outre les séquence essentielles à l’interaction du ligand, on y retrouve

le domaine d’activation de la transcription ligand-dépendant (Activation Function-2 [AF-

2]), les séquences d’interaction avec les protéines de choc thermique, le domaine de

dimérisation ainsi que des séquences de localisation nucléaire. Des changements de

conformation, découlant d’une interaction au ligand ou de la dimérisation des récepteurs,

module le potentiel d’activation de la transcription de la portion C-terminale des récepteurs.

Tout comme pour les séquences AF-1, plusieurs cofacteurs montrent une affinité pour le

domaine AF-2.

Fig. 1 Représentation schématique des domaines fonctionnels des récepteurs nucléaires. Identification du domaine de liaison à l’ADN (DNA Binding Domain [DBD]) contenant l’extension C-terminale (COOH-Terminal Extention [CTE]), du domaine multifonctionnel de liaison au ligand (Ligand Binding Domain [LBD]), de dimérisation et d’activation de la transcription ligand-dépendant (Activation Function-2 [AF-2]) ainsi que du domaine d’activation de la transcription ligand-indépendant (Activation Function-1 [AF-1]).

1.1 Liaison à l’ADN Les récepteurs nucléaires régulent l’expression de gènes cibles en se liant à l’ADN au

niveau de séquences spécifiques, les éléments de réponse aux hormones (HREs pour

« hormone response elements ») (Fig. 2). Ces courtes séquences se situent habituellement

dans la région promotrice de gènes cibles. Elles peuvent également être présentes dans la

séquence « enhancer » à plusieurs kilobases en amont du site d’initiation de la transcription.

Tel que mentionné précédemment, deux motifs consensus de 6 pb ont été identifiés,

AGAACA, reconnu principalement par les récepteurs des hormones stéroïdiennes, et

AGG/TTCA, reconnu par l’ensemble des autres récepteurs. Les récepteurs nucléaires se

lient aux éléments de réponse sous forme de monomères, d’homodimères ou

3

d’hétérodimères. La disposition des séquences pour l’interaction d’un dimère peut se

configurer en palindrome, en palindrome inversé ou en répétition directe. L’arrangement

ainsi que le nombre de nucléotides entre les éléments de réponse, variant généralement de 0

à 5 pb, confèrent une spécificité pour la liaison des récepteurs nucléaires. La séquence en 5’

du motif permet également d’accroître la sélectivité des récepteurs pour les sites de

reconnaissance. Trois résidus de la boîte P, située dans le premier doigt de zinc du domaine

de liaison à l’ADN des récepteurs nucléaires, interagiraient de façon spécifique avec les

nucléotides des éléments de réponse (Luisi, Xu et al. 1991; Schwabe, Chapman et al. 1993).

Fig. 2 Illustration des différents modes de liaison des récepteurs nucléaires à l’ADN. Les récepteurs peuvent exercer leur fonction régulatrice de la transcription sous forme d’homodimère, de monomère ou d’hétérodimère. Les éléments de réponses, illustrés par des flèches, peuvent être disposés en palindrome, en palindrome inversés ou en répétition directe.

1.1.1 Monomère Plusieurs récepteurs nucléaires se lient à l’ADN sous forme de monomères. L’élément de

réponse AGG/TTCA est dans ces conditions précédé en 5’ d’une séquence A/T riche (2-6

pb) qui est reconnue par la portion CTE du domaine de liaison à l’ADN. Le CTE forme une

4

boucle qui permet d’accroître le contact avec l’ADN au niveau du sillon mineur. Il procure

ainsi une meilleure stabilité des récepteurs sur leur élément de réponse. La boîte A

contenue dans le CTE contribue plus précisément à la reconnaissance des séquences A/T

riche en amont du motif (Wilson, Paulsen et al. 1992; Giguere, Tini et al. 1994; Giguere

1999).

1.1.2 Homodimère L’homodimérisation constitue le mode principal d’interaction des récepteurs stéroïdiens, tel

ER, AR, PR, GR et ERR, bien que plusieurs autres récepteurs non-stéroïdiens adoptent

également cette conformation. Les interfaces de dimérisation entre les récepteurs ont été

identifiées dans le domaine de liaison au ligand (répétition de séquences hydrophobes) ainsi

que dans le domaine de liaison à l’ADN. La boîte D, située dans le deuxième doigt de zinc,

ainsi que la boîte T, présente dans le domaine CTE, constituent des composantes de ces

interfaces de dimérisation (Hard, Kellenbach et al. 1990; Tanenbaum, Wang et al. 1998).

1.1.3 Hétérodimère Plusieurs récepteurs nucléaires non-stéroïdiens lient l’ADN préférentiellement sous forme

d’hétérodimères. Le récepteur de l’acide rétinoïque-9-cis, RXR, constitue le principal

partenaire d’hétérodimérisation (Kliewer, Umesono et al. 1992). Certains récepteurs tel que

TR, RAR ou VDR peuvent lier leur élément de réponse sous forme d’homodimère, bien

qu’une association avec RXR accroît leur capacité à lier l’ADN ainsi que leur potentiel

d’activation de la transcription. Des récepteurs monomériques tel que NGFI-B et NURR1

peuvent également former un complexe hétérodimérique avec RXR (Perlmann and Jansson

1995). Pour certaines combinaisons de récepteurs les deux partenaires impliqués peuvent

lier l’élément de réponse avec une polarité différente. Ils occupent ainsi successivement le

site en amont ou en aval. La variété des motifs, palindromes, palindromes inversés,

répétitions directes, implique une certaine variation des interfaces de dimérisation des

récepteurs recrutés. Ces différents arrangements nécessitent une importante flexibilité des

protéines permettant une rotation entre le DBD et le LBD. Il existe également, selon les

partenaires impliqués, différentes combinaisons d’occupation des récepteurs par leurs

ligands respectifs. Ainsi pour l’hétérodimère PPAR/RXR, les deux récepteurs peuvent être

5

inoccupés, RXR ou PPAR seul peuvent interagir avec leur ligand ou les deux récepteurs

peuvent être occupés. Le potentiel de transactivation varie alors selon l’état d’interaction

des récepteurs avec leurs ligands (Aranda and Pascual 2001).

Il existe différents mécanismes d’action des récepteurs nucléaires dans la cellule. Le facteur

de transcription peut être localisé dans le cytoplasme et associé à des protéines de choc

thermique (Pratt and Toft 1997). L’interaction au ligand entraîne une dissociation des

récepteurs aux protéines chaperonnes, puis une translocation au noyau afin qu’il puisse y

avoir activation de la transcription de gènes cibles. Selon d’autres modèles, les récepteurs

nucléaires peuvent demeurer dans le noyau de façon continue, liés ou non à l’ADN. En

absence de leur ligand certains récepteurs nucléaires possèderaient même un effet

répresseur sur l’expression des gènes cibles (Chen and Evans 1995; Horlein, Naar et al.

1995).

Fig. 3 Représentation schématique des mécanismes d’action des récepteurs nucléaires. L’interaction au ligand (triangles vert) peut avoir lieu dans le cytoplasme ou le noyau. Les ligands, de divers catégories, peuvent être d’origine extracellulaire (sécrétion endocrine ou paracrine) ou intracellulaire (intermédiaire métabolique).

D’autres récepteurs nucléaires orphelins exerceraient une fonction transactivatrice

constitutive. L’activité des récepteurs nucléaires peut être modulée selon trois mécanismes:

D’abord par la liaison du ligand au récepteur ou à son partenaire d’hétérodimérisation,

ensuite par un changement de leur état de phosphorylation et finalement par une interaction

avec d’autres protéines, notamment avec d’autres facteurs de transcription ou des

cofacteurs (Giguere 1999).

6

L’ensemble des récepteurs nucléaires formant la superfamille auraient pour origine un

même ancêtre commun. Une analyse de la séquence des protéines, selon un schéma

évolutif, a permis d’établir une classification des récepteurs nucléaires en six sous-familles

(Tableau 1). La classe I regroupe les récepteurs des hormones thyroïdiennes (TRs), des

acides rétinoïques (RARs), de la vitamine D (VDRs), des prostaglandines et des acides gras

polyinsaturés «Peroxisomes proliferator activated-receptor» (PPAR). Cette classe

comprend également plusieurs autres récepteurs nucléaires notamment, «Pregnane X

receptor» (PXR), «Constitutive androstane receptor» (CAR), «Liver X receptor» (LXR),

«Farnesoid X receptor» (FXR), «Reverse ErbA» (RevErb) et «Retinoid Z receptor»

(RZR/ROR). La classe II contient les récepteurs des acides rétinoïques-9-cis (RXRs). Elle

regroupe également les récepteurs «chicken ovalbumine upstream regulators» (COUPSs),

«hepatocyte nuclear factor 4» (HNF4), «Testis receptors» (TR2), «Tailles-related receptor»

(TLX) et «Photoreceptor-specific nuclear receptor» (PNR). La troisième classe regroupe les

récepteurs des hormones stréroïdiennes incluant les récepteurs des glucocorticoïdes (GR),

des hormones androgènes (AR), de la progestérone (PR) et des hormones oestrogènes (ER).

Elle comprend également les «Estrogen-related receptors» (ERR). Les récepteurs nucléaires

orphelins «» (NOR-1), «NGF-induced clone B» (NGFI-B) et «Nur-related factor 1»

(NURR 1) forment la quatrième classe tandis que les récepteurs «Stéroïdogenic factor 1»

(SF-1/FTZ-F1) et «Germ cell nuclear factor» (GCNF) appartiennent respectivement aux

classes V et VI. Une dernière catégorie de récepteurs nucléaires, formant la classe 0,

comprend les protéines «Small heterodimeric partner» (SHP) et «Dosage-sensitive sex

reversal» (DAX-1). Plusieurs autres récepteurs nucléaires ont été identifiés chez différentes

espèces, mais ne sont pas mentionnés dans cette liste (Laudet 1997; Giguere 1999; Aranda

and Pascual 2001).

7

Tableau 1. Récepteurs nucléaires chez les mammifères

Classe Nom Sous-type Nomenclature Ligand Liaison HRE

I TR Thyroid hormone receptor α NR1A1 Hormone thyroïdienne (T3) H Pal, DR-4, IP

β NR1A2 Hormone thyroïdienne (T3) H Pal, DR-4, IP

I RAR Retinoic acid receptor α NR1B1 Acide rétinoïque H DR-2, DR-5, Pal, IP

β NR1B2 Acide rétinoïque H DR-2, DR-5, Pal, IP

γ NR1B3 Acide rétinoïque H DR-2, DR-5, Pal, IP

I PPAR Peroxisome proliferator- α NR1C1 Acides gras, leukotriene B4, H DR-1

activated receptor Wy 14.643, fibrates

β NR1C2 Acides gras H DR-1

γ NR1C3 Acides gras, prostaglandin J2 H DR-1

I RevErb Reverse ErbA α NR1D1 Orphelin M, D DR-2, Hémisite

β NR1D2 Orphelin M, D DR-2, Hémisite

I ROR RAR-related orphan α NR1F1 Cholesterol, cholesteryl M Hémisite

receptor sulphate

β NR1F2 Acide rétinoïque M Hémisite

γ NR1F3 Acide rétinoïque M Hémisite

I LXR Liver X receptor α NR1H3 Oxysterols, T0901317, GW3965 H DR-4

β NR1H2 Oxysterols, T0901317, GW3965 H DR-4

I FXR Farnesoid X receptor α NR1H4 Acides biliaires, Fexaramine H DR-4, IR-1

β NR1H5 Lanosterol H DR-4, IR-1

I VDR Vitamin D receptor NR1I1 Vitamine 1,25-dihydroxy (D3), H DR-3, IP-9

Acide litocholique

I PXR Pregnane X receptor NR1I2 Stéroïdes synthétiques et naturels, H DR-3

pregnenolone-16Æ-carbonitrile,

xénobiotiques

I CAR Constitutive androstane α NR1I3 Xenobiotiques, phenobarbital H DR-5

receptor β NR1I4 Xenobiotiques, phenobarbital H DR-5

II HNF-4 Human nuclear factor 4 α NR2A1 Acyl-CoA thioesters D DR-1, DR-2

γ NR2A2 Acyl-CoA thioesters D DR-1, DR-2

II RXR Retnoid X receptor α NR2B1 Acide rétinoïque-9-Cis D, H Pal, DR-1

β NR2B2 Acide rétinoïque-9-Cis D, H Pal, DR-1

γ NR2B3 Acide rétinoïque-9-Cis D, H Pal, DR-1

II TR2 Testis receptor α NR2C1 Orphelin D, H DR-1 à DR-5

β NR2C2 Orphelin D, H DR-1 à DR-5

II TLL Tailless NR2E2 Orphelin M, D DR-1, Hémisite

II PNR Photoreceptor-specific NR2E3 Orphelin M, D DR-1, Hémisite

nuclear receptor

II COUP-TF Chicken ovalbumin upstream α NR2F1 Orphelin D, H Pal, DR-5

promoter-transcription factor β NR2F2 Orphelin D, H Pal, DR-5

II EAR2 ErbA2-related gene-2 NR2F6 Orphelin D, H Pal, DR-5

III ER Oestrogen receptor α NR3A1 Oestradiol-17β, tamoxifen, D Pal

raloxifene

β NR3A2 Oestradiol-17β, composés D Pal

synthetiques

III ERR Oestrogen receptor-related α NR3B1 Orphelin M, D Pal, Hémisite

receptor β NR3B2 Diethylstilbestrol, 4-OH tamoxifen M, D Pal, Hémisite

γ NR3B3 Diethylstilbestrol, 4-OH tamoxifen M, D Pal, Hémisite

III GR Glucocorticoid receptor NR3C1 Cortisol, dexamethasone, RU486 D Pal

III MR Mineralocorticoid receptor NR3C2 Aldosterone, spirolactone D Pal

III PR Progesterone receptor NR3C3 Progesterone, medroxy- D Pal

progesterone acetate, RU486

8

III AR Androgen receptor NR3C4 Testosterone, flutamide D Pal

IV NGFI-B NGF-induced factor B NR4A1 Orphelin M,D,H Pal, DR-5, Hémisite

IV NURR1 Nur related factor 1 NR4A2 Orphelin M,D,H Pal, DR-5, Hémisite

IV NOR1 Neuron-derived orphan NR4A3 Orphelin M Hémisite

receptor 1

V SF1 Steroidogenic factor 1 NR5A1 Orphelin M Hémisite

V LRH1 Liver receptor homologous NR5A2 Orphelin M Hémisite

protein 1

VI GCNF Germ cell nuclear factor NR6A1 Orphelin D DR-0

0 DAX-1 DSS-AHC critical region on the NR0B1 Orphelin

chromosome, gene 1

0 SHP Short heterodimeric partner NR0B2 Orphelin H M: monomère, D: homodimère, H: heterodimère, DR: répétition directe, Pal: Palindrome, IP: Palindrome inversé. (Giguere 1999; Aranda and Pascual 2001; Gronemeyer, Gustafsson et al. 2004)

1.2 Évolution des récepteurs nucléaires Tel que mentionné précédemment, il existe une catégorie de récepteurs nucléaires, désignés

orphelins, dont aucun ligand correspondant n’a été identifié. Diverses recherches ont

toutefois permis d’associé, de façon inattendue, un ligand à des récepteurs nucléaires qui

était initialement définis orphelins dont l’oxystérol pour le récepteur LXR ou les acides

biliaires pour FXR. Par ailleurs, pour certains autres récepteurs nucléaires orphelins la

perspective de trouver un ligand demeure faible. La classification phylogénétique des

récepteurs nucléaires suscite encore plusieurs débats. Pourquoi certains récepteurs

nucléaires appartenant à des classes différentes interagissent avec des ligands similaires

dont les récepteurs des acides rétinoïques RAR et RXR alors que des récepteurs paralogues,

appartenant à une même classe, possèdent une affinité différente pour un même ligand?

PPARγ lie les prostaglandines J2 alors que PPARβ et PPARα s’avèrent incapable de

répondre efficacement à ce composé. De plus les acides gras n’activent pas de façon

identique ces trois récepteurs nucléaires (Laudet 1997; Thornton 2001)

Plusieurs analyses phylogénétiques des récepteurs ont été effectuées afin de répondre à ces

questions. Elles ont permis d’établir différents modèles évolutifs. Le premier récepteur

nucléaire serait apparu chez les métazoaires (Escriva, Safi et al. 1997). Du moins aucune

trace de récepteur nucléaire n’a été détecté chez des organismes non-métazoaire dont les

plantes, les champignons, les algues, les levures et les protozoaires. Les récepteurs COUP-

TF, RXR, FTZ-F1 appartenant aux classes II et V ont été mis en évidence chez les

9

cnidarians et seraient parmi les premiers récepteurs apparus. Deux vagues de duplication de

gènes et d’évolution auraient donné lieu à la grande diversité des récepteurs nucléaires

observée actuellement chez les vertébrés (Laudet 1997; Escriva, Delaunay et al. 2000). Une

première série de duplication après l’apparition des cnidarians aurait donné naissance aux

six classes de récepteurs nucléaires. Une seconde vague de duplication serait survenue

après la séparation des arthropodes et des vertébrés. Elle aurait contribué à la multiplication

des récepteurs dans chacune des six classes actuellement établie chez les vertébrés. Cette

deuxième vague de duplication serait à l’origine de l’émergence des formes paralogues de

récepteurs tel que RARα, RARβ et RARγ ou TRα et TRβ.

Les nouveaux gènes, issus d’une duplication, seraient soumis à un parcourt évolutif

différent. L’accumulation de mutations à des vitesses variables aurait pour effet de moduler

tant le patron d’expression que la fonction des protéines. Cette hypothèse pourrait expliquer

la redondance fonctionnelle de protéines paralogues fréquemment observée suite à

l’inactivation d’un gène. La diversification des gènes chez les vertébrés a également eu lieu

pour d’autres grandes superfamilles de protéines, notamment pour les facteurs de

transcription ETS, les facteurs de croissances Wnt ainsi que les protéines homéotiques hox.

Elle concorde en outre avec une complexification globale du génome.

Selon les models évolutifs établis, l’affinité d’un récepteur pour un ligand serait une

propriété acquise et le premier récepteur nucléaire apparu aurait été orphelin. Cette

hypothèse pourrait expliquer la structure conservée des récepteurs nucléaires en contraste

avec la grande diversité de leurs ligands (Escriva, Safi et al. 1997; Laudet 1997).

Parmis l’ensemble des récepteurs nucléaires ont retrouve dans le LBD une pochette LBP

(ligand-binding pocket) qui constitue le lieu d’interaction des ligands. La taille ainsi que la

forme de cette pochette influencent grandement la spécificité d’un ligand pour son

récepteur. Bien que NURR1 possède une LBD adoptant une structure canonique, il a été

démontré, par crystallographie aux rayons-X, que le LBP était absent chez ce récepteur dû à

la présence de six résidus hydrophobes occupant toute la cavité (Wang, Benoit et al. 2003).

Ces résidus sont également conservés chez les autres membres de la sous-famille Nur, soit

NGFI-B et NOR-1. NURR1 possèderait une conformation active du LBD malgré une

absence de LBP et malgré le fait que la surface d’interaction au cofacteurs, telle que définie

10

chez les récepteurs nucléaires, soit significativement différente. En effet, l’activité

transcriptionnelle de NURR1 serait, fortement corrélée à l’assemblage de l’hélice H1 avec

les hélices H3-H12 du LBD. Une stabilisation de cette assemblage serait essentielle à la

fonction du récepteur et par conséquent constituerait une forme de régulation de la protéine.

En somme ces résultats montrent l’existence de récepteurs nucléaires définis orphelins, non

parce qu’aucun ligand spécifique n’a encore été identifié, mais parce qu’ils possèderaient

une structure leur procurant une activité ligand-indépendante. Ils correspondent à l’idée

établie d’un récepteur nucléaire orphelin ancestral.

Une nouvelle nomenclature des récepteurs nucléaires, inspiré du systême élaboré pour les

cytochromes P450, a été établie afin de réduire la confusion découlant du grand nombre de

nom triviaux donnés aux récepteurs (Nebert, Adesnik et al. 1987). Cette nomenclature est

principalement basée sur l’arbre phylogénétique des récepteurs nucléaires, tiré des travaux

de Laudet V. (Laudet 1997). Le classement phylogénétique avait été établi a partir de

l’analyse de l’évolution des deux domaines les mieux conservés parmi les récepteurs

nucléaires, soit les domaines de liaison à l’ADN et de liaison au ligand. Ainsi, le nom

indique respectivement, pour chaque récepteur nuccléaire (NR) : la classe, le gène et la

forme paralogue (Tableau 1) (Laudet, Auwerx et al. 1999).

1.3 Rôles physiologiques des récepteurs nucléaires

1.3.1 Hormones stéroïdiennes

À ce jour, plusieurs ligands spécifiques des récepteurs nucléaires ont été identifiés. De

façon générale, il s’agit de petites molécules lipophiliques impliquées dans un large

éventail de mécanismes physiologiques. Ces ligands peuvent circuler tant de façon

endocrine, paracrine, autocrine qu’intracrine. Parmi les différentes catégories de ligands

connus, notons d’abord les hormones stéroïdiennes. Les récepteurs nucléaires possédant

une affinité pour les hormones stéroïdiennes sont spécifiques aux vertébrés. Il en existe six

types, les récepteurs des estrogènes (ERα et ERβ), de la progestérone (PR), des androgènes

(AR), des glucocorticoïdes (GR) et des minéralocorticoïdes (MR). On retrouve également

un gène orthologue qui code pour une protéine apparentée au récepteur des estrogènes, le

«estrogen related receptor (ERR)» (Evans 1988; Giguere, Yang et al. 1988). Selon diverses

11

analyses phylogénétiques, le récepteur des estrogènes (ER) auraient donné naissance, par

duplication, aux autres membres de la classe, soit AR, PR, GR, MR et ERR (Thornton

2001). Les récepteurs des hormones stéroïdiennes se distinguent par leur propension à

s’associer, lorsque non liés, à un large complexe de protéines chaperonnes, constitué de

Hsp90 et Hsp56 (Pratt and Toft 1997).

Chez la souris, l’inactivation des gènes codant pour les récepteurs des estrogènes, de la

progestérone ou des androgènes n’est pas létale et n’affecte pas le ratio des sexes. Par

ailleurs l’absence de ces récepteurs affecte fortement le développement des organes

reproducteurs et par conséquent la fertilité. Le récepteur des glucocorticoïdes est quant à lui

impliqué dans plusieurs mécanismes physiologiques. Il participe notamment à la régulation

du métabolisme des carbohydrates, des protéines et des lipides ainsi qu’à la modulation des

réponses du système nerveux central et immunitaire. L’inactivation du gène chez la souris a

permis de mettre en évidence son rôle essentiel dans le développement de différents

organes dont les poumons et la glande surrénale (Beato, Herrlich et al. 1995).

1.3.2 Hormones thyroïdiennes Les hormones thyroïdiennes jouent un rôle clé dans le développement du système nerveux

central, dans la maturation post-natale du myocarde ainsi que dans l’homéostasie de l’axe

hypophyse/glande thyroïde. Il existe deux récepteurs nucléaires spécifiques aux hormones

thyroïdiennes (TRα etTRβ). Une mutation dans le récepteur TRβ a été mise en évidence

chez les personnes atteintes du syndrome de résistance aux hormones thyroïdiennes. Tout

comme chez les personnes montrant une déficience en hormones thyroïdiennes, la maladie

se manifeste par des problèmes d’audition, un retard mental, un déséquilibre émotionnel

ainsi que des troubles d’apprentissage (Kastner, Mark et al. 1995).

1.3.3 Vitamine D et acides rétinoïques

Certains récepteurs nucléaires possèdent une affinité pour les vitamines D et A. Cette

spécificité pour une autre catégorie de molécules contribue à l’étendue des fonctions

physiologiques exercées par les protéines de cette superfamille. Le récepteur de la vitamine

D (VDR) est associé à la variation de la densité minérale osseuse, et ce en relation avec

12

l’absorption de calcium. Quant aux récepteurs des acides rétinoïques (RXR et RAR), ils

sont essentiels à la survie, la croissance, la reproduction et la vision des organismes. Les

acides rétinoïques jouent un rôle prépondérant dans le maintien de nombreux tissus. RAR

possède plusieurs isotypes et isoformes (α1, α2, β1-β4, γ 1 et γ2). Il montre une affinité

pour les acides rétinoïques all-trans et 9-cis. RXR (α, β et γ) est activé uniquement par les

acides rétinoïques 9-cis. L’étendue des fonctions de RXR réside dans sa capacité à former

des hétérodimères avec un grand nombre de récepteurs nucléaires (Kastner, Mark et al.

1995). Les voix de signalisation transmises par les récepteurs RXR et RAR sont impliquées

dans le développement du système nerveux central à plusieurs niveau. Des centaines de

gènes sont régulés par les acides rétinoïques au cours du processus de différentiation

neuronal et de croissance des neurites. Ces gènes codent pour des facteurs de transcription,

des protéines structurales, des enzymes, des glycoprotéines de surface, des protéines

extracellulaires, des neurotransmetteurs, des neuropeptides, des hormones, des facteurs de

croissances ainsi que des récepteurs membranaires (Maden 2001). De plus, les acides

rétinoïques sont impliqués dans l’établissement des axes anteropostérieur et dorsoventrale

du système nerveux central. La différentiation antérieure du tube neural est davantage

ciblée par leur action tandis qu’au niveau de l’axe dorsoventral les acides rétinoïques sont

requis pour le développement des interneurons ainsi que des neurones moteurs latéraux

(Maden 2002).

1.3.4 Récepteurs du métabolisme Un ensemble de récepteurs nucléaires participent à l’adaptation des organismes aux

facteurs environnementaux, à leur diète ainsi qu’à l’absorption de drogues ou de composés

toxiques. Ils ont été regroupés dans la catégorie de récepteurs nucléaires du métabolisme

(Gordon, Fayard et al. 2003). Ces protéines exercent en quelque sorte une fonction de

senseurs et répondent à leur ligand en activant différents sentiers de signalisation par la

transcription de gènes cibles. Ils assurent ainsi l’homéostasie du métabolisme des lipides,

des glucides, du cholestérol, des acides biliaires. Les ligands généralement présents en

concentration élevée proviennent de la diète, de l’environnement ou sont des intermédiaires

de sentiers métaboliques.

13

PPARγ «peroxisome proliferator-activated receptor” exerce une fonction importante dans

la gestion de l’énergie et le métabolisme du glucose (Lemberger, Desvergne et al. 1996).

Selon les différents isoformes il est notamment détecté dans les tissus adipeux, l’intestin et

les cellules hématopoïétiques (Braissant, Foufelle et al. 1996; Loviscach, Rehman et al.

2000). Son expression est activée par un niveau élevé d’insuline (Rieusset, Andreelli et al.

1999). Parmi ses ligands naturels on retrouve les acides gras, dont les acides arachidonique

et linoleique, ainsi que certains dérivés dont le 15-déoxy-delta 12,14-prostaglandine J2,

l’acide éicosapentaénoique et les acides 9- et 13-hydroxyoctadécadiénoique (Forman,

Tontonoz et al. 1995; Yu, Bayona et al. 1995; Kliewer, Sundseth et al. 1997; Lehmann,

Lenhard et al. 1997; Nagy, Tontonoz et al. 1998). Différents ligands synthétiques, tel que

des anti-inflammatoires, utilisés de façon thérapeutique ont également été identifiés

(Lehmann, Lenhard et al. 1997). Les isotypes PPARα, β/δ et γ sont impliqués dans la

régulation du métabolisme des acides gras, des triglycérides et des lipoprotéines. Les acides

gras constituent les principaux ligands de PPARα qui induit l’activation de gènes impliqués

dans leur catabolisme. L’expression de PPARα est régulée par le récepteur des

glucocorticoïdes afin de moduler l’absorption nutritionnelle en condition de stress.

PPARβ/δ possède également une affinité pour les acides gras ainsi que pour la

prostacycline cyclooxygénase 2. Il serait impliqué dans la prolifération et la différenciation

des cellules de la peau, l’implantation de l’embryon ainsi que la différenciation des

précurseurs d’adipocytes.

LXRs «liver X receptor» ainsi que LRH-1 «liver receptor homologue-1» exercent

également une fonction dans le métabolisme des lipides. Ils sont plus précisément

impliqués dans le transport inverse du cholestérol ainsi que dans son absorption (Nitta, Ku

et al. 1999; Schultz, Tu et al. 2000; Lu, Repa et al. 2001). Les oxystérols, les acides

biliaires 6α-hydroxy constituent des ligands naturels de LXR. Le récepteur nucléaire FXR

«farnesol X receptor», tout comme LXRs et LRH-1, participe au métabolisme des acides

biliaires. FXR lie une grande variété d’acides biliaires dont l’acide chénodéoxycholique,

lithocholique et déoxycholique (Makishima, Okamoto et al. 1999; Parks, Blanchard et al.

1999; Wang, Chen et al. 1999). Enfin, la défense des organismes contre des composés

Xéno- et endobiotiques est exercée par PXR/SXR «pregnane X receptor/ steroid et

xenobiotique receptor». Ce récepteur présent principalement dans le foie et plus faiblement

14

dans l’intestin régulerait l’expression du cytochrome p450 (CYP3A) (Bertilsson, Heidrich

et al. 1998; Blumberg, Sabbagh et al. 1998; Lehmann, McKee et al. 1998). SHP «small

heterodimeric partner» constitue un récepteur nucléaire atypique dépourvu d’un domaine de

liaison à l’ADN (Seol, Choi et al. 1996). Il est exprimé dans de nombreux organes dont le

petit intestin, la rate, le cœur, le pancréas, la glande surrénale, les ovaires et les testicules. Il

s’avère être le partenaire d’hétérodimérisation d’une variété de récepteur nucléaires dont

PPAR, ER, et LRH-1 et LXR. De façon générale il aurait un effet inhibiteur sur l’activité

de ces récepteurs nucléaires (Masuda, Yasumo et al. 1997).

C’est le travail coordonné de cet ensemble de récepteurs nucléaires qui permettrait

l’homéostasie des différents sentiers métaboliques. Plusieurs pathologies sont d’ailleurs

associées à un déséquilibre de ces voies de signalisation tel que l’obésité, la résistance à

l’insuline, le diabète de type 2, l’hyperlipidemie et l’athérosclérose.

1.4 Cofacteurs & domaines AF-1 et AF-2 Les facteurs de transcription, dont les récepteurs nucléaires, peuvent moduler l’assemblage

du complexe de préinitiation de la transcription, au niveau d’un promoteur, par une

interaction directe ou indirecte avec les composantes basales de la machinerie

transcriptionnelle. Les interactions indirectes sont créées par l’action de certaines protéines

qui servent à faire le pont, les cofacteurs (coactivateurs/corépresseurs) ou facteurs de

transcription intermédiaires (TIFs). L’existence de cofacteurs spécifiques aux récepteurs

nucléaires a été mise en évidence suite à des expériences de transfection. La présence d’un

second récepteur dans un contexte cellulaire donné avait comme conséquence de réprimer

l’activité d’un premier récepteur. L’interférence produite suggérait la titration de cofacteurs

communs aux deux récepteurs et essentiels à leurs activités respectives. Il est maintenant

connu que les coactivateurs et corépresseurs jouent un rôle essentiel dans l’activité

régulatrice de la transcription exercée par les récepteurs nucléaires. Par contre, leur fonction

spécifique pour le contrôle des processus physiologiques demeurent inconnues. Plusieurs

cofacteurs interagissent avec les mêmes récepteurs nucléaires et sont exprimés dans une

variété de tissus (Aranda and Pascual 2001).

15

1.4.1 Catégories de cofacteurs L’ensemble des cofacteurs connus associés aux récepteurs nucléaires sont classés en trois

catégories. Les différents complexes de cofacteurs identifiés possèdent des activités

distinctes. Le regroupement TRIP/DRAP favorise le recrutement de composantes de la

machinerie de transcription au niveau du promoteur, dont l’ARN polymérase II (Liu, Wong

et al. 1999; Llopis, Westin et al. 2000). Le complexe PCAF/CBP/p160 possède une activité

acétyltransférase et exerce sa fonction enzymatique sur les histones, entraînant un

modification de la structure de la chromatine (Spencer, Jenster et al. 1997; Chen, Lin et al.

1999). Les éléments de l’ensemble SWI/SNF produisent également un remodelage de la

chromatine de façon ATP-dépendante (Vignali, Hassan et al. 2000). Ils produisent une

déstructuration des nucléosomes en modifiant le contacte histone/ADN. Ils facilitent ainsi

l’accès des composantes de la machinerie de transcription à l’ADN (Tableau 2).

1.4.2 Domaine AF-2 L’extrémité carboxy-terminale des récepteurs nucléaires se définit comme le domaine de

liaison au ligand (LBD pour ligand binding domain). Cette portion de la protéine contient le

domaine AF-2 d’activation de la transcription ligand-dépendante. La séquence AF-2 peut

également produire une interférence dans l’activité transcriptionnelle selon la combinaison

récepteur/ligand. Le cœur du domaine AF-2 est situé dans l’hélice 12 du LBD et possède

un motif consensus (φφXEφφ) constitué d’acides aminés hydrophobes (φ) et précédé d’une

boucle de 8 à 12 acides aminés variables. Des résidus chargés de l’hélice 12 combinés au

motif signature de l’hélice 3 et à des résidus leucine des hélices 3 et 4 forment une surface

hydrophile hautement conservée et propice à l’interaction de cofacteurs. Le domaine AF-2

joue un rôle clé dans l’activité des récepteurs nucléaires par le recrutement de différents

types de cofacteurs. Des interactions avec les protéines de la famille p160 (facteurs SRC),

avec les co-intégrateurs CBP/p300 ainsi qu’avec les éléments du complexe TRAP/DRIP,

ont été mise en évidence (Aranda and Pascual 2001). Le motif LXXLL retrouvé dans une

variété de cofacteurs incluant les membres de la famille p160, CBP/p300 et DRAP/DRIP

serait essentiel à leur interaction avec les récepteurs nucléaires. L’interaction du motif

LXXLL avec le domaine AF-2 a d’ailleurs été démontrée (Heery, Kalkhoven et al. 1997;

Darimont, Wagner et al. 1998; Nolte, Wisely et al. 1998).

16

Tableau 2. Cofacteurs des récepteurs nucléaires

Catégorie Famille Nom

p160 SRC-1 Steroid receptor coactivator-1

SRC-2 Steroid receptor coactivator-2

SRC-3 Steroid receptor coactivator-3

ERAP160 Estrogen receptor-associated protein 160 kD

ERAP140 Estrogen receptor-associated protein 140 kD

PPARγ coactivator PGC-1 PPARγ coactivator-1

PGC-2 PPARγ coactivator-2

RNA coactivator SRA Steroid receptor RNA activator

E3 ubiquitin-protein ligase E6-AP

RPF-1

High-mobility group HMG-1 High-mobility group-1

HMG-2 High-mobility group-2

Rb-binding protein L7/SPA

Positive cofactors PC2/PC4 Positive cofactors

ARA70 Androgen receptor activator

Coactivateur NCoA62 Novel coactivator protein

TRIP230 TR-interacting protein

TSC-2 Tuberous sclerosis-2

PBP peroxisome proliferator-activated

receptor (PPAR)-binding protein

SPT6

TIF1α transcriptional intermediary factor 1α

SMCC SRB/mediator-containing complex

ARIP3 androgen receptor-interacting protein 3

Bcl-2-associated Rap46 Receptor-associating protein

athanogene 1 (BAG-1)

BRG-1 Brahma-related gene 1

RING finger protein SNURF Small nuclear RING finger

TBP/TAFIIs TBP TATA-binding protein

TAFIIs TATA-binding protein associated factor

NRIF3 nuclear receptor-interacting factor 3

RNA helicase p68

nuclear RNA-binding protein TLS Translocated in liposarcoma

Conserved ATPase domain Trip-1 TR-interacting protein-1

TSC-2 Tuberous sclerosis-2

RIP-160 receptor-interacting protein

CBP/p300 CBP CREB-binding protein

p300

Cointégrateur p/CIP cointegrator-associated protein

TRAP/DRIP TRAP TR-associated proteins

DRIP VDR-interacting protein

Acetylase PCAF p300/CBP-associating factor

ADA alteration/deficiency in activation

17

Coactivateur/ RIP140 receptor interacting protein 140 kD

Corépresseur Protein à domaine SET NSD1 Nuclear receptor SET domain containing gene 1

SMRT/NCoR SMRT Silencing mediator for retinoic

and thyroid hormone receptors

NCoR Nuclear corepressor

SUN-CoR Small ubiquitous nuclear corepressor

Corépresseur TRUP Thyroid receptor-uncoupling protein

Ssn6-Tup1 Suppressor of snf1 6/deoxy-thymidine

monophosphate uptake positive 1

Ca2+-binding protein Calreticulin

REA Repressor of estrogen receptor activity

Alien

HDAC HDAC1

Deacetylase HDAC2

Metastasis-associated NURD Nucleosome remodeling and deacetylase

genes (MTAs)

(McKenna, Lanz et al. 1999; Robyr, Wolffe et al. 2000; Aranda and Pascual 2001)

1.4.3 Domaine AF-1 On retrouve à l’extrémité N-terminale des récepteurs nucléaires un second domaine

d’activation de la transcription, AF-1, considéré ligand-indépendant. Son activité semble

également associée à la présence de cofacteurs. Une certaine forme de coopération existe

entre les domaines AF-1 et AF-2. Certains cofacteurs liés au domaine AF-2 peuvent

participer à l’activité du domaine AF-1. L’interaction des coactivateurs p160 et des

composantes du complexe DRIP/TRAP avec l’extrémité N-terminale de divers récepteurs

nucléaires a été mise en évidence. L’association au domaine AF-1 ne requièrt pas la

participation du motif LXXLL des cofacteurs impliqués, mais plutôt des séquences riches

en glutamines (Bevan, Hoare et al. 1999). La phosphorylation de résidus sérine/thréonine

dans la portion N-terminale des récepteurs constituerait un mécanisme de recrutement de

cofacteurs. Ainsi plusieurs voies kinases s’avèrent liées à l’activité des récepteurs

nucléaires (Rochette-Egly 2003).

1.4.4 Domaine de liaison à l’ADN et cofacteurs GT198 constitue une nouvelle classe de coactivateur spécifique au récepteurs nucléaires

(Ko, Cardona et al. 2002). Il se distingue par son mécanisme d’action. GT198 représente

18

pour le moment un type unique de cofacteur montrant une affinité pour le domaine de

liaison à l’ADN. Il se lie aux récepteurs à l’aide d’une séquence de dimérisation riche en

leucine.

1.4.5 Échange des complexes coactivateurs et corépresseurs Les coactivateurs et corépresseurs sont essentiels à l’activité des récepteurs nucléaires.

Toutefois peu d’études portent sur l’échange des différents complexes protéiques au niveau

des récepteurs nucléaires et ce, en fonction de la présence ou l’absence d’un ligand.

Récemment le rôle des protéines TBL1 et TBLR1, dans la transition de l’état réprimé à

l’état activé des récepteurs nucléaires a été mis en évidence. TBL1 et TBLR1 se

caractérisent par un domaine F box/WD-40. Bien qu’elles aient initialement été identifiées

comme des composantes du complexe N-CoR/SMRT, elles serviraient, en fait, à l’échange

des corépresseurs pour des coactivateurs. Ce modèle a plus spécifiquement été mis en

évidence au niveau des récepteurs nucléaires RAR, ER, PPARγ et TR. TBL1/TBLR1

possèderaient une fonction d’adaptateur, via TBLR1, avec le complexe

ubiquitine/protéasome 19S. Ce mécanisme induirait la libération et possiblement la

dégradation du complexe de corépresseurs N-CoR/SMRT. TBL1 et TBLR1 seraient

également requis pour l’échange de cofacteurs au niveau d’autres types de facteur de

transcription dont c-jun et NFκB (Perissi, Aggarwal et al. 2004).

2. La sous-famille NOR-1/NGFI-B/NURR1

2.1 La propriété de gène à induction précoce de NOR-1, NGFI-B et NURR1 NGFI-B, NURR 1 et NOR-1, respectivement NR4A1, NR4A2 et NR4A3 selon la nouvelle

nomenclature, forment une sous-famille de récepteurs nucléaires orphelins, désignée Nur.

Elle constitue la classe IV des récepteurs de la superfamille. Ces trois protéines présentent

une homologie de 97% entre leur domaine de liaison à l’ADN, de 37-53% entre leur région

N-terminale et de 53-77% pour la portion C-terminale, correspondant au domaine de liaison

au ligand. NGFI-B, NURR 1 et NOR-1 ont également en commun une spécificité pour

l’élément de réponse NBRE (Wilson, Fahrner et al. 1991). Ces récepteurs nucléaires on

19

initialement été définis comme des activateurs constitutifs de la transcription, ne nécessitant

pas une interaction préalable à un ligand pour exercer leur fonction de facteur de

transcription. Tel que décrit précédemment, le domaine de liaison aux ligand des récepteurs

de cette sous-famille ne possède pas de cavité « ligand-binding pocket » permettant la

liaison d’un ligand (Wang, Benoit et al. 2003). Cette caractéristique du LBD est également

observée chez DHR38 l’orthologue des récepteurs Nur chez la drosophile (Baker,

Shewchuk et al. 2003). NGFI-B, NURR1 et NOR-1 représentent une catégorie unique de

récepteur nucléaire possédant une fonction « d’immediate early gene ».

NGFI-B et NURR 1 peuvent s’hétérodimériser avec RXR et se lier à un élément de réponse

DR5 (Forman, Umesono et al. 1995; Perlmann and Jansson 1995; Zetterstrom, Solomin et

al. 1996; Aarnisalo, Kim et al. 2002; Sacchetti, Dwornik et al. 2002). Contrairement aux

deux autres membres de la sous-famille, NOR-1 ne possède pas la capacité de former un

hétérodimère avec RXR (Zetterstrom, Solomin et al. 1996). L’activité de NGFI-B sous

forme d’homodimère a également été démontré au niveau de l’élément de réponse NurRE,

(Nur response element) dans la région régulatrice du gène pro-opiomélanocortin (POMC)

(Philips, Lesage et al. 1997). Les récepteurs nucléaires de la sous-famille Nur sont

considérés comme des «immediate early genes», impliqués dans la prolifération cellulaire.

Ils sont exprimés rapidement dans une variété de types cellulaires en réponse à différents

stimuli, notamment des facteurs de croissance. NGFI-B, NURR 1 et NOR-1 sont associés

au développement et à l’activité du système nerveux central. NOR-1 est également appelé

TEC, MINOR, CHN et NR4A3 (Ohkura, Hijikuro et al. 1994; Hedvat and Irving 1995;

Labelle, Zucman et al. 1995; Clark, Benjamin et al. 1996). NGFI-B porte aussi les noms de

Nur77, TR3, N10, NAK-1, TIS1 et NR4A1 (Hazel, Nathans et al. 1988; Milbrandt 1988;

Arenander, Lim et al. 1989; Chang, Kokontis et al. 1989; Ryseck, Macdonald-Bravo et al.

1989; Nakai, Kartha et al. 1990), tandis que NURR1 est aussi désigné TINUR, NOT,

RNR1, HZF-3 et NR4A2 (Law, Conneely et al. 1992; Scearce, Laz et al. 1993; Mages,

Rilke et al. 1994; Pena de Ortiz, Cannon et al. 1994).

2.1.1 NOR-1 NOR-1 (neuron derived orphan receptor) a initialement été identifié dans une culture

primaire de neurones du cerveau antérieur de rat en processus d’apoptose (Ohkura, Hijikuro

20

et al. 1994). La mort cellulaire était induite par une carence en facteurs neurotrophiques et

l’ADNc du récepteur nucléaire avait été isolé par PCR à l’aide d’oligos dégénérés

correspondant à des séquences conservées du domaine de liaison à l’ADN. Dans des

lignées de neuroblastome NB-OK-1, l’expression de NOR-1, tout comme celle de NGFI-B

et de NURR1, était induite par un traitement à la forskolin et au 12-O-

tétradécanoylphorbol-13-acétate. Ces agents stimulent la différentiation neuronale et

entraînent respectivement l’activation des protéines kinases A et C. Ces expériences ont

permis de mettre en évidence le caractère «d’immediate-early gene» des récepteurs de la

sous-famille Nur (Maruyama, Tsukada et al. 1995). NOR-1 a également été isolé à partir

d’une librairie d’ADNc de lymphocytes T humains activés par du PHA

(phytohémagglutinine) et du PMA (phorbol 12-myristate 13-acétate). PHA, une lectine,

constitue un agent mitogène qui stimule la prolifération des lymphocytes T via l’activation

du complexe TCR tandis que PMA lie et active la protéine kinase C. La stimulation des

cellules T entraîne l’induction de seconds messagers qui régulent ensuite l’expression de

différents «immediate-early genes». Le rôle de NOR-1 dans la prolifération cellulaire a

ainsi été démontré d’où l’origine de son appellation MINOR pour «mitogen-inducible

nuclear receptor» (Hedvat and Irving 1995). Une surexpression de NOR-1 dans le foie a

également été constaté suite à une hépatectomie partielle chez le rat (Petropoulos, Part et al.

1995).

La fusion des gène EWS (Ewing’s sarcoma) et NOR-1 a été mis en évidence dans les

chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques (Labelle, Zucman et al. 1995; Clark,

Benjamin et al. 1996). Une protéine de fusion EWS/NOR-1 issue de cette translocation

chromosomique t(9 ; 22)(q22 ;q12) pourrait être à l’origine du phénotype tumoral. Le nom

TEC donné au récepteur nucléaire orphelin signifie «Translocated in extraskeletal

chondrosarcoma». Trois autres partenaires de fusion du récepteur nucléaire NOR-1 ont été

identifiés dans ces tumeurs, soit TAF2N t(9 ;17), TCF12 t(9 :15) et tout récemment TGF (

(Sjogren, Meis-Kindblom et al. 1999; Sjogren, Wedell et al. 2000; Hisaoka, Ishida et al.

2004). Le rôle de ces protéines de fusion dans le développement des chondrosarcomes

myxoïdes extrasquelettiques n’est pas connu.

21

NOR-1 et NGFI-B exercent une fonction importante dans le mécanisme de sélection

négative des thymocytes qui a lieu dans le thymus. Ces récepteurs nucléaires participent, de

façon redondante, au processus apoptotique induit par l’activation des récepteurs TCR (Liu,

Smith et al. 1994; Cheng, Chan et al. 1997). NOR-1 est exprimé dans une variété de tissus

et de types cellulaires. Il est notamment présent dans la glande surrénale et régulerait, tout

comme NGFI-B, la transcription de la 21-hydroxylase une enzyme impliquée dans la

synthèse de composés stéroïdiens (Fernandez, Brunel et al. 2000). Dans le contexte de

maladies cardiovasculaires, on note l’expression de NOR-1, NGFI-B et NURR1 dans les

cellules musculaires lisses et endothéliales des lésions athéromateuses (Wansa, Harris et al.

2003). De plus, on constate une variation du patron d’expression de NGFI-B et NOR-1

dans le cerveau en réponse à différentes drogues dont les antipsychotiques (Beaudry,

Langlois et al. 2000; Werme, Ringholm et al. 2000; Ethier, Beaudry et al. 2004; Maheux,

Ethier et al. 2005). NOR-1, NGFI-B et NURR 1 sont induits dans une culture primaire

d’ostéoblaste en réponse à l’hormone parathyroïde (PTH). Le récepteur couplé à une

protéine G, PTHR1, serait localisé en amont de la cascade de signalisation et l’activation

des récepteurs nucléaires Nur serait induite via PKA-cAMP (Pirih, Nervina et al. 2003).

2.1.2 NGFI-B NGFI-B (Nerve growth factor-induced clone B) a initialement été identifié dans des

cellules phéochromocytoma PC12 traitées au NGF (nerve growth factor) ainsi que dans des

fibroblastes induits au sérum (Hazel, Nathans et al. 1988; Milbrandt 1988). Il exercerait une

fonction importante dans la régulation neuroendocrine de l’axe

hypothalamo/hypophyso/surrénalien. NGFI-B participerait au contrôle de l’expression du

gène pro-opiomélanocortin (POMC) dans l’hypophyse (Murphy and Conneely 1997;

Drouin, Maira et al. 1998). Au niveau de la glande surrénale, il régulerait la transcription du

gène codant pour l’enzyme 21-hydroxylase en fonction du niveau d’ACTH (hormone

adrénocorticotropique) (Wilson, Mouw et al. 1993). La 17-hydroxylase constituerait

également un gène cible du récepteur nucléaire (Zhang and Mellon 1997). Chez le rat,

NGFI-B serait exprimé, en réponse au stress, dans les neurones du noyau paraventriculaire

de l’hypothalamus responsables de la libération de la CRH (Corticotropin-releasing

hormone) (Parkes, Rivest et al. 1993; Honkaniemi, Kononen et al. 1994).

22

Le récepteur nucléaire orphelin NGFI-B participerait également au processus de synthèse

d’hormones stéroïdiennes se déroulant dans les cellules Leydig des testicules (Song, Park et

al. 2001; Song, Lee et al. 2002). Ces cellules localisées dans les compartiments interstitiels

des testicules procèderaient à la conversion du cholestérol en prégnénolone et

subséquemment en progestérone. Elles seraient également responsables de la synthèse de

testostérone. L’activité des cellules Leydig serait stimulée par l’hormone LH (Luteinizing

Hormone), originaire de l’hypophyse. Il a été démontré dans des lignées de cellules Leydig

de souris que l’expression de NGFI-B était régulée par la LH (Song, Park et al. 2001). La

PKA ainsi que la PKC interviendrait dans la signalisation menant à l’induction de NGFI-B.

En somme, NGFI-B (Nur77) serait impliqué dans le développement des testicules chez la

souris.

Chez le rat, l’activité du récepteur nucléaire NGFI-B dans les ovaires a également été mis

en évidence. Son expression serait sous le contrôle de la LH et aurait lieu dans les cellules

granulosa des follicules précédant l’ovulation. Son messager serait également exprimé dans

les cellules thecales et interstitielles des ovaires. Sa présence serait associée à la synthèse

d’hormones stéroïdiennes. Il régulerait notamment l’expression du gène codant pour la

20α-hydrostéroide déhydrogénase. Cette enzyme contribue au catabolisme de la

progestérone dans le corpus luteum (Park, Park et al. 2001; Stocco, Lau et al. 2002).

Le rôle NGFI-B dans l’apoptose a beaucoup été étudié. Outre son implication dans la

sélection négative des lymphocytes T immatures, NGFI-B exercerait une fonction

proapoptotique dans une variété de cellules tumorales. Une translocation de NGFI-B aux

mitochondries est observée dans des cellules de tumeur du poumon, de la prostate, de

l’ovaire, du colon et de l’estomac (Li, Kolluri et al. 2000; Liu, Wu et al. 2002; Wu, Liu et

al. 2002; Holmes, Soprano et al. 2003; Kolluri, Bruey-Sedano et al. 2003; Wilson, Arango

et al. 2003). La translocation de NGFI-B est préalable à la libération du cytochrome C et à

la poursuite des mécanismes de mort cellulaire. Il a récemment été démontré que le

récepteur nucléaire NGFI-B interagissait avec BCL-2. Cette liaison entraîne un changement

de conformation de BCL-2, modifiant ainsi son potentiel antiapoptotique en potentiel

proapoptotique (Lin, Kolluri et al. 2004). La translocation de NGFI-B, du noyau aux

mitochondries, en réponse à un signal apoptotique aurait lieu sous forme d’hétérodimère

23

avec RXRα. La migration du complexe RXRα/NGFI-B serait conditionnelle à la présence

du ligand de RXRα qui favoriserait la localisation des récepteurs nucléaires dans le noyau

(Cao, Liu et al. 2004).

L’inactivation du gène NGFI-B chez la souris fût réalisée (Lee, Wesselschmidt et al. 1995).

Toutefois, il ne semble pas que l’absence du récepteur nucléaire produise l’apparition de

phénotype majeur. Aucune anomalie n’est décelée, tant au niveau de la maturation des

lymphocytes T, de l’activité de l’axe hypotalamo/hypophyso/surrénalien que du

développement du système reproducteur.

2.1.3 NURR1 NURR1 constitue le troisième membre de la sous-famille de récepteurs nucléaires Nur. Il a

été identifié, chez le rat, dans les cellules du foie en régénération (Law, Conneely et al.

1992; Scearce, Laz et al. 1993). Une hépatectomie partielle avait été effectué chez l’animal

afin d’étudier l’expression de gènes participant à la prolifération cellulaire. Les propriétés

d’ «immediate-early gene» du récepteur nucléaire NURR1 ont ainsi été mises en évidence.

L’ADNc de NURR1 avait initialement été isolé dans une banque de cerveau de souris

(Law, Conneely et al. 1992). Tout comme NGFI-B, son expression est induite par une

dépolarisation des membranes dans des cellules PC12. NURR1 est fortement exprimé dans

le cerveau. Il est plus spécifiquement associé au développement des neurones

dopaminergiques du mésencéphale (Zetterstrom, Solomin et al. 1997). L’inactivation du

gène NURR1 chez la souris entraîne une absence du développement des neurones

dopaminergiques de la substance noire et l’aire tegmentale ventrale et conséquemment la

mort des souris à la naissance (Zetterstrom, Solomin et al. 1997),.(Castillo, Baffi et al.

1998; Saucedo-Cardenas, Quintana-Hau et al. 1998). L’innervation dopaminergique

nigrostriatal est impliquée dans le contrôle des mouvements volontaires et s’avère affectée

chez les personnes atteintes de la maladie de Parkinson. Il semble que certains

polymorphismes de NURR1 puissent être associés à la maladie de Parkinson (Xu, Liang et

al. 2002; Le, Xu et al. 2003).

24

Tout comme NOR-1 et NGFI-B, NURR1 participerait à une variété de mécanismes

cellulaires. Tel que mentionné précédemment, il contribuerait au métabolisme des tissus

osseux sous le contrôle de l’hormone parathyroïde (Tetradis, Bezouglaia et al. 2001). Il a

récemment été démontré que le récepteur nucléaire NURR1 régulait l’expression de la

«corticotropine-releasing hormone» au niveau des articulations dans le contexte de

maladies inflammatoires tel que l’arthrite rhumatoïde. On détecte la présence de NURR1

plus spécifiquement au niveau du tissu synovial. Les cytokines PGE2, Il-1β et TNF-α

seraient responsable de l’augmentation du messager et de la protéine NURR1. La

régulation du promoteur de NURR1 serait plus spécifiquement exercée par les protéines

CREB et NF-κB(Murphy, McEvoy et al. 2001; McEvoy, Murphy et al. 2002).

2.2 Patron d’expression de NGFI-B, NURR 1 et NOR-1

2.2.1 Au cours du développement embryonnaire Les trois récepteurs de la sous-famille NGFI-B/NURR1/NOR-1 sont fortement associés au

système nerveux central. Une analyse exhaustive effectuée par hybridation in situ a été

réalisée afin de comparer la distribution spatio-temporelle, principalement dans le cerveau,

des transcrits NGFI-B, NURR1 et NOR-1 chez le rat et la souris (Zetterstrom, Solomin et

al. 1996). Cette étude avait pour objectif de mieux comprendre les rôles communs et

distincts des trois récepteurs. Les patrons d’expression de NGFI-B, NURR1 et NOR-1 qui

peuvent à la fois se superposer ou s’exclure contribuent à expliquer certains phénotypes

chez les souris knock-out pour NGFI-B et NURR1. Ainsi NURR1 est le seul des trois

récepteurs exprimé dans les neurones dopaminergiques du mésencéphal, tandis NGFI-B et

NOR-1 sont colocalisés dans la glande surrénale et le thymus suggérant une redondance

fonctionnelle dans ces tissus.

Chez la souris, NOR-1 est détecté au jour E11.5 du développement embryonnaire. Il est

d’abord décelé dans le plancher et le plafond du tube neural. Chez le rat, au jour E16.5,

NOR-1 est fortement exprimé dans le cortex cérébral. L’ARNm NOR-1 est plus

précisément confiné à la couche de neurones en différentiation, externe aux cellules

neuroépithéliales en prolifération. De façon générale, le messager NOR-1 est détecté dans

le néocortex, la moelle épinière, la glande surrénale et l’oreille interne. On le retrouve

25

également, mais en plus faible quantité, dans l’hippocampe, le thalamus, le cervelet et le

noyau amygdalien.

NURR1 apparait également au jour E11.5 du développement embryonnaire chez la souris.

Il est plus spécifiquement exprimé au niveau des cellules post-mitotiques, non-

prolifératives du tube neural et du cerveau. On observe une forte concentration de l’ARNm

NURR1 dans la portion ventrale du mésencéphale où se trouve les précurseurs des

neurones dopaminergiques. Le messager NURR1 est également décelé dans la partie

proximo-antérieure des membres postérieurs. Chez le rat, au jour E16.5, NURR1 est plus

précisément exprimé dans la portion postérieure du cerveau, soit au niveau du

mésencéphale et de la région pontine. On détecte une forte présence du messager NURR1

dans le thalamus, l’aire tegmentale ventrale, la substance noire et la moelle épinière.

NURR1 est aussi exprimé, mais à un niveau plus faible, dans le néocortex, l’hippocampe et

le noyau amygdalien.

Chez le rat, au jour E16.5, l’ARNm de NGFI-B est mis en évidence uniquement dans la

glande surrénale et les nerfs.

2.2.2 A la Naissance et à l’âge adulte Les analyses par hybridation in situ ont également été réalisées afin d’établir le patron

d’expression, chez le rat, de NGFI-B, NURR1 et NOR-1 à la naissance ainsi qu’à l’âge

adulte (Zetterstrom, Solomin et al. 1996). Cependant, la récolte des données à la naissance,

pour les trois récepteurs nucléaires, est limitée au système nerveux et à la tête. Ainsi au jour

0 post-natal, une présence élevée de messager NOR-1 est observée dans le néocortex, les

noyaux caudé/putamen, l’hippocampe, le subiculum, le noyau habenulaire, le noyau

amygdalien et l’oreille interne. Un niveau plus faible d’ARNm NOR-1 est décelé dans le

cervelet ainsi que la moelle épinière. Chez le rat adulte, NOR-1 est fortement exprimé dans

le bulbe olfactif, l’hippocampe, le subiculum, le noyau habenulaire, le noyau agmydalien,

le cervelet et la glande surrénale. Le gène NOR-1 est également transcrit, mais plus

faiblement, dans le néocortex, le caudé/putamen, la moelle épinière, le septum, l’intestin,

les poumons et les testicules.

26

À la naissance, le messager NURR1 est présent dans le néocortex, le subiculum, le noyau

habenulaire, l’hypothalamus, l’aire tegmentale ventrale et la substance noire. On détecte

l’ARNm NURR1, en plus faible quantité, dans le bulbe olfactif, le septum, l’hippocampe,

la moelle épinière ainsi que dans le noyau amygdalien. On détecte à l’âge adulte le

messager NURR1 dans le néocortex, l’hippocampe, le subiculum, le noyau habenulaire,

l’hypothalamus, l’aire tegmentale ventrale, la substance noire et le cervelet. On retrouve

l’ARNm NURR1, en quantité inférieure, dans le bulbe olfactif, le noyau amygdalien et les

testicules.

NGFI-B montre un patron d’expression à la naissance plus restreint que les deux autres

récepteurs de la sous-famille. Ainsi on retrouve le transcrit NGFI-B dans le bulbe olfactif et

en proportion moindre dans les noyaux caudé/putamen et les nerfs. NGFI-B présente un

patron d’expression plus étendu à l’âge adulte. Ainsi on observe la présence d’ARNm dans

le bulbe olfactif, le néocortex, le caudé/putamen, l’hippocampe, le subiculum, le cervelet et

la glande surrénale. On détecte des transcrits NGFI-B en plus faible proportion dans le

noyau habenulaire, l’hypothalamus, le noyau amygdalien, les reins, les poumons et les

testicules.

Le patron d’expression des trois récepteurs nucléaires de la sous-famille NGFI-

B/NURR1/NOR-1 a également été analysé par buvardage Northern dans le cadre de

différentes recherches. Chez l’humain adulte, l’ARNm NOR-1 est abondant dans le cœur et

le muscle squelettique. Il est également détecté de façon plus marginale dans le cerveau et

le rein (Labelle, Zucman et al. 1995; Ohkura, Ito et al. 1996). Dans les tissus fœtaux

humains, une forte expression de NOR-1 est décelée dans le cœur (Labelle, Zucman et al.

1995). Les transcrits sont aussi présents dans le cerveau, les poumons et en plus petite

quantité dans le rein et le foie (Ohkura, Ito et al. 1996). Deux transcrits majeurs sont

décelés dans les différents tissus. Ces messagers possèdent une taille de 4.0 et 5.5 kb selon

Ohkura et al. et de 5.0 et 6.5 kb selon Labelle et al. qui ont également mis en évidence un

troisième ARNm de 2.0 kb exprimé uniquement dans les testicules. La comparaison des

patrons d’expression de NOR-1 chez l’humain, la souris et le rat révèle certaines

distinctions. Ainsi on constate une présence importante du messager NOR-1 dans les tissus

27

musculaires, cœur et muscle squelettique, chez l’humain comparativement à une expression

prépondérante dans les tissus nerveux chez le rat et la souris.

Le patron d’expression des récepteurs NURR-1 et NGFI-B a également été établit par

analyses Northern. Chez la souris, l’ARNm NGFI-B apparaît principalement dans les

testicules, le cerveau et le muscle squelettique. Quant au messager NURR1, il est

principalement distribué dans le cerveau (Law, Conneely et al. 1992). Il est détecté au jour

19 du développement embryonnaire, atteint un niveau maximal à la naissance et diminue

progressivement jusqu’à l’âge adulte. Chez le rat adulte, outre une présence importante du

messager NURR1 dans le cerveau, on observe une expression plus faible dans les poumons,

la rate et l’estomac (Scearce, Laz et al. 1993).

On constate une forte similarité entre les patrons d’expression des trois membres de la

sous-famille Nur chez le rat adulte. La présence des messagers NOR-1, NURR1 et NGFI-B

diffère d’avantage au cours de la vie embryonnaire ainsi qu’à la naissance. Certaines

distinctions notables attire d’ailleurs l’attention. D’abord le faible niveau d’expression de

NGFI-B dans l’ensemble des tissus, au cours du développement. De plus, à l’opposé de

NGFI-B et NOR-1, on observe une présence marquée du messager NURR1 dans les

structures du mésencéphal ventral. Une absence des neurones dopaminergiques de la

substance noire et de l’aire tegmentale ventrale découle d’ailleurs d’une inactivation du

gène NURR1 chez la souris. Ces résultats suggèrent que l’expression des membres de la

sous-famille Nur puisse corréler avec une fonction importante de ces récepteurs dans le

développement ainsi que dans l’activité des différents types cellulaires. NOR-1 se distingue

de NURR1 et NGFI-B par sa présence importante dans l’oreille interne durant

l’embryogénèse et à la naissance, par son expression dans l’intestin à l’âge adulte, ainsi que

par son apparition plus précocement dans le cervelet. Notons également, chez l’embryon, la

présence importante de l’ARNm NOR-1 dans la couche de cellule en différentiation du

cortex cérébral.

28

2.3 Liaison à l’ADN et éléments de réponses

2.3.1 NBRE, « NGFI-B response element » Les trois membres de la sous-famille NGFI-B/NURR1/NOR-1 peuvent lier l’ADN sous

forme de monomères. L’élément de réponse NBRE (aaAGGTCA), pour NGFI-B response

element, a été identifié par un système de sélection in vivo chez la levure, une technique

permettant de trouver la séquence cible de protéines liant l’ADN (Wilson, Fahrner et al.

1991). L’affinité de NURR1 et NOR-1 pour le NBRE a par la suite été démontré (Wilson,

Paulsen et al. 1992). Les trois récepteurs NGFI-B, NURR1 et NOR-1 montrent d’ailleurs

une très forte homologie entre les séquences en acides aminés de leur domaine de liaison à

l’ADN (> 90%).Le potentiel d’activation de la transcription des trois récepteurs nucléaires

à partir du NBRE a subséquemment été mis en évidence. Le NBRE est maintenant définit

comme un élément de réponse spécifique des membres de la sous-famille NGFI-

B/NURR1/NOR-1. Il a d’ailleurs été identifié dans la région promotrice du gène codant

pour l’enzyme 21-hydroxylase qui serait régulée par NGFI-B (Wilson, Mouw et al. 1993).

2.3.2 NurRE, « Nur response element » L’élément de réponse NurRE, pour Nur response element, a été identifié dans la région

régulatrice du gène pro-opiomélanocortine (POMC). Ce motif sur lequel s’homodimérise

NGFI-B possède une structure palindromique contenant deux sites distincts du NBRE

séparés par 6 pb (gTGATATTTacctccAAATGCCAg) (Philips, Lesage et al. 1997).

Les cellules corticotrophes de l’hypophyse antérieur produisent la pro-opiomélanocortine

(POMC) et l’ACTH en réponse à un signal hypothalamique la CRH (corticotropin releasing

hormone). L’élément de réponse NurRE est essentiel à la transcription du gène POMC dans

les cellules AtT-20. Il a d’ailleurs été montré qu’un dominant négatif NGFI-B abolissait

l’expression du gène POMC induite par le facteur CRH (Philips, Lesage et al. 1997). Les

récepteurs des glucocorticoïdes exercent également une fonction régulatrice, mais

répressive, sur le gène POMC. Un élément de réponse nGRE superposé à un NBRE a

d’ailleurs été identifié dans son promoteur (Drouin, Maira et al. 1998; Turney and Kovacs

2001). Toutefois, le potentiel de transactivation de l’homodimère NGFI-B au niveau de la

séquence NurRE est supérieur à celui de la forme monomérique du récepteur sur le NBRE.

29

De plus, les deux éléments du palindrome NurRE sont requis pour une réponse

physiologique.

2.3.2.1 Phosphorylation de NGFI-B et liaison au NurRE Dans les cellules AtT-20 dérivées de l’hypophyse, le sentier de signalisation cAMP/PKA

induit par la CRH est essentiel à l’activité transcriptionnelle régulée par l’élément de

réponse NurRE. La signalisation CRH/cAMP/PKA permettrait d’accroître la liaison de

NGFI-B au NurRE, mais n’aurait pas d’effet au niveau du NBRE. Une déphosphorylation

de la sérine 316 dans le domaine de liaison à l’ADN serait nécessaire à la liaison du

récepteur NGFI-B sur l’ADN.

Par ailleurs, une hyperphosphorylation de l’extrémité N-terminale du récepteur est observée

en réponse à différents signaux et concorde avec la découverte que le domaine AF-1 serait

essentiel à l’action de NGFI-B (et de NURR1) au niveau du NurRE. Un changement de

l’état de phosphorylation, induit par la voie de signalisation PKA, permettrait le

recrutement de coactivateurs qui stabiliserait la forme homodimérique des récepteurs

(Maira, Martens et al. 2003).

2.3.3 Hétérodimérisation de RXR avec NGFI-B et NURR-1 RXR est le partenaire des récepteurs nucléaires orphelins NGFI-B et NURR1. Les

hétérodimères formés (RXR/NURR1 et RXR/NGFI-B) reconnaissent préférentiellement un

élément de réponse DR5 (répétition directe espacée de 5 nucléotides) (Perlmann and

Jansson 1995). Contrairement au deux autres membres de la sous-famille, diverses

expériences in vitro et in vivo montrent que NOR-1 est incapable de lier RXR pour former

un complexe stable et activer la transcription sous forme d’hétérodimère (Zetterstrom,

Solomin et al. 1996) Le complexe RXR/RAR (all-trans retinoic acid receptor) montre une

spécificité pour l’élément de réponse DR5 (GGTTCAccgaaAGTTCA). Cette association

avec RAR inhibe l’activité spécifique de RXR qui devient un partenaire silencieux tandis

que la combinaison RXR/NGFI-B ou RXR/NURR1 sur le même motif DR5 stimule

l’activation du récepteur de l’acide rétinoïque–9-cis en réponse à son ligand. Il devient alors

un partenaire actif. NGFI-B et NURR1 module donc positivement le potentiel d’activation

de la transcription de RXR (Perlmann and Jansson 1995).

30

2.3.3.1 RXR et NURR1 Il existe trois isotypes du récepteur RXR α, β et γ codés par trois gènes distincts. Ces trois

formes montrent un patron d’expression différent, entre autre dans le système nerveux

central où se retrouvent également les trois membres de la sous-famile NGFI-

B/NURR1/NOR-1. Les différents complexes hétérodimériques formés peuvent ainsi jouer

une fonction régulatrice spécifique selon leur distribution dans les différents types

cellulaires. NURR1 interagit uniquement avec les isotypes α et γ de RXR pour former un

complexe hétérodimérique fonctionnel. RXRα est exprimé de façon ubiquitaire mais faible

dans le cerveau alors que RXRγ se concentre principalement dans le striatum,

l’hypothalamus et l’hypophyse antérieure. La présence d’un élément DR semble également

essentielle à la transduction d’un signal rétinoïque par le complexe RXR/NURR1

(Sacchetti, Dwornik et al. 2002).

En établissant les séquences du domaine de liaison au ligand essentielles à

l’hétérodimérisation de RXR et de ses partenaires, une région composée de 11 résidus à été

mise en évidence (Perlmann, Umesono et al. 1996; Lee, Na et al. 1998). Cette séquence,

identifiée la boîte I est située dans l’hélice 9 et 10 du LBD. Elle se révèle fortement

conservée, tant parmi les récepteurs nucléaires se dimérisant que parmi les récepteurs

monomériques (Aarnisalo, Kim et al. 2002). Curieusement, NOR-1 qui demeure incapable

de s’hétérodimériser avec RXR possède une boîte I dont la séquence diffère peu de celle de

NURR1. Des mutations par substitution de 1-3 aa dans la boîte I de NURR1 peuvent

complètement abolir la capacité du récepteur à former un complexe avec RXR. Par contre,

NURR1 conserve alors sa capacité à activer la transcription sous forme de monomère sur

un NBRE. La substitution de la boîte I de NOR-1 pour celle de NURR1 n’a pas conféré au

récepteur NOR-1 la capacité de s’hétérodimériser avec RXR. La composition en acides

aminés à l’extérieur de la boîte I s’avère donc également importante pour la formation d’un

dimère. Certaines mutations à l’intérieur de la boîte I de RXR supprime son potentiel

d’hétérodimérisation avec NURR1. Par contre, ces mêmes changements n’affectent pas

l’interaction de RXR avec RAR, TR ou CAR. Ces résultats reflètent les différences

fonctionnelles de chaque hétérodimère.

2.3.3.2 RXR et NGFI-B

31

Le récepteur nucléaire NGFI-B a originellement été identifié suite à son induction rapide

dans les cellules PC12 en réponse au facteur de croissance NGF (nerve growth factor)

(Milbrandt 1988). Il a ensuite été démontré que NGF produisait un changement de l’état de

phosphorylation de NGFI-B (Katagiri, Hirata et al. 1997). NGF cause, de plus, une

translocation de NGFI-B du noyaux au cytoplasme. L’exportation du récepteur serait

régulée en partie par la phosphorylation de la serine 105 présente dans la boîte A du

domaine de liaison à l’ADN. Cette modification semble d’ailleurs dépendante de la voie de

signalisation TRK/RAS/MAP kinase. D’une localisation uniquement nucléaire, NGFI-B se

retrouve distribué, en réponse au NGF, en proportion équivalente entre le noyau et le

cytoplasme (Katagiri, Takeda et al. 2000). La forme phosphorylée du récepteur est

principalement observée dans le cytoplasme. Deux signaux de localisation nucléaire NLS

situés dans le domaine de liaison à l’ADN ainsi que trois signaux d’exportation nucléaire

NES putatifs, présents dans le domaine de liaison au ligand constituent des séquences

essentielles à la distribution et la translocation de NGFI-B. RXR subit également une

translocation du noyau vers le cytoplasme parallèlement à l’exportation de NGFI-B. Une

translocation sous forme d’hétérodimère RXR/NGFI-B est proposée. Une forme mutée de

RXR incapable de s’hétérodimériser demeure dans le noyau suite à une stimulation au NGF

alors que NGFI-B est transloqué dans le cytoplasme. La phosphorylation du récepteur

nucléaire NGFI-B empêche son retour vers le noyau et pourrait également produire la

capture de RXR nouvellement synthétisé. La compartimentation de RXR dans le

cytoplasme entraînerait alors une modulation de la signalisation induite par les acides

rétinoïques (Katagiri, Takeda et al. 2000).

2.3.3.5 Hétérodimérisation entre NGFI-B, NURR1 et NOR-1 L’activité sous forme de monomère des trois membres de la sous-famille NGFI-

B/NURR1/NOR-1 au niveau de l’élément de réponse NBRE a été démontré (Wilson,

Fahrner et al. 1991; Wilson, Paulsen et al. 1992). La capacité de NGFI-B de

s’homodimériser pour activer la transcription en se liant à un motif le NurRE a également

été découverte (Drouin, Maira et al. 1998). De plus, NGFI-B et NURR1 s’hétérodimérisent

avec RXR, contrairement à NOR-1 qui est incapable de s’associer à ce partenaire. Qu’en

est-il de la capacité d’homodimérisation de NURR1 et NOR-1 et d’hétérodimérisation entre

32

les trois membres de la sous-famille? NGFI-B, NURR1 et NOR-1 induisent l’activation de

la transcription d’un gène régulé par le promoteur de la POMC contenant un motif NurRE,

dans des cellules AtT-20. La réponse des trois récepteurs est dix fois plus sensible que celle

obtenue au niveau d’un élément de réponse NBRE dans un même contexte expérimental.

Des analyses par gel de retard de mobilité montrent la présence de formes monomériques et

homodimériques des récepteurs NURR1 et NOR-1 sur l’élément de réponse NurRE (Maira,

Martens et al. 1999). Par ailleurs la présence de dimères NOR-1 s’avère discutable. En

combinant deux vecteurs d’expession , NGFI-B + NURR1, NGFI-B + NOR-1 et NURR1 +

NOR-1 lors de transfections dans des cellules CV1, on observe un accroissement du

potentiel d’activation de la transcription d’un gène régulé par un élément de réponse NurRE

(POMC) supérieur à celui obtenu en utilisant un seul vecteur d’expression. Il est intéressant

de constater que les trois membres de la sous-famille NGFI-B/NURR1/NOR-1 puissent

agir en synergie au niveau du promoteur POMC. Il est aussi intéressant de noter qu’en plus

du NurRE, un motif NBRE se trouve également présent dans le promoteur du gène POMC.

Des expériences de précipitation par affinité « GST pull-down » montrent une interaction in

vitro entre NURR1 et NGFI-B. Des analyses par gels de retard de mobilité combinées à

l’utilisation d’anticorps suggèrent la formation d’hétérodimères NURR1 et NGFI-B. Des

essais de double-hybride dans des cellules de mammifères et des coimmunoprécipitations à

partir d’extraits nucléaires de cellule AtT-20 appuient l’hypothèse d’un complexe NGFI-B

et NURR1 (Maira, Martens et al. 1999).

2.4 Cofacteurs des récepteurs nucléaires NOR-1, NGFI-B et NURR1

2.4.1 Domaine AF-1 du récepteur nucléaire NOR-1 La fonction transactivatrice du domaine AF-1 du récepteur nucléaire orphelin NOR-1 a fait

l’objet d’étude, principalement dans le contexte des réactions inflammatoires et de la

carcinogénènes (Wansa, Harris et al. 2003). La migration et la prolifération des cellules

musculaires lisses vasculaires constituent un processus impliqué dans la pathophysiologie

des maladies cardiovasculaires, dont l’athérosclérose. Les lésions athéromateuses s’avèrent

le foyer de réactions inflammatoires et immunitaires stimulées par l’action de cytokines.

L’expression des récepteurs nucléaires NOR-1, NGFI-B et NURR1 a été mise en évidence

33

dans les cellules musculaires lisses ainsi que dans les cellules endothéliales participant à la

formation des lésions (Monajemi, Arkenbout et al. 2001; Arkenbout, de Waard et al. 2002).

Des analyses ont été réalisées sur des lignées C2C12 provenant de muscle squelettique afin

de comprendre le rôle des différentes régions régulatrices du récepteur nucléaire NOR-1

dans ce contexte cellulaire. L’utilisation de différentes protéines chimériques Gal 4

(DBD)/NOR-1 (pleine longueur, extrémité N-terminale, extrémité C-terminale) lors

d’expériences de transfection, a permis de démontrer le rôle essentiel de la portion N-

terminale dans l’activité transactivatrice de la protéine (Wansa, Harris et al. 2003). La

séquence fonctionnelle a plus spécifiquement été circonscrite aux acides aminés 1-112.

NOR-1 interagit in vitro avec les cofacteurs SRC1, 2 et 3. La portion N-terminale possède

une plus grande affinité que l’extrémité C-terminale pour ces coactivateurs et plus

spécifiquement pour SRC2. SRC2 accroît le potentiel de transactivation de NOR-1 de façon

AF-1 dépendante. Les cofacteurs spécifiques aux récepteurs nucléaires p300, Drip 205,

PCAF, et SRC2 interagissent directement avec NOR-1 in vitro. Le complexe de

coactivateurs se forme au niveau de la région N-terminale du récepteur. Par contre, la

présence du LBD renforce ces interactions.

Le 6-mercaptopurine (6-MP) ainsi que d’autres dérivés (6-MP thiopurine) possèdent des

propriétés anti-prolifératives, anti-cancéreuses et anti-inflammatoires. Ces composés

stimulent la capacité transactivatrice des récepteurs nucléaires NGFI-B/NURR1/NOR-1

dans des cellules d’origine musculaire(Wansa, Harris et al. 2003). Lorsque métabolisé, le 6-

MP devient un analogue d’acide nucléique pouvant être incorporé dans l’ADN et l’ARN et

produisant une cytotoxicité menant à la mort cellulaire. Il inhibe également la biosynthèse

de purine à de multiples étapes et entraîne une diminution de la production d’adénosine et

de guanosine. Récemment il a été démontré que le 6-MP modulait l’activité de TRAP220

(Wansa and Muscat 2005). Ce coactivateur interagit avec la région N-termiale (acides

aminés 1-800) de NOR-1 et augmente le potentiel de transactivation du récepteur de

manière AF-1 dépendante. Cette régulation serait exercée indépendamment de la

phosphorylation du domaine AF-1 de NOR-1 par la PKC et la PKA. Ainsi le 6-MP

stimulerait le recrutement du coactivateur TRAP220 au niveau du récepteur NOR-1.

34

2.4.2 Domaine AF-1 du récepteur nucléaire NGFI-B Les fonctions transactivatrices des différentes extrémités du récepteur nucléaire NGFI-B

ont été analysées dans le contexte des cellules C2C12 (Wansa, Harris et al. 2002). Des

protéines chimériques Gal4 (DBD)/ NGFI-B (pleine longueur, extrémité N-terminale et

extrémité C-terminale) ont été utilisées pour des expériences de transfection. Tout comme

NOR-1, la portion N-terminale de NGFI-B possède un potentiel d’activation de la

transcription. Le domaine AF-1 se situe entre les acides aminés 1-160. La mutagenèse

visant la substitution de sérines/thréonines contenues dans le domaine AF-1 et constituant

des sites putatifs de phosphorylation ne semble pas affecter le potentiel de transactivation

de cette portion de NGFI-B. Les trois protéines coactivatrices SRC 1, 2 et 3 lient

directement in vitro le récepteur NGFI-B et sont plus spécifiquement recrutées par la

portion N-terminale. SRC2 stimule l’activité du domaine AF-1 de NGFI-B tel qu’observé

pour NOR-1 mais ne semble pas s’associer et accroître les fonctions transactivatrices de la

portion C-terminale contenant la séquence AF-2. Par ailleurs, SRC2 stimule intensivement

l’activité transactivatrice du LBD de NGFI-B en présence du DBD/LBD de RXR lié à son

ligand. p300, PCAF et SRC interagissent indépendamment et directement avec la portion

N-terminale de NGFI-B. Par contre, l’association au facteur DRIP-205 est conditionnelle à

la présence de SRC2 et p300. Tout comme pour NOR-1, la portion C-terminale de NGFI-B

coopère avec l’extrémité N-terminale du récepteur.

Des transfections dans des cellules AtT20 (Maira, Martens et al. 2003) montrent que le

cofacteur SRC 1 stimule l’activité des récepteurs NGFI-B, NURR1 et NOR-1 beaucoup

plus efficacement au niveau d’un élément de réponse NurRE, propice à la formation d’un

homodimère, que sur un site NBRE, motif permettant la liaison d’un monomère. Les trois

protéines SRC1, 2 et 3 s’associent à un homodimère NGFI-B pour activer la transcription.

La combinaison du CBP (Creb binding protein) au SRC1 produit un effet accru sur le

potentiel transcriptionnel des récepteurs nucléaires NGFI-B, NURR1 et NOR-1. Leur

recrutement se fait principalement au niveau du domaine AF-1 de manière PKA-

dépendante. Seul SRC1 semble affecté par une délétion en C-terminale de NGFI-B.

L’utilisation des mutants SRC2 délétés du motif LXXLL ou du domaine Q, montre que le

cofacteur interagit principalement avec le AF-1 par le biais de séquences riches en

glutamines constituant le domaine Q (Maira, Martens et al. 2003).

35

D’autres cofacteurs spécifiques au récepteurs nucléaires modulent l’activité de NGFI-B.

ASC-2 (activating signal cointegrator-2) constitue un coactivateur indirect du récepteur

nucléaire, agissant par le biais d’adaptateur et répondant à la CaMK IV (Ca2+/calmoduline-

dépendent protein kinase). En contre partie, SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and

Thyroid hormone receptors) se lie directement à NGFI-B et inhibe son activité (McKenna,

Lanz et al. 1999; Lee, Lee et al. 2001; Sohn, Kwak et al. 2001). Ce corépresseur contient

deux motifs CoRNR qui possèdent une affinité pour le domaine AF-2 (Hu and Lazar 1999;

Perissi, Staszewski et al. 1999). SMRT est également soumis à la kinase CaMK IV qui

entraîne sa translocation dans le cytoplasme.

2.4.3 Domaine AF-2 du récepteur nucléaire NURR1 Une forme mutée du récepteur NURR1, délétée d’une portion C-terminale contenant le

domaine AF-2, possède un potentiel réduit d’activation de la transcription au niveau d’un

élément de réponse NBRE dans des cellules 293 issues de reins d’embryons humains.

(Castro, Arvidsson et al. 1999) Par contre, on constate que l’intégrité du domaine AF-2 de

NURR1 (substitution d’acide aminé réduisant la capacité transactivatrice) n’est pas

essentielle à l’activité d’un hétérodimère RXR (lié à son ligand)/NURR1 au niveau d’un

élément de réponse DR5. La présence du domaine AF-2 demeure tout de même nécessaire

à l’hétérodimérisation du récepteur nucléaire. Chez les récepteurs de la sous-famille NGFI-

B/NURR1/NOR-1 on retrouve une lysine au cœur du domaine AF-2 qui contraste avec la

présence d’un acide glutamique conservé parmi l’ensemble des récepteurs nucléaires. La

substitution de cette lysine pour une alanine ou un acide glutamique accroît le potentiel

d’activation de la transcription de NURR1 dans le contexte de lignées cellulaires

neuronales c17.2 (Castro, Arvidsson et al. 1999). Ce résultat montre l’influence inhibitrice

de la lysine au sein du domaine AF-2 du récepteur nucléaire.

Les travaux portant sur les récepteurs de la sous-famille Nur montrent dans un premier

temps l’importance du domaine AF-1 pour leur fonction transactivatrice (Wansa, Harris et

al. 2002; Wansa, Harris et al. 2003). Les résultats suggèrent que l’extrémité C-terminale de

NOR-1 et NGFI-B, qui contient le domaine AF-2, ait pour rôle de stabiliser l’interaction de

cofacteurs liant le domaine AF-1. Dans un deuxième temps, d’autres recherches suggèrent

qu’un potentiel d’activation de la transcription AF-2 dépendante réduit chez les récepteurs

36

Nurs puisse découler de la présence de la lysine conservée (Castro, Arvidsson et al. 1999).

Des études portant sur le domaine AF-2 de NURR1 montrent que la surface d’interaction

des coactivateurs s’avère significativement différente de celle observée parmi l’ensemble

des récepteurs nucléaires. De plus, les membres de la sous-famille Nur et plus

particulièrement NURR1 sembleraient incapables de recruter et d’interagir avec des

cofacteurs via cette surface d’interaction « classique » définie selon la forme canonique des

récepteurs nucléaires (Wang, Benoit et al. 2003). Tel que décrit précédemment, la structure

tertiaire de NURR1, NOR-1 et NGFI-B ne serait pas propice à la liaison à un ligand dû à

l’occupation de la cavité « ligand-binding pocket » par des résidus hydrophobes. Toutefois,

la conformation de l’hélice AF-2 de NURR1 serait stabilisée par des interactions

intramoléculaires en absence de liaison à un ligand. Ainsi, il semble que la structure

tertiaire du domaine de liaison au ligand de NURR1 soit similaire à celle des récepteurs

actifs, liés à leur ligand. Ces résultats appuient l’idée de récepteurs constitutivement actifs.

2.5 Isoformes Différentes isoformes des récepteurs nucléaires NOR-1 et NURR1 on été identifiées et

caractérisées (Ohkura, Ito et al. 1998; Ohkura, Hosono et al. 1999). On note principalement

l’existence de récepteurs tronqués à l’extrémité C-terminale. Ces isoformes produites par

épissage alternatif sont dépourvues de leur domaine de liaison au ligand contenant les

séquences de dimérisation et de transactivation ligand dépendante (AF-2). Leur fonction

spécifique dans la cellule demeure inconnue. D’autres récepteurs nucléaires dont CAR et

PPAR possèdent également une isoforme tronquée en C-terminale (Choi, Chung et al.

1997; Sabatino, Casamassimi et al. 2005). À ce jour, aucune isoforme de NGFI-B n’a été

décrite.

2.5.1 Isoformes NOR-1 et structure du gène Le gène NOR-1 chez l’humain est constitué de 8 exons dont les deux premiers ainsi que la

portion 3’ du huitième sont non-codants (Ohkura, Ito et al. 1996). Le transcrit

correspondant au récepteur tronqué en C-terminal (NOR-1ΔC) se compose des exons 1 à 5

plus une portion de l’intron 5 qui devient la nouvelle région 3’ non-codante. De plus, on

observe la présence de 25 nouveaux acides aminés à l’extrémité C-terminal du récepteur

37

tronqué qui correspondent à la séquence du début de l’intron 5 qui devient l’exon 5b

(Petropoulos, Part et al. 1995; Ohkura, Ito et al. 1998). Ce nouvel isoforme fut initialement

mis en évidence dans le contexte de la fusion des gènes EWS et NOR-1 impliquée dans

l’apparition de chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques (Labelle, Zucman et al.

1995). Le transcrit EWS/NOR-1 isolé codait pour la portion N-terminale de EWS liée à la

séquence du récepteur NOR-1 tronqué en C-terminal. Le transcrit codant pour la forme

courte du récepteur NOR-1 a également été isolé à partir d’une librairie de cerveau de rat

(Petropoulos, Part et al. 1995). La présence d’une séquence 5’ non-codante distincte et les

25 nouveaux acides aminés en 3’ ont toutefois confondu les auteurs qui suggéraient

l’existence d’un second gène NOR-2.

L’équipe de chercheurs (Ohkura, Ito et al. 1996; Ohkura, Ito et al. 1998) qui avaient à

l’origine cartographié le gène NOR-1 chez l’humain, ont par la suite définit l’origine des

séquences composant les différents transcrits NOR-1 (Ohkura, Ito et al. 1998). Tout comme

chez le rat on retrouve un messager humain dont la région 5’ non-codante ne correspond

pas à la séquence des exons 1 et 2. Il s’agit, en fait, de la fin de l’intron 2 (540 pb) contigüe

à l’exon 3 et renommée l’exon 3b. La substitution des exons 1 et 2 par l’exon 3b peut à la

fois être observée dans un transcrit pleine longueur et dans l’isoforme tronqué en 3’. Ces

messagers possédant une extrémité 5’ non-codante distincte ont initialement été isolés à

partir d’ARNpoly(A)+ provenant de différents tissus humains soit le muscle squelettique, le

cerveau fœtal et le placenta.

Des expériences de transfection dans des cellules L929 et G361 ont été effectuées afin de

vérifier les propriétés régulatrices de la séquence comprise entre le début de l’exon 1 et le

début de l’exon 3b. Ces analyses montrent un niveau faible d’activité de cette région

promotrice potentielle. Par ailleurs, la séquence en amont de l’exon 1, définie comme le

promoteur du gène NOR-1, montre une activité beaucoup plus grande lors d’expériences de

transfection suggérant son importance dans la régulation du gène. Elle contient plusieurs

sites putatifs de liaison pour les facteurs (Sp1, AP1, CRE et Myo D). De plus, on constate

l’absence de boîte TATA caractéristique des gènes « housekeeping ».

Il existe également une isoforme du récepteur NOR-1 tronqué en N-terminal (NOR-1ΔN) et

isolé à partir d’une banque d’ADNc de cœur fœtal humain (Labelle, Zucman et al. 1995).

38

Le transcript codant pour cette forme est délété des 42 nucléotides (-2 à +40) du début de

l’exon 3, menant à la perte du codon méthionine d’initiation de la traduction. Le recours au

codon méthionine suivant comme site d’initiation mène à la production d’un récepteur

délété de ses 30 premiers acides aminés.

2.5.2 Activité transcriptionnelle de NOR-1, NOR-1ΔC et NOR-1ΔN L’activité transcriptionnelle des différentes isoformes du récepteur NOR-1, tronquées en N-

terminal et en C-terminal, a été évaluée au niveau de l’élément de réponse NBRE (Labelle,

Bussieres et al. 1999). Tel que démontré par gel de retard de mobilité NOR-1 et NOR-1ΔN

possèdent la capacité de lié le NBRE alors que NOR-1ΔC montre peu d’affinité pour

l’élément de réponse. Des analyses par transfection dans des lignées de chondrocyte COS-1

et C-20/A4 montrent une diminution du potentiel d’activation de la transcription du

récepteur NOR-1 lorsque délété des 30 premiers acides aminés. L’activité du récepteur

NOR-1ΔC est évidemment réduite compte tenu de sa faible capacité à lier le NBRE. En

enlevant les 29 derniers acides aminés en 3’ de l’isoforme NOR-1ΔC, donc en éliminant les

25 acides aminés spécifiques de la forme courte, on constate que le récepteur NOR-1ΔC(-

29) acquiert l’habilité à lier le NBRE. Par ailleurs, bien qu’il interagisse à nouveau avec

l’élément de réponse, son potentiel d’activation de la transcription demeure quasi identique

à celui de NOR-1ΔC. Il est possible que le récepteur NOR-1ΔC, tronqué en C-terminal,

puisse exercer une forme de compétition avec NOR-1 pleine longueur en titrant des

cofacteurs spécifiques de la région N-terminale et ainsi jouer un rôle de répresseur (Labelle,

Bussieres et al. 1999).

2.5.3 Isoformes NURR1 Une seconde isoforme du récepteur NURR1, nommé NURR2, a été identifiée à partir d’une

librairie d’ADNc ce cellules MC3T3-El de souris (Ohkura, Hosono et al. 1999).Tout

comme pour le récepteur NOR-1 le transcrit isolé code pour une forme tronquée en C-

terminal, dépourvue du domaine de liaison au ligand. Une délétion interne de 121

nucléotides entraîne un changement de cadre de lecture et l’apparition d’un codon stop au

début d’un exon. L’interruption prématurée de la traduction produit la perte des 143

derniers acides aminés sur les 598 constituant le récepteur NURR1. Le messager NURR2

39

se distingue également de NURR1 au niveau de l’extrémité 5’. L’isoforme tronquée existe

également chez le rat et l’humain. NURR2 est exprimé dans les mêmes tissus que NURR1,

mais à un niveau plus faible. Des analyses par gels de retard de mobilité montrent que

NURR2, bien qu’il conserve son domaine de liaison à l’ADN, possède une plus faible

affinité que NURR1 pour l’élément de réponse NBRE. La forme courte du récepteur

NURR1 se distingue de l’isoforme tronquée NOR-1 par sa capacité à lier l’ADN. L’activité

transcriptionnelle de NURR2, évaluée lors d’analyses par transfections et comparée à celle

de NOR-1, NGFI-B et NURR1 n’a pu être détectée. Des cotransfections dans des cellules

MCF-7 montrent qu’une présence croissante de NURR2 dans la cellule réduit le potentiel

de transactivation des récepteurs NURR1, NGFI-B et NOR-1. Ces observations appuient

l’hypothèse d’une répression exercée par NURR2 sur les trois membres de la sous-famille.

L’effet inhibiteur résulterait d’une compétition pour le recrutement de cofacteurs liant la

portion N-terminale ou pour l’occupation du NBRE. Pour conclure, malgré les informations

obtenues dans ce contexte expérimental, la fonction réelle des isoformes tronquées en C-

terminal de NURR1 et NOR-1 demeure inconnue.

2.6 Rôles physiologiques

2.6.1 Régulation de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien Les cellules corticotrophes de l’hypophyse antérieur produisent la pro-opiomélanocortine

(POMC) et l’ACTH en réponse à un signal hypothalamique, la CRH (corticotropin

releasing hormone)(Philips, Lesage et al. 1997; Drouin, Maira et al. 1998). Le messager

NGFI-B est exprimé dans les neurones de l’hypothalamus qui libèrent la CRH

(Honkaniemi, Kononen et al. 1994). Il a également été démontré que l’expression de NGFI-

B, NURR1 et NOR-1 était induite, en réponse au CRH, dans les cellules AtT-20 dérivées

de l’hypophyse (Murphy and Conneely 1997; Philips, Lesage et al. 1997; Maira, Martens et

al. 2003). Le rôle essentiel de l’élément de réponse NurRE pour la transcription du gène

POMC dans les cellules AtT-20 a été mis en évidence. Au niveau de la glande surrénale, le

récepteur nucléaire NGFI-B régule également l’expression de gènes codant pour des

enzymes impliqués dans la synthèse de composés stéroïdiens (Wilson, Mouw et al. 1993).

40

En somme, le récepteur nucléaire NGFI-B exerce des fonctions régulatrices importantes

aux trois niveaux de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien.

Comme mentionné précédamment l’enzyme 21-hydroxylase participant au catabolisme

d’hormones stéroïdiennes et produite par la glande surrénale est induite par l’ACTH. On

retrouve un motif NBRE dans le promoteur du gène de la 21-hydroxylase qui est régulé par

NGFI-B(Wilson, Fahrner et al. 1993; Wilson, Mouw et al. 1993). Curieusement les

fonctions de la glande surrénale, dont l’expression de la 21-hydroxylase, ne semblent pas

affectées chez la souris déficiente pour NGFI-B (Crawford, Sadovsky et al. 1995). Ces

observations suggèrent une redondance fonctionnelle exercée en partie par le récepteur

nucléaire NOR-1. En effet, l’expression de NOR-1 est détectée dans l’hypothalamus,

l’hypophyse et la glande surrénale. Quant à NURR1, bien qu’il soit exprimé dans

l’hypothalamus et l’hypophyse, sa présence n’est pas décelée dans la glande surrénale.

L’ACTH et l’angiotensine II provenant de l’hypophyse stimulent la synthèse et la sécrétion

d’hormones stéroïdiennes dont les minéralocorticoïdes et les glucocorticoïdes. Dans une

culture primaire de cellules fasciculaires de la surrénale, ces composés induisent

l’expression de NOR-1 qui précède celle de gènes codant pour des enzymes tel que

p450C17, 3b-hydroxysteroïde dehydrogénase et p450C21 (21-hydroxylase). En somme,

NOR-1 exercerait une fonction d’intermédiaire dans le processus de signalisation menant à

la synthèse d’hormones stéroïdiennes. L’expression du récepteur nucléaire NOR-1 est

dépendante des sentiers de signalisation PKA et PKC dans les cellules fasciculaires de la

surrénale (Fernandez, Brunel et al. 2000).

Bien que son rôle physiologique n’ait pas encore été démontré, NOR-1 interagit sous forme

de monomère sur l’élément de réponse NBRE situé dans le promoteur du gène POMC,

mais semble incapable de lier avec affinité, sous forme d’homodimère, le motif NurRE. Par

contre, NOR-1 possède le potentiel d’activer la transcription d’un gène rapporteur sous le

contrôle du promoteur 21-hydroxylase qui contient un élément de réponse NBRE

(Fernandez, Brunel et al. 2000).

41

2.6.2 Apoptose

2.6.2.1 Thymocytes et sélection négative Au cours du développement, une sélection négative des thymocytes, précurseur des

lymphocytes T périphériques, se produit dans le thymus. Ce processus se traduit par

l’élimination, via un signal apoptotique, des lymphocytes T immatures qui réagissent au

soi. L’activation de l’apoptose est provoquée par une interaction du récepteur TCR (T-Cell

antigen Receptor), exprimé à la surface des thymocytes avec un complexe majeur

d’histocompatibilité (MHC) présentant un peptide du soi. Les MHC sont habituellement

situés à la surface de cellules présentatrices d’antigènes . Ce mécanisme s’avère essentiel

aux organismes afin d’éviter que survienne des réactions auto-immunes. D’autres

opérations de sauvegarde ont lieu dans les organes périphériques du système immunitaire.

Elles entraînent l’élimination des lymphocytes T matures réagissant à des peptides du soi.

Les hybridomes de cellules T constitue un modèle in vitro privilégié pour étudier les voies

de signalisation ainsi que les différents transcrits produits dans les lymphocytes T. Les

hybridomes peuvent mimer certains aspects de la sélection négative ayant lieu dans le

thymus. L’induction du récepteur TCR se fait via l’utilisation d’un anticorps dirigé contre

la molécule CD3, constituant le complexe TCR-CD3 (Woronicz, Lina et al. 1995). Il a été

démontré que l’activation de l’apoptose dans les thymocytes et les hybridomes de cellules

T requière un augmentation intracellulaire de Ca2+. Ainsi l’utilisation de substances tel que

le calcium ionophore (ionomycine), qui stimule la PKC, ou le phorbol ester (PMA) qui

accroît la concentration intracellulaire de Ca2+ permet également de mimer la signalisation

induite par l’activation du récepteur TCR.

2.6.2.2 NGFI-B, NOR-1 et Apoptose Tel que démontré par la technique d’hybridation soustractive, l’expression du gène NGFI-B

est rapidement induite par l’activation du récepteur TCR dans les thymocytes immatures

ainsi que dans les hybridomes de cellules T (Liu, Smith et al. 1994). Le rôle spécifique du

récepteur nucléaire dans le sentier apoptique a été confirmé par différentes expériences.

D’abord la surexpression d’une protéine NGFI-B dominante-négative entraîne une

inhibition de l’apoptose induite par l’activation du récepteur TCR, dans les hybridomes de

42

cellule T (Cheng, Chan et al. 1997). Ce même résultat a ensuite été observé dans les

thymocytes de souris transgéniques surexprimant le récepteur NGFI-B dominant-négatif

(domaine de liaison à l’ADN de NGFI-B) (Zhou, Cheng et al. 1996). A l’opposé,

l’expression constitutive du récepteur NGFI-B entraîne l’induction massive d’apoptose

dans les thymocytes en maturation. Une diminution du nombre de thymocyte et de cellules

T périphériques est observée chez les souris transgéniques surexprimant NGFI-B. Ces

recherches montrent, tant dans les hybridomes de cellules T que les thymocytes, la fonction

importante de NGFI-B dans la signalisation apoptotique induite par l’activation du

récepteur TCR.

Contrairement aux résultats attendus, la maturation des thymocytes tout comme l’état des

lymphocytes T périphériques ne semble pas affecté par l’inactivation du gène NGFI-B chez

la souris (Lee, Wesselschmidt et al. 1995). L’absence de phénotype suggère une

redondance fonctionnelle exercée par les deux autres membres de la sous-famille, NURR1

et NOR-1. Le rôle de NOR-1 dans l’apoptose des cellules T a plus spécifiquement été

confirmé (Cheng, Chan et al. 1997). Des expériences de transfections ont montré que le

dominant négatif NGFI-B exerçait un effet inhibiteur sur l’activité de NOR-1 et NURR1 au

niveau de l’élément de réponse NBRE. Ce résultat explique la différence de phénotype

observé entre la souris knock-out pour le gène NGFI-B et la souris transgénique exprimant

le récepteur NGFI-B dominant-négatif. Il a ensuite été démontré que NOR-1 et NGFI-B

étaient tous les deux induits dans les thymocytes en réponse à une stimulation aux

PMA/ionomycin. La présence de NURR1 n’était pas décelée (Cheng, Chan et al. 1997).

Tout comme pour le récepteur nucléaire NGFI-B, une expression constitutive de NOR-1

dans des thymocytes de souris trangéniques entraîne une augmentation massive d’apoptose.

Des analyses par FACS (fluorescence-activated cell sorter) permettaient de constater une

diminution importante de thymocytes matures et immatures tandis qu’une réaction TUNEL

(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling) montrait

un niveau élevé d’apoptose. Une souris transgénique surexprimant NURR1 a été produite et

les analyses effectuées ne permettaient pas de mettre en évidence un phénotype comparable

à celui obtenu pour NGFI-B et NOR-1 (Cheng, Chan et al. 1997).

43

2.6.2.3 Du récepteur TCR au promoteur de NGFI-B Les mécanismes de transmission du signal, de la surface des thymocytes au promoteur de

NGFI-B ont fait l’objet d’études. La concentration intracellulaire de Ca2+ joue un rôle

central dans la transduction du signal apoptotique. Elle influence en premier lieu l’activité

de la phosphatase calcineurine Ca2+/calmoduline-dépendante. La calcineurine, présente

dans le cytoplasme, déphosphoryle ensuite des protéines de la famille des facteurs de

transcription NFAT (nuclear factor of activated T cells) (Blaeser, Ho et al. 2000). Cette

étape est nécessaire à leur translocation dans le noyau. Le NFAT stimule la transcription de

gènes incluant plusieurs cytokines dont IL-2, Il-4 et IFN-γ. Il y a ensuite recrutement de

MEF 2 (Myocyte enhancer factor-2) par interaction directe avec NAFT et formation d’un

complexe sur l’ADN. MEF2 appartient à une famille de facteurs de transcription connue

sous le nom de RSRF (response-serum related-factor proteins). Les protéines MEF2,

identifiées MEF2A, B, C et D, sont codées par des gènes distincts et forment des

homodimères ou des hétérodimères. MEF2D s’avère prédominant dans les lymphocytes T.

Des sites MEF2 sont présents dans les promoteurs de gènes spécifiques aux muscles et

exprimés durant la myogénèse. On observe également des séquences de reconnaissance

MEF2 dans les promoteurs de gènes de réponse précoce dont NGFI-B (Woronicz, Lina et

al. 1995). La région minimum du promoteur de NGFI-B répondant au calcium contient

deux sites MEF2. A proximité de chacun on retrouve un site putatif de liaison NFAT. Une

liaison à l’ADN du facteur NFAT n’est par ailleurs pas indispensable à l’activité du

complexe. Le MEF2D et NFAT agissent en synergie pour recruter le coactivateur p300. Ce

complexe de protéines constituerait un ensemble de facteurs nécessaires à l’induction du

gène NGFI-B (Youn, Chatila et al. 2000; Youn and Liu 2000; Esau, Boes et al. 2001).

Outre les protéines activatrices de la transcription, il existe également un groupe de

protéines impliquées dans la répression du gène en absence de signal calcique. La protéine

Cabin 1 exercerait une répression sur la transcription du gène NGFI-B en se liant à MEF2

au niveau du promoteur. La Cabin 1 forme un complexe avec des corépresseurs et des

protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine. Un signal calcique active la

calmoduline qui, une fois transloquée dans le noyau, lie la Cabin 1 et libère ainsi le MEF2.

La transcription du gène NGFI-B peut alors avoir lieu. La création d’une souris mutante,

générée par recombinaison homologue et exprimant la cabin 1 tronquée, montre néanmoins

44

que cette protéine n’est pas essentielle à la régulation de l’apoptose dans les thymocytes

(Esau, Boes et al. 2001).

Un troisième mode de régulation du facteur de transcription MEF2 a été décrit. Il implique

l’activité de la kinase calmoduline dépendante IV/GR. Par l’intermédiaire de différents

mécanismes dont la phosphorylation de MEF2 ou la dissociation de HDAC4, la CAMK

IV/GR induit une activation du facteur de transcription (Blaeser, Ho et al. 2000). Une

quatrième voie de contrôle de MEF2 exercée par la MAP kinase ERK5 a également été

identifié (Kasler, Victoria et al. 2000). Contrairement aux analyses exhaustives réalisées

pour NGFI-B, aucune étude porte sur la régulation du promoteur de NOR-1 dans un

contexte apoptotique, toutefois il a été démontré que la cascade de signalisation CAMK-

K/CAMK-IV (CAMK kinase/ Ca2+-Calmodulin-dependent protein kinase-IV) entraînait

une augmentation de la transcription NOR-1 dans des cellules SH-SY5Y dérivées de

neuroblastomes. Trois sites CRE (cAMP response element) situés dans le promoteur

proximal de NOR-1 (-162 pb à -42 pb) seraient responsable de cette réponse (Inuzuka,

Tokumitsu et al. 2002). Ces résultats indiquent que la régulation de l’expression de NOR-1,

tout comme celle de NGFI-B est modulée par la concentration intracellulaire de Ca2+.

2.6.2.4 Régulation de la protéine NGFI-B Outre la régulation de l’expression du gène NGFI-B dans les thymocytes, la

phosphorylation du récepteur nucléaire exerce un contrôle sur la signalisation apoptotique.

Lorsqu’un thymocyte immature reconnaît, mais de façon modérée à faible un complexe

majeur d’histocompatibilité associé à un peptide du soi, la cellule privilégie un signal

permettant la survie plutôt que l’activation de la mort cellulaire. L’apoptose résulte

d’avantage d’une interaction forte avec le MHC (Sebzda, Mariathasan et al. 1999). Ce

mécanisme de survie est également requis pour la régulation des lymphocytes T matures.

L’expression de NGFI-B et NOR-1 est induite en réponse à la stimulation du récepteur

TCR. Par contre il a été montré que dans certaines conditions, l’expression de NGFI-B

n’était pas nécessairement corrélée avec l’induction de l’apoptose. Il est connu que la

phosphorylation de NGFI-B au niveau de la sérine 350 produit un effet inhibiteur sur sa

capacité à lier l’ADN ainsi que sur son potentiel de transactivation (Hirata, Kiuchi et al.

45

1993; Katagiri, Hirata et al. 1997). Ce mécanisme de régulation a été mis en évidence dans

différents types cellulaires dont les lymphocytes T (Pekarsky, Hallas et al. 2001).

2.6.2.5 Protéine kinase AKT Le sentier phosphatidyl inositol 3-kinase(PI-3K)-AKT est impliqué dans la transmission du

signal de survie des lymphocytes T (Masuyama, Oishi et al. 2001; Pekarsky, Hallas et al.

2001). Une interaction in vitro et in vivo entre AKT et NGFI-B a été mise en évidence. En

effet, il a été démontré que AKT phosphorylait NGFI-B au niveau de la sérine 350. Cette

modification post-traductionnelle du récepteur aurait lieu dans le cytoplasme où se trouve

AKT, selon des expériences de transfection (Pekarsky, Hallas et al. 2001). La localisation

Fig. 4 Inhibition de l’activité proapoptotique de NGFI-B dans les cellules-T par AKT. AKT répond à un signal de survie, transmis par le récepteur TCR, en phosphorylant NGFI-B au niveau de la sérine-350, située dans le domaine de liaison à l’ADN. La phosphorylation de NGFI-B inhiberait sa capacité à lier l’élément de réponse NBRE et à activer la transcription. AKT et NGFI-B phosphorylé sur la sérine-350 seraient principalement détectés dans le cytoplasme.

46

intracellulaire de NGFI-B serait régit par la phosphorylation de la serine 105, située dans la

portion N-terminale du récepteur. Ce changement, exercé sous le contrôle du sentier MAPK

(mitogen-activated protein kinase), induirait une translocation du récepteur vers le

cytoplasme permettant un contact avec AKT. On retrouve une séquence RLPSKP autour de

la sérine 350 de NGFI-B qui correspond au site de phosphorylation RXXS/TXP de AKT.

L’activité transactivatrice de NGFI-B au niveau d’un NBRE serait réduite en présence de

AKT, tel que démontré par des expériences de transfection dans des cellules 293 (Pekarsky,

Hallas et al. 2001) ainsi que dans des hybridomes de cellules T (Masuyama, Oishi et al.

2001). En phosphorylant la serine 350, AKT réduirait la capacité de NGFI-B à lier l’ADN,

suggérant une fonction possible de AKT dans le noyau.

La sérine 350 se situe dans le domaine de liaison à l’ADN du récepteur nucléaire NGFI-B.

Cette région montre respectivement 92 et 91% d’homologie avec les DBD des récepteur

NURR1 et NOR-1 chez la souris. La séquence correspondant au site de reconnaissance et

de phosphorylation de AKT est identique entre NGFI-B, NURR1 et NOR-1 tant chez

l’humain, le rat que la souris. Il est donc envisageable que AKT puisse également réguler

NOR-1.

2.6.2.6 Fas/Fas ligand Fas Ligand avait été définit comme un gène cible potentiel de NOR-1 et NGFI-B (Weih,

Ryseck et al. 1996). L’interaction Fas/FasL est effectivement impliqué dans l’induction de

l’apoptose des thymocytes et des lymphocytes T matures. FasL appartient à la superfamille

TNF (Tumor necrosis factor) et peut être exprimé sous forme de protéines membranaires ou

de cytokines solubles. Son récepteur Fas, constitue un membre de la superfamille

TNF/NGF. Il avait été suggéré que les voies de signalisation régulées par l’activation du

récepteur TCR et l’interaction de Fas/Fas Ligand puissent agir en synergie (Wong, Arron et

al. 1997). Des analyses par buvardage Northern, Western et par cytométrie en flux,

effectuées par Weih, F. et al., ont montré que la surexpression de NGFI-B, sous le contrôle

du promoteur proximal de la Lck (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase), dans les

thymocytes chez la souris, entraînait une augmentation de l’expression de Fas Ligand. La

présence élevée du récepteur nucléaire provoquerait un accroissement de l’apoptose des

thymocytes et conséquemment une atrophie du thymus. Les souris transgéniques NGFI-B

47

ont été croisées avec des souris gld (generalized lymphoproliferative disease) qui possèdent

une mutation ponctuelle dans la région du gène FasL codant pour le domaine extracellulaire

de la protéine. Cette mutation abolit la capacité de Fas ligand à lier son récepteur Fas, ainsi

on observe chez la souris gld/gld une population anormale de cellules-T dans les organes

périphériques de l’immunité, une hypertrophie de la rate et des ganglions lymphatiques

ainsi que le développement de maladies autoimmunes (Cohen and Eisenberg 1991; Giese

and Davidson 1994). La présence de mutation sur les deux allèles du gène FasL chez les

souris transgéniques NGFI-B produit une atténuation importante du phénotype provoqué

par la surexpression du récepteur nucléaire qui se manifeste par une diminution de

l’apoptose des thymocytes (Weih, Ryseck et al. 1996). Ces résultats suggéraient un lien

entre les sentiers de signalisation proapoptotique de NGFI-B et FasL. Toutefois, l’analyse

du promoteur proximal de FasL ne révèlait pas la présence d’un élément de réponse du

récepteur nucléaire (Takahashi, Tanaka et al. 1994). Des croisements permettant d’obtenir

des souris surexprimant NGFI-B dans les thymocytes et portant des mutations gld/gld ont à

nouveau été réalisés par un autre groupe de chercheurs (Cheng, Chan et al. 1997). Une

expression constitutive de NGFI-B entraînait une diminution importante du phénotype de la

maladie lymphoproliférative, confirmant les travaux de Weih, Ryseck et al. (1996).

Toutefois, tel que mis en évidence par FACS (fluorescence-activated cell sorter), il n’y

avait pas d’augmentation de FasL tant chez des souris transgéniques NGFI-B que NOR-1

(sous le contrôle du promoteur Lck) comparativement à des souris sauvages. Ces résultats

menaient ainsi à la conclusion que FasL ne constituait pas un effecteur majeur de NGFI-B

et NOR-1 (Cheng, Chan et al. 1997)

2.6.2.7 Translocation de NGFI-B aux mitochondries Les thymocytes et les hybridomes de cellule T ne constituent pas les seuls types cellulaires

dans lesquels NGFI-B joue un rôle proapoptotique. Dans les cellules de cancer gastrique

(BGC-823) NGFI-B exerce une double fonction en réponse à certaines drogues. Un

traitement au TPA (tétradécanoyle phorbol-1,3-acétate) entraîne une induction de

l’apoptose, via l’activité de la PKC (protein kinase C), tandis qu’une incubation avec

ATRA (all-trans retinoic acid) produit une interruption du cycle cellulaire (Wu, Liu et al.

2002). L’intérêt de cette recherche réside dans le mode d’action du récepteur nucléaire

48

NGFI-B. La translocation de NGFI-B du noyau au cytoplasme et plus spécifiquement aux

mitochondries produirait un impact important sur les processus cellulaires. Cette

redistribution du récepteur serait régulée par la phosphorylation. La translocation de NGFI-

B aux mitochondries en réponse à un traitement au TPA induit la libération du cytochrome

C dans le cytoplasme et subséquemment l’initiation de l’apoptose. Le cytochrome C est

localisé dans l’espace intermembranaire ou à la surface de la membrane interne des

mitochondries. Sa dispersion dans le cytoplasme joue un rôle important dans le processus

apoptotique. La protéine kinase C constituerait un intermédiaire essentiel à la réponse de

NGFI-B induite par le TPA. Un traitement préalable des cellules avec un inhibiteur de la

PKC ou la Wortmannin inhibe à la fois la transcription d’ARNm NGFI-B et la

translocation du récepteur nucléaire dans le cytoplasme. Des analyses par FACS montre

qu’un traitement des cellules de cancer gastrique BGC-823 avec ATRA résulte en un arrêt

du cycle cellulaire en G0/G1, via l’activité de NGFI-B. La transfection des cellules avec un

ADNc anti-sens de NGFI-B entraîne une résistance des cellules à ATRA (Wu, Liu et al.

2002). ATRA n’induit pas l’apoptose, en accord avec l’observation qu’il ne provoque pas

une translocation de NGFI-B, ni une libération du cytochrome C.

2.6.2.8 Interaction de NGFI-B avec Bcl-2 La famille de protéines Bcl-2 se caractérise par la présence de motifs conservés BH (Bcl-2

homology). Chaque membre possède au moins un des quatre domaines BH, dont la

combinaison procure des propriétés anti ou proapoptotiques. Bcl-2 et Bcl-X possèdent les

quatres domaines BH et exercent un effet inhibiteur sur l’apoptose. Bax et Bak sont formés

des séquences BH1, BH2 et BH3 et montrent des propriété pro-apoptotiques, tout comme

Bad et Bid qui contiennent uniquement le domaine BH3 (Adams and Cory 1998; Gross,

McDonnell et al. 1999).

NGFI-B interagirait avec Bcl-2 via son domaine de liaison au ligand (Lin, Kolluri et al.

2004). Une hélice alpha putative, située entre les acides aminés 471 à 488 seraient plus

spécifiquement impliquée dans cette liaison. La leucine en position 487 serait, de plus,

requise pour cette affinité. Quant à Bcl-2, une boucle située entre les domaines BH3 et BH4

participerait à l’interaction des deux protéines. Le changement de conformation

subséquemment induit provoquerait l’exposition du domaine BH3, habituellement caché

49

chez les membres de la famille Bcl-2 possédant une activité antiapoptotique. À l’opposé,

cette séquence est normalement accessible parmis les protéines de la famille Bcl-2 aux

propriétés proapoptotiques (Gross, McDonnell et al. 1999). Ainsi du caractère protecteur,

Bcl-2 se muerait en tueur par son interaction avec NGFI-B. Cette transformation ne

nécessiterait pas le clivage de Bcl-2 par les caspases. En effet, l’activité protéolytique des

caspases produit une élimination du domaine BH4 permettant une exposition du motif BH3

(Cheng, Kirsch et al. 1997). L’interaction de NGFI-B et Bcl-2 serait associée à la

translocation du récepteur nucléaire aux mitochondries et serait préalable à la libération du

cytochrome C dans le cytoplasme. Il a été démontré que le changement de

compartimentation de NGFI-B aux mitochondries et l’interaction avec Bcl-2 avait lieu sous

forme d’hétérodimère NGFI-B/RXR. De plus, la présence du ligand de RXR (9-cis-RA)

favorisait une survie de la cellule et inhiberait le ciblage des mitochondries par NGFI-

B/RXR (Cao, Liu et al. 2004). En somme, ces informations précisent de façon importante

le rôle de NGFI-B dans l’apoptose.

Deux types de signalisation apoptotique induitent par l’activation du récepteur CD95 ont

été décrits pour différent type cellulaire. La première se caractérise par une accumulation

importante du complexe DISC (death-inducing signaling complex) au niveau de la portion

intracellulaire du récepteur CD95. Le recrutement des différentes composantes du DISC est

préalable à l’activation de la caspase-8 et mène finalement au clivage de la caspase-3 et à la

mort cellulaire. La cascade de protéolyse des caspases dans les cellules qui montrent une

accumulation importante du complexe DISC serait indépendante des fonctions

mitochondriales et ne pourrait être interrompu par une surexpression de Bcl-2 (Scaffidi,

Fulda et al. 1998). La deuxième catégorie de cellules montre une accumulation réduite du

DISC. La composition protéique du complexe pourrait également différer. La mitochondrie

constitue dans ce contexte un amplificateur du signal apoptotique menant à l’activation de

la caspase-8 et de la caspase-3. Dans ces cellules, Bcl-2 et Bcl-x peuvent exercer un effet

inhibiteur sur cette cascade de caspases et ainsi réduire l’apoptose. Les thymocytes et

cellules T périphériques appartiennent à la première catégorie de cellules, qui montrent une

formation importante du DISC. L’apoptose induite par le récepteur CD95 se déroulerait,

dans ces cellules, indépendamment des fonctions mitochondriales.

50

Fig. 5 Modèles de mécanismes apoptotiques. A) Translocation de l’hétérodimère NGFI-B/RXR aux mitochondries et incuction de l’apoptose. Une interaction de NGFI-B avec Bcl-2 produit un changement de conformation qui modifie le potentiel anti-apoptotique de Bcl-2 en propriété pro-apoptotique. La liaion du ligand de RXR (9-cis-RA) favorise la localisation nucléaire et l’activité transcriptionnelle de NGFI-B/RXR. B) Modèle de deux sentiers de signalisation apoptotique du récepteur CD95. Dans un premier cas, une formation importante du DISC favorise une forte activation de la caspase-8 et permet d’outrepasser la contribution de la mitochodrie à la cascade d’activation des caspases. Dans un deuxième cas, une formation faible du DISC produit une activation de la caspase-8 en proportion moins élevé et le recourt à la mitochondrie pour l’amplification du signal.

51

De plus, la surexpression de Bcl-2 et Bcl-x ne produirait pas un effet inhibiteur sur

l’activation de la mort cellulaire.

NGFI-B et NOR-1 seraient impliqués dans le processus apoptotique des thymocytes, induit

par l’activation du récepteur TCR, comme décrit précédemment. Cependant, dans différents

types de cellules tumorales, NGFI-B agirait par le ciblage des mitochondries (Lin, Kolluri

et al. 2004) et probablement via une interaction avec Bcl2. Ces indications contradictoires

suggèrent différentes alternatives. D’abord il est possible que dans les cellules T, les

mécanismes d’activation de l’apoptose induits par les récepteurs TCR ou CD95 soient

distincts. Il se pourrait également que NGFI-B et NOR-1 participent au processus

apoptotique par différentes voies de signalisation, dont le ciblage des mitochondries et la

fonction de facteur de transcription. Notons que la translocation de NGFI-B à la

mitochondrie a principalement été étudiée dans des cellules tumorales. La redondance

fonctionnelle de NGFI-B et NOR-1 dans le mécanisme apoptotique des thymocytes sous-

tend, compte tenu des connaissances actuelles, que leur activité soit exercée

indépendamment de RXR et par conséquent, possiblement selon un mode monomérique.

2.6.2.9 Mort cellulaire et système nerveux central Il existe des formes distinctes de mort cellulaire que ne montrent pas les caractéristiques

propres de l’apoptose, dont les traditionnnelles cascades de caspases et la fragmentation du

noyau. La mort cellulaire observée dans le système nerveux, dans le contextes de maladies

meurodégénératives ou en répercussion à une ischémie, montre un mécanisme non-

apoptotique (Dal Canto and Gurney 1994; Majno and Joris 1995; Sperandio, de Belle et al.

2000; Turmaine, Raza et al. 2000). La participation de NGFI-B, via sa phosphorylation, à

un mécanisme de mort cellulaire programmé alternatif a récemment été mis en évidence

(Castro-Obregon, Rao et al. 2004). Le modèle établit suggère la participation de la voie

MAPK, plus spécifiquement la cascade RAF/MEK2/ERK2. ERK2 phosphorylerait NGFI-

B au niveau de la thréonine 142. Le récepteur de la neurokinine-1 (NK1R) activé par son

ligand, la substance P, serait situé en amont de cette cascade de signalisation . La protéine

Arrestin 2, recrutée pa le récepteur au niveau de sa portion cytoplasmique constitue le

premier effecteur du récepteur. La participation des récepteurs nucléaires de la sous-famille

52

Nur à des mécanismes de mort cellulaire dans les tissus nerveux pourrait représenter une

avenue importante pour l’étude de maladies neurodégénératives ou de traumatismes.

2.6.3 Chondrosarcome myxoïde extrasquelettique

2.6.3.1 Caractéristiques cliniques Les chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques (CME) sont des tumeurs relativement

rares situées dans les tissus profonds mous ou sous-cutanés des membres. Ils se retrouvent

plus particulièrement dans la musculature. Les CME montrent une croissance lente, mais

une forte malignité en terme de récurence locale et de propension à former des métastases,

principalement dans les poumons. Les CME sont habituellement diagnostiqués chez les

adultes. Le maximum d’incidence se situe dans la cinquantaine et la soixantaine. Ils

touchent d’avantage les hommes que les femmes avec un ratio de 2 :1. La taille des tumeurs

peut varier de 1 à 25 cm et peut parfois atteindre des dimensions supérieures. Bien qu’ils

surviennent le plus fréquemment dans les membres dont la cuisse, le genou, le mollet, la

cheville, l’avant-bras, des CME se retrouvent également au niveau du tronc, de l’épaule, du

cou et de la région intraglutéale. La réapparition de tumeurs peut se produire plusieurs

années après le premier diagnostique (Antonescu, Argani et al. 1998; Weiss, Goldblum et

al. 2001; Kawaguchi, Wada et al. 2003).

La tumeur primaire présente un aspect ovoïde. Formées d’un lobule ou d’une masse

multinodulée, elle est généralement bien délimitée par une capsule fibreuse. La section d’un

CME révèle une apparence mucoïde, une coloration comportant différentes teintes de gris

et de beige ainsi qu’une texture gélatineuse. Des hémorragies caractéristiques des CME

couvrent une partie des lésions. Les cellules constituant la tumeur possèdent une forme

ronde ou légèrement allongée. De taille et de structure uniforme, elles sont disposées selon

un alignement typique en brin et en cordon séparés de matériel mucoïde. La matrice

extracellulaire riche en glucosaminoglycans possède l’apparence du cartilage hyalin. Les

cellules des CME montrent des caractéristiques histologiques similaires à ceux des

chondroblastes tel un noyau hyperchromatique de petite taille entouré d’une gaine étroite de

cytoplasme fortement éosinophile. Il est parfois possible d’observer un cytoplasme vacuolé

et dans de rare occasions des cellules de cartilage différenciées. Le patron de croissance des

53

cellules varie parmi les CME. Les tumeurs sont typiquement hypocellulaires, montrant un

faible pléomorphisme nucléaire. Des indices de la présence de mitoses sont peu

nombreuses et les zones de nécrose absentes. Il existe cependant certaines variantes des

CME qui possèdent une forte cellularité, un patron de croissance diffus presque en absence

de matrice myxoïde. Cette catégorie de CME est associée à un pléomorphisme nucléaire

accru, une augmentation des signes de l’activité mitotique et la présence de nécrose. Il est

également possible d’observer dans les CME des foyers de cellules dont l’apparence

différente témoigne d’un autre stade de différenciation. En somme, les cellules

mésenchymales constitueraient l’origine des CME et les propriétés chondroblastiques des

tumeurs représenterait un des aspects histologiques de leur différentiation

multidirectionnelle (Aigner, Oliveira et al. 2004).

Au niveau de la structure cellulaire des CME on constate la présence d’un complexe

Golgien développé, d’un réticulum endoplasmique rugeux dilaté ainsi qu’un nombre élevé

de mitochondries. Des aggrégats de microtubules, des dépôts de glycogène ainsi que des

granules neurosécrétoires de forte densité sont également communs aux CME. De plus, des

projections cytoplasmiques ainsi que des jonctions cellulaires incomplètes peuvent

également être visibles (Antonescu, Argani et al. 1998; Okamoto, Hisaoka et al. 2001;

Weiss, Goldblum et al. 2001; Aigner 2002; Kawaguchi, Wada et al. 2003).

2.6.3.2 Immunohistochimie Des analyses immunohistochimiques ont permis de détecter la présence de différentes

protéines dans les CME. La chromogranine A, la synaptophysine, la S-100 et l’énolase

spécifique au neurones sont plus communément identifiées dans les CME, bien que leur

niveau soit variable d’une tumeur à l’autre. S-100 est une protéine liant le calcium

exprimée dans les chondrocytes différentiés. La glycoprotéine chromogranine A,

entreposée dans des granules, se retrouve dans la medullo surrénale, les neurones et les

cellules neuroendocrines. La synaptophysine est une glycoprotéine membranaire associée

aux vésicules synaptiques. On note également son expression dans les neurites et les cônes

de croissance (Antonescu, Argani et al. 1998; Okamoto, Hisaoka et al. 2001; Sjogren,

Meis-Kindblom et al. 2003).

54

2.6.3.3 Analyse cytogénétique et moléculaire L’analyse génétique des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques a permis de mettre

en évidence la présence de translocation chromosomiques récurrentes, à l’origines de la

pathologie. Le réarrangement t(9 ;22)(q22 ;q12), observé dans environ 75% des cas produit

la fusion de l’extrémité 5’ du gène EWS avec le gène NOR-1 complet (Labelle, Zucman et

al. 1995; Clark, Benjamin et al. 1996). Cette translocation a d’ailleur inspiré le choix du

nom TEC, pour « translocated in extraskeletal chondrosrcoma », donné au récepteur

nucléaire NOR-1. Un nouveau transcrit ainsi qu’une protéine chimérique EWS/NOR-1 se

trouvent alors présent dans la cellule tumorale. EWS code pour une protéine putative de

liaison à l’ARN. Un second type de translocation chromosomique t(9 ;17)(q22 ;q11)

identifié dans approximativement 15% des CME implique un second gène de la famille

EWS, TAF2N, et le gène NOR-1 (Attwooll, Tariq et al. 1999; Panagopoulos, Mencinger et

al. 1999; Sjogren, Meis-Kindblom et al. 1999). La fusion a lieu selon le même patron, la

portion 5’ du gène TAF2N se retrouve liée au gène NOR-1 intégral. Une troisième fusion

récurrente mais moins fréquente a été découverte t(9 ;15)(q22 ;q21) (Sjogren, Wedell et al.

2000). Dans cette translocation, le partenaire de fusion de Nor-1 code pour le facteur de

transcription hélice-boucle-hélice TCF12. La protéine hybride présente dans les tumeurs

montre la même composition, l’extrémité amino-terminale de TCF12 est liée au récepteur

nucléaire. Finalement, un quatrième transcrit de fusion a été identifié. Il est constitué de la

séquence de TFG en 5’suivit de la séquence NOR-1 en 3’ (Hisaoka, Ishida et al. 2004). Le

gène TFG est situé sur le chromosome 3 (3q11-q12), toutefois, la translocation à l’origine

du transcrit TFG/NOR-1 implicant les chromosomes 3 et 9 n’a pas encore été mise en

évidence par des analyses cytogénétiques. En somme, le gène NOR-1 demeure une

composante constante de ces réarrangements menant au développement de CME.

2.6.3.4 EWS Le gène EWS, pour Ewing’s sarcoma, est impliqué dans le développement de différentes

tumeurs suite à des réarrangements chromosomiques entraînant la liaison de deux gènes.

L’apparition d’une nouvelle protéine de fusion dans la cellule serait à l’origine de leur

transformation néoplastique.

55

Le gène codant pour la protéine EWS contient un cadre de lecture ouvert de 1968 pb et

code pour une protéine de 656 aa. Situé sur le bras long du chromosome 22 (22q12), il est

composé de 17 exons et 16 introns. Deux transcrits, EWS et EWS-b son générés par

épissage alternatif. Le messager EWS-b, qui code pour une protéine de 583 aa, se distingue

du transcrit EWS par l’absence des exons 8 et 9. Il existe également une isoforme

spécifique au cerveau, mis en évidence chez la souris et l’humain qui comporte un exon 4’

supplémentaire de 18pb (Delattre, Zucman et al. 1992; Ohno, Ouchida et al. 1994; Kim and

Pelletier 1999)

Bien que sa fonction spécifique ne soit pas clairement définie, EWS est décrit comme une

protéine de liaison à l’ARN dû à l’existence d’un motif de reconnaissance de l’ARN

(RRM) typique de 85 aa codé par les exons 11 à 13. De plus, trois régions riches en

glycine, arginine et proline (RGG) similaires aux motifs retrouvés dans les protéines liant

l’ARN tel que SSB1, nucléoline, fibrillarine, hnRNPs et Nop1 sont codées par les exons 8,

9 et 14 à 16. Les deux isoformes de EWS possèdent également la capacité de lier l’ARN in

vitro. Elles interagissent avec les séquences poly(G) et poly(U). De plus, le motif RGG

situé à l’extrémité de la région C-terminale peut fonctionner comme un domaine de liaison

à l’ARN (Ohno, Ouchida et al. 1994). EWS contient un domaine IQ typique de 20 acides

aminés qui peut être phosphorylé par la protéine kinase C et qui interagit avec la

calmodulin (CaM). La phosphorylation de cette séquence inhibe la capacité de EWS à se

lier aux homopolymères d’ARN (Deloulme, Prichard et al. 1997). L’extrémité N-terminale

de EWS contient le domaine NTD (N-terminal domain) codé par les 7 premiers exons et

constitué de 285 aa. Cette région est composée à 90% de résidus tyrosine, glutamine,

glycine, alanine, sérine, thréonine et proline. Ainsi on retrouve des séquences répétées

dégénérées SYGQQSX ainsi qu’un motif riche en proline. La séquence délimitée par les

acides aminés 157 à 262 montre 40% d’homologie avec la séquence CTD de la grande

sous-unité de l’ARN polymérase II des eucaryotes (Delattre, Zucman et al. 1992). Le CTD

constitue le lieu d’association du complexe enzymatique d’initiation de la transcription.

Son état de phosphorylation régule la transition des étapes d’initiation et d’élongation de la

transcription (Corden 1990).

56

Bien que le rôle précis de EWS ne soit pas clairement défini, des fonctions putatives

seraient attribuées à cette protéine. Dans un premier temps, EWS pourrait constituer un

coactivateur de la transcription puisqu’il possède la capacité de s’associer avec des facteurs

transcriptionnels important dont le complexe basal TFIID, le coactivateur CBP et

l’ARNpolII (Bertolotti, Melot et al. 1998; Petermann, Mossier et al. 1998; Rossow and

Janknecht 2001; Araya, Hirota et al. 2003). Dans un deuxième temps, il a été proposé que

EWS puisse recruter des enzymes de modification de la machinerie transcriptionnelle

nécessaires aux étapes d’initiation ou d’élongation de la transcription tel que la protéine

tyrosine kinase c-Abl (Kim, Lee et al. 1999). Finalement, compte tenu de son potentiel de

liaison à l’ARN, EWS pourrait exercer une fonction d’adaptateur et participer aux étapes

couplées de synthèse et de mâturation des ARN messagers. EWS interagit d’ailleurs avec

certains facteurs d’épissage dont SF1 et U1C (Zhang, Paley et al. 1998; Knoop and Baker

2000).

2.6.3.5 Sous-famille EWS/TAF2N/TLS Deux protéines apparentées à EWS, TLS/FUS et TAF2N/TAF68/RBP56, ont été identifiées

chez l’humain (Morohoshi, Arai et al. 1996). Elles possèdent toutes trois un domaine

consensus de liaison à l’ARN (RNP-CS) qui leur permettent également de lier l’ADN

simple brin. Les domaines RNP-CS de EWS, TAF2N et TLS montrent des caractéristiques

structurales communes qui les distinguent des autres protéines liant l’ARN. Elles ont été

regroupées en une sous-famille de protéines appelée TET pour TLS, EWS, TAF2N. Un

quatrième membre identifié chez la drosophile, SARFH (sarcoma-associated RNA-binding

fly homologue), a par la suite été ajouté au groupe (Immanuel, Zinszner et al. 1995). Les

protéines EWS, TAF2N et TLS sont présentes dans une grande variété de tissus chez la

souris adulte. A l’exception du muscle squelettique et du cœur pour EWS, les trois

protéines sont exprimées dans le muscle, les testicules, le thymus, le rein, le foie, la rate, le

cervelet, le cerveau, les poumons et le cœur (Sjogren, Meis-Kindblom et al. 1999; Melot,

Dauphinot et al. 2001).

Bien que la localisation des points de cassure de chacun des gènes TET puisse varier lors

des réarrangements chromosomiques, la présence de la région NTD demeure constante

dans les protéines de fusion formées (Sjogren, Meis-Kindblom et al. 1999). Dans le cas des

57

protéines EWS et TAF2N, cette région s’avère d’ailleurs utilisée pour leur interaction in

vitro avec le facteur TFIID de l’ARN pol II. La portion N-terminale de EWS (333 premiers

aa) montre une affinité différente de celle de EWS pleine longueur pour les sous-unités

hRPB de l’ARN pol II. La protéine EWS interagit avec hRPB3 alors que EWS tronqué tend

à lier hRPB5 et hRPB7. Ces résultats suggèrent que la portion N-terminale de EWS

intégrée à une protéine de fusion peut acquérir des propriétés distinctes de celles de la

protéine EWS pleine longueur (Bertolotti, Melot et al. 1998).

Il existe une forte homologie entre les protéines EWS et TAF2N. Leur séquences en acides

aminés montre 70% de similitude. EWS et TAF2N interagissent avec les mêmes protéines

TAFIIs constituant la structure basale de TFIID. Par ailleurs, on constate une absence

d’affinité entre EWS et TAF2N ainsi qu’une association avec des sous-unités de l’ARN

polymérase II distinctes, suggérant une exclusion mutuelle à l’intérieur du complexe

enzymatique (Bertolotti, Melot et al. 1998).

2.6.3.6 Fusions et Sous-famille TET La fusion des membres de la sous-famille TET, soit EWS, TAF2N et TLS, avec différents

partenaires, plus spécifiquement des facteurs de transcription, a été observé dans une

variété de tumeurs. Tel que mentionné précédemment un schéma typique caractérise ces

réarrangement chromosomiques. Les protéines de fusion générées possèdent l’extrémité N-

terminale d’une protéine TET liée à un facteur de transcription qui contient un domaine de

liaison à l’ADN (Sjogren, Meis-Kindblom et al. 1999). Dans les sarcomes d’Ewing qui ont

inspiré le nom de la protéine EWS, on retrouve comme partenaire de fusion les protéines

E1AF, ETV1, FLI1, FEV et ERG (Sorensen, Lessnick et al. 1994; Jeon, Davis et al. 1995;

Lessnick, Braun et al. 1995; Peter, Couturier et al. 1997; Urano, Umezawa et al. 1998;

Mastrangelo, Modena et al. 2000; Yamaguchi, Yamazaki et al. 2005). EWS est également

impliqué dans l’apparition de liposarcomes myxoïde lorsque lié à CHOP, de tumeurs à

petites cellules rondes desmoplastiques avec WT1, de sarcomes à cellules claires avec

ATF1, de sarcome à petite cellule ronde avec ZSG, de tumeur osseuse avec POU5FI et

finalement de chondrosarcomes myxoïde extrasquelettiques avec NOR-1 (Zucman, Delattre

et al. 1993; Gerald, Rosai et al. 1995; Labelle, Zucman et al. 1995; Panagopoulos, Hoglund

et al. 1996). TLS se retrouve également lié à deux partenaire de EWS, soit ERG et CHOP,

58

respectivement dans des leucémies myéloïde et dans des liposarcomes myxoïdes (Rabbits

TH 1993, Ichikawa H 1994). Finalement TAF2N a été identifié dans des chondrosarcomes

myxoïdes extrasquelettiques, fusionné avec NOR-1 (Sjogren, Meis-Kindblom et al. 1999).

2.6.3.7 TCF12 Le gène TCF12 code pour un facteur de transcription hélice-boucle-hélice (bHLH). Il

appartient à la classe A de la famille de protéines E- qui regroupe également E2A, TCF4 et

Da (Hu, Olson et al. 1992; Zhang and Bina 1992; Sjogren, Wedell et al. 2000). TCF12 est

constitué d’un domaine NTD suivi d’un domaine leucine zipper potentiel. L’extrémité C-

terminale est composée du domaine spécifique de la classe A (CAS) précédé du domaine

bHLH. Les protéines de la classe A sont exprimées de façon ubiquitaire et jouent un rôle

clé dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Elles peuvent agir comme

régulateurs négatifs de la prolifération en stimulant l’apoptose ou l’expression de gènes

codant pour des inhibiteurs de kinases cycline-dépendantes. TCF12 peut s’hétérodimériser

avec les protéines bHLH de classe A et B dont E2A, TAL1, myogénine et MyoD. Il est

impliqué dans la myogénèse et l’hématopoïèse.

2.6.3.8 TFG Le messager TFG de 2.4 kb est exprimé dans une variété de tissus humains fœtaux et

adultes. Sa séquence code pour une protéine contenant un domaine putatif « coiled-

coil ».(Mencinger, Panagopoulos et al. 1997). Le gène TFG « TRK-fused gene”, constitué

de 7 exons, a initialement été mis en évidence suite à une translocation chromosomique

produisant une oncoprotéine chimérique TRK-T3 (Greco, Mariani et al. 1995). Cette

protéine de fusion cytoplasmique contient la portion N-terminale de TFG liée au domaine

tyrosine kinase du récepteur NTRK1. Elle serait à l’origine de carcinomes papillaires de la

glande thyroïde. La portion TFG, et principalement le domaine « coiled-coil » contribuerait

à l’activation constitutive, ligand-indépendante, tyrosine kinase de la portion NTRKI de

l’oncogène (Greco, Fusetti et al. 1998; Roccato, Miranda et al. 2005). TFG a également été

identifié dans le contexte d’une seconde protéine chimérique. ALK constitue dans les

lymphomes à large cellules anaplastiques le partenaire de fusion de TFG. L’oncoprotéine

59

générée TFG/ALK possède également une activité tyrosine kinase (Hernandez, Bea et al.

2002). Outre le domaine « coiled-coil », TFG constient plusieurs séquences consensus dont

un domaine PB1, des sites putatifs de phosphorylation pour PKC et CK2, des sites de

glycosylation ainsi que des sites de liaison pour SH2 et SH3. La protéine TFG, ainsi que

plusieurs de ses domaines, s’avère conservée chez une variété d’espèces. Récemment une

nouvelle fusion, TFG/NOR-1, a été identifié dans un chondrosarcome myxoïde

extrasquelettique (Hisaoka, Ishida et al. 2004). Seule une séquence riche en SPYGQ

présente dans la portion N-terminale de TFG pourrait constituer un point commun avec

EWS et TLS.

2.6.3.9 Transcrits EWS/NOR-1, TAF2N/NOR-1, TCF12/NOR-1 et TFG/NOR-1 Tel que décrit précédemment, quatre catégories de réarrangements chromosomiques, soit

EWS/NOR-1, TAF2N/NOR-1, TCF12/NOR-1 et TFG/NOR-1, ont été mis en évidence

dans les chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques. Les sites de fusion au niveau des

gènes impliqués peuvent néanmoins varier d’une tumeur à l’autre. Une variété de

messagers sont ainsi générés. Une classification des différents types de transcrits produit

par la fusion de EWS et NOR-1 a d’abord été effectuée (Labelle, Zucman et al. 1995;

Clark, Benjamin et al. 1996; Brody, Ueda et al. 1997; Antonescu, Argani et al. 1998;

Attwooll, Tariq et al. 1999; Panagopoulos, Mencinger et al. 1999; Sjogren, Meis-Kindblom

et al. 1999; Okamoto, Hisaoka et al. 2001; Panagopoulos, Mertens et al. 2002; Hisaoka,

Ishida et al. 2004).

Le messager de type 1 s’avère le plus fréquent. Il se caractérise par la fusion en phase de

l’exon 12 de EWS avec le nucléotide en position –2, devant le codon d’initiation de la

traduction, de l’exon 3 de NOR-1 (Fig. 6).

Les transcrits chimériques de type 2 montrent une liaison entre l’exon 7 de EWS et l’exon 2

de NOR-1, à la position –176 en amont du codon d’intiation de la traduction. La protéine

de fusion produite est constituée de 59 nouveaux aa situés entre les portions EWS et NOR-

1 et codée par les 175 nucléotides de l’exon 2. Ils correspondent à la séquence normalement

5’ non-codante de NOR-1. Il existe une variante du transcrit de type 2. La portion NOR-1

est tronquée en C-terminale et ne comprends pas les exons 6, 7 et 8 retrouvés dans la forme

60

longue. La séquence EWS, la jonction au point de fusion, et les 418 premiers aa de NOR-1

demeurent homologues entre les deux messagers. Le transcrit court possède ensuite 25

acides aminés ainsi qu’une région 3’ non-codante distincte. Ces séquences correspondent

au début de l’intron 5 de NOR-1. Cet épissage alternatif de la portion NOR-1 du transcrit

EWS/NOR-1 concorde avec le mécanisme de maturation des messagers observé dans les

cellules normales.

Le messager de type 3 se caractérise par une fusion au centre de l’exon 12 de EWS au

nucléotide 1262 avec l’exon 3 de NOR-1. Le transcrit de type 4 est formé par la liaison de

l’exon 11 de EWS, au nucléotide 1179, avec l’exon 1 de NOR-1 en position –180 en amont

du codon d’initiation de la traduction. La liaison de l’exon 13 de EWS et de l’exon 3 de

NOR-1 en position –2 constitue l’ARN chimérique de type 5. Le messager de type 6 se

définit par une jonction en l’exon 12 de EWS et le début de l’exon 2 du récepteur nucléaire.

Différentes variantes s’ajoutent également à cette liste de transcrits. On observe un

messager EWS/NOR-1 formé de la jonction de l’exon 12 de EWS et de l’exon 3 de NOR-1.

Par contre les exon 8 et 9 de EWS ont été éliminés par épissage. Un second ARNm montre

une jonction identique mais une absence de l’exon 10 de EWS. Une dernier transcrit

constitué d’un insert de 119 pb entre l’exon 12 de EWS et l’exon 3 de Nor-1 a finalement

été trouvé.

Les transcrits TAF2N/NOR-1 identifiés jusqu’à ce jour possèdent un patron identique

(Panagopoulos, Mertens et al. 2002). L’ARNm chimérique est formé de la fusion entre

l’exon 6 de TAF2N et de l’exon 3 de Nor-1. Le messager TCF12/NOR-1, est constitué des

325 premiers nucléotides codant de TCF12 et de l’exon 3 de NOR-1. Quand à l’ARNm

TFG/NOR-1, il contient la séquence des 6 premiers exons de TFG fusionnés à la séquence

de NOR-1 au niveau du l’exon 3.

61

Fig. 6 Illustration schématique des protéines NOR-1, EWS et EWS/NOR-1. A) Représentation des protéines NOR-1 et EWS dont les gènes sont respectivement situés sur les chromosomes 9 et 22. Identification des différents domaines fonctionnels de NOR-1 : domaine de liaison à l’ADN (DBD), de liaison au ligand (LBD) et d’activation de la transcription (AF-1 et AF-2); et de EWS : domaine N-terminal (N-Terminal Domain [NTD]) et domaine de liaison à l’ARN (RNA binding domain [RNA BD]). Les chiffres indiquent les exons codant pour des séquences peptidiques. B) Illustration des protéines de fusion EWS/NOR-1 codées par les transcrits de type I et II.

2.6.3.10 Points de cassure Dans une variété de réarrangements étudiés les points de cassure se situaient à l’intérieur

des introns 7, 12 et 13 ou de l’exon 12 de EWS. Quant à NOR-1, le bris de l’ADN

génomique survenait dans l’intron 1 ou 2 du gène. Pour la translocation TAF2N/NOR-1, le

site de fusion a été localisé dans l’intron 6 de TAF2N ainsi que dans l’intron 2 de NOR-1.

Bien que des fusions simples des gènes EWS et NOR-1 puissent être fréquemment

observées, des réarrangements génétiques additionnels, tels des insertions de nucléotides,

des délétions, des duplications, des inversions, peuvent également accompagner

l’événement de translocation chromosomique.

Dans diverses tumeurs, la présence de motifs répétés autour des sites de fusion, tel que des

séquences ALU, suggère une certaine participation de ces séquences au processus de

62

translocation chromosomique (Jeffs, Benjes et al. 1998; Panagopoulos, Mertens et al.

2002). Le gène EWS contient des séries de répétitions ALU qui s’étendent respectivement

sur 29%, 55% et 39% des introns 7, 12 et 13. Ces introns correspondent aux régions où

surviennent le plus fréquemment les points de cassure. Dans le gène TAF2N, une séquence

ALU ainsi qu’une répétition LINE occupent 30% de l’intron 6 ou se trouve le site de

fusion. Par contre on ne retrouve pas de motifs répétés connus dans les introns 1 et 2 du

gène Nor-1 où surviennent les cassures.

2.6.3.11 Protéine de fusion EWS/NOR-1 Les analyses cytogénétiques des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques établissent

clairement la participation des protéines de fusion EWS/NOR-1, TAF2N/NOR-1,

TCF12/NOR-1 dans le processus tumoral. La protéine chimérique EWS/NOR-1 a

d’avantage fait l’objet d’études. L’impact des protéines de fusion impliquant EWS et

différents facteurs de transcription ont également été analysés. La principale cause du

potentiel tumoral des protéines EWS de fusion serait la perturbation de l’expression des

gènes cibles normalement régulés par les facteurs de transcription. Cette variation du

niveau transcriptionnel de certains gènes aurait pour effet de perturber le cycle cellulaire.

Des expériences ont révélées que la portion N-terminale de EWS, fusionnée au domaine de

liaison à l’ADN de Gal 4, possédait un potentiel intrinsèque d’activation de la transcription

(May, Lessnick et al. 1993; Bailly, Bosselut et al. 1994). Le même schéma structural est

observé dans le contexte d’une fusion avec un facteur de transcription : la portion N-

terminale de EWS se trouve liée à une séquence contenant un domaine de liaison à l’ADN.

Des expériences de transfections dans des lignées COS-1 et de chondrocytes humain

C20/A4 ont été effectuées afin de comparer l’activité transcriptionnelle de NOR-1 et

EWS/NOR-1 (transcrit de type 2) au niveau d’un motif NBRE (Labelle, Bussieres et al.

1999). La présence du NTD de EWS n’altère pas la capacité du récepteur NOR-1 à lier son

élément de réponse. Par ailleurs, tout comme NOR-1ΔC, la protéine chimérique EWS/

NOR-1ΔC possède une faible affinité pour le NBRE. La portion EWS ajoutée au récepteur

Nor-1 accroît très fortement le potentiel d’activation de la transcription du récepteur

nucléaire. Ainsi EWS/NOR-1 est un activateur 270 fois plus puissant que NOR-1 dans les

Cos-1 et 50 fois supérieur dans les C-20/A4. EWS/ NOR-1ΔC dont le transcrit a également

63

été identifié dans les CME demeure un activateur modéré (Brody, Ueda et al. 1997;

Labelle, Bussieres et al. 1999). Il possède une capacité transactivatrice légèrement

inférieure à celle de NOR-1 dans les Cos-1 et C-20/A4.

Afin de mieux définir le rôle de la portion N-terminale de EWS dans le contexte de la

protéine de fusion EWS/NOR-1, une série de délétion a été effectuée. Ainsi, l’élimination

des 65 premiers acide aminés de EWS, sur 265 aa, réduit de 75% le potentiel d’activation

de transcription de l’oncogène. Cette diminution de l’activité se poursuit graduellement, en

corrélation avec le nombre d’aa de EWS délétés (Labelle, Bussieres et al. 1999).

Différentes analyses de délétions réalisée avec les protéines de fusion EWS/FLI-1,

EWS/ATF-1 et EWS/ERG montrent que EWS dérégule l’activité transcriptionnelle du

facteur natif (Ohno, Rao et al. 1993; Zucman, Delattre et al. 1993; Ohno, Ouchida et al.

1994; Fujimura, Ohno et al. 1996).

Cette variation du niveau transcriptionnel d’un gène cible en présence de NOR-1 ou

EWS/NOR-1 suggère une interaction et/ou une participation de cofacteurs différents selon

la protéine impliquée. Pour d’autres types de fusion EWS et facteur de transcription, la

modification des interactions avec des cofacteurs a plus clairement été définie.

L’association constitutive de la protéine de fusion EWS/ATF-1 au coactivateur CBP

(CREB-binding protein) produirait un effet répressif des fonctions du complexe p53/CBP.

Les portions EWS et ATF-1 seraient essentielles à l’interaction constitutive avec le

CBP(Fujimura, Siddique et al. 2001).

Filion et al. (2004) ont récemment réussi à établir un modèle cellulaire pour EWS/NOR-1

par l’établissement d’une lignée chondrogénique CFK2 exprimant de façon stable la

protéine de fusion (Filion and Labelle 2004). Ces travaux ont permis d’apporter des

informations importantes sur le rôle de la protéine chimérique dans la transformation

tumorale des cellules. D’abord l’oncogène ne modifie pas la vitesse de prolifération des

cellules CFK2 dans une culture subconfluente, toutefois il exerce un effet transformant en

altèrant l’inhibition de contact des cellules dans une culture confluente. De plus, les cellules

exprimant EWS/NOR-1 parviennent à croître en absence d’ancrage dans de l’agar semi-

liquide, propriété caractéristique des cellules tranformées. De plus, EWS/NOR-1 n’affecte

pas l’état de différentiation chondrogéniques des cellules CFK2 tel que démontré par la

64

production de glycoaminoglycans. En somme, ces résultats suggèrent que la présence de la

protéine de fusion EWS/NOR-1 pourrait altérer l’état prolifératif des cellules impliquée

dans la chondrogénèse et ainsi initier le développement des chondrosarcomes myxoïdes

extrasquelettiques.

2.6.3.12 Promoteur EWS Il est intéressant de noter que le gène codant pour le récepteur nucléaire Nor-1 lorsque

fusionné à la portion 5’ du gène EWS devient sous le contrôle du promoteur de ce dernier

(Sjogren, Meis-Kindblom et al. 2003). Le niveau d’expression du messager EWS/NOR-1

est d’ailleurs beaucoup plus élevé que celui de NOR-1 tel que démontré par PCR semi-

quantitatif. Ainsi la surexpression de la portion NOR-1 dans le contexte de la protéine de

fusion EWS/NOR-1 pourrait avoir un impact sur la transcription des gènes cibles du

récepteurs ainsi que sur l’utilisation de cofacteurs.

2.6.3.13 Épissage et EWS/NOR-1 Des propriétés autres que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle pourrait contribuer

au potentiel tumoral de la protéine de fusion EWS/NOR-1 (Ohkura, Yaguchi et al. 2002).

Un système de complémentation fonctionnel chez la levure a effectivement permis de

révéler la capacité de EWS/NOR-1 à compenser l’effet d’une mutation ponctuelle dans la

protéine Snu23. Ni EWS, ni NOR-1 ne peuvent remplir cette fonction. Snu23p a à l’origine

été identifié chez la levure à l’intérieur de l’unité tri-snRNP U4/U6/U5 du complexe central

de la machinerie nucléaire d’épissage des prémessagers. Il a également été détecté dans les

spliceosomes en activité contenant les particules SnRNP U1, U2, U5 et U6 ainsi que des

facteurs d’épissages non-snRNP (Gottschalk, Neubauer et al. 1999). Bien que la protéine

EWS/NOR-1 puisse pallier une déficience fonctionnelle du mutant Snu23, elle demeure

incapable de sauver un mutant dont Snu23 est totalement inactivé. Même si les séquences

des protéines EWS/NOR-1 et Snu23 montrent peu d’homologie, la complémentation de

leur activité peut être expliqué par la similarité de leurs structures et motifs. NOR-1 et

Snu23 possèdent tout les deux un motif en doigt de zinc, alors que EWS et Snu23

contiennent un domaine de liaison à l’ARN.

65

Aucun homologue de Snu23 n’a été identifié chez l’humain. Les résultats suggèrent

néanmoins que EWS/NOR-1 puisse influencer directement l’épissage de prémessagers chez

l’humain. Cette hypothèse a été fortement renforcée par la démonstration du potentiel de

EWS/NOR-1 à affecter l’épissage alternatif du gène E1a dans des cellules de mammifère.

Sa capacité à interagir fortement avec le facteur d’épissage U1C a également été mise en

évidence (Ohkura, Yaguchi et al. 2002). Par contre, les protéines EWS et NOR-1, de façon

individuelle, ne possèdent pas ces mêmes propriétés. La surexpression de EWS/NOR-1

cause une augmentation de l’usage des sites d’épissage 5’ distaux des prémessagers

suggérant que la protéine de fusion puisse agir par le biais d’interaction avec des facteurs

qui contribuent à la sélection des sites d’épissage en 5’. Le lien direct entre EWS/NOR-1 et

U1C, composante impliquée dans la reconnaissance des sites 5’ appuie cette hypothèse.

EWS/Fli interagit également avec U1C ainsi qu’avec SF1 (Splicing Factor 1). Des analyses

d’épissage in vivo du gène E1A ont démontré que EWS/Fli interfère dans la sélection des

sites d’épissage alternatif effectuée par la composante hnRNPA1 (heterogenous nuclear

ribonucleoprotein A1) (Knoop and Baker 2001). Puisse qu’il y a association des facteurs

d’épissages avec l’ARN polymérase II ainsi qu’avec des facteurs d’initiation de la

transcription, il est possible que EWS/NOR-1 puisse agir simultanément sur l’activité

transcriptionnelle et le processus d’épissage.

2.6.3.14 Analyses cytogénétiques, SKY et FISH Tel qu’observé habituellement dans les cellules tumorales, d’autres réarrangements

chromosomiques accompagnent également les mutations initiales. Des analyses

cytogénétiques approfondies d’une dizaine de chondrosarcomes myxoïdes

extrasquelettiques ont été effectuées (Panagopoulos, Mertens et al. 2002). La coloration

standard des bandes G ainsi que les techniques de SKY (spectral karyotyping) et de FISH

(fluorescence in situ hybridation) ont été utilisées. Les résultats obtenus ont ensuite été

comparés à ceux contenus dans la littérature. On constate d’abord une prédominance de

caryotypes diploïdes ou quasi diploïdes. Cette étude révèle ensuite une présence fréquente

de trisomies, simples ou multiples, des chromosomes 1q, 7, 8, 12 et 19. La trisomie

66

partielle 1q est principalement décelée dans les chondrosarcomes myxoïdes

extrasquelettiques contenant la translocation chromosomique t(9 ;22).

On retrouve dans la région du bras long du chromosome 1 quelques gènes candidats qui

pourraient participer au processus tumoral soient PRUNE, JTB et EAT/mcl-1

(Hatakeyama, Osawa et al. 1999; Okita, Umezawa et al. 2000). PRUNE présente un grand

intérêt puisque l’amplification et la surexpression de ce gène a été mise en évidence dans

une variété de sarcomes humains (Forus, D'Angelo et al. 2001). La protéine codée par le

gène PRUNE exerce une régulation négative sur le suppresseur de métastase nm23-H1,

connu pour son implication dans les cancers du sein et du colon.

2.6.3.15 Profile d’expression génique Des analyses de microarrays ont permis d’établir le profile d’expression des gènes de deux

chondrosarcomes myxoïde extrasquelettiques possédant un aspect histologique ainsi que

des transcrits de fusion différents (Sjogren, Meis-Kindblom et al. 2003). La première

tumeur, contenant une fusion EWS/NOR-1 montrait une composition cellulaire myxoïde

classique tandis que la seconde, contenant une fusion TCF12/NOR-1 correspondait aux

variantes histologiques montrant un arrangement cellulaire solide. Bien que des différences

majeures histologiques distinguent les deux chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques,

il est étonnant de constater à quel point leurs profils d’expression montrent une forte

similitude. Lorsque comparé à un liposarcome de référence, les chondrosarcomes possède

une composition en ARNs fort différente. Parmi les gènes montrant un niveau d’expression

élevé dans les CME, CHI3L1 et METTL1 retiennent d’abord l’attention.

CHI3L1 code pour une « chitinase-like protein » qui est la principale protéine de sécrétion

des chondrocytes articulaires humains et des fibroblastes synoviaux (Hakala, White et al.

1993). CHI3L1 est également un marqueur de la différentiation tardive des macrophages

(Krause, Rehli et al. 1996). Cette protéine possèderait une fonction dans le remodelage et la

dégradation de la matrice extracellulaire, suggérant également un rôle dans les processus

d’invasion tumorale. Un niveau sérique élevé de CHI3L1 est associé à un état avancé de

cancer colorectal et à une récurrence dans le cas d’un cancer du sein (Johansen, Cintin et al.

1995; Cintin, Johansen et al. 1999). Sa surexpression a également été observée dans des

67

gliomes à haut niveau de malignité ainsi que dans des carcinomes papillaires de la glande

thyroïde (Sjogren, Meis-Kindblom et al. 2003). Des analyses par RT-PCR ont permis de

confirmer l’expression de CHI3L1 dans les chondrosarcomes myxoïdes à l’étude et

l’absence de transcrit CHI3L1 dans les liposarcomes myxoïde.

Quant au gène METTL1, qui code pour une « methyltransferase-like protein », il présente

également un intérêt dans le contexte de l’étude sur les chondrosarcomes puisque des

changements épigénétiques, tel que la méthylation de l’ADN, sont couramment observés

dans les néoplasmes humains(Jones and Baylin 2002). Le facteur de transcription RELB

membre de la famille de facteurs-KB nucléaire attire également l’attention des auteurs de

cette étude. En effet RELB pourrait avoir une influence dans la tumorigenèse puisqu’il est

impliqué dans le contrôle de la prolifération cellulaire, la différenciation et l’apoptose.

Parmi les 35 gènes identifiés par l’analyse du profil d’expression de chondrosarcomes

myxoïdes extrasquelettiques, on note la présence de 2 gènes, CHI3L1 et CHST1, impliqués

dans la chondrogenèse et de 4 gènes, SCG2 (chromogranin C), NEF3 (neurofilament 3),

GFAP (glial fibrillary acidic protein) et GAD2 (glutamate decarboxylase 2), codant pour

des marqueur du développement neuroendocrinien. Ces dernières observations concordent

avec l’hypothèse d’une différenciation neuroendocrinienne partielle des chondrosarcomes

myxoïdes extrasquelettiques, jumelée à la différentiation chondroïde. Cette hypothèse

s’appuyait sur des résultats d’analyses immunohistochimiques et des observations

structurales des tumeurs.

Malgré les multiples informations acquises sur les chondrosarcomes myxoïdes

extrasquelettiques par l’ensemble des analyses réalisées, aucune corrélation ne peut encore

être établie entre l’aspect histologique des tumeurs, les différentes trisomies, les types de

fusions ou les pronostiques.

68

2.6.4 Récepteurs nucléaires et protéines homéotiques

2.6.4.1 Interaction entre NOR-1 et SIX3 Plusieurs cofacteurs spécifiques aux récepteurs nucléaires ont été identifiés. L’interaction

de protéines coactivatrices avec les membres de la sous-famille NGFI-B/NURR1/NOR-1 a

également été mise en évidence (Wansa, Harris et al. 2003). Des recherches effectuées afin

de découvrir des cofacteurs spécifiques du récepteur NOR-1 ont été réalisées. Comme le

gène NOR-1 est de façon ponctuelle fortement exprimé dans le cerveau antérieur murin au

jour 17 du développement embryonnaire, une banque d’ADNc d’encéphale de rat au jour

E17 a été utilisée pour effectuer des expériences de double-hybride chez la levure (Ohkura,

Ohkubo et al. 2001). Les travaux ont permis de montrer l’existence d’interaction entre le

récepteur nucléaire NOR-1 et la protéine homéotiques SIX3.

Les expériences de double hybride ont été répétées avec les trois membres de la sous-

famillle NGFI-B/NURR1/NOR-1 qui montrent une forte homologie entre leur domaines de

liaison à l’ADN et une homologie modérée entre leurs extrémités C-terminales. Ces essais

ont confirmé la spécificité de l’interaction NOR-1/SIX 3 (Ohkura, Ohkubo et al. 2001).

Une analyse par Northern blot du profil d’expression des gènes NOR-1 et SIX3 dans le

cerveau antérieur à différent temps, de la vie embryonnaire à l’age adulte, montre un niveau

maximal des deux transcrits au jour E18. Un survol par RT-PCR semi-quantitatif de

l’expression de NGFI-B, NURR1, NOR-1 et SIX3 confirme la coexpression spécifique de

NOR-1 et SIX3 au jour E18. Le domaine de liaison à l’ADN ainsi que l’extrémité carboxy-

terminale de NOR-1 constitueraient les séquences minimales nécessaires à l’interaction des

deux facteurs de transcription.

2.6.4.2 SIX3 SIX3, initialement isolé chez la souris, appartient à la sous-classe de gènes homéotiques

SIX/Sine Oculis qui regroupe également SIX1, SIX2, SIX4, SIX5, drosophila sine oculis

(so) ainsi que « chicken optic 2 » (Oliver, Mailhos et al. 1995). Les protéines se

69

caractérisent par une séquence conservé de 110 acides aminés, le domaine six. Ce dernier

se situe dans l’extrémité N-terminale, contigu à l’homéodomaine. Drosophila sine oculis est

connu pour son rôle essentiel dans le contrôle d’événements initiaux menant à la formation

du système visuel chez la mouche. Elle est impliquée tant dans le développement des yeux

que dans celui des lobes optiques. Bien qu’il présente un degré d’homologie en acide aminé

inférieur à celui d’autres protéines de la sous-classe, SIX3 constituerait l’homologue

fonctionnel de sine oculis chez les vertébrés (Cheyette, Green et al. 1994).

Une analyse du patron d’expression de SIX3 chez la souris par hybridation in situ a été

réalisée (Oliver, Mailhos et al. 1995). Le transcrit est initialement décelé au jour 8.5 du

développement embryonnaire dans la portion antérieure de la plaque neurale qui donnera

naissance à des dérivés ectodermiques et neuraux. Le messager SIX3 est détecté dans des

structures qui formeront l’ectoderme de la cavité nasale, les placodes olfactives ainsi que

les poches de Rathke. SIX3 est également exprimé dans des tissus neuronaux en

développement tel la région ventrale du prosencéphale, les cavités optiques,

l’hypothalamus ainsi que les vésicules optiques. Au jour E 9.0 l’expression de SIX3 est

progressivement détectée dans les pédoncules optiques, les vésicules optiques, la rétine

neurale, le cristallin ainsi que le chiasma optique. En somme SIX3 serait impliqué dans la

formation des yeux et de la ligne médiane de la tête chez plusieurs organismes dont le

poulet, le xenopus laevis, le medeka fish et le zebrafish.

L’inactivation du gène SIX3 chez la souris produit des organismes montrant un encéphale

tronqué dans sa portion antérieure (Lagutin, Zhu et al. 2001). Notons que l’expression de

Six 3 démarque la bordure antérieure de la plaque neurale au cours du développement chez

la souris. Par contre une surexpression de SIX3 dans l’embryon de zebrafish produit

l’hypertrophie du cerveau antérieur ainsi qu’une désorganisation générale de l’encéphale

(Kobayashi, Toyama et al. 1998). De plus, l’expression ectopique de SIX3 dans l’embryon

de souris entraîne la formation inhabituelle de structures s’apparentant à des vésicules

optiques dans la portion postérieure et médiane du cerveau. Parallèlement la présence

ectopique de messager SIX3 chez le poisson Medeka induit la formation de cellules de la

rétine et du cristallin dans les tissus (Lagutin, Zhu et al. 2001).

70

Des recherches ont finalement démontré que la présence de mutations dans

l’homéodomaine de SIX3 était associé à l’holoprosencéphalie chez l’humain (Wallis,

Roessler et al. 1999). Cette maladie consiste en une malformation congénitale commune et

sévère du cerveau qui produit la séparation latérale de l’encéphale en deux moitiés. Des

formes bénignes de l’holoprosencéphalie existent et se manifestent par des anomalies

craniofaciales accompagnées ou non d’une malformation du cerveau.

2.6.4.3 SIX3, NOR-1 et EWS/NOR-1 Les proteins SIX3 et NOR-1 possèdent chacune des fonctions propres dans différents types

cellulaires. Par contre, aucune voie de signalisation modulée par l’interaction des deux

facteurs de transcription n’a, à ce jour, été identifiée. Des transfections dans des cellules

MCF-7 d’adénocarcinomes humains montre que la présence de SIX3 exerce un effet

suppressif de manière dose dépendante sur l’activité transactivatrice de NOR-1 au niveau

de l’élément de réponse NBRE. (Ohkura, Ohkubo et al. 2001).

L’interaction potentielle de SIX3 et de l’oncogène EWS/NOR-1 dans le contexte des

chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques (CME) a fait l’objet d’études (Laflamme,

Filion et al. 2003). L’expression de SIX3 a d’abord été mis en évidence dans des tumeurs

possédant également le transcrit de fusion EWS/NOR-1 (type 1 et 2) ainsi que le messager

NOR-1. L’interaction in vitro de SIX3 avec les protéines NOR-1 et EWS/NOR-1 a été

démontré par protéine de fusion GST. L’élimination successive du domaine AF-2, du

leucine zipper et de la région charnière de NOR-1 n’affecte pas sa capacité à interagir avec

SIX3. Par contre, la délétion du domaine de liaison à l’ADN du récepteur altère

significativement son interaction avec l’homéoprotéine. Les diverses isoformes de

EWS/NOR-1 tronquées possèdent une affinité pour SIX3 qui interagit également avec la

portion EWS de l’oncogène. Des délétions dans la protéine SIX3 montrent le rôle essentiel

de l’homéodomaine pour sa liaison in vitro avec NOR-1 et EWS/NOR-1. L’interaction

entre les protéines a été confirmé in vivo par des expérience de double hybride de

mammifère effectué dans des lignées de chondrocytes humains immortalisés, TC-28 et C-

20/A4.

71

Contrairement aux travaux de Ohkura et al. (2001) qui mettaient en évidence l’effet

répressif de SIX3 sur l’activité transcriptionnelle du NOR-1 dans des cellules MCF-7,

Laflamme et al. (2003) montrent la fonction coactivatrice de SIX3 sur le récepteur

nucléaire dans les lignées de chondrocytes TC-28 et C-20/A4. La présence croissante de

SIX3 accroît le potentiel de transactivation de NOR-1 de manière dose dépendante dans ce

type de cellule. SIX3 exercerait à la fois une fonction de coactivateur et de corepresseur sur

l’activité du récepteur NOR-1. Le recrutement de tierces cofacteurs, variant selon le

contexte cellulaire pourrait expliquer les propriétés différentes de l’homéoprotéine. De plus,

dans les lignées de chondrocytes TC-28 et C-20/A4 alors que SIX3 accroît le potentiel de

transactivation de NOR-1, un effet opposé sur l’activité de la protéine de fusion

EWS/NOR-1 est produit par la protéine homéotique. Ce résultat suggère une influence

importante de l’interaction de SIX3 avec la portion EWS de l’oncoprotéine. L’effet

corépressif de SIX3 pourrait être causé par une occupation de sites de liaison de cofacteurs

participant au potentiel de transactivation élevé de EWS. Toutefois, l’ensemble de ces

résultats, obtenu par des expériences de transfection, donc observé chez des protéines

surexprimées, demeurent un indicatif des fonctions qui pourraient avoir lieu in vivo.

L’interaction de NOR-1 et SIX3 n’est pas le premier exemple d’une association entre un

récepteur nucléaire et une homéoprotéine. Il a été démontré que la protéine à

homéodomaine FTZ (fushi tarazu) chez la drosophile liait le récepteur nucléaire orphelin

αFTZ-F1 (Guichet, Copeland et al. 1997; Yu, Li et al. 1997).

2.6.5 Système nerveux central et sous-famille NOR-1/NGFI-B/NURR1

2.6.5.1 NURR1 et système dopaminergique

2.6.5.1.1 Inactivation du gène NURR1 chez la souris Une découverte majeure dans l’étude de la neurobiologie a été réalisée en inactivant le gène

NURR1 chez la souris (Zetterstrom, Solomin et al. 1997). Cela mit en évidence la fonction

essentielle de ce récepteur nucléaire orphelin dans le développement des neurones

dopaminergiques du mésencéphal. Ces résultats furent par la suite confirmés par d’autres

groupes de recherches qui créèrent également des souris déficientes pour la protéine

NURR1 (Castillo, Baffi et al. 1998; Saucedo-Cardenas, Quintana-Hau et al. 1998). La

72

dopamine, un neurotransmetteur de type catécholamine, exerce un rôle central dans le

contrôle des mouvements volontaires, les fonctions cognitives et le développement de

comportements associés aux émotions. Les neurones dopaminergiques localisés dans la

substance noire projettent leurs axones dans le striatum et participent à la régulation des

fonctions motrices. Leur dégénérescence est associée à la maladie de Parkinson. Les

neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale envoient leurs projections dans le

système limbique et le cortex cérébral. Ils contrôlent les comportements et la motivation

liés aux émotions (Self and Nestler 1995). La schizophrénie, la dépression et les problèmes

de dépendance se rattacheraient à une perturbation de ce système (Ritz, Lamb et al. 1987;

Koob 1992; Seeman, Guan et al. 1993). L’expression de NURR1 dans le mésencéphale

ventral est détecté au jour 10.5 du développement embryonnaire, chez la souris. La

présence du récepteur nucléaire est préalable à l’apparition de marqueurs dopaminergiques

au jour E11.5 tel que TH (tyrosine hydroxylase) et AADC (L-aromatic amino acid

decarboxylase), des enzymes impliqués dans la synthèse du neurotransmetteur. La cascade

de signalisation initiant la différenciation des neurones du mésencéphale ventral en

neurones dopaminergiques est induite par l’expression, au jour E10, de SHH (sonic

hedgehog) dans la portion ventrale (floor plate) du tube neural. Une collaboration

subséquente de FGF-8 (fibroblast growth factor-8) serait également requise. Nurr1 joue un

rôle essentiel au cœur de cette cascade de signalisation. Il se révèle indispensable à la survie

et la différentiation terminale des cellules précurseurs des neurones dopaminergiques du

mésencéphale ventral tel que démontré par l’analyse de marqueurs précoces (AHD2

[aldehyde dehydrogenase 2], En [Engrailed], Ptx3 [pituitary homeobox 3]) et tardifs (TH)

(Wallen, Zetterstrom et al. 1999). NURR1 serait plus spécifiquement impliqué aux étapes

de maturation, de migration et d’innervation du striatum. L’absence de NURR1 induit une

dégénérescence des précurseurs de neurones dopaminergiques et la mort des souris NURR1

-/- peu de temps après la naissance. Chez la souris adulte normale l’expression de NURR1

demeure continue dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale suggérant qu’outre

la différentiation des neurones durant le développement embryonnaire, le récepteur

nucléaire serait également nécessaire au maintient de l’activité cellulaire au cours de la vie

post-natale.

73

Notons que le développement des neurones dopaminergiques situés dans des régions du

cerveau où le récepteur nucléaire NURR1 n’est pas exprimé, dont le bulbe olfactif, le noyau

paraventriculaire de l’hypothalamus et le noyau arqué, ne se trouve pas affecté chez la

souris Nurr1 -/-. De plus, la TH est détectée, chez la souris déficiente pour le récepteur

nucléaire, parmi d’autres groupes de neurones dopaminergiques exprimant normalement

Nurr1, notamment dans le noyau périventriculaire, la zona incerta dorsale et la portion

postérieure de l’hypothalamus. (Castillo, Baffi et al. 1998).

2.6.5.1.2 Gènes cibles de NURR1 La découverte du rôle essentiel de NURR1 dans le développement des neurones

dopaminergiques du mésencéphale ventral a entraîné l’orientation des recherches vers une

nouvelle avenue, soit l’identification des gènes cibles du récepteur nucléaire. Les deux

premiers gènes identifiés, la tyrosine hydroxylase (TH) et le transporteur de la dopamine

(DAT), étaient surtout associés à la neurotransmission de la dopamine alors que le

troisième, le récepteur tyrosine kinase (Ret), permettait d’avantage d’expliquer son rôle

dans le développement des neurones. Ret constitue une sous-unité du récepteur répondant

au GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) et autres facteurs neurotrophiques

apparentés. (Sakurada, Ohshima-Sakurada et al. 1999; Schimmel, Crews et al. 1999;

Sacchetti, Mitchell et al. 2001; Wallen, Castro et al. 2001).

2.6.5.1.3 Schizophrénie et NURR1 Une perturbation du développement neural serait à l’origine de la schizophrénie. Cette

désorganisation surviendrait à la mi-gestation, une période au cours de laquelle le cerveau

se développe de façon intensive et durant laquelle l’apport d’acides rétinoïques est

fortement requise. Certains auteurs (Goodman 1998) suggèrent l’importance des voies de

signalisation des rétinoïdes, impliquant RXR et RAR, dans l’apparition de la schizophrénie.

Trois arguments majeurs appuient cette hypothèse. D’abord les malformations congénitales

associées à une perturbation des sentiers de signalisation des acides rétinoïques

s’apparentent aux anomalies qui stigmatisent les malades atteints de schizophrénie, dont un

corps calleux sous-développé, des ventricules hypertrophiés, une microcéphalie. Ensuite les

régions chromosomiques liées à la schizophrénie contiennent des gènes qui peuvent être

74

rattachés de près ou de loin aux sentiers métaboliques ou aux voies de signalisation des

acides rétinoïques. Finalement, plusieurs gènes candidats, associés à la maladie s’avèrent

également régulés par les récepteurs des acides rétinoïques. La dopamine et le récepteur D2

de la dopamine sont principalement concernés (Mena, Casarejos et al. 1995; Samad, Krezel

et al. 1997). Spécifions que RXR est le partenaire d’hétérodimérisation de plusieurs

récepteurs nucléaires, notamment de NURR1 et NGFI-B, également exprimés dans le

cerveau (Zetterstrom, Solomin et al. 1996).

Plusieurs chercheurs ont axé leur travaux sur l’identification de locus liés à la

schizophrénie. Parmi les gènes candidats mis en évidence à travers ces recherches on

retrouve les récepteurs des acides rétinoïques, dont RXR, ainsi que NURR1. Pour le

moment différents polymorphismes tendent à associer le gène NURR1 à l’apparition de la

schizophrénie, mais aucune étude ne confirme de liens fontionnels pour le moment

(Buervenich, Carmine et al. 2000; Chen, Tsai et al. 2001; Ishiguro, Okubo et al. 2002).

2.6.5.2 Antipsychotiques, NGFI-B et NOR-1 L’utilisation d’antipsychotiques constitue un traitement privilégié pour réduire les

symptômes de la schizophrénie. Par ailleurs, leurs mécanismes d’action demeurent encore

imprécis. De plus, certains neuroleptiques provoquent des effets secondaires importants.

Les antipsychotiques typiques, dont l’halopéridol, réduisent efficacement les symptômes de

la maladie, notamment les hallucinations. Par contre, ces drogues ont une forte propension

à entraîner l’apparition d’effets indésirables associés au système extrapyramidal, tel que des

spasmes musculaires, le tremblement des doigts et des mains, de la difficulté à avaler et

parler, une perte d’expression faciale, de la faiblesse et de la raideur dans les membres, des

pertes d’équilibre (Casey 1991; Kane 2001). De nouveaux neuroleptiques définis comme

atypique ont vu le jour, telle la clozapine. Bien qu’ils préservent les malades d’effets

secondaires liés au système extrapyramidal, ces médicaments « nouvelle génération » ne

sont pas dénués d’effets pernicieux, comme la prise excessive de poids (Allison and Casey

2001; Serretti, De Ronchi et al. 2004). Les antipsychotiques exercent leur effets en liant et

bloquant le récepteur D2 de la dopamine. L’affinité et la spécificité différentes de ces

drogues pour le récepteur D2 expliquent la variété des réponses physiologiques. Les

antipsychotiques atypiques montrent une affinité plus faible pour le récepteur D2 ainsi

75

qu’une affinité plus élevée pour le récepteur 5-HT2A (5-hydroxytryptamine) de la

sérotonine, comparativement aux antipsychotiques typiques (Meltzer 1999; Maheux, Ethier

et al. 2005). La contribution des autre sous-types de récepteurs de la dopamine et de la

sérotonine (D3, D4 et 5-HT1A) à la réponse des antispychotiques reste à être établie. Des

équipes de recherches se sont également penchées sur l’expression de facteurs de

transcription induits par les antipsychotiques. Les récepteurs nucléaires de la sous-famille

NGFI-B/NURR1/NOR-1 et plus spécifiquement NGFI-B et NOR-1 ont fait l’objet de ces

études.

Des traitements aigus et chroniques avec un antipsychotique typique, l’halopéridol, et

atypique, le clozapine, ont été administrés à des rats dont le cerveau a ensuite été analysé

par hybridation in situ (Beaudry, Langlois et al. 2000; Werme, Ringholm et al. 2000;

Langlois, Beaudry et al. 2001). Pour NGFI-B et NOR1 on observe une réponse comparable

suite à un traitement aigu. Une augmentation de l’expression est produite dans la coquille

du noyau accumbens par l’administration des deux catégories de neuroleptiques. une forte

expression de l’ARNm NGFI-B est également observée dans le cortex cingulaire et

préfrontal (Beaudry, Langlois et al. 2000). Une augmentation importante du transcrit

NGFI-B est détectée dans le striatum dorsolatéral en réponse à l’halopéridol. Un traitement

chronique à la clozapine réduirait l’expression basale de NGFI-B, alors que

l’administration répétée d’halopéridol induirait une augmentation du messager dans la

région dorsolatérale du striatum. Une diminution de l’ARNm NGFI-B est décelée dans le

cortex somatosensoriel primaire en réponse aux deux neuroleptiques (Langlois, Beaudry et

al. 2001). Il a été démontré qu’une administration d’halopéridol produisait une

colocalisation des ARNm de NGFI-B, de l’enképhaline et de la neurotensine dans le

striatum dorsolatéral. Il s’agirait en fait d’une même population de neurones exprimant le

récepteur D2 de la dopamine et probablement responsable des effets secondaires (Beaudry,

Langlois et al. 2000). En somme, une analyse exaustive du patron d’expression des

récepteurs de la sous-famille Nur induit par une variété d’antipsychotiques typiques et

atypiques montre que NGFI-B et NOR-1 sont modulés de façon très similaire chez la souris

(Maheux, Ethier et al. 2005).

76

Bien que RXRγ1 soit peu modulé par un traitement chronique ou aigu à l’halopéridol et à la

clozapine, on note une expression concomitante du récepteur des acides rétinoiques-9-cis

avec celle de NGFI-B suggérant la possibilité d’un mode d’action sous forme

d’hétérodimère. Le patron d’expression normal de RXRγ1 se caractérise par un gradient de

la portion médiale à latérale du striatum, ainsi qu’un pic dans la région ventromédiale de la

coquille du noyau accumbens (Langlois, Beaudry et al. 2001; Ethier, Beaudry et al. 2004).

Les effets de traitements à l’halopéridol ont été analysés chez la souris déficiente pour le

récepteur nucléaire NGFI-B par hybridation in situ (Ethier, Beaudry et al. 2004).

Étonnamment, on constate, chez la souris NGFI-B -/-, une forte diminution de l’état

cataleptique provoqué par une injection d’halopéridol. L’expression de neurotensine et

d’enképhaline, normalement induite par le neuroleptique dans le stiatum dorsolatéral, se

trouve significativement réduite chez la souris déficiente pour le récepteur nucléaire. Des

antagonistes des récepteurs D2/D3 et D1, provoquant également la catalepsie ont été

administrés aux souris. Les résultats indiquent que l’influence du récepteur NGFI-B est

exercée principalement sur l’activité des récepteurs D2/D3. Chez la souris déficiente pour

le récepteur nucléaire on observe d’ailleurs un niveau d’expression plus élevé du récepteur

D2 de la dopamine dans le striatum dorsolatéral. Spécifions qu’un élément de réponse

RARE (retinoic acid response element) est présent dans la région promotrice du gène

codant pour le récepteur D2 de la dopamine (Samad, Krezel et al. 1997).

Bien que l’absence de NGFI-B chez la souris réduise l’effet cataleptique causé par une

administration d’halopéridol, une augmentation spontanée des signes de dyskinésie tardive,

qui se traduit par incoordination orofaciale, est observée chez les souris déficientes pour

NGFI-B. Les manifestations de dyskinésie tardive sont fortement accrues en réponse à un

traitement chronique à l’halopéridol et ce d’avantage chez la souris NGFI-B -/- (Ethier,

Kagechika et al. 2004). L’administration de DHA (docosahexaenoic acid), un agoniste de

RXR, ne produit pas d’effet, tant chez la souris NGFI-B +/+ que -/-. Toutefois, une

administration de DHA, au cours d’un traitement chronique à l’halopéridol entraîne une

réduction significative des signes de dyskinésie tardive chez la souris sauvage mais ne

produit pas d’effet chez la souris NGFI-B -/-. Un traitement au HX531, un antagoniste de

RXR produit une augmentation des manifestations d’incoordination orofaciale chez la

77

souris sauvage mais aucun effet significatif n’est observé chez la souris knock-out pour

NGFI-B. Une administration de HX531 lors d’un traitement chronique à l’halopéridol

accroît significativement les signes de dyskinésie tardive chez la souris NGFI-B +/+ mais

ne produit pas d’effet additionnel chez la souris déficiente pour le récepteur nucléaire. Ces

résultats indiquent que NGFI-B et RXR, seraient impliqués dans l’apparition de la

dyskinésie en réponse à un traitement à l’halopéridol.

L’expression du récepteur NOR-1 a également été analysée au cours de cette étude menée

par Éthier et al. (2004). Ainsi tant chez la souris normale que chez la souris NGFI-B -/-,

une forte augmentation de l’expression du récepteur nucléaire NOR-1 est induite par une

administration d’halopéridol dans le striatum dorsomédial ainsi que dans la coquille et le

corps du noyau accumbens. De plus, en réponse au neuroleptique, la présence du messager

NOR1 est significativement supérieure dans ces régions du cerveau chez la souris NGFI-B

-/-. Il importe de rappeler que le récepteur nucléaire NOR-1 ne possède pas la capacité de

s’hétérodimériser avec RXR comme NGFI-B, suggérant un rôle distinct qu’il serait

intéressant de définir.

3. Objectif : Inactivation du gène NOR-1 chez la souris L’objectif de nos travaux de recherche visait la création et la caractérisation d’une souris

déficiente pour le récepteur nucléaire orphelin NOR-1. Cette approche permet d’évaluer les

conséquences provoquées par l’absence ou la diminution d’une protéine au cours du

développement ou durant la vie post-natale d’un organisme. L’inactivation du gène par

recombinaison homologue fût la stratégie privilégiée et la souris, le modèle animal

sélectionné.

L’inactivation du gène NGFI-B chez la souris fût initialement réalisée en 1995 par l’équipe

de Milbrandt (Lee, Wesselschmidt et al. 1995). Étonnament la souris ne présentait pas

d’anomalie majeure. La maturation des lymphocytes T, l’activité de l’axe

hypotalamo/hypophyso/surrénalien dont l’expression d’enzymes stéroïdogéniques, ainsi

que le développement du système reproducteur ne semblait pas affecté par l’absence du

récepteur. Le phénotype sauvage suggérait une redondance fonctionnelle, exercée par

NURR1 ou NOR-1. Une souris mutante nulle pour le gène NURR1 fût également produite

78

(Zetterstrom, Solomin et al. 1997; Castillo, Baffi et al. 1998; Saucedo-Cardenas, Quintana-

Hau et al. 1998). Contrairement à la souris NGFI-B -/-, la souris NURR1 -/- présentait un

phénotype important tel que mentionné précédemment, soit l’absence des neurones

dopaminergiques de la substance noire et de l’aire tegmentale ventrale. Ces neurones sont

normalement impliqués dans la motricité volontaire, les fonctions cognitives et le

développement de comportements. Parmi les trois membres de la sous-famille NGFI-

B/NURR1/NOR-1 seul le gène codant pour le récepteur NOR-1 n’avait pas encore été

inactivé chez la souris. Le récepteur nucléaire orphelin NOR-1 dans le contexte des

chondrosarcomes myxoïdes extrasquellettiques constituait déjà le sujet des recherches

effectuées par l’équipe de Labelle Y. La création d’une souris NOR-1 -/- constituait donc

une avenue intéressante pour l’avancement des connaissance sur le récepteur nucléaire

orphelin et son rôle dans la tumorigénèse.

Dans un premier temps, mes travaux de recherche avaient pour objectif l’analyse du locus

NOR-1 chez la souris en vue de procéder à la construction du vecteur de recombinaison

homologue. L’analyse du patron d’expression ainsi que l’étude des différentes isoformes de

NOR-1 ont simultanément été entammées. Les résultats de ces expériences sont présentés

dans le premier article. Dans un deuxième temps, des recherches portants sur la protéine de

fusion EWS/NOR-1, exprimé dans les chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques, ont

été effectuées en parallèle avec la céation de la souris NOR-1. Le potentiel d’activation de

la transcription du domaine AF-2 de NOR-1 a été évalué dans le contexte de la protéine

chimérique EWS/NOR-1. Le deuxième article contient les résultats de ces travaux.

Finalement, mes études visait la création d’une souris déficiente pour le récepteur NOR-1.

Les étapes menant à l’inactivation du gène NOR-1 ainsi que les analyses préliminaires

réalisées sur la souris sont confinées dans la troisième section des résultats. Des lignées de

fibroblastes ont été établies à partir des embryons de souris NOR-1 et ont permis l’étude de

la fonction « d’immediate early gene » du récepteur. Les résultats de ces expérience sont

également contenus dans la troisième section.

4. Article 1 STRUCTURE AND EXPRESSION OF THE MOUSE GENE ENCODING THE ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR TEC

Annie Maltais and Yves Labelle

Unité de recherche en génétique humaine et moléculaire, Pavillon Saint-François d'Assise,

CHUQ, Québec (Qc) G1L 3L5 Canada, and Faculté de médecine de l'Université Laval,

Sainte-Foy (Qc) G1K 7P4 Canada

Correspondence: Yves Labelle, Unité de recherche en génétique humaine et moléculaire,

Pavillon Saint-François d'Assise, CHUQ, 10 rue de l'Espinay, Québec (Qc) G1L 3L5

Canada

phone: (418) 525-4402

fax: (418) 525-4195

email: [email protected]

Contributributions : Annie Maltais : Figures 1,2,3,4 et 6, Table 1

Yves Labelle : Texte, Figures 5 et 7

80

RÉSUMÉ

Le récepteur nucléaire orphelin TEC (Translocated in Extraskeletal Chondrosarcoma),

impliqué dans le contrôle de la prolifération cellulaire et de l’apoptose, est principalement

exprimé dans le système nerveux central chez les mammifères. Afin de mieux comprendre

la régulation de l’expression du gène TEC, nous avons procédé à la caractérisation du locus

génomique chez la souris et analysé le patron d’expression dans une variété de tissus. Le

gène qui s’étend sur environ 40 kilobases contient 8 exons dont les deux premiers sont non-

codants. La région promotrice ne contient pas de boîte TATA ou CCAAT, cependant des

sites de liaison pour les facteurs de transcription CREB (Cyclic AMP Responsive Element

Binding protein) et Sp1 sont présents. Deux types de transcrits générés par épissage

alternatif ont été caractérisés par RT-PCR : Le premier code pour le récepteur pleine

longueur de 627 acides aminés, le second pour une forme tronquée du récepteur constituée

de 429 acides aminés et dont l’extrémité carboxy-terminale est manquante. Des analyses

par buvardage Northern et RT-PCR montrent que les ARNs messagers codant pour les

deux isoformes sont exprimés dans tous les tissus examinés. Le niveau le plus élevé est

observé dans le cerveau. Le patron d’expression suggère que TEC puisse exercer une

fonction « housekeeping » dans la cellule en plus de son rôle dans la prolifération

cellulaire.

81

ABSTRACT

TEC (for Translocated in Extraskeletal Chondrosarcoma) is an orphan nuclear receptor

involved in the control of cell proliferation and apoptosis and is mainly expressed in the

mammalian central nervous system. In order to begin to understand the regulation of its

expression, we have characterized the mouse genomic locus encoding TEC and analyzed its

expression pattern in various tissues. The gene spans approximately 40 kilobases and

contains 8 exons, of which the first two are non-coding. The promoter region does not

contain any identifiable TATA box or CCAAT box elements, however several binding sites

for the transcription factors CREB (cyclic AMP Responsive Element Binding protein) and

Sp1 are present. Two types of transcripts generated by alternative splicing were

characterized by RT-PCR: one encodes the full-length receptor of 627 amino acids, the

other encodes a truncated receptor of 429 amino acids lacking the entire carboxyl-terminal

domain. Northern blots and RT-PCR analyses show that mRNAs encoding both isoforms

are expressed in all mouse tissues examined, with the highest levels being found in the

brain. This expression pattern suggests that TEC may perform some basic housekeeping

cellular function in addition to its role in cell proliferation.

INTRODUCTION

The nuclear receptor superfamily comprises a large number of receptors that regulate many

aspects of development and differentiation by controlling the expression of specific target

genes in response to various ligands. For many of these receptors, no ligands have yet been

identified and for this reason they are termed orphan (reviewed in Enmark and Gustafsson,

1996). TEC is a human orphan receptor which was originally discovered as the fusion

partner of the EWS gene in the recurrent t(9;22) chromosomal translocation found in

extraskeletal myxoid chondrosarcomas (Labelle et al., 1995; 1999; Clark et al., 1996, in the

latter TEC is named CHN). TEC was also cloned as MINOR, a mitogen-inducible gene

activated in human peripheral T cells stimulated with phytohemagglutinin (PHA) and

phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Hedvat and Irving, 1995). The rat homologue of

TEC, NOR-1, was first isolated from primary cultures of rat forebrain neurons undergoing

apoptosis (Ohkura et al., 1994), and it was subsequently shown to be also involved in T-cell

receptor (TCR)-mediated apoptosis (Cheng et al., 1997). Amino acid homology analyses

indicate that TEC is a member of a subfamily that includes two other closely related orphan

82

receptors, NGFI-B and NURR1. Having been cloned in various species by different groups,

each receptor has received more than one name: NGFI-B is also known as Nur77, N10,

NAK-1 and TR3, whereas NURR1 is also known as RNR-1, NOT, TINUR and HZF-3. As

is the case with TEC, both NGFI-B and NURR1 are involved in cell proliferation as

immediate-early gene products. NGFI-B is activated in the rat pheochromocytoma cell line

PC12 following treatment with nerve growth factor and membrane depolarization

(Milbrandt, 1988; Hazel et al., 1991). Transcription of the NGFI-B gene is rapidly activated

in mouse fibroblasts stimulated by addition of serum or purified growth factors (Hazel et

al., 1988), and similarly as TEC, NGFI-B is involved in TCR-mediated apoptosis

(Woronicz et al., 1994; Liu et al., 1994; Woronicz et al., 1995). NURR1 is not expressed in

quiescent rat liver cells but is rapidly and transiently induced following partial hepatectomy

(Scearce et al., 1993). In addition, NGFI-B and NURR1 appear involved in the control of

the hypothalamic/pituitary/adrenal axis at the neuroendocrine level, as they both regulate

the expression of the genes encoding corticotropin-releasing factor and

proopiomelanocortin (Murphy and Conneely, 1997). Furthermore, NGFI-B is involved in

the transcriptional activation of the gene encoding steroid 21-hydroxylase in the adrenal

gland (Wilson et al., 1993).

All three receptors of the NGFI-B subfamily bind as monomers a DNA-response element

called the NGFI-B response element (NBRE), which was initially characterized by a

genetic selection scheme in yeast (Wilson et al., 1991). The NBRE consists of a single

estrogen receptor element/thyroid receptor element half-site containing three additional

adenine-thymidine base pairs at its 5' end (Wilson et al., 1992). In addition to binding DNA

as monomers, both NGFI-B and NURR1, but not TEC, can form heterodimers with the

RXR receptor on direct repeat elements separated by 5 base pairs (Perlmann and Jansson,

1995; Zetterström et al., 1996a). These heterodimers are responsive to the RXR ligand 9-cis

retinoic acid, suggesting that NGFI-B and NURR1 may be involved in a pathway linking

growth factors to vitamin A signaling. Finally, it was recently shown that NGFI-B can form

homodimers on a novel response element consisting of a palindromic sequence found in the

promoter region of the proopiomelanocortin gene (Philips et al., 1997). Thus members of

the NGFI-B subfamily may present the intriguing capacity to bind DNA either as

83

monomers, heterodimers or homodimers depending on the cellular context in which they

are expressed.

In situ hybridization in the developing and adult rat and mouse show that TEC, NGFI-B

and NURR1 are predominantly expressed in the central nervous system, with both

overlapping and distinct expression patterns (Zetterström et al., 1996a). TEC and NURR1

are expressed in the developing embryo as well as in the adult animal, whereas NGFI-B is

mainly expressed in the adult. Knock-out mice lacking NURR1 exhibit a deficiency in

dopamine neurons of the substantia nigra and the ventral tegmental area (Zetterström et al.,

1997; Saucedo-Cardenas et al., 1998), a phenotype which is consistent with the expression

of NURR1 in these cells in the developing embryo. NGFI-B knock-out mice on the other

hand display no obvious phenotype, both at the level of TCR-mediated apoptosis (Lee et

al., 1995) and on the regulation of the adrenocortical function (Crawford et al., 1995), two

physiological systems in which previous data had suggested that NGFI-B played an

important role. This observation raises the possibility that another member of this

subfamily may compensate for the absence of NGFI-B in the deficient animals.

In order to begin to understand the regulation of the expression of the TEC receptor, we

have isolated and characterized the mouse genomic locus containing TEC and examined the

expression of the gene in various mouse tissues. Two different mRNAs generated by

alternative splicing encode two isoforms of the receptor: a full-length receptor and a

carboxyl-truncated receptor. As expected the highest expression levels of both mRNAs are

found in the brain, however we have also found that both mRNAs are expressed in all

tissues examined, suggesting a basic housekeeping function for the receptor in addition to

its role as an immediate-early gene product.

MATERIALS AND METHODS

Characterization of the mouse genomic locus containing TEC A fragment of 282 bp corresponding to the 5' end of the coding sequence of the mouse TEC

cDNA was amplified by RT-PCR from mouse brain total RNA using oligonucleotides

derived from the published rat cDNA sequence (Ohkura et al., 1994; forward oligo: 5'

atgccctgcgtgcaagcccaat 3', reverse oligo: 5' gcgaccctcttccatcttgat 3'). The fragment was

84

cloned in the pCRII vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and sequenced by the dideoxy

method using the Sequenase kit (United State Biochemical, Cleveland, Ohio, USA) to

confirm its identity. The purified fragment was first used as a probe on Southern blots

containing mouse genomic DNA digested with various restriction enzymes, and in each

case a single band was detected (data not shown), indicating a single locus for TEC in the

mouse genome. The probe was then used to screen filters containing a mouse ES cells

bacterial artificial chromosome (BAC) genomic DNA library (Genome Systems, Saint-

Louis, Missouri, USA). Two positive clones were identified, and pulse-field DNA gel

electrophoresis revealed that they contained approximately 90 and 140 kb of mouse

genomic DNA. The clones were analyzed by restriction enzyme digestions and subsequent

Southern blot hybridizations with oligonucleotides covering the coding sequence of the

cDNA. Seven fragments ranging from 6 to 14 kb were subcloned in pBluescript II

(Stratagene, La Jolla, CA, USA) and used to determine the exon/intron structure of the gene

by DNA sequencing (Fig. 1). The sizes of the introns were determined either by DNA

sequencing, PCR amplification or estimation based on the distance between restriction

enzyme sites.

RACE (rapid amplification of cDNAs ends) analyses were carried out to obtain the 5' non-

coding exons and to map the 5' end of the mature mRNA. Marathon-Ready cDNA prepared

from mouse brain poly A+ RNA was obtained from Clontech (Palo Alto, CA, USA). A

first amplification reaction was performed with the provided AP1 oligonucleotide and a

gene specific oligonucleotide 5' gcgtggcgtaagtggaccccg 3'. Amplification conditions were:

an initial denaturation step at 95˚C/5 min, 30 cycles of 95˚C/30 sec, 68˚C/30 sec and

72˚C/3 min, and a final elongation step at 72˚C/5 min. A nested PCR amplification was

then performed using the oligonucleotide AP2 provided and a second gene specific

oligonucleotide 5' ctgggcttgcacgcagggcat 3'. Amplification conditions were identical to

those described above except that the annealing temperature was set at 65˚C and 20

amplification cycles were performed. RACE products were analyzed on 2% agarose gels,

cloned in pBluescript II and sequenced.

The promoter region of TEC was sequenced using an automated ABI 373A sequencer and

analyzed using the transcription factor database Transfac (Heinemeyer et al, 1999) and the

85

TESS computer program (Transcription Element Search Software, URL:

http://www.cbil.upenn.edu/tess/index.html).

Northern blots and RT-PCR analyses

Multiple tissues Northern blots containing poly A+ RNA from various mouse tissues were

purchased from Clontech. The 5' probe is the fragment that was used for screening the BAC

library. The 3' probe is a fragment of 535 bp corresponding to the 3' end of the coding

sequence of the mouse TEC cDNA that was amplified by RT-PCR from mouse brain total

RNA using oligonucleotides derived from the published rat cDNA sequence (Ohkura et al.,

1994; forward oligo: 5' cgctgagcacgtgcagcagtt 3', reverse oligo: 5' gtcctccagcttcaggtagaa

3'). This last fragment was cloned and sequenced to confirm its identity. The actin control

probe was provided with the blots. For the RT-PCR analyses, total RNA was purified from

various mouse tissues using Trizol (Life Technologies, Burlington, ON, Canada), and the

reactions were performed using the RT-PCR kit from Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut,

USA). The reverse transcriptase reactions were performed with random hexamers

following the manufacturer's recommendations. The amplification conditions were identical

for both the long and short isoforms: an initial denaturation step of 95˚C/5 min, 35 cycles of

95˚C/30 sec, 55˚C/30 sec and 72˚C/2 min, and a final elongation step of 72˚C/10 min. The

forward oligo located in exon 3 was identical for both amplifications: 5'

gcctgccagcactacgga 3'. The reverse oligos were 5' gtctttaatggagtcgagcca 3' for the transcript

encoding the full-length receptor (located in exon 7) and 5' cacaatgccaggcacagtca 3' for the

transcript encoding the carboxyl-truncated receptor (located in the 3'-untranslated region of

exon 5a). The DNA fragments generated were 662 and 450 bp for transcripts encoding the

long and short isoforms respectively.

In vitro translation and band-shift assays The cDNAs corresponding to various receptor isoforms (Figure 7A) were cloned in the

expression vector pcDNA3.1+ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The vectors were used in

a coupled in vitro transcription/translation assay using the TNT kit (Promega, Madison, WI,

USA). Products translated in the presence of 35

S-methionine following the manufacturer's

recommendations were analyzed by SDS-PAGE on a 8% gel, and the gel was fixed, dried

86

and exposed to X-ray films. Products translated in the absence of labeled precursor were

used for band-shift experiments. Band-shift assays were performed with 2 µl of in vitro

translated proteins mixed with 0.65 ng of 32

P-end-labeled B1a oligonucleotide containing

the NBRE site (5'gagttttaaaaggtcatgctcaatttgg3', NBRE site underlined) in 10 mM Tris pH

8.0/40 mM KCl/ 0.05% NP-40/1 mM DTT/10 ng/µl poly dI:dC/6% glycerol. Competition

experiments were performed using the B1a oligonucleotide or a mutated mB1a version

(5'gagttttaagaggtcatgctcaatttgg3'). Binding reactions were carried out for 30 min on ice and

loaded onto 4% non-denaturing polyacrylamide gels. Migration conditions were 150V for

2h in 0.5X TBE buffer and the gels were fixed, dried and exposed to X-ray films.

Transfection of COS-1 cells Transfection of COS-1 cells were performed in 6-wells cell culture plates using the

Lipofectamine Plus Reagent (Life Technologies, Burlington, ON, Canada) following the

manufacturer's recommendations. Each transfection contained 25 ng of expression vector,

400 ng of a reporter vector containing eight copies of the NBRE placed upstream of an

inactive basal prolactin promoter-luciferase gene construct (p(B1a)8-Luc, Wilson et al.,

1991), and 200 ng of a normalizing vector containing a CMV promoter-ß-galactosidase

gene construct (pCMV-Gal). Cell extracts were prepared 72h after transfection and

enzymatic activities measured using a Luciferase Assay System (Promega), a Luminescent

ß-galactosidase Detection Kit (Clontech) and a Berthold MiniLumat LB 9506

Luminometer. Luciferase relative light units were normalized with ß-galactosidase

activities to correct for transfection efficiencies.

RESULTS

Structural organization of the mouse TEC gene Figure 1 illustrates the genomic locus containing TEC. The gene spans approximately 40

kb and is divided into 8 exons, of which the first two correspond to the 5'-untranslated

sequence of the mature mRNA. Exon 3 is the largest coding exon, containing 956 bp and

encoding the entire amino-terminal domain of the receptor, as well as the first zinc-finger

module of the DNA-binding domain. Table 1 illustrates the position of the introns in

relation to the coding sequence of the receptor (see Fig. 6 for the relation between the

87

amino acid sequence and the various domains of the receptor). Exon 4 is the smallest

coding exon, containing 130 bp and encoding the second zinc-finger module of the DNA-

binding domain. The next exon encodes the carboxyl-terminal extension (CTE) of the

DNA-binding domain, containing the amino acid region corresponding to the A box which

is unique to receptors of the NGFI-B subfamily. The A box is involved in the recognition of

the adenine-thymidine residues located at the 5' end of the NBRE element (Wilson et al.,

1992). Exon 6 encodes a perfect leucine zipper motif, which is also found in other members

of the NGFI-B subfamily.

A carboxyl-truncated receptor isoform generated by alternative splicing of the human TEC

primary transcript has been characterized by cDNA and genomic sequence analysis

(Labelle et al., 1995; Hedvat and Irving, 1995; Clark et al., 1996; Ohkura et al., 1996;

Ohkura et al., 1998). RT-PCR analyses have shown that a similar alternatively spliced

transcript is detectable in mouse tissues (see below). This transcript differs from the

transcript encoding the full-length receptor by lacking exons 6, 7 and 8 and by using a stop

codon located in exon 5a (see Fig. 1 and Table 1). The full-length TEC receptor contains

627 amino acids and is encoded by exons 3 to 8, whereas the carboxyl-truncated receptor,

designated TEC∆C, contains 429 amino acids and is encoded by exons 3, 4 and 5a (Fig. 2).

TEC∆C therefore lacks the leucine zipper motif present in exon 6. In addition, exon 5a

contains a short carboxyl-terminal amino acid sequence that is not found in the full-length

receptor. This sequence is 10 amino acids long in the mouse and rat receptors and 25 amino

acids long in the human receptor (Fig. 2, the rat sequence is from Petropoulos et al., 1995,

and the human sequence is from Labelle et al., 1995).

Structural features of the 5'-flanking region The 5' end of the mature TEC mRNA was obtained by RACE using a Marathon-Ready

cDNA sample prepared from mouse brain poly A+ RNA. The products of a nested

amplification reaction were analyzed by agarose gel electrophoresis (Fig. 3A). A series of

bands were obtained, purified from the gel, cloned and sequenced. The 5' ends of five

independent clones corresponding to the longest band (see arrow in Fig. 3A) mapped to two

G residues whose positions are indicated in Figure 3B. The 5' ends of other clones

corresponding to the smaller bands on the agarose gel mapped downstream of these G

88

residues, suggesting that there is not a single transcription initiation site but rather a

transcription initiation region. The DNA sequence upstream these G residues was analyzed

for the presence of specific transcription factor DNA-response elements. No TATA box

element was found, however three putative sites for the CREB (Cyclic AMP Responsive

Element Binding) protein, two for Sp1 and one for C/EBPalpha (CC-AAT/Enhancer

Binding Protein) were identified (Fig. 3B).

Expression pattern of TEC

Two Multiple Tissue Northern blots containing approximately 2 µg of poly A+ RNA from

the indicated tissues or developmental stages were hybridized with the 282 bp probe

described above corresponding to the 5' end of the coding sequence of TEC (Fig. 4, 5' end

probe). Two major transcripts were detected at approximately 5.9 and 4.8 kb in all adult

tissues analyzed. The strongest signals are seen in the testis, skeletal muscle, lung, brain

and heart, while lower levels are detected in the kidney, liver and spleen. In addition, there

is a strong signal at approximately 2.5 kb seen only in the testis. In the developing embryo,

only the 5.9 kb transcript is detectable, and its expression appears relatively constant

between days 7 and 17 of gestation.

The same blots were stripped and rehybridized with a probe of 535 bp corresponding to the

3' end of the coding sequence of TEC (Fig. 4, 3' end probe). The results were essentially

identical to those obtained with the 5' end probe. This indicates that both the 5.9 and 4.8 kb

transcripts contain the entire coding sequence of the full-length receptor. We therefore

conclude that the difference in length between the two transcripts is due to sequences

located at the 5' and/or 3' untranslated ends. We rehybridized the same blots with a probe

corresponding to the 3' untranslated end of exon 5a (Fig. 1), in order to detect the putative

transcript ending in exon 5a, however no signals were observed (data not shown).

Reasoning that either this transcript was absent in the mouse tissues analyzed or expressed

at too low levels to be detected by Northern blots, we performed RT-PCR experiments with

oligonucleotides for the amplification reactions located in the DNA-binding domain and the

3' untranslated end of exon 5a using total RNA extracted from various mouse tissues. As a

control we used the same amplification conditions to amplify a fragment corresponding to

89

the transcript encoding the full-length receptor. Figure 5A shows that the transcript

encoding the full-length receptor can easily be detected by ethidium bromide staining in an

agarose gel in all tissues examined. Figure 5B shows that the transcript encoding the

truncated receptor is detectable by ethidium bromide staining in an agarose gel in some

tissues only. Southern blot analysis of the PCR products using an internal oligonucleotide

shows however that this last transcript is indeed present in all tissues examined (Fig. 5C).

Thus the transcript encoding the truncated receptor appears much less abundant than the

one encoding the full-length receptor. In addition, the alternative splicing event does not

appear to be differentially regulated in the various tissues, since the relative amounts of

both transcripts appear equivalent in the different tissues (compare Fig. 5A versus 5B and

5C).

Homology analyses of the NGFI-B subfamily Figure 6 shows a computer-generated alignment of the amino acid sequences of the mouse,

rat and human TEC receptors as well as the mouse NURR1 and rat NGFI-B receptors. The

homology in the DNA-binding domain is very close to 100% between TEC, NURR1 and

NGFI-B, suggesting that they may regulate the expression of the same set of target genes.

The P- and D-boxes within the DNA-binding domain, which have been shown to be crucial

for DNA sequence recognition and dimerization respectively in the steroid receptors

subfamily (Danielsen et al., 1989; Mader et al., 1989; Umesono and Evans, 1989), are also

present in the NGFI-B subfamily. The A-box, located in the CTE of the DNA-binding

domain and essential for the recognition of the two adenine-thymidine base pairs at the 5'

end of the NBRE (Wilson et al., 1992), is specific to the NGFI-B subfamily. Following the

CTE is a perfect leucine-zipper motif, which mediates dimer formation. In the amino-

terminal domain, TEC possesses a stretch of histidine residues that is not found in NURR1

and NGFI-B. Considering the overall homology between the three receptors, this histidine

stretch is quite intriguing, and may point to a functional feature of TEC that is absent in

NURR1 and NGFI-B. A BLAST search of protein data banks with this histidine stretch

followed by the three glutamine residues shows that several other transcription factors

possess the same motif, such as the homeobox proteins MOX-2 (Gorski et al., 1993), GAX

(LePage et al., 1994) and HNF-6 (Lannoy et al., 1998).

90

DNA-binding and transactivation potential of the TEC isoforms In the course of our studies concerning the DNA-binding and transcriptional activation

potential of various TEC isoforms, we have previously observed that the 25 amino acids

present at the carboxyl-terminal end of the human truncated isoform (see Fig. 2) exert a

repressive effect on the binding of this isoform to the NBRE (Labelle et al., 1999). Having

characterized the corresponding mouse amino acid sequence, we wished to determine if this

mouse sequence also exerted a negative effect on NBRE-binding. Figure 7A shows the

various in vitro-translated proteins that were used for this experiment. Figure 7B shows that

the human TEC receptor (hTEC) binds efficiently the NBRE in the band-shift assay,

whereas the truncated isoform hTEC∆C binds very weakly the same element. Deleting the

last 29 amino acids of hTEC∆C restores the DNA-binding capacity (see hTEC∆C(-29)),

and adding the 10 amino acids of the mouse sequence to this last construct does not prevent

its binding to the NBRE (see hTEC∆C(m)). We conclude from this result that the

inefficient binding of hTEC∆C to the NBRE does not represent a general feature of the

truncated isoforms.

The transcriptional activation potential of each isoform was tested by co-transfection of

COS-1 cells with expression vectors encoding the isoforms and a luciferase reporter vector.

The full-length receptor hTEC activates transcription of the reporter gene approximately 20

fold when compared to the empty expression vector (Fig. 7C). The hTEC∆C isoform does

not significantly activate transcription, which correlates with its inefficient NBRE-binding.

The other two isoforms however, hTEC∆C(-29) and hTEC∆C(m), which bind the NBRE as

efficiently as hTEC, only slightly activate transcription, approximately 2.7 and 4.0 fold

respectively. From these results we conclude that the transcriptional activation potential of

hTEC is mostly attributable to sequences located at its carboxyl-terminal domain.

DISCUSSION In this report we have presented the genomic structure of the mouse TEC gene and

analyzed its expression in various mouse tissues. TEC is an orphan nuclear receptor highly

homologous to two other nuclear receptors, NGFI-B and NURR1. The genomic structures

of the mouse NURR1 and rat NGFI-B genes have been published (Watson and Milbrandt,

1989; Castillo et al., 1997; Saucedo-Cardenas et al., 1997), and as could be expected from

91

the high degree of homology between the three proteins, their gene structures are also

highly similar. Like TEC, NURR1 contains 8 exons, the first two being non-coding. NGFI-

B on the other hand contains 7 exons, of which only the first is non-coding. In addition, the

position of the splice sites in the coding sequences of the three genes are identical, strongly

suggesting that all three genes originate from a single common ancestral gene. DNA

sequence analysis of the promoter region of TEC indicate the presence of several putative

binding sites for the transcription factors CREB (Cyclic AMP Responsive Element Binding

protein, Hoeffler et al, 1988) and Sp1 (Dynan and Tjian, 1983), whereas one site was found

for the transcription factor C/EBPalpha (CC-AAT/Enhancer Binding Protein, Lucero et al,

1989). The NURR1 promoter also contains putative sites for CREB and Sp1, however in

addition it contains a CArG box (Castillo et al, 1997), which is absent in TEC. The CArG

box is involved in the transcriptional response to serum factors (Treisman, 1986), and its

presence in NURR1 and absence in TEC may indicate that the transcription of these

receptor genes are not regulated by the same signaling pathways. Notably the NGFI-B

promoter also does not contain an identifiable CArG box (Watson and Milbrandt, 1986).

An alternative splice site in the NURR1 gene has been recently characterized which

generates a truncated isoform of the receptor, termed NURR2, that lacks the carboxyl-

terminal domain of the full-length receptor (Castillo et al., 1997; Ohkura et al., 1999). This

situation is similar to what we have found for TEC, however there is one difference

between the two situations: TEC∆C does not possess the leucine zipper motif that is present

in exon 6 of the full-length receptor, whereas NURR2 still possess this domain, because in

this case the termination codon is located after exon 6. Assuming that this leucine zipper

motif does indeed have a functional role, this difference between TEC∆C and NURR2 is

intriguing. One possible explanation is that there may be more then two isoforms for each

receptor arising by alternative splicing mechanisms, and conceivably not all of these

isoforms have been identified yet.

The role of TEC∆C and NURR2 is not known, however by analogy with other members of

the nuclear receptor superfamily they may act as negative regulators of the full-length

receptors. Supporting this idea, we have shown that although TEC∆C(m) binds the NBRE,

it does not activate transcription of a NBRE-containing promoter. Similar results were

92

obtained with NURR2 (Ohkura et al., 1999). Interestingly, these results also indicate that

the sequences responsible for the transactivation properties of the full-length isoforms of

TEC and NURR1 in co-transfection experiments are located in their carboxyl-terminal

domain.

The expression pattern of TEC, NURR1 and NGFI-B has been examined in a number of

studies to date. Initially these receptors were though to be expressed mainly in the

mammalian central nervous system (CNS). In situ hybridization experiments indicated that

both NURR1 and TEC are expressed early in the CNS of the developing rat embryo, while

NGFI-B is mostly expressed later, in the adult rat CNS (Zetterström et al., 1996a; 1996b;

Xiao et al., 1996). Subsequently quantitative RT-PCR analyses have shown that both

NGFI-B and NURR1 are expressed in a wide variety of tissues in the adult rat, with the

highest levels being found in the pituitary gland (Bandoh et al., 1997). Our analyses of the

expression of TEC in the mouse indicate that this receptor is also widely expressed.

Northern blot analyses show the presence of transcripts encoding the full-length receptor in

all tissues analyzed, although the levels vary widely between the different tissues. Taken

altogether, these results suggest that the three receptors of this subfamily may be

ubiquitously expressed in all tissues and cells. The question then becomes what

"housekeeping" function might these receptors fulfill, and whether or not this function is

related to their role as immediate-early gene products involved in the control of cell

proliferation.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank J. Milbrandt for the p(B1a)8-Luc vector and E.W. Khandjian for critical reading

of the manuscript. This work was supported by a grant from the Natural Sciences and

Engineering Research Council of Canada to Y.L. (OGP0183693). Y.L. is supported by a

junior scientist fellowship from the Fonds de la recherche en santé du Québec.

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97

FIG. 1. Schematic drawing of the genomic locus containing TEC. Each exon is numbered and indicated by a box under the upper line representing the locus. Empty boxes correspond to non-coding sequences, while filled boxes correspond to amino acid coding sequences. The initiating methionine, as well as the two stop codons characterized, are indicated. Restriction enzyme sites are shown over the top line: B: BamHI; E: EcoRI; H: HindIII. The seven fragments that were subcloned in a plasmid vector are shown below the genomic locus.

98

Table 1. Exon/intron organization of the mouse TEC gene. Exon sequences are shown in uppercase letters while intron sequences are shown in lowercase letters. The conserved gt and ag dinucleotide sequences located at the 5' splice donor and 3' splice acceptor sites respectively are underlined, as well as the initiating methionine in exon 3 and the two stop codons in exons 5a and 8.

99

FIG. 2. Schematic drawing illustrating the full-length TEC and carboxyl-truncated TEC∆C isoforms. The activation domain (AD), DNA-binding domain (DBD), and ligand-binding domain (LBD) are shown. Numbers above each isoform correspond to the encoding exons of the genomic locus, and the first and last amino acid is indicated. Below TEC∆C is a comparison of the additional amino acid sequences that are found at the carboxyl-terminal end of the mouse, rat and human truncated isoforms. The GenBank accession numbers for the cDNA coding sequences of the mouse TEC and TEC∆C isoforms are AF191211 and AF191212 respectively.

100

FIG. 3. A. Agarose gel analysis of a nested RACE experiment using mouse brain poly A+ RNA. R: RACE products, M: øX174/HaeIII DNA marker. The arrow points to the longest band obtained in the RACE products. B. 5'-flanking sequence analysis of the TEC gene. The two G residues corresponding to the 5' ends of 5 clones originating from the band shown in A are indicated. The flanking region contains putative DNA-response elements for the CREB protein, C/EBPalpha and Sp1. The GenBank accession number for the TEC promoter sequence is AF191213.

101

FIG. 4. Northern blot analyses of TEC. Multiple Tissue Blots obtained from Clontech and containing approximately 2 µg of poly A+ RNA from the indicated tissues were hybridized sequentially with probes corresponding to the 5' end or 3' end of the coding sequence of TEC (5' probe and 3' probe respectively), and to a control actin probe provided with the blots (actin). Membranes were exposed to autoradiographic films at -80˚C with intensifying screens.

102

FIG. 5. RT-PCR analyses of TEC and TEC∆C isoforms in various mouse tissues. A. Amplification of a fragment corresponding to the 3' end of the transcript encoding the full-length TEC isoform. Lane 1: øX174/HaeIII DNA marker, lanes 2 to 8: RT-PCR reactions using total RNA isolated from heart, lung, skeletal muscle, brain, testis, kidney and spleen, lane 9: no RNA input. B. Amplification of a fragment corresponding to the 3' end of the transcript encoding the carboxyl-truncated TEC∆C isoform. Lanes are as indicated above. C. Southern blot analysis of the RT-PCR products shown in B. Products were transferred onto a nylon membrane, hybridized with an internal oligonucleotide and the membrane exposed to an autoradiographic film at room temperature. Lanes are as indicated above.

103

FIG. 6. Homology analysis of the mouse, rat and human amino acid sequences of TEC, as well as the mouse NURR1 and rat NGFI-B amino acid sequences. The alignment was performed with the ClustalW algorithm and the BOXSHADE program. The various domains indicated are as follows: Histidine stretch, DNA-BD: DNA-binding domain, P: P box, D: D box, A: A box, Leucine-zipper.

104

105

FIG. 7. In vitro translation, band-shift assay and transcriptional activation of the various TEC isoforms. A. In vitro coupled transcription/translation reactions of hTEC, hTEC∆C, hTEC∆C(-29) and hTEC∆C(m) isoforms. 35S-methionine-labeled proteins were separated on a 8% polyacrylamide gel, the gel was fixed, dried and exposed to an autoradiographic film. Apparent molecular weight markers are shown at the left of the panel. B. Band-shift assays with in vitro translated proteins in absence of labeled precursor. Translated proteins were incubated with the 32P-labeled B1a oligonucleotide containing the NBRE, and the reaction was loaded onto a 4% non-denaturing polyacrylamide gel. The gel was fixed, dried and exposed to an autoradiographic film. -: no competitor added, B1a: competition with a 20 fold excess of cold B1a oligonucleotide, mB1a: competition with a 20 fold excess of cold mB1a oligonucleotide. C. Transcriptional activation of the various TEC isoforms in COS-1 cells. Expression vectors encoding the indicated proteins were transfected in COS-1 cells along with a luciferase reporter vector and a ß-galactosidase normalizing vector. Each transfection was performed six independent times and the mean value was plotted along with the standard deviation (vertical bars).

5. Article 2 THE AF2 DOMAIN OF THE ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR TEC IS ESSENTIAL FOR THE TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF THE ONCOGENIC FUSION PROTEIN EWS/TEC

Annie Maltais, Christine Filion, Yves Labelle*

Unité de recherche en génétique humaine et moléculaire, Pavillon Saint-François

d'Assise, CHUQ, Québec (Qc) G1L 3L5 Canada; and Faculté de médecine de

l'Université Laval, Sainte-Foy (Qc) G1K 7P4 Canada

Corresponding author: Centre de recherche, Pavillon Saint-François d'Assise, 10 rue

de l'Espinay, Québec (Qc) G1L 3L5 Canada. Phone: (418) 525-4444, fax: (418) 525-

4195, e-mail: [email protected]

Contributions : Annie Maltais : Figure 3, Christine Filion : Figures 2, et 4

Maxime Tremblay : Figure 1, Yves Labelle : Texte, Figure 1 et 5.

107

RÉSUMÉ

La protéine de fusion EWS/TEC, codée par un translocation chromosomique t(9 :22) dans

des tumeurs humaines de type chondrosarcome myxoide extrasquelettique, participerait au

processus tumoral, en partie par une dérégulation de l’expression de gènes cibles impliqués

dans le contrôl de la prolifération cellulaire. Nous avons montré dans ces travaux que le

domaine AF2 de TEC est essentiel à l’activité transcriptionnelle de la protéine de fusion

EWS/TEC. Une délétion des 15 derniers acides aminés de la protéine de fusion, constituée

de 949 acides aminés, produit une perte de l’activité transcriptionnelle de 70% dans des

lignées de chondrocytes humains transfectés. Des analyses par mutations ponctuelles

indiquent que les acides aminés I939, D940 et F943, situés dans le domaine AF2, jouent un

rôle crucial dans l’activité de EWS/TEC. Des résultats comparables sont obtenus avec le

récepteur nucléaire TEC natif. Ces résultats suggèrent que EWS/TEC interagisse, du moins

en partie, avec les mêmes co-activateurs transcriptionnels que le récepteur TEC natif, et que

ces co-activateurs puissent être impliqués dans le processus menant au développement de

chondrosarcomes chez l’humain.

108

ABSTRACT The EWS/TEC fusion protein encoded by the t(9:22) chromosomal translocation in human

extraskeletal myxoid chondrosarcoma tumors is thought to participate in the tumoral

process at least in part by deregulating the expression of specific target genes involved in

the control of cell proliferation. In this work we show that the AF2 domain of TEC is

essential for the transcriptional activity of the EWS/TEC fusion protein. Significantly,

deleting only the last 15 amino acids of the fusion protein, which contains 949 amino acids

in its full form, results in a loss of over 70% of its transcriptional activity in transfected

human chondrocyte cell lines. Point mutation analyses indicate that within the AF2 domain,

amino acid residues I939, D940 and F943 all play a crucial role in the activity of

EWS/TEC. Comparable results were obtained with the native TEC receptor. These results

suggest that EWS/TEC interacts at least in part with the same transcriptional co-activators

as the native TEC receptor, and that these co-ativators may be involved in the tumoral

process leading to human chondrosarcoma tumors.

1. INTRODUCTION

Human chondrosarcoma tumors represent approximately 10% of all primary malignant

bone tumors, being the second most common bone tumor after osteosarcomas (reviewed in

[1]). One subtype of chondrosarcoma, called extraskeletal myxoid chondrosarcoma (EMC),

was fisrt described as a rare soft tissue tumor occurring primarely in the musculature [2].

Although EMC is a slow-growing tumor of relatively low-grade malignancy, it is

nonetheless capable of recurrence and metastasis [3]. The molecular mechanisms leading to

the formation of EMC are unknown, however three recurrent chromosomal translocations

generating chimeric gene fusions have been described in these tumors: t(9;22), fusing the

TEC gene to the EWS gene [4, 5]; t(9;17), fusing TEC to TAF2N [6, 7, 8]; and t(9;15),

fusing TEC to TCF12 [9]. It is presumed that these gene fusions encode chimeric proteins

which are required for the tumoral process to occur. The structure of these chimeric fusion

proteins is similar in all three cases: the amino terminal portions of either EWS, TAF2N or

TCF12 is fused to the complete amino acid sequence of TEC. The precise role of these

fusion proteins in the tumoral process is unknown, however the observation that EWS/TEC

109

is approximately 270-fold more active as a transcriptional activator than the native TEC

protein [10] suggests that this fusion protein may act at least in part by activating the

transcription of specific target genes required for the oncogenic process.

TEC, which stands for Translocated in Extraskeletal Chondrosarcoma [4], is also called

MINOR [11], CHN [5] and NOR-1 [12], and has been designated NR4A3 in the nuclear

receptor nomenclature system [13]. This orphan receptor was originally discovered in

primary cultures of rat forebrain neurons undergoing apoptosis [12], and appears to play a

role in cell proliferation as an immediate-early gene product as it is induced in T cells

activated by phytohemagglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate [11], as well as in the

regenerating liver following partial hepatectomy [14]. TEC is also induced in MCF-12 cells

undergoing apoptosis [15], and its constitutive expression in thymocytes leads to massive

cell death [16]. Within the nuclear receptor superfamily, TEC is most homologous to two

other orphan receptors, NGFI-B and NURR1, with which it forms a specific subfamily.

TEC and EWS/TEC can both bind as monomers a DNA-response element called the NBRE

(NGFI-B Response Element, [10]). This element consists of a AGGTCA half-site with an

extension of two adenine/thymidine base pairs at its 5' extremity that is recognized by a

domain called the A box lying outside the zinc fingers DNA-binding domain of TEC. Both

TEC and EWS/TEC can also activate transcription constitutively when bound to the NBRE

in the context of a minimal promoter [10]. As mentionned above, the addition of the amino

terminal portion of EWS to TEC greatly increases the transcriptional activity of TEC. In

order to determine if the presence of the EWS portion alone of the fusion protein is

sufficient for this activation to occur or if some specific domains of TEC are also involved,

the contribution of the activation function-2 (AF2) domain of TEC was assessed. The AF2

domain is conserved throughout the nuclear receptor superfamily and although its

importance in ligand-dependent transcriptional activation has been clearly documented [17,

18, 19], its precise role in orphan receptors possibly activating transcription in the absence

of ligand is less well understood. This report presents evidence that the integrity of the AF2

domain of TEC is essential for the transcriptional activity of the EWS/TEC fusion protein.

2. MATERIALS AND METHODS

110

2.1. Plasmids and constructions

The full-length TEC and EWS/TEC cDNAs [10] were cloned in the pcDNA3.1+

mammalian expression vector (Invitrogen). The AF2 domain was deleted from TEC by

PCR using an oligonucleotide introducing a stop codon following amino acid S611 (Fig.

1A). This TEC∆AF2 mutant receptor therefore lacks the last 15 amino acids of the native

full-length receptor. Individual amino acid substitution mutants were constructed using the

Gene Editor in vitro Site-Directed Mutagenesis System from Promega (Fig. 1B). The AF2

deletion as well as the individual amino acid substitution mutants were transferred to the

EWS/TEC cDNA by restriction enzyme cloning. All constructs were sequenced for

confirmation.

2.2. Cell lines and transfections

NIH 3T3 cells were maintained in DMEM medium containing 10% calf serum, COS-1

cells in DMEM containing 10% FBS and TC28 and C20 cells in DMEM/F12 (1:1)

containing 10% FBS. Cells were transfected using the Lipofectamine Reagent (Canadian

Life Technologies) in triplicate in 24-well plates with 100 ng of the indicated pcDNA

expression vector, 100 ng of a p(B1a)8-luciferase reporter vector containing 8 copies of the

NBRE and 200 ng of a pCMV-galactosidase normalizing vector. The DNA:lipofectamine

complexes were added to the cells in medium without serum, and after three hours

complete medium was added. Cell extracts were prepared 48 hours afterwards and

luciferase and galactosidase activities were assayed using a Luciferase Assay System

(Promega), a Luminescent beta-galactosidase Detection Kit (Clontech) and a Berthold

MiniLumat LB 9506 Luminometer.

2.3. Band-shift assays

Proteins corresponding to the various mutant forms of TEC or to the native receptor were

synthesized in vitro using the TNT T7 RNA Polymerase Coupled Reticulocyte Lysate

System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Band-shift assays were

performed in 20 µl of 10 mM Tris pH 8.0/40 mM KCl/0.05% NP-40/1 mM DTT/10 ng/µl

poly dI:dC/6% glycerol. The oligonucleotide B1a containing the NBRE (underlined: 5'-

gagttttaaaaggtcatgctaatttgg-3') was 32P-end labeled with the T4 polynucleotide kinase (New

111

England Biolabs) and added to each binding reaction. An oligonucleotide containing a

mutant NBRE site was used for competition experiments (mB1a: 5'-gagttttaagaggtcatgctca-

3'). Binding reactions were carried out for 30 minutes on ice and loaded onto 4% non-

denaturing polyacrylamide gels. Migration conditions were 150 V for 2 hours in 0.5X TBE

buffer, and the gels were subsequently fixed, dried and exposed to X-ray films.

3. RESULTS

Figure 1A shows a comparaison of the AF2 core domains of various receptors including the

TEC/NGFI-B/NURR1 subfamily. The four conserved hydrophobic residues (outlined)

present in the steroid, retinoic acid and vitamin D receptors are also found in the TEC

subfamily. However the conserved negatively charged glutamic acid residue (underlined)

present in the former receptors is absent in the TEC subfamily, being replaced by a basic

lysine residue. In order to determine if the AF2 domain of TEC is implicated in the

constitutive transcriptional activity of EWS/TEC, a deletion mutant lacking only the last 15

amino acids of the fusion protein was constructed and tested in transient transfection assays

along with the full-length EWS/TEC. Figure 2 shows that deletion of the AF2 domain

significantly reduced the transcriptional activity of EWS/TEC in two immortalized human

chondrocyte cell lines, TC28 and C20. In TC28 cells, the activity of EWS/TEC∆AF2 is

reduced to approximately 30% of EWS/TEC, whereas in C20 cells it goes down to 15%.

These results are quite significant considering that EWS/TEC contains 949 amino acids and

EWS/TEC∆AF2 lacks only the last 15 of these amino acids. The TC28 and C20 cell lines

were created by transfection of primary cultures of human costal cartilage cells with the

large T antigen of SV40 and subsequent selection by suspension culture above agarose

[20]. Both cell lines show typical chondrocyte morphology, express chondrocyte-specific

mRNAs and display cartilage-specific modulation upon treatment with IL-1ß [20]. As

EWS/TEC is involved in human chondrosarcoma tumors, we felt that these chondrocyte

cell lines were more likely to reflect the in vivo activity of the fusion protein than other

available cell lines.

In order to identify in the AF2 domain the amino acids involved in the transcriptional

activity of EWS/TEC, each of the eight residues was individually mutated to a nonpolar

hydrophobic alanine residue (Fig. 1B). The mutant fusion proteins were tested as described

112

previously for their ability to activate transcription of the reporter gene in the chondrocyte

cell lines. Figure 3 shows that in both cell types, mutation of the D940 residue has the

greatest negative impact on the activity of EWS/TEC, reducing it to levels even lower than

those observed for the EWS/TEC∆AF2 mutant. The F943A and I939A mutations show the

second and third greatest negative impacts on the activity of EWS/TEC respectively, again

in both cell types. Therefore the negative effects of these three mutations are remarkably

similar in the two chondrocyte cell lines. In contrast, mutation of the lysine residue specific

to the TEC/NGFI-B/NURR1 subfamily does not significantly affect the activity of the

fusion protein in either cell lines. These results indicate that the integrity of the AF2

domain of TEC is required for the transcriptional activity of EWS/TEC.

To determine if the AF2 domain is also required for the activity of the native TEC receptor,

similar experiments were performed with the mutant TEC receptors. Figure 4 shows that

deletion of the AF2 domain of TEC leads to a significant reduction of the transactivation

potential of the receptor in the TC28 chondrocyte cell line as well as in COS-1 and NIH

3T3 cells. Furthermore, the individual amino acid TEC mutants show a transactivation

pattern that is remarkably similar to that observed with EWS/TEC: the D617A, F620A and

I616A TEC mutants (corresponding to the D940A, F943A and I939A EWS/TEC mutants

respectively) all significantly reduce the transactivation potential of the native TEC

receptor in the same relative proportions, whereas the K618A TEC mutant (corresponding

to the K941A EWS/TEC mutant) has no significant effect on transactivation. These results

strongly suggest that the AF2 domain of TEC plays the same role in the native receptor as it

does in the EWS/TEC fusion protein.

To confirm that the observed differences in transcriptional activities are not the result of

differential binding capacities of the TEC mutant receptors to the NBRE element, band-

shift assays were performed with in vitro translated proteins and a labeled oligonucleotide

containing the NBRE sequence. Figure 5 shows that the full-length receptor efficiently

binds the NBRE (lane 1), as well as the TEC∆AF2 deletion mutant (lane 4) and the single

amino acid mutants from S614A to I621A (lanes 5 to 12 respectively). Lanes 2 and 3 are

control competition reactions with an excess of cold oligonucleotides containing a wild-

type or mutant NBRE sequence respectively.

113

4. DISCUSSION

The results presented in this study show clearly two points: first, the AF2 domain of the

orphan nuclear receptor TEC is required for the capacity of EWS/TEC and TEC to activate

transcription from a minimal promoter containing the NBRE element. Second, the

mechanism by which this domain intervenes in transcriptional activation appears similar for

both EWS/TEC and TEC. This can be inferred from the fact that single amino acid

substitution mutants show a similarly altered pattern of activation in both proteins. This

altered pattern of activation indicate that amino acids D617, F620 and I616 of TEC are

required for the ability of the proteins to efficiently activate transcription.

The AF2 domain was originally identified as a conserved C-terminal sequence essential for

the biological activity of the thyroid hormone receptor [21, 22]. Subsequently it was found

to be a general transactivation domain required for all nuclear receptors which are

transcriptionally activated upon ligand binding. Crystal structure analyses of the ligand-

binding domains of various receptors both in the presence and absence of agonists [23, 24,

25, 26] have shown that in the unliganded receptors the AF2 domain adopts an amphipathic

alpha helical structure that extends away from the ligand-binding domain. Upon ligand

binding, the AF2 alpha helix folds back towards the ligand-binding domain, thus creating a

ligand-binding hydrophobic pocket and effectively trapping the ligand inside the receptor.

More recently, biochemical studies have shown that the AF2 domain is also involved in the

binding of transcriptional co-activators such as the p160 or SRC (steroid receptor

coactivator) protein family [27, 28], the TRAP/DRIP complexes [29, 30] and the p300/CBP

proteins [31, 32]. These results cast some light as to the role of the AF2 domain in ligand-

activated receptors. What about orphan receptors such as TEC and the associated oncogenic

fusion protein EWS/TEC ? Several possibilities exist. First, TEC may actually have a

specific intracellular ligand required for its transcriptional activity. In this case the AF2

domain could act in a manner similar as that described above, and our results suggest that

EWS/TEC would also be activated by this ligand. Alternatively, TEC and EWS/TEC may

be transcriptionally activated by post-translational modifications such as phosphorylation.

Recently the phosphorylation of a single serine residue at position 203 of the SF-1 receptor

has been shown to mediate the binding of general nuclear receptor cofactors required for

114

transcription [33]. Similarly, phosphorylation of the ER beta receptor leads to recruitment

of SRC-1 and subsequent transcriptional activation [34]. Therefore phosphorylation or

some other form of post-translational modification may play a role in the activities of TEC

and EWS/TEC. Finally, both proteins may constitutively interact with general transcription

factors and activate transcription under all circumstances in a "housekeeping" fashion. This

possibility however is not supported by the fact that as mentionned in the introduction, TEC

is an immediate-early gene product, which suggests that in some circumstances at least its

expression is somehow modulated in response to changes in the cellular environment.

To conclude, our results indicate that the AF2 domain of TEC is required for the efficient

transcriptional activity of both TEC and the oncogenic EWS/TEC fusion protein. This

suggests that EWS/TEC interacts at least in part with the same transcriptional co-activators

as the native TEC receptor, and that therefore these co-ativators may be involved in EMC

tumors. Identification of these co-activators is one approach towards elucidating the

molecular mechanisms leading to the development of human chondrosarcoma tumors.

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank Drs. J. Milbrandt for the p(B1a)8-luciferase reporter vector and E. W. Khandjian

for help with Figure 5. This work was supported by grants from the Natural Sciences and

Engineering Research Council of Canada (no. 183693) and the Canadian Institutes for

Health Research (no. 44028) to Y. L. A. M. was supported by a fellowship from La

Fondation de l'Université Laval and Y. L. is a scholar of Le Fonds de la Recherche en Santé

du Québec.

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118

Fig. 1. (A) Sequence alignment of the AF2 domains of various nuclear receptors representing different subfamilies within the superfamily (ER, RAR, RXR and VDR) as well as the three members of the TEC subfamily (NGFI-B, NURR1 and TEC). Outlined residues represent conserved hydrophobic amino acids and underlined residues represent the conserved acidic amino acid that is replaced by a basic amino acid in the TEC subfamily. (B) Sequence alignment of the various AF2 mutant TEC receptors in which each amino acid has been individually mutated to an alanine residue.

119

Fig. 2. Transient co-transfection assays of TC28 and C20 cells with a luciferase reporter vector, a beta-galactosidase normalizing vector and expression vectors encoding either the full-length EWS/TEC receptor (black bars) or a truncated mutant lacking the last 15 amino acids, EWS/TEC∆AF2 (grey bars). Each transfection was carried out in triplicate and the results are expressed as the mean with the standard error indicated above each bar. The results clearly show that deletion of the AF2 domain results in a loss of at least 70% of the activity of EWS/TEC in both cell lines.

120

Fig. 3. Transient co-transfection assays of TC28 and C20 cells with a luciferase reporter vector, a beta-galactosidase normalizing vector and the indicated EWS/TEC expression vectors. Each transfection was carried out in triplicate and the results are expressed as the mean with the standard error indicated above each bar. Each result was analyzed using Student's t-test with respect to the full-length EWS/TEC receptor to estimate statistical significance. * indicates P < 0.05 and ** indicates P < 0.01.

121

122

Fig. 4. Transient co-transfection assays of TC28, COS and NIH 3T3 cells with a luciferase reporter vector, a beta-galactosidase normalizing vector and the indicated TEC expression vectors. Each transfection was carried out in triplicate and the results are expressed as the mean with the standard error indicated above each bar. Each result was analyzed using Student's t-test with respect to the full-length TEC receptor to estimate statistical significance. * indicates P < 0.05 and ** indicates P < 0.01. RLU: relative light units.

123

Fig. 5. Band-shift assays with a 32P-labeled NBRE oligonucleotide and in vitro-translated TEC receptors. Lane 1: full-length TEC, lane 2: competition with a 25-fold excess of cold NBRE oligonucleotide, lane 3: competition with a 25-fold excess of cold oligonucleotide containing a mutation in the NBRE sequence and therefore showing the specificity of the band-shift. Lane 4: TEC∆AF2 lacking the last 15 amino acids; lanes 5 to 12, the various individual mutant receptors from S614A to L621A respectively (Fig. 1B). Lower star indicates free probe, upper star indicates protein/DNA complex.

6. Inactivation du gène NOR-1 chez la souris par recombinaison homologue

6.1. Construction du vecteur de recombinaison homologue Nous avons procédé au criblage d’une banque d’ADN génomique de souris 129cc sur filtre

(Genome Systems, Inc.) avec une sonde marquée au P32 correspondant à la région 5’ de

l’ADNc de NOR-1. La sonde NOR-1 5’, constituée de 282 pb, avait été amplifiée par RT-

PRC, à partir d’ARN total de cerveau de souris extrait à l’aide de TRIzol selon le protocole

du fournisseur (Life Technologies, Inc.) en utilisant les amorces 5’-atgccctgcgtgcaagcccaat-

3’ et 5’-gcgaccctcttccatcttgat-3’. La sonde a ensuite été clonée, séquencée puis testée par

buvardage Southern sur de l’ADN génomique de souris (Fig. 1 A). Suite au criblage, deux

BACs (Bactérial Artificial Chromosomes) positifs, contenant une section du locus Nor-1,

clonés dans le vecteur pBeloBAC11, ont été identifiés (Fig. 1 B). Les BACs 51D3 et 168I3,

possédant respectivement des inserts de 146.1 kb et de 89.3 kb, ont été analysés par

digestion avec différentes enzymes de restriction et par migration sur gel d’agarose «low

melting» (1 %) en champ pulsé (Fig. 1 C). Nous avons procédé à la construction et au

criblage d’une banque plasmidique du clone 168I3. Un fragment génomique HindIII de

13.5 kb contenant les exons 2-5 a été isolé, puis utilisé pour la construction du vecteur de

recombinaison homologue (Fig. 1 D et E).

Le plasmide pMC1NeoPolyA (Stratagene), constitué d’une cassette de sélection positive

codant pour un gène de résistance à la néomycine (Néomycine phosphotransphérase), a été

choisi pour l’élaboration du vecteur de ciblage génique (Fig. 2). Un fragment de restriction

KpnI/KpnI de 4.2 kb, contenant la fin de l’intron 2 et le début de l’exon 3, a été inséré en

amont de la cassette Néo tandis qu’un second fragment BamH1/EcoRI de 1.8 kb,

correspondant à l’intron 3, a été positionné en aval.

Cette construction permettait, par le mécanisme de recombinaison homologue, d’innactiver

le gène NOR-1 dans les cellules embryonnaires souches (ES) de souris en substituant la

portion 3’ de l’exon 3 ainsi qu’une partie du début de l’intron 3 par la cassette Néo (Fig. 3).

La séquence exonique éliminée codait en partie pour le premier doigt de zinc du domaine

125

de liaison à l’ADN. Elle correspondait plus spécifiquement aux acides aminés 182 à 318.

126

Fig. 1 Criblage d’une banque d’ADN génomique clonée dans des BAC et isolation du locus NOR-1. A) Sonde 5’ NOR-1 testée par buvardage southern sur de l’ADN génomique de souris digéré avec les enzymes EcoRI et HindIII. Des fragments de 16 et 13.5 kb sont respectivement détectés. B) Criblage d’une banque d’ADN génomique de souris avec la sonde 5’ NOR-1 marquée au P32. La banque est clonée dans un vecteur de type chromosome artificiel bactérien (BAC) illustré schématiquement. Chaque clone, présent en duplicata, est localisé sur un endroit spécifique de la membrane. C) Caractérisation de deux clones de 146.1 et 89.3 kb (1 et 2), isolés à partir de la banque d’ADN génomique. Migration des clones digérés avec l’enzyme de restriction Not I sur gel d’agarose en champs pulsés. Présence de séquences du gène NOR-1 confirmée par buvardage southern avec la sonde 5’ NOR-1. D) Analyse des clones (1 et 2) par buvardage Southern. Les séquences génomiques sont digérées avec les enzymes de restriction EcoRI, BamHI et HindIII et hybridées avec la sonde 5’ NOR-1 marquée au P32. Des fragments de 16 kb, 8kb et 13,5 kb sont respectivement mis en évidence. Le fragment HindIII de 13,5 kb a été sélectionné pour la construction du vecteur de recombinaison homologue. E) Illustration schématique du locus génomique Nor-1. Chaque exon est représenté par une boîte et identifié par un numéro.Le codon ATG d’initiation de la traduction ainsi que les deux codons TGA de terminaison sont représentés. Identification des sites de restriction: B: BamHI, E: EcoRI, H: HindIII, K: KpnI, X: XhoI. Sous le locus sont représenté septs fragments d’ADN génomique sous-clonés dans des vecteurs plasmidiques et ayant servi à l’analyse de la structure du gène.

127

Fig. 2 Représentation schématique du vecteur de recombinaison homologue. Un fragment génomique HindIII sous-cloné de 13.5 kb, contenant les exons 2 à 5 du gène NOR-1 (boîtes bleues), ainsi que le plasmide pMCINeoPolyA ont été utilisés pour la construction du vecteur de recombinaison homologue. Des fragments KpnI/KpnI de 4.2 kb et BamHI/EcoRI de 1.8 kb ont respectivement été insérés en amont et en aval de la cassette Néo (boîte rouge). Identification des sites de restriction: B: BamHI, E: EcoRI, H: HindIII, K: KpnI, X: XhoI.

128

Fig. 3 Inactivation du gène NOR-1 chez la souris par recombinaison homologue. Représentation schématique du vecteur de recombinaison homologue, du locus génomique et du gène NOR-1 recombiné. Les exons (1-5) sont représentés par des boîtes, les régions colorées indiquent les séquences codantes. Le gène de résistance à la néomycine (NEO), la cassette de sélection négative codant pour la thymidine kinase (TK) ainsi que les sites de restriction sont illustrés (E: EcoRI, B: BamHI, H: HindIII, K: KpnI). La taille prévue des différents fragments de restriction, la sonde de 1400 pb, ainsi que les produits PCR attendus sont également indiqués

129

Ainsi, advenant la production d’un transcrit résiduel et d’une protéine partielle, l’absence

de cette structure assurait une perte importante de l’activité du récepteur.

6.2. Obtention des cellules embryonnaires souches recombinées Des cellules embryonnaires souche (ES) de souris WW6 ont été électroporées avec le

fragment purifié. L’équivalent de 2 pétris 100mm à confluence ont été mis en suspension

dans 10 ml de milieu (DMEM/10% FBS/ 100U penicilline/ 0.2μg/ml streptomycin/ 7x10-

4% β-mercaptoethanol (v/v)) et 800 μl de cellules ES ont ensuite été électroporées avec 25

μg d’ADN (1μg/μl). Nous avons ensuite remis les cellules en culture sur cellules

nourricières STO SNL2 neor exprimant le transgène LIF (Leukemia inhibitory factor) dans

un pétri 100 mm contenant 10 ml de milieu. Après 24h d’incubation (37°C/5% CO2) la

sélection au G418 (400 μg/ml) et au ganciclovir (2 μM) a été appliquée aux cellules. Après

3 jours de traitement, les cellules ont été lavées au PBS 1X puis du milieu frais

complémenté au G418 et au ganciclovir a été ajouté. Les colonies de cellules capables de

pousser en présence de G-418 et de GANC dans le milieu de culture, ont été repiquées puis

mise en culture sur cellules nourricières dans des plaques 96 puits. En tout, 768 colonies

ont été prélevées afin de procéder à l’extraction de l’ADN génomique puis à l’analyse du

locus NOR-1. Un volume de 60 μl de tampon de lyse (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 M

EDTA (pH 8.0), 20 μg/ml RNAse A, 0.5% SDS) contenant 1mg/ml de protéinase K était

requis par puit. Les plaques ont été incubées toute la nuit à 55°C puis l’ADN a été précipité

à l’éthanol (75 mM NaCl/EtOH 100%). Nous avons identifié par PCR quatre clones

positifs. Toutefois, suite à des analyses par buvardage Southern, seulement un d’entre eux

s’est avéré bon pour la poursuite de nos travaux. La réussite du ciblage génique a été à la

fois confirmé par PCR et par buvardage Southern. Les amorces 5’-tgaagagcttggcggcgaatg-

3’ et 5’-aggcaacctaagcggcttatt-3’ utilisées pour la réaction PCR, situées respectivement

dans la cassette Néo et l’intron 3 permettaient d’identifier l’allèle recombinée (Fig. 3). Tel

que montré dans la figure 4A un fragment de 1.5 kb était obtenu à partir de l’ADN

génomique de cellules ES NOR-1+/-. Le fragment amplifié a subséquemment été cloné

puis séquencé afin de confirmer son identité. Une sonde 5’ HindIII/KpnI de 1.4 kb située

dans l’intron 2 juste en amont de la séquence homologue du vecteur de recombinaison a été

utilisée pour les buvardages Southern (Fig. 3 et 4B). Différentes combinaisons de

130

Fig. 4 Analyse génotypique des cellules ES. A) Amplification par PCR et résolution sur gel d’agarose du fragment de 1.5 kb généré à partir de l’allèle NOR-1 recombinée (-). Absence d’amplification à partir des échantillons de cellules ES NOR-1+/+. B) Recombinaison homologue confirmée par buvardage southern. L’ADN génomique extrait des cellules ES a été digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et EcoRI/HindIII puis hybridée avec la sonde 5’ de 1400 pb. Des fragments EcoRI de 13.5 kb et EcoRI/HindIII de 8.0 kb sont produits par l’allèle sauvage (+), tandis que des bandes EcoRI de 11.3 kb et EcoRI/HindIII de 5.8 kb représentent l’allèle mutante (-).

131

digestions de l’ADN génomique, notamment avec les enzymes de restriction EcoRI et

EcoRI/HindIII, ont été effectuées pour ces analyses. Les fragments EcoRI de 13.5 kb et

EcoRI/HindIII de 8.0 kb étaient générés à partir de l’allèle sauvage tandis que les fragments

EcoRI de 11.3 kb et EcoRI/HindII de 5.8 kb étaient produits à partir de l’allèle mutante.

Une série de digestions et des hybridations avec une sonde 3’ (localisée dans l’intron 5) et

Néo ont également été réalisé afin de confirmer la réussite de l’intégration.

6.3 Génération des souris mutantes pour le gène NOR-1 Les cellules ES contenant une allèle recombinée, ont été injectées dans des blastocystes

129cc prélevés à 3.5 jour du développement (Giroux, Tremblay et al. 1999). Les

blastocystes ont à leur tour été introduit dans des souris receveuses pseudo-gestantes. Les

souris chimériques issues de ces blastocytes ont ensuite été croisées avec des souris

sauvages 129cc afin de produire les premiers hétérozygotes mutants NOR-1. Le croisement

d’hétérozygotes a subséquemment permis d’obtenir des souris homozygotes nulles pour le

gène NOR-1. De plus, nous avons procédé à des croisements successifs de nos souris

porteuses d’une allèle mutée avec des 129cc afin d’homogénéiser le profil génétique entre

les individus. Au moment de nos analyses 2-4 générations de souris c’étaient succédées.

Nous avons ensuite mis au point les buvardages Southern et les réactions PCR requis pour

établir le génotype des souris. L’ADN génomique a d’abord été extrait des queues de souris

selon le protocole standard d’extraction au phénol/chloroforme (Sambrook and Russell

2001). Un échantillon de 10 μg d’ADN était ensuite digéré avec les enzymes de restriction

EcoRI ou EcoRI/HindIII, puis résolu par migration sur gel d’agarose 0,8% pour ensuite être

transféré sur membrane de nylon. Des fragments de 13.5 kb et de 8.0 kb sont

respectivement produits par des digestions EcoRI et EcoRI/HindIII à partir de l’allèle

sauvage (+), tandis que des bandes de 11.3 kb et de 5.8 kb résultent de digestions EcoRI et

EcoRI/HindIII effectuées à partir l’allèle mutante (-) (Fig.5 A). La sonde 5’ HindIII/KpnI

de 1.4 kb marquée au p32 et externe au vecteur de recombinaison homologue a servi à

l’hybridation des membranes. Pour les réactions PCR nous avons utilisé la combinaison des

amorces 5’-gagggctgcaagggctttttca-3’ et 5’-gcgaccctcttccatcttgat-3’ pour identifier l’allèle

sauvage, ainsi que les amorces 5’- atgccctgcgtgcaagcccaat -3’ et 5’-gcgaccctcttccatcttgat-3’

132

Fig. 5 Établissement du génotype des souris NOR-1. A) Analyse par buvardage Southern. L’ADN génomique extrait des queues de souris a été digéré par les enzymes de restriction EcoRI et EcoRI/HindIII, puis hybridé avec la sonde génomique de 1400pb externe au bras homologue 5’ du vecteur de recombinaison. Les fragments EcoRI de 13.5 kb et EcoRI/HindIII de 8.0 kb sont générés à partir de l’allèle sauvage (+) tandis que les fragments EcoRI de 11.3 kb et EcoRI/HindII de 5.8 kb sont produits à partir de l’allèle mutante (-). B) Analyse par PCR effectuée sur l’ADN génomique des queues de souris. Les fragments de 1.7 kb et 1.5 kb produits sont issus respectivement de l’allèle sauvage (+) et de l’allèle recombinée (-). (Contribution Christine Filion : figure5 B)

133

Fig. 6 Absence du transcrit NOR-1 chez les souris NOR-1 -/-. A) Détection de l’ARNm NOR-1 par RT-PCR et migration des fragments amplifiés sur gel d’agarose. Les réactions ont été effectuées avec de l’ARN total extrait du cerveau de souris NOR-1 +/+, +/- et -/-. B) Réaction contrôle d’amplification d’un fragment GAPDH confirmant la présence d’ARN dans chacun des échantillons.

134

pour mettre en évidence l’allèle mutante, tel que décrit pour les cellules ES (Fig. 5 B). Nous

avons également vérifier la présence de messager NOR-1 chez nos souris par RT-PCR (Fig.

6). L’ARN total de cerveaux de souris ou du muscle squelettique a été extrait à l’aide de

TRIzol (Life Technologies, Inc.) selon le protocole du fournisseur. Les amorces 5’-

acactctcagcctccgct-3’ et 5’-cttgaagaagatcgggaa-3’ situées respectivement dans les exons 2

et 3 furent utilisées pour le PCR. L’amplification d’une séquence de l’ADNc du GAPDH, à

l’aide des oligos 5’-tgcaccaccaccaactgcttag-3’ et 5’-ggatgcagggatgatgtttc-3’, a été utilisée

comme réaction contrôle, Les fragments amplifiés ont été résolus sur gel d’agarose en

présence de bromure d’éthidium.

On constate, tel qu’attendu, l’absence du transcrit NOR-1 intègre chez la souris NOR-1 -/-.

Les expériences de génotypage permettent dans un premier temps de montrer la viabilité

des souris déficientes pour le récepteur nucléaire NOR-1. Dans un deuxième temps, elles

révèlent la prévalence des naissances selon un ratio Mendélien.

6.4 Analyse phénotypique des souris NOR-1

6.4.1 Analyse histologique Afin d’évaluer les conséquences engendrées par une absence du récepteur nucléaire NOR-1

chez la souris, nous avons d’abord procédé à l’analyse histologique de différents tissus. Les

cellules exprimant normalement le messager NOR-1, tel qu’établit par buvardage northern

lors de nos précédentes expériences ainsi que d’après la littérature, ont plus spécifiquement

fait l’objet de ces analyses (Tableau 3). Les différents organes provenant de souris NOR-1

+/+ et -/- ont été prélevés, fixés à la paraformaldéhyde 4 %, déshydratés à l’éthanol et

imprégnés dans de la paraffine. Les coupes de tissus de 6 μm disposées sur lame on ensuite

été colorés à l’éosine et à l’hématoxyline.

135

136

Fig. 7 Analyse histologique des différents tissus chez la souris NOR-1. Comparaison des divers types cellulaires dans lesquels NOR-1 est normalement exprimé entre les souris sauvages et mutantes. L’aspect des cellules et la structure des tissus, coloré à l’éosine et à l’hématoxyline, semble identique entre les souris NOR-1 -/- et +/+. A) Coupe transversale de cerveau. B) Hippocampe. C) Cervelet. D) Embryon 16.5 jours. E) Coupe longitudinale du muscle squelettique. F) Coupe transversale du muscle squelettique. G) Cellules musculaires cardiaques. H) I) Testicule. J) Poumon K) L) Thymus. Agrandissement 2.5 X: A, D; 5X: B; 10X: C, E, F, H, J, K; 40X: G, I, L.

137

Tableau 3. Expression de NOR-1 chez la souris, le rat et l’humain.

Espèce Âge Expression Technique Référence

Souris E11.5 Plancher et plafond du tube neural In situ Zetterström, R.H. (1996)

Souris E11.5 - P1 Vésicule otique - oreille interne In situ & lacZ Ponnio, T. (2002)

Souris P0 Cortex, hippocampe, noyau habenulaire In situ & lacZ Ponnio, T. (2002)

(++) Cerveau, cœur, Muscle squelettique, poumon, testicule Souris Adulte

(+) Rate, foie, Rein Northern Maltais, A. (2000)

(++) Néocortex, moelle épinière, surrénale, oreille interne Rat E16.5

(+) Hippocampe, thalamus, cervelet, noyau amygdalien In situ Zetterström, R.H. (1996)

Rat E17 Encéphale antérieur Northern Ohkura, N. (1994)

(++) Néocortex, striatum, hippocampe, subiculum, noyau habénulaire, noyau agmydalien, oreille interne Rat P0 (+) Cervelet, moelle épinière

In situ Zetterström, R.H. (1996)

(++) Bulbe olfactif, hippocampe, subiculum, noyau habenulaire, noyau agmydalien, cervelet, surrénale

Rat Adulte (+) Néocortex, striatum, moelle épinière, striatum, moelle épinière, septum, intestin, poumons, testicules

In situ Zetterström, R.H. (1996)

(++) Cerveau Rat Adulte

(+) Thymus, rein, rate Northern Ohkura, N. (1994)

Humain Fœtus Cœur Northern Labelle, Y. (1995)

(++) Cerveau, poumon Humain Fœtus

(+) Reins, foie Northern Ohkura, N. (1996)

(++) Cœur, muscle squelettique Humain Adulte

(+) Cerveau, rein Northern Labelle, Y. (1995),

Ohkura, N. (1996)

(++) : Expression importante, (+) : Détection.

6.4.1.1 Cerveau

Cortex cérébral et hippocampe Chez la souris, le cerveau constitue l’organe dans lequel le récepteur nucléaire NOR-1 est

le plus fortement exprimé. Les messagers des deux autres membres de la sous-famille,

NGFI-B et NURR1, y sont également présents. L’ARNm NOR-1 se retrouve en quantité

importante dans le cortex cérébral. Le niveau d’expression de NOR-1 bien que supérieur

durant le développement embryonnaire, demeure décelable après la naissance et à l’âge

adulte. Dès le stade embryonnaire, on observe également la présence de transcrits NOR-1

dans l’hippocampe. Nos observations préliminaires ne nous ont pas permis de mettre en

évidence des différences structurales importantes associées à une absence du récepteur Nor-

138

1 (Fig 7A et B). Au premier abord, un développement normal du cortex cérébral et de

l’hippocampe semble avoir prévalu chez les souris NOR-1 -/-.

Cervelet Durant le développement embryonnaire ainsi qu’à la naissance seul l’expression de NOR-1,

parmis les trois récepteurs de la sous-famille NGFI-B/NURR1/NOR-1, est détectée dans le

cervelet. Les ARNm des trois récepteurs nucléaires sont néanmoins présents à l’âge adulte.

Les différents types cellulaires constituant le cervelet semblent présents et normaux chez la

souris Nor-1 -/- (Fig. 7 C).

6.4.1.2 Embryon L’analyse Northern effectuée à partir d’ARNm d’embryons de souris de différents âges

montrait une forte expression du récepteur aux jours E15.0 et E17.0 du développement.

D’autres recherches révélaient une présence importante de transcrits Nor-1 au jour E18.0.

Des embryons de souris ont été prélevés au jour E16.5 afin de comparer l’état des différents

organes dont principalement le cerveau (Fig.7 D). Les souris NOR-1 -/- et +/+ montrent un

développement comparable.

6.4.1.3 Muscles squelettiques et cardiaque Chez l’humain, l’expression du récepteur nucléaire NOR-1 prédomine dans les tissus

musculaires dont les muscles squelettiques et le cœur. De plus, NOR-1 est fortement

exprimé dans le cœur fœtal (Labelle, Zucman et al. 1995). Chez la souris, le messager de

NOR-1 se retrouve également en quantité élevé dans les tissus musculaires bien que sa

concentration soit plus importante dans le cerveau. À ce jour, aucune fonction liée à

l’activité des cellules musculaires n’a été associée au récepteur nucléaire NOR-1 (Fig.7 E,

F et G).

6.4.1.4 Thymus Le thymus constitue le lieux de maturation des lymphocytes T. C’est dans cet organe du

système immunitaire que se déroule la sélection négative et positive des cellules T. C’est

également dans le thymus que ces cellules acquièrent leur spécificité CD4+ ou CD8+. La

139

participation des récepteurs nucléaires NOR-1 et NGFI-B à la sélection négative des

lymphocytes T a été mis en évidence. Ces protéines participent plus spécifiquement au

processus apoptotique. De plus, tel que démontré par hybridation in situ chez la souris,

NGFI-B et NOR-1 sont exprimés dans le thymus au jour E21.5 du développement

embryonnaire (Zetterstrom, Solomin et al. 1996).

Le thymus est constitué de deux couches de tissus d’origines distinctes: le cortex issu de

l’ectoderme et la medulla provenant de l’endoderme. Les coupes de thymus de souris Nor-1

déficientes et de souris sauvages montrent une organisation cellulaire identique, soit la

région corticale, foncée, et la région médullaire, plus pâle (Fig.7 K et L). On distingue les

thymocytes, petits points mauves. À travers, on observe les cellules épithéliales du cortex

ou les cellules épithéliales et dendritiques de la médulla. Celles-ci montrent une coloration

rose et une forme étoilée. Il serait toutefois intéressant de quantifier par FACS

(fluorescence-activated cell sorter) les sous-populations de thymocytes contenues dans le

thymus afin d’évaluer si la sélection négative des précurseur de lymphocyte T est

réellement affectée.

L’intégrité apparente du thymus chez les souris Nor-1 déficientes s’accorde avec les

résultats obtenu chez la souris knock-out pour NGFI-B. En effet, lors de ces expériences,

l’absence du récepteur NGFI-B était présumément pallié par la présence de NOR-1. Ainsi,

par le biais de cette redondance fonctionnelle la maturation des lymphocytes T pouvait se

dérouler normalement.

6.4.1.5 Poumons Aucun problème respiratoire associé à une malformation pulmonaire ne s’est manifesté

chez les souris mutantes pour le récepteur NOR-1. La ramification des bronches et la

structure des alvéoles apparaissent normales (Fig 7 J). Il n’y a pas recrudescence du taux de

mortalité chez les souriceaux knock-out. En somme, bien qu’il soit exprimé dans les

poumons, le récepteur NOR-1 ne semble pas essentiel à la fonction de cet organe.

140

6.4.1.6 Testicules Tel que démontré chez le rat par hybridation in situ, les trois gènes de la sous-famille

NGFI-B/NURR1/NOR-1 sont exprimés dans les testicules (Zetterstrom, Solomin et al.

1996). Ces résultats ont été réitérés par buvardages northern, notamment pour NGFI-B et

NOR-1. Il a été démontré NGFI-B jouait un rôle important dans la synthèse d’hormones

stéroïdiennes dans les cellules Leyding des testicules. Les cellules Leydig, localisées dans

les compartiments interstitiels, c’est à dire entre les tubules séminifères, transforment le

cholestérol en prégnénolone puis en progestérone. Il y a finalement synthèse de la

testostérone, hormone culminante au bout de cette chaîne anabolique. La LH (Luteinizing

Hormone), sécrétée par l’adénohypophyse, stimule les cellules Leydig qui répondent par la

synthèse d’hormones. Il a été démontré que l’expression de NGFI-B était induite dans les

cellules Leydig en réponse à la LH. De plus, chez la souris, NGFI-B est exprimé dans les

testicules durant leur développement postnatal, période correspondant à la puberté (Song,

Park et al. 2001; Song, Lee et al. 2002). Chez la souris NGFI-B déficiente le

développement normal des testicules suggère une redondance fonctionnelle. Bien que

NOR-1 soit exprimé dans les testicules aucun phénotype apparent n’est décelé chez la

souris mutante pour le récepteur (Fig.7 H et I).

6.4.1.7 Conclusion La comparaison des prélèvements provenant de souris NOR-1 déficientes et de souris

sauvages indique que le récepteur nucléaire NOR-1 n’est pas essentiel au développement et

au maintien basal des différents tissus dans lesquels il est normalement exprimé. Toutefois,

ces observations demeurent préliminaires et ne permettent pas de mettre en évidence

l’existence de phénotypes qui pourraient se manifester de façon plus subtile. Des analyses

moléculaires approfondies seraient éventuellement requises.

6.4.2 Test d’orientation Au cours de la période consacrée à la création de la souris NOR-1 déficiente, d’autres

souris knock-out pour le récepteur NOR-1 ont vu le jour (Ponnio, Burton et al. 2002;

DeYoung, Baker et al. 2003). Des phénotypes distincts ont été obtenus. Dans un premier

cas la souris présentait une malformation des canaux semi-circulaires de l’oreille interne

141

ainsi que de l’hippocampe (Ponnio, Burton et al. 2002; Ponnio and Conneely 2004) tandis

que dans le deuxième cas c’est l’embryogenèse à un stade précoce qui était affecté par une

absence du récepteur NOR-1 (DeYoung, Baker et al. 2003). Nos résultats s’apparentent

exclusivement à ceux de Ponnio et al. En effet, nos souris Nor-1 déficientes, tout comme

les leurs, naissent selon un ratio mendélien, atteignent l’âge adulte et se reproduisent

normalement. Par contre, les souris NOR-1 déficientes produites dans le laboratoire de

DeYoung et al. n’arrivent pas à terme et meurent autour du jour 8.5 de la vie embryonnaire.

Outre une malformation de l’oreille interne et de l’hippocampe, les souris knock-out créées

par l’équipe de Ponnio et al. présentent une apparence normale. L’absence du récepteur

NOR-1 ne semble pas entraîner l’apparition de séquelles majeures dans les autres organes

où le gène est habituellement transcrit. La structure anormale de l’oreille interne se

manifeste par des canaux semi-circulaires de circonférence réduite, des ampullas aplanies et

une diminution du volume de fluide endolymphatique. Différents tests ont été mis au point

afin d’établir si l’orientation des souris dans l’espace se trouve affectée, due notamment à

une malformation de l’oreille interne. Parmi ces tests l’un d’entre eux permet plus

spécifiquement de mettre en évidence une perturbation de l’orientation spatiale en

l’absence d’indice tactile (contact-righting) (Kiernan, Zalzman et al. 1999). Les souris

NOR-1 déficientes de Ponnio et al. avaient été soumis à cette évaluation. Le tiers des

individus NOR-1 -/- avaient échoué le test (6 sur 18), tandis que la totalité des souris

sauvages pouvaient déterminer leur orientation en l’absence de repère tactile.

Afin d’établir si les souris NOR-1 -/- produites dans notre laboratoire possèdent un

phénotype identique, nous avons procédé aux mêmes expériences La souris était introduite

142

Fig. 8 Trouble de l’orientation en absence d’indice tactile chez les souris NOR-1 -/-. Pourcentage des souris NOR-1 +/+ et NOR-1 -/- ayant réussit avec succès le test d’orientation. La barre d’erreur (±) représente l’écart-type du pourcentage. ***: p< 0.0001 (Test du khi-carré de Pearson).

143

dans un tuyaux de plastique transparent d’un diamètre de 3 cm et d’une longueur de 30 cm.

Lorsqu’elle atteignait le centre, une rotation du tuyau, de 180°, était effectuée afin que

l’animal soit inversé, le dos en direction du sol. Cinq secondes étaient laissées à la souris

pour qu’elle puissent se retourner et poursuivre son chemin. Une valeur de 1 était attribuée

aux souris qui réussissaient en respectant cet interval de temps et de 0 à celles qui

échouaient. Nous avons répétée l’expérience trois fois pour chaque souris et la valeur était

attribuée à l’animal en fonction de la réponse majoritairement observée. Parmis les 62

souris NOR-1 -/- soumises au test, 26 d’entre elles montraient une incapacité à retrouver

leur orientation spatiale. Par contre, chez les 59 souris NOR-1 +/+ testées, seulement 4 ont

échoué l’épreuve. Le pourcentage de réussite correspond à 58.06% pour les souris mutantes

contre 93.22% pour les individus normaux (Fig. 8). Nous avons appliqué le test du khi-

carré de Pearson, qui permet de comparer les pourcentages, et pu ainsi confirmer que la

différence entre les résultats obtenus était statistiquement significative avec un niveau

critique (p-value) < 0.0001.

Nos données s’apparentent aux valeurs qu’avait obtenu Ponnio et al. et révèlent un

problème d’orientation en absence de stimuli extéroceptifs. Ainsi elles suggèrent une

malformation de l’oreille interne chez nos souris NOR-1 déficientes. Par conséquent, ces

résultats confirment la réussite de nos expériences de ciblage génique visant à inactiver

NOR-1 chez la souris. De plus, notre travail corrobore les conclusions de Ponnio et

collaborateurs sur le rôle du récepteur nucléaire, mais sème un doute sur les résultats de

DeYoung et collaborateurs qui démontrait le rôle essentiel de NOR-1 durant

l’embryogénèse.

6.4.3 Réponse aux antipsychotiques Les trois récepteurs nucléaires de la sous-famille NGFI-B/NURR1/NOR-1 sont fortement

associés au système nerveux central. NURR1 est notamment essentiel à la croissance des

neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral. Quant à NOR-1 et NGFI-B ils ont

plus particulièrement été étudiés dans le contexte de réponses aux drogues, principalement

aux antipsychotiques. Ainsi, chez la souris et le rat, on observe une modulation du patron

144

d’expression de NGFI-B et NOR-1 suite à des traitement aigus ou chroniques à la clozapine

et à l’halopéridol. Ces variations sont observées principalement dans le striatum ainsi que

dans la coquille et le corps du noyau accumbens. Les antipsychotiques constituent des

antagonistes plus ou moins puissants des récepteurs D2 de la dopamine et 5-HT2A de la

sérotonine. Le transcrit NGFI-B serait d’ailleurs détecté dans une population de neurones

du striatum dorsolatéral exprimant le récepteur D2 et probablement responsables d’effets

secondaires liés au système extrapyramidal.

Chez la souris une administration d’halopéridol produit un état cataleptique qui peut être

évalué en positionnant l’animal sur un grillage incliné. Le niveau de paralysie peut être

mesuré en déterminant le temps nécessaire à la souris pour bouger ses quatre pattes. Des

doses d’halopéridol ont été administrées à des souris NGFI-B déficientes. Étonnamment,

l’état cataleptique n’était pas provoqué par la drogue chez ces individus. Ces résultats

suggéraient un rôle du récepteur nucléaire dans l’apparition des effets secondaires

extrapyramidaux (Ethier, Beaudry et al. 2004). L’utilisation d’antagonistes des récepteurs

de la dopamine, qui simulent l’effet de l’halopéridol, montrait une spécificité de la

transmission via le récepteur D2.

En réponse à l’halopéridol, l’induction de l’expression de NOR-1 dans le striatum

dorsolatéral ainsi que dans le noyaux accumbens s’avérait significativement supérieure

chez les souris NGFI-B -/-. Ces résultats suggéraient une compensation exercée par le

récepteur nucléaire NOR-1 en absence de NGFI-B. D’autre part, le patron d’expression de

NOR1 par les antipsychotiques s’apparente fortement à celui de NGFI-B (Maheux, Ethier

et al. 2005). Des analyses préliminaires ont donc été effectuées sur nos souris NOR-1 -/-.

Elles avaient pour objectif de déterminer le rôle du récepteur dans la réponse à

l’halopéridol.

L’état cataleptique des souris NOR-1 +/+ et -/-, provoqué par un traitement à l’halopéridol,

a été évalué à l’aide de la procédure élaborée par Dobner et al, 2001. Ces analyses ont été

effectuées dans le contexte des travaux du Dr Daniel Lévesque. Une dose de 1 mg/kg

d’halopéridol a d’abord été administrés au souris NOR-1 adultes, pesant entre 20-25 kg.

Une solution saline a servi de véhicule pour l’halopéridol et de solution contrôle. L’effet du

neuroleptique a ensuite été évalué à différents temps suivant l’injection, soit 30, 60, 90 et

145

Fig. 9 Réponse cataleptique induite par l’administration d’halopéridol chez les souris NOR-1 -/- et +/+. L’état cataleptique est évaluée à différents temps (0, 30, 60. 90 et 120 min) après une injection d’halopéridol (1 mg/kg) ou du véhicule (contrôle). Chaque point représente la moyenne (± SEM) obtenue pour 10 individus. Il n’y a pas différences significatives entre les souris sauvages et mutante suite à l’administration d’halopéridol. Cependant, un niveau plus fiable de l’activité motrice basale est observée chez les souris NOR-1 -/- contrôles , comparativement aux souris NOR-1 +/+ contrôles. (*p<0.05). (Dr. Daniel Lévesque).

146

120 min. Les souris ont été disposées sur une grille inclinée selon un angle de 70°, et le

temps nécessaire à celles-ci pour bouger les quatre pattes a été mesuré jusqu’à une durée

maximum de 180 secondes. Une dizaine de souris NOR-1 +/+ et NOR-1 -/- ont été

soumises au test, pour chacune des deux conditions (halopéridol ou saline).

La drogue produit un effet comparable entre les deux catégories d’individus testés. Ainsi

contrairement à NGFI-B, l’ablation génétique de NOR-1 n’altère pas la réponse

cataleptique d’un antipsychotique typique. Effectivement, il semble que l’effet de NGFI-B

dans ce système soit dépendant des rétinoïdes (Ethier, Beaudry et al. 2004; Ethier,

Kagechika et al. 2004). Ce qui indique que l’activité de NGFI-B dans le striatum, en

réponse au antispychotiques, aurait lieu via une hétérodimérisation avec RXR. En somme,

NGFI-B et NOR-1 ne seraient pas redondant dans cette structure. Toutefois, l’influence de

NOR-1 sur la régulation de neuropeptides, de neuromodulateurs ou de leurs récepteurs

pourrait être envisagée. De plus, il est intéressant de constater une différence significative

entre l’activité motrice basale des souris contrôle NOR-1 +/+ et NOR-1 -/-. En effet, les

individus mutants pour NOR-1 semblent plus amorphes et prennent d’avantage de temps

pour mouvoir les quatre pattes sur le montage expérimental. Cette différence pourrait

découler de leur trouble d’orientation spatial dû à la malformation de l’oreille interne, ou à

une réponse comportementale causée par un déséquilire neurochimique encore inconnu.

6.5 Culture primaire de fibroblastes de souris L’absence de phénotype apparent chez la souris NOR-1 déficiente n’exclut pas la

possibilité que des perturbations liées à l’absence du récepteur puissent se manifester dans

des conditions de stress ou en réponse à l’administration de drogues. Afin de simplifier le

système biologique en vue de définir de nouvelles pistes de recherche nous avons établit

des cultures primaires de fibroblastes à partir de nos souris.

Des embryons de souris de 12 à 14 jours ont été prélevés de façon stérile. Les enveloppes et

les annexes ont été retirées, ainsi que les pattes, la tête et la queue dans le cas d’embryons

trop gros. Ces tissus embryonnaires ont été conservés afin de confirmer le génotype des

souris. Le matériel obtenu a ensuite été haché, rincé trois fois au PBS 1X stérile, puis

incubé dans 15 à 20 ml de trypsine (0.2%) à 37°C avec agitation en présence de billes de

147

verre durant 15 minutes. Après sédimentation de 2 minutes, le surnageant a ensuite été

prélevé, puis mélangé à 20 ml de milieu DMEM contenant 10% de FBS. Les étapes

d’incubation avec de la trypsine fraîche ont été répétées avec les sédiments. La suspension

cellulaire a ensuite été centrifugée à 1200 RPM pendant 4 minutes, puis le culot a été remis

en suspension dans 10 ml de milieu DMEM/10% FBS. Le milieu a ensuite été filtré à

travers une gaze stérile puis les cellules ont été comptées afin d’obtenir 300 000-600 000 de

cellules par ml. Un volume de 10 ml de milieu a été distribué par pétri 100 mm. Après 24

heures d’incubation à 37°C, 5% CO2 le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais

DMEM/10 % FBS. Soixante-douze heures après la mise en culture, les cellules ont été

trypsinisées, puis remises en suspension dans du milieu DMEM/10% FBS afin d’obtenir

une densité de 500 000 cellules par ml. Un volume de 10 ml a à nouveau été distribué par

pétris 100 mm. Les passages ont été répétés successivement, après 72 heures d’incubation,

jusqu’à l’établissement de lignées de fibroblastes. En tout, quatre lignées ont été établies,

deux NOR-1 +/+ et deux NOR-1-/-.

6.5.1 Caractérisation des lignées de fibroblastes Le génotype des lignées de fibroblaste a d’abord été confirmé par PCR. L’extraction de

l’ADN génomique des cellules en culture a été effectué à l’aide du protocole standard décrit

par Sambrook et al. (Sambrook and Russell 2001). Pour les amplifications nous avons

utilisé les mêmes amorces que celles sélectionnées pour génotyper les souris NOR-1, soit

5’-gagggctgcaagggctttttca-3’ et 5’-gcgaccctcttccatcttgat-3’ pour identifier l’allèle sauvage,

ainsi que 5’- atgccctgcgtgcaagcccaat -3’ et 5’-gcgaccctcttccatcttgat-3’ pour l’allèle mutante

(Fig.10A). La présence ou l’absence de transcrit NOR-1 dans les cellules a été déterminé

par RT-PCR (Fig. 10B). Les réactions ont été effectuées à partir de l’ARN total des

fibroblastes purifié à l’aide de TRIzol selon le protocole suggéré (Life Technologies, Inc.),

Les oligos 5’-acccccagccccaccattca-3’ et 5’-ccagcggagggaaggtcag-3’, situés respectivement

dans l’exon 2 et dans l’extrémité de l’exon 3 éliminée par recombinaison homologue, ont

été utilisé pour les amplifications PCR. Des oligos spécifiques de l’actine, 5’-

atggatgacgatatcgctgc-3’ et 5’-tgtcaggtcccggccag-3’, ont servi pour la réaction contrôle. Les

fragments amplifiés ont ensuite été résolus par migration sur gel d’agarose et révélés par

coloration au bromure d’éthidium.

148

Fig. 10 Caractérisation du génotype des cultures primaires de fibroblastes NOR-1. A) Réactions PCR effectuées à partir de l’ADN génomique des fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- en culture. Des fragments de 1.7 et 1.5 kb sont respectivement générés par les allèles NOR-1 sauvage (+) et recombinée (-). B) Détection du transcrit NOR-1 par RT-PCR. L’ARN total extrait des fibroblates en culture a été utilisé pour les réactions. Une bande de 825 pb indique la présence du messager NOR-1. L’amplification d’une séquence de l’actine par RT-PCR confirme la présence d’ARN dans chacune des échantillons.

149

NOR-1, tout comme NGFI-B et NURR1, constitue un « immediate-early gene ». Ces trois

récepteurs nucléaires sont rapidement induits dans une variété des types cellulaires en

réponse à différents facteurs de croissance, et ce, sans la synthèse préalable de protéines de

novo. NOR-1, NGFI-B et NURR1 exerceraient ainsi un rôle dans la prolifération cellulaire.

L’activation de l’expression du gène NOR-1 avait été mis en évidence, à plusieurs reprise,

par l’analyse de l’ARN. Par contre, seul Hedvat et al. (Hedvat and Irving 1995) ont analysé

la dynamique de la protéine lors de la croissance cellulaire. En somme, ils ont montré

l’induction du récepteur nucléaire dans des cellules Jurkat, quatre heures après une

stimulation au PHA/PMA. NOR-1 endogène marquée au 35S était mis en évidence par

immunoprécipitation avec un sérum anti-NOR-1.

Nos lignées de fibroblastes générées à partir des souris NOR-1 -/- et +/+ constituaient un

modèle in vitro intéressant pour étudier la fonction du récepteur nucléaire dans différents

processus cellulaires, dont la prolifération. Des anticorps polyclonaux dirigés contre la

partie N-terminale du récepteur nucléaire NOR-1 ont été générés dans le laboratoire de Y.

Labelle (Laflamme, Filion et al. 2003). Ces anticorps avaient d’abord été utilisés pour

évaluer le niveau d’expression de la protéine dans les différents tissus chez la souris. Des

extraits protéiques ont été analysés par buvardage western. Le cerveau d’embryon E16.5

jours et de souris adultes ainsi que le muscle squelettique ont plus attentivement fait l’objet

d’études. Malheureusement la présence de bandes non-spécifiques découlant du caractère

polyclonal des anticorps interférait avec la visualisation de signaux positifs. De plus, il est

possible que la protéine n’ait pas été présente en quantité suffisante pour être mise en

évidence par ces analyses.

6.5.2 Prolifération cellulaire

6.5.2.1 Induction du récepteur nucléaire NOR-1 Dans un premier temps nous avons tenté de mettre en évidence la présence de NOR-1

endogène dans nos lignées de fibroblastes. Aucune trace du récepteur n’était décelable dans

les extraits protéiques provenant des cultures confluentes. Compte tenu du rôle putatif du

récepteur dans la prolifération, nous avons plutôt analysé sa présence dans un contexte de

stimulation de la prolifération cellulaire.

150

Les fibroblastes en culture, à 70% de confluence, ont été mise en quiescence par privation

de sérum. Les cellules ont été incubées pendant 72 heures dans du milieu de culture

DMEM/0.2% FBS, puis stimulée par une induction au sérum en substituant le milieu

pauvre par du DMEM/20% FBS. Nous avons extrait les protéines des fibroblastes en

culture à différents temps, soit 0h, 0.5h, 1h, 2h, 4h et 8h suivant la stimulation. Les cellules,

rincées avec du PBS 1X étaient ensuite lysées à l’aide d’un tampon d’extraction SDS. Un

volume de 500 μl de tampon était requis par pétri de 100 mm de diamètre. Les échantillons

préalablement soniqués et bouillis, ont été analysé par buvardage Western. Un volume de

150 μl était déposé sur gel SDS-polyacrylamide 10%, puis transféré sur membrane PVDF

(polyvinylidene difluoride) (Amersham Biosciences). L’anticorps polyclonal produit dans

notre laboratoire et dirigé contre la portion N-terminale de NOR-1 a été utilisé afin de

détecter la présence du récepteur nucléaire dans nos extraits protéiques. Nous avons incubé

les membranes 1 heure dans la solution de blocage TBST 0.1%/ lait en poudre 10% puis

nous les avons mises en présence de l’anticorps NOR-1 dans une proportion 1 :200 dans du

TBST 0.1%/ lait en poudre 5% durant 1 heure. Les membrane ont été lavées trois fois, 10

minutes avec du TBST 0.1%. Le second anticorps, un IgG de chèvre anti-lapin couplé à la

HRP (horseradish peroxidase), de Zymed a été utilisé selon un ratio 1 :10 000 dans du

TBST 0.1%/ lait 5%. Les membranes ont à nouveau été lavées trois fois puis les protéines

ont été révélées avec l’aide du kit Western Lightning Chemiluminescence de Perkin-Elmer.

Chacune des analyses a été réalisée en triplicata.

Pour les deux lignées de fibroblastes NOR-1 +/+, on observe une dynamique identique. Le

récepteur nucléaire NOR-1 atteint son niveau maximal 2 heures après la stimulation de la

prolifération (Fig. 11A). Avant ce pic d’expression la protéine n’est pas décelable. Après 4

heures, le récepteur nucléaire demeure toujours présent bien qu’en plus faible quantité. À 8

heures le signal a disparu. En somme, NOR-1 apparaît de façon fugace en réponse à une

induction de la prolifération cellulaire. Ces caractéristiques concordent avec les propriétés

« d’immédiat early gene » attribuées à NOR-1. De plus, nos résultats qui montrent une

présence de la protéine à 2 et 4 heures ne sont pas en contradiction avec ceux de Hedvat et

al. (Hedvat and Irving 1995) qui avait mis en évidence NOR-1 dans des cellules Jurkat 4

heures après une stimulation avec des facteurs de croissance (PHA/PMA). L’intérêt de cette

151

Fig. 11 Induction du récepteur NOR-1 dans les fibroblastes en prolifération. A) Analyses par buvardage Western de l’expression du récepteur NOR-1. Les extraits protéiques ont été effectués à différent temps (0, 0.5, 1, 2, 4 et 8 heures) suivant l’induction de la prolifération des fibroblastes NOR-1 +/+ et -/-, préalablement mis en quiescence. Des anti-NOR-1 polyclonaux de lapin ont été utilisés pour ces expériences. La protéine NOR-1 apparaît 2 et 4 heures après la stimulation, uniquement dans les cellules NOR-1 +/+. B) Variation du niveau de transcrit NOR-1 évalué au temps 0 et 2 heures par RT-PCR. Absence de messager dans les fibroblastes NOR-1 -/-. Réactions de RT-PCR contrôles sans l’addition de RT ou avec des amorces spécifiques de l’actine pour montrer l’absence d’ADN et la présence d’ARN total dans chacun des échantillons. (Contribution Christine Filion : figure 11 B)

152

expérience réside également dans la démonstration de l’absence du récepteur nucléaire dans

les lignées de fibroblastes issues des souris NOR-1 -/-. En somme, ces résultats confirment

la réussite du ciblage génique visant l’inactivation du gène NOR-1 chez la souris. Ils

attestent également de la validité de nos souris comme modèle d’étude.

6.5.2.2 Expression du gène NOR-1 Les analyses par RT-PCR, effectuées afin de caractériser génétiquement nos lignées de

fibroblastes, avaient été réalisées à partir de cellules en cycle. Ces données indiquaient ainsi

la présence de messager NOR-1 dans les cellules qui ne sont pas, de façon synchronisée,

soumises à une induction de la prolifération. Par conséquent, nous avons voulus déterminer

si la modulation du niveau d’ARNm NOR-1 variait selon une dynamique comparable à

celle de la protéine suite à une induction au sérum.

Suivant le même protocole expérimental de privation de sérum et d’induction de la

prolifération cellulaire, l’ARN total des fibroblastes a été extrait au temps 0 et 2 heures

après la stimulation, à l’aide de TRIzol (Life Technologies, Inc.). Nous avons ensuite

analysé le niveau d’ARNm NOR-1 par RT-PCR semi-quantitatif. Les amorces qui ont servi

à caractériser les lignées de fibroblastes NOR-1 -/- et +/+, soit 5’-acccccagccccaccattca-3’

et 5’-ccagcggagggaaggtcag-3’, ainsi que les amorces spécifiques de l’actine 5’-

atggatgacgatatcgctgc et 5’-tgtcaggtcccggccag-3’, ont à nouveau été utilisées pour le PCR.

Bien qu’il y ait une augmentation de la quantité d’ARNm au temps 2 heures, qui

correspond au pic d’induction de la protéine, on constate toutefois une présence continuelle

du messager dans les cellules (Fig. 11B). Ces résultats suggèrent qu’une régulation

importante du niveau de la protéine NOR-1 pourrait avoir lieu à l’étape de traduction.

Pourtant, dans la littérature, la quantité d’ARNm est généralement considéré comme

indicatif de la présence du récepteur Nor-1 dans les cellules (Ohkura, Hijikuro et al. 1994;

Labelle, Zucman et al. 1995; Ohkura, Ito et al. 1996; Zetterstrom, Solomin et al. 1996).

6.5.2.3 Croissance cellulaire Afin de vérifier si les fibroblaste en culture se trouvent affectés par l’absence du récepteur

NOR-1, nous avons procédé à une analyse du cycle cellulaire. Les cellules NOR-1 -/- à 70

153

% de confluence ont été synchronisées en G0 par privation de sérum (DMEM/ 0.2% FBS).

L’activation de la division cellulaire a ensuite été induite par un apport de milieu riche

(DMEM/ 20% FBS). Le contenu en ADN des cellules a été évalué au temps 0, 6, 12, 18, 24

et 36 heures par coloration à l’iodure de propidium et analyse par FACS (fluorescence-

activated cell sorter). Pour chaque temps, 2 X106 de fibroblastess ont été prélevés, rincés au

PBS, suspendus dans 50 µl de PBS/2% FBS puis fixés avec 1 ml d’éthanol 75% glacé 30

min à 4°C. Les fibroblastes en suspension ont ensuite été centrifugée à 1600 RPM et

rincées au PBS. Le culot de cellules a été resuspendu dans 500µl d’iodure de propidium

(0.1 mg/ml)/0.6% NP-40/PBS, puis 500 µl de RNAse (2mg/ml)/PBS, ont été ajoutés aux

échantillons. Les fibroblastes en traitement ont finalement été incubés à la noirceur 30 min

à température pièce. Nous avons procédé à la détection du contenu en ADN des cellules par

FACS. Le logiciel CellQuest a servi au traitement de données. Bien que la protéine NOR-1

apparaisse de façon importante et très ponctuelle dans les fibroblastes en réponse à une

activation de la prolifération, les résultats montrent que même en absence du récepteur

nucléaire les fibroblastes effectue normalement leur cycle cellulaire (Fig. 12).

154

Fig. 12 Analyse du cycle cellulaire des fibroblastes NOR-1 -/- en culture primaire. Synchronisation des cellules en G0 par privation de sérum, puis activation de la croissance cellulaire par induction au sérum. Le contenu en ADN des fibroblastes a été évalué au temps 0, 6, 12, 18, 24 et 36 heures suivant l’activation, par coloration à l’iodure de propidium et analyse par FACS. La proportion de cellules en phase G0/G1 (2N), S (2N-4N) et G2/M (4N) du cycle cellulaire est illustrée par les différents pics et indiquée sur le premier histogramme. 10X103 cellules ont été analysées pour chaque temps.

155

6.5.2.4 Induction de NGFI-B et NURR 1 Nous avons ensuite voulu déterminer si NGFI-B et NURR1 répondaient à une induction de

la prolifération cellulaire de façon identique à celle du récepteur NOR-1. Les étapes de

mise en quiescence et d’induction de la croissance ont été effectuées à nouveau.

L’expression des récepteurs nucléaires NGFI-B et NURR1 a été évaluée par buvardage

western aux différents temps établies, après la stimulation. Ces analyses visaient également

à comparer, dans les fibroblaste NOR-1 +/+ et -/-, la régulation de NGFI-B et NURR1.

Nous avons procédé aux mêmes étapes expérimentales décrites précédemment, soit une

mise aux repos des cellules par privation de sérum suivi d’une induction de la prolifération.

Les protéines ont été extraites des fibroblaste en culture (pétris 100mm) aux temps 0h, 0.5h,

1h, 2h, 4h et 8h après l’ajout du milieu DMEM enrichi à 20% de sérum. Les échantillons

ont été analysés par buvardage Western à l’aide d’anticorps polyclonaux (Santa Cruz

Biotechnology) dirigés contre les récepteurs NGFI-B(C-19) et NURR1(N-20). Des dilution

relatives de 1:100 et 1:1000 ont respectivement été utilisés. Les conditions de blocage et

d’incubation sont les mêmes que celles initialement établies pour l’immunobuvardage avec

l’anticorps NOR-1. Le second anticorps de chèvre anti-IgG de lapin couplé à la HRP

(horseradish peroxidase) de Zymed a à nouveau servi aux analyses dans un ratio de 1 :10

000. La présence des protéines a été révélé à l’aide du kit Western Lightning

Chemiluminescence de Perkin-Elmer. C’est immunodétections ont été répétées à trois

reprises.

156

Fig. 13 Réponse de NURR1 et NGFI-B à une stimulation de la prolifération dans des fibroblastes NOR-1 +/+ et -/-. Analyse par buvardage western de la quantité de protéines NURR1 et NGFI-B au temps 0, 0.5, 1, 2, 4 et 8 heures après une induction au sérum des cultures de fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- préalablement mis en quiescence. Des anticorps polyclonaux dirigés contre NGFI-B et NURR1 ont été utilisés pour les immunodétection.

157

NURR1 montre un profil similaire à celui de NOR-1. Ainsi on constate une présence

ponctuelle du récepteur nucléaire qui atteint un niveau maximal 2 heure après la stimulation

de la culture (Fig.13). Toutefois il est presque imperceptible à 4 heures alors que NOR-1

demeure encore visible. De plus, le récepteur NURR1 semble se manifester sous la forme

d’un doublet. Cette observation suggère un état phosphorylé de la protéine.

En réaction à une stimulation de la prolifération, NGFI-B montre une dynamique

d’expression distincte de celle de NOR-1 et de NURR-1. La protéine demeure présente de

façon constante sur la période de 8 heures durant laquelle s’échelonnait l’expérience. On

distingue également la présence d’un doublet, montrant l’existence probable d’une forme

phosphorylée du récepteur déjà observé dans la littérature (Hazel, Misra et al. 1991).

L’importance des résultats obtenus par ces expériences réside principalement dans

l’absence de distinction observé entre les lignées de fibroblaste NOR-1 +/+ et NOR-1 -/-.

Aucune variation significative n’est mise en valeur entre les profils d’expression de Nurr1

et NGFI-B, que le récepteur NOR-1 soit présent ou absent.

6.6 PARP et caspase 8 L’apoptose constitue un mécanisme complexe, régulé par un ensemble de protéines, via

différentes voies de signalisation. Elle est d’abord induite par une catégorie de récepteurs

membranaires « death receptors » regroupant notamment TNF-R1, DR3, DR4 (Trail-R1),

DR5 (Trail-R2) et CD95 (Apo-1/Fas) (Schulze-Osthoff, Ferrari et al. 1998). Ces protéines

se caractérisent par un domaine de mort dans la portion cytoplasmique, qui est impliqué

directement dans l’activation de l’apoptose par le recrutement de protéines de signalisation.

Le complexe protéique formé constitue le DISC (death-inducing signaling complex)

(Kischkel, Hellbardt et al. 1995).

De l’activation à la mort cellulaire, les caspases (cystéine aspartic acid-specific protease)

représentent des médiateurs importants du processus apoptotique. Il s’agit d’enzymes

protéolytiques qui agissent en cascade et clivent une variété de protéines clées. La

procaspase correspond à la forme inactive de la protéine. Le clivage de la procaspase en

caspase entraîne l’activation de l’enzyme.

158

Le rôle de NOR-/- dans l’apoptose avait principalement été mis en évidence dans les

thymocytes, lors de la sélection négative, en réponse à une activation du récepteur TCR

(Cheng, Chan et al. 1997). De plus, NOR-1 avait initialement été identifié dans une culture

primaire de neurones du cerveau antérieur de rat en processus d’apoptose (Ohkura, Hijikuro

et al. 1994). Nous avons donc voulu déterminer si l’absence de NOR-1 dans nos

fibroblastes pouvait affecter les mécanismes apototiques. Afin de comparer la réponse des

fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- à certaines conditions de stress menant à l’apoptose, nous

avons soumis nos cellules à un traitement à la staurosporine, un inhibiteur de protéines

kinases. Pour analyser, à l’aide de marqueurs moléculaires, l’évolution du processus

apoptotique, nous avons évaluer la dynamique des réactions de clivage de la PARP et de la

caspase-8 dans nos cellules traitées.

PARP La Poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) constitue un substrat important de la caspase-3.

Bien qu’elle soit impliquée dans le déroulement de l’apoptose, cette enzyme nucléaire

participe également à une grande variété de processus cellulaires. Elle se définit par sa

capacité à lier des cassures simple ou double brins au niveau desquelles elle exerce son

activité enzymatique. Celle-ci consiste à la synthèse et au transfert de la poly(ADP-ribose),

de son substrat la NAD, à un petit nombre de protéines cibles. La PARP jouerait un rôle

dans les mécanismes de réparation de l’ADN, de recombinaison, de régulation de la

transcription, de prolifération et de la différentiation cellulaire (Aoufouchi, Yelamos et al.

1999). Toutefois, sa fonction spécifique, au cours de ces processus, n’est pas clairement

établit. L’activation de l’apoptose conduit au clivage de la PARP par la caspase-3. Il a été

proposé que la protéolyse de la PARP faciliterait le processus de fragmentation de l’ADN.

Par ailleurs, il n’a jamais été démontré que l’inactivation de celle-ci soit réellement

essentielle à la progression de l’apoptose (Lazebnik, Kaufmann et al. 1994). Malgré tout,

elle demeure un indicatif important pour l’étude de ce processus cellulaire.

Caspase-8 La caspase 8 est impliquée de diverse façon dans l’apoptose. Elle participe à la formation

du DISC, via notamment une interaction avec la protéine adaptatrice FADD/MORT1

159

(Stegh, Barnhart et al. 2002). La protéolyse autocatalytique de la caspase 8 au niveau de ce

complexe produit la libération des sous-unités actives p18 et p10 dans le cytosol et

subséquemment l’activation d’autres caspases, dont la 1, 3, 6 et 7. La caspase 8 clive et

inactive également certaines molécules proapoptotiques dont Bid. Cet homologue de Bcl-2

est alors transloqué au niveau des mitochondries ou il produit une perturbation via un

mécanisme Bax et/ou Bak dépendant.

Les mitochondries prennent part au processus apoptotique. Leur participation se traduit par

une perte de leur potentiel transmembranaire. En effet, la formation de pores entraîne une

modulation de la perméabilité. Simultanément, le clivage du cytochrome C et sa libération

dans le cytoplasme mènent à l’activation de la caspase-3. Cette étape a lieu avec le

concours de la protéine Apaf-1, liant le cytochrome C, ainsi que le complexe Apaf-

3/caspase 9 (Li, Nijhawan et al. 1997). La mitochondrie constituerait un point de contrôle

du processus apoptotique. C’est à cette étape qu’interviendrait les protéines

antiapoptotiques Bcl-2 et Bcl-X. Bien que le rôle spécifique de Bcl-2, Bcl-X, Bax, Bak,

Bad et Bid ne soit pas entièrement établit, ces protéines participeraient à la formation de

canaux dans les membranes mitochondriales. D’autres fonctions particulières leur seraient

également attribuées. Ainsi Bcl-X séquestrerait la caspase 8 active à la surface de la

membrane mitochondriale externe en s’associant avec la protéine BAR (bifonctional

apoptosis regulator) (Zhang, Xu et al. 2000). Tel que mentionné précédemment, il existerait

un mécanisme apoptotique alternatif, indépendant de l’activité mitochondriale dans

certaines cellules. L’efficacité du recrutement et de l’activation de la caspase 8 au niveau

du DISC permettrait à la protéine d’agir directement sur les caspases en aval, dont la

caspase-3 et ainsi de passer outre les fonctions mitochondriales (Scaffidi, Fulda et al.

1998).

Nous avons ainsi analysé la dynamique de la PARP et de caspase-8 dans nos lignées de

fibroblastes NOR-1 +/+ et NOR-1 -/- en réponse à une induction de l’apoptose par un

traitement à la straurosporine. Les fibroblastes ont été étalés à 5X105 cellules par pétris 100

mm, puis incubées 24 heures à 37°C à 5% CO2. La staurosporine a été administrée (1 μM)

aux fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- dans du milieu DMEM/10% FBS durant 3 heures. Des

extraits protéiques ont ensuite été préparés au temps 0h, 6h, 12h et 24h après le traitement

160

puis déposés sur gel de polyacrylamide-SDS 10 % et 12% respectivement pour la PARP et

la caspase-8. Des anticorps polyclonaux anti-poly(ADP) ribose polymerase (PARP) et anti-

caspase 8 (Dr. Guy Poirier et Dr. Madeleine Carreaux Québec, Canada) ont été utilisé pour

ces expériences ainsi qu’un second anticorps de chèvre anti-IgG de lapin, couplé à la HRP

(horseradish peroxidase) (Zymed). L’anti-PARP permet de visualiser la protéine pleine

longueur ainsi que le fragment de 83-85 kDa produit par son clivage, tandis que l’anticorps

dirigé contre la caspase-8 reconnaît la procaspase, le fragment intermédiaire p43/p41 ainsi

que les sous-unités catalytiques p18 et p10 qui n’apparaissent toutefois pas sur notre figure.

Il s’agit d’observations préliminaires réalisées à deux reprises.

Tant dans les lignée de fibroblastes NOR-1 +/+ que NOR-1 -/- on constate le clivage de la

PARP et de la caspase-8, majoritairement à 12 heures après le traitement. La protéolyse se

manifeste par la diminution des protéines pleines longueurs ainsi que par l’apparition des

fragments intermédiaires de 83 et 43 kDa respectivement pour la PARP et la caspase-8.

Bien qu’il semble y avoir des distinctions entre les deux lignées, ces données demeurent

encore préliminaires et démontrent principalement, pour le moment, qu’il y a présence

d’apoptose, en réponse à un traitement avec un inhibiteur des protéines kinases, tant dans

les fibroblastes NOR-1 +/+ que NOR-1 -/-.

161

Fig. 14 Comparaison du profil de clivage de la PARP et de la caspase 8 entre les fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- en cours d’apoptose. Analyse par buvardage western de la protéolyse de la PARP et de la caspase 8 en réponse à un traitement des cellules à la staurosporine (1 µM). Utilisation d’anticorps anti-PARP et anti-caspase 8 pour l’immunodétection.

Discussion Générale

7.1 Rôles du récepteur nucléaire NOR-1

7.1.1 Rôle essentiel de NOR-1 dans le développement de l’oreille interne et de l’hippocampe Deux autres groupes de chercheurs ont axé leur travaux sur la production d’une souris

NOR-1 déficiente. Les premières connaissances apportées par l’inactivation du récepteur

nucléaire NOR-1 chez la souris furent publiées par Ponnio et al. (Ponnio, Burton et al.

2002). Ils démontrèrent d’abord la fonction essentielle du récepteur nucléaire NOR-1 dans

le développement normal des canaux semi-circulaires de l’oreille interne. Ils mirent ensuite

en évidence sa fonction dans le développement post-natal de l’hippocampe (Ponnio and

Conneely 2004).

7.1.1.1 Souris NOR-1 hétérozygotes et patron d’expression Dans un premier temps l’insertion par recombinaison homologue d’un gène codant pour la

β-galactosidase dans le locus NOR-1, plus précisément à l’intérieur de l’exon 3 codant pour

le premier doigt de zinc, a entraîné l’inactivation du gène. Cette stratégie a, dans un

deuxième temps, permis d’étudier, chez la souris hétérozygote, l’expression spatio-

temporel de NOR-1 (Ponnio, Burton et al. 2002). Les observations ont ensuite été comparés

à des résultats d’hybridation in situ chez une souris normale. Des souris C57BL X 129/SV

ont été utilisées pour ces recherches. Tel que connu à travers la littérature l’expression de

NOR-1 est décelée à la naissance dans le cortex, l’hippocampe et le noyau habenulaire. Ces

travaux ont par ailleurs apporté, comme nouveauté, un indice de l’expression de NOR-1

dans les structures formant l’oreille interne des souris. Au jour E11.5 le transcrit NOR-1

serait présent dans la région dorsolatérale de la vésicule otique destinée à formée les trois

canaux semi-circulaires et le vestibule. Ces structures sont responsables de la perception

sensori-motrice et gravitationnelle. NOR-1 est plus spécifiquement limité à l’épithélium

non-sensoriel. Au jour 1 post natal (P1) NOR-1 est exprimé au pourtour interne des canaux

semi-circulaires. Il serait également présent dans les cellules épithéliales des ampullaes,

163

senseurs de l’accélération angulaire et de l’utricle (maculae), senseur de l’accélération

linéaire et de la gravité.

7.1.1.2 Souris homozygotes -/- et développement vestibulaire Du jour E13.5 au jour P1 on observe chez la souris NOR-1 -/- un diamètre inférieur des

canaux semi-circulaires comparativement à celui des souris sauvages (Ponnio, Burton et al.

2002). De plus, on constate une forme anormalement aplanie des ampullaes. Les structures

sensorielles du vestibule paraissent néanmoins intactes. L’apoptose ne serait pas à l’origine

de ce ralentissement de croissance. Une prolifération réduite des cellules épithéliales non

sensorielles serait plus spécifiquement en cause. Chez la souris NOR-1 -/-, au jour E15.5,

les cellules épithéliales des canaux semi-circulaires exprimant normalement Nor-1

montrent une forme habituelle en colonne. Par contre, au jour P1 on observe un

changement morphologique de ces cellules chez la souris NOR-1 déficiente. Elles perdent

leur polarité (formation en colonne) et deviennent aplaties. Une analyse

immunohistochimique de la distribution de la protéine d’adhésion E-cadhérine au jour

E15.5 et P1 a été réalisée. Cette dernière compose les « zonula adherens » cruciales au

maintien du feuillet de cellules épithéliales. Au jour P1 une corrélation entre le changement

structural des cellules endothéliales et l’expression faible de la E-cadhérine est mise en

évidence. En raison de leur morphologie, les auteurs suggèrent une contribution des

cellules épithéliales non–sensorielles des canaux semi-circulaires, exprimant normalement

NOR-1, à la composition du fluide endolymphatique. Elles participeraient également au

maintien de la population de cellules endothéliales par la régulation de la prolifération des

cellules voisines. NOR-1 pourrait exercer un contrôle de la croissance des canaux semi-

circulaires en influençant les voies de signalisation des BMP.

7.1.1.3 Régulation de la croissance axonale des fibres moussus et survie des cellules pyramidales dans l’hippocampe. L’équipe de Ponnio et al ont poursuivit leurs investigations sur la souris NOR-1 -/- (Ponnio

and Conneely 2004). Leurs travaux portaient plus spécifiquement sur le développement

ainsi que la plasticité synaptique des neurones de l’hippocampe. L’insertion d’une cassette

LacZ dans le locus NOR-1 a ainsi permis de mettre en évidence une expression putative du

164

récepteur nucléaire dans les différents types cellulaires constituant l’hippocampe. Au jour

E14.5 du développement embryonnaire, NOR-1 serait exprimé dans la couche plexiforme

primitive de l’hippocampe, en continuité avec la lamina externe du cortex cérébral. À la

naissance le messager NOR-1 serait détecté dans les couches de cellules granulaires du

gyrus denté ainsi que dans les couches de cellules pyramidales du subiculum et des régions

CA1-CA3 de l’hippocampe. La maturation des cellules granulaires se poursuit trois

semaines après la naissance et corrèlerait avec une continuité de l’expression de NOR-1.

L’ARNm NOR-1 serait également présent dans les cellules moussus de la région hilaire du

gyrus denté.

Les cellules moussus de l’hippocampe tirent leur nom de leur apparence filamenteuse qui

rappelle celle des cellules moussus du cervelet. Chacune des cellules granulaires du gyrus

denté donne naissance à une axone (fibre moussu) non-myélinisée qui traverse d’abord

l’hilus de l’hippocampe où elle envoie plusieurs connexions collatérales (Henze, Urban et

al. 2000). L’axone principale atteint ensuite la région CA3 de l’hippocampe, plus

specifiquement le stratum lucidum qui correspond aux dendrites apicales des cellules

pyramidales du CA3. Les projections axonales des cellules moussus formes des synapses

avec les neurones excitateurs et interneurones inhibiteurs de l’hilus et de la région CA3 de

l’hippocampe (Ribak, Seress et al. 1985; Frotscher, Seress et al. 1991). La principale

caratéristique des cellules granulaires est leur capacité à se renouveler tout au long de la vie

de l’animal. Elle sont continuellement générées par des cellules souches situées dans

l’hilus. Les cellules progénitrices migrent ensuite vers la couche de cellules granulaires du

gyrus denté où elles forment de nouvelles projections axonales et connexions synaptiques.

L’analyse structurale de l’hippocampe dorsale montre la présence des couches de cellules

granulaires et pyramidales chez les souris adultes NOR-1 +/+ et -/-. Aucune anormalité

apparente n’est décelée au niveau de la couche granulaire du gyrus dentate. Une

observation approfondie révèle toutefois une désorgaisation des cellules pyramidales des

régions CA1 et CA3 de l’hippocampe chez les souris NOR-1 -/-. Au cours des cinq jours

suivant la naissance (P0-P5), la mortalité par appoptose des cellules pyramidales de la

portion CA1 serait significativement plus élevée chez les souris NOR-1 -/-. Au jour P7, une

diminution de la densité des projections de fibres moussus au niveau de la région CA3 est

165

mise en évidence chez les souris déficientes pour le récepteur nucléaire (Ponnio and

Conneely 2004).

L’innervation du gyrus denté serait également affectée chez les souris déficientes pour le

récepteur NOR-1. Les neurones moussus situés dans l’hilus denté constituent un système

commissural qui envoie des projections axonales dans le gyrus dentate pour former des

connexions synaptiques avec les cellules granulaires et les interneurones inhibiteurs situés

dans la couche moléculaire du gyrus. Ces neurones mousses de l’hilus sont à leur tour

innervées par les fibres mousus originaires des cellules granulaires du gyrus denté. Ces

projections constituent leur principaux synapses excitateurs. Cette boucle de connexions,

permettant un retour d’information exercerait un rôle important dans les mécanismes

d’apprentissage et de mémorisation. Il participerait également à la propagation des influx

lors de crises d’épilepsies. L’absence de NOR-1 chez la souris aurait pour conséquence

d’affecter la croissance axonale des neurones mossus. Au jour P14, cette perturbation se

traduirait morphologiquement par une diminution de l’innervation axonale dans la couche

moléculaire interne du gyrus denté. Chez la souris NOR-1 -/- adulte, la présence de fibres

moussus serait complètement absente au niveau de la lame suprapyramidale du gyrus

dentate et fortement diminuée au niveau de la lame pyramidale inférieure. Cette perte des

fibres moussus ne serait pas attribuable à une perturbation de la différentiation des neurones

mais bien à un problème de migration des axones. En effet, la proportion de corps

cellulaires de neurones moussus dans l’hilus de l’hippocampe ventrale, serait identique

entre les souris NOR-1 -/- et +/+. En outre, cette perturbation morphologique entraînerait

une susceptibilité des souris à des crises convulsives provoquées notamment par l’acide

kainique, un agoniste des récepteurs de la glutamate. Elle évoquerait les troubles

d’épileptiques du lobe temporal observés chez l’humain et découlant d’une pathologie de

l’hippocampe (Bausch and McNamara 1999).

7.1.2 Fonction essentielle de NOR-1 dans la gastrulation L’inactivation du gène NOR-1 chez la souris a également été réalisé par DeYoung et al.

(DeYoung, Baker et al. 2003). Étonnement les résultats obtenus se distinguaient fortement

de ceux observés par Ponnio et al. (Ponnio, Burton et al. 2002; Ponnio and Conneely 2004)

166

Alors que ces derniers mettaient en évidence un anomalie de l’oreille interne et de

l’hippocampe, De Young et al. constataient plutôt une perturbation de la gastrulation au

cours du développement précoce de la souris. La moitié 3’ de l’exon 3 codant pour le

premier doigt de zinc du domaine de liaison à l’ADN fût délété par recombinaison

homologue. Des souris de souche 129/Sv X C57BL/6 furent le modèle animal sélectionné

pour ces expériences.

Selon les résultats de De Young et al. (DeYoung, Baker et al. 2003), il semble que

l’absence de NOR-1 soit létal pour les souris. La pré-implantation des embryons se

déroulerait normalement chez les individus NOR-1 -/-, par contre une morphologie

anormale était décelée au jour E7.5. On observerait une résorption ou une dégénérescence

des embryons NOR-1 -/-, au jour E8.5. NOR-1 serait essentiel à la formation du

mésoderme antérieur ainsi qu’à ses dérivés tel que démontré par hybridation in situ. Le

récepteur exercerait une fonction essentielle dans la distribution des cellules du mésoderme

au niveau de la ligne primitive. Chez la souris NOR-1 -/- ces cellules seraient incapable de

migrer normalement produisant une accumulation inhabituelle du mésoderme au niveau de

la ligne primitive au cours de la gastrulation. Chez les hétérozygotes qui atteignent le jour

E8.5, on constate une hypotrophie de la région du tronc. Des phénotypes comparables

seraient également observés chez les souris déficientes pour les protéines Fgf8 (fibroblaste

growth factor) ou eeg (embryonic ectoderm development gene) (Faust, Schumacher et al.

1995; Sun, Meyers et al. 1999).

7.2 Souris NOR-1 déficientes créées dans notre laboratoire L’analyse du locus et des transcrits NOR-1 chez nos souris, ainsi que les buvardages

westerns montrent que la recombinaison homologue visant à inactiver le gène a bien eu

lieu. Toutefois, les observations histologiques préliminaires dans les différents tissus, où

NOR-1 est normalement exprimé, n’ont pas permis, à ce stade, d’identifier un phénotype

associé à l’absence du récepteur. De plus, la morphologie des souris, leur survie, leur

capacité à se reproduire ainsi que la répartition mendélienne des génotypes à la naissance

n’indiquaient pas la présence d’un trouble physiologique important lié à l’inactivation du

gène NOR-1.

167

La création d’une souris NOR-1 déficiente par Ponnio et al. (Ponnio, Burton et al. 2002) a

permis d’identifier des phénotypes causés par l’absence du récepteur nucléaire orphelin. Tel

que décrit précédemment, les souris montraient une malformation de l’oreille interne qui

consistait plus spécifiquement en une réduction de la taille des canaux semi-circulaires ainsi

que des ampullae correspondantes. Cette anomalie morphologique est causée par une

perturbation de la prolifération cellulaire au niveau de ces structures. Il en résultait une

diminution de l’espace pour le fluide endolymphatique qui circule dans le système

vestibulaire. Le mouvement du fluide endolymphatique dans les conduits est enregistré par

les cellules sensorielles ciliées et permet une perception du mouvement et de la gravité.

Chez la souris ce phénotype se manifestait par un problème d’orientation spaciale en

l’absence d’indices tactiles

Nos souris ont été soumises à un test d’orientation standard « contact righting » afin de

mettre en évidence un trouble associé à une malformation de l’oreille interne. Parmi nos

souris NOR-1 -/-, 58% des individus ont réussi le test tandis que 93.2% des souris NOR-1

+/+ sont parvenu à retrouver leur orientation dans l’espace en l’absence d’indices tactiles.

Nos résultats s’apparentaient à ceux obtenus par Ponnio et collaborateurs qui montraient

que 67% des souris mutantes réussissaient le test contre 100% chez les individus sauvages.

Nos résultats indiquaient donc la présence d’un problème au niveau de l’oreille interne chez

les souris NOR-1 -/-. Ils permettaient de mettre en évidence ce phénotype en l’absence du

récepteur nucléaire, confirmant également la réussite du ciblage génique.

Il est étonnant de constater les différences entre les phénotypes observés chez les souris

NOR-1 -/- créées par nous et Ponnio et al. versus celles créées par DeYoung et al (Ponnio,

Burton et al. 2002; DeYoung, Baker et al. 2003). Certaines hypothèses pourraient expliquer

ces distinctions majeures. Dans un premier temps il est possible qu’au cours du processus

de recombinaison homologue d’autres gènes aient été mutés, soit par une intégration au

hasard du vecteur de ciblage génique, soit par des réarrangements chromosomiques

imprévus. Dans un deuxième temps, l’allèle recombinée peut devenir une allèle

hypomorphe, malgré une délétion stratégique du gène ciblé par l’insertion d’une cassette

néo et/ou lacZ contenant un signal de polyadénylation. Un transcrit ainsi qu’une protéine

168

résiduels peuvent dans certaines circonstances être produits et entraîner des effets dans la

cellule.

Dans le cadre de nos expériences nous avons sélectionné une lignée de cellules ES qui ne

semblait pas avoir intégré la construction en dehors du locus NOR-1, tel que démontré par

buvardage Southern à l’aide d’une sonde néo. Toutefois une seule lignée de cellules ES

recombinante a servi à générer des souris chimériques et mutantes pour NOR-1. Les souris

knock-out produites par DeYoung et al, qui montraient un problème développemental lors

de la gastrulation, originaient également d’une seule lignée ES recombinée. Quant aux

travaux de Ponnio et al, qui a mis en évidence une malformation de l’oreille interne et de

l’hippocampe, deux lignées de cellules ES distinctes ont été sélectionnées pour créer en

parallèle des souris NOR-1 -/-. En ce qui a trait à nos souris, on ne peut exclure la

possibilité que notre mutation ait généré une allèle hypomorphe. Cependant, nos analyses

par RT-PCR montrent qu’il n’y a pas de transcrits produits qui contiennent les séquences

codant pour le premier doigt de zinc constituant le domaine de liaison à l’ADN. De plus,

aucune protéine correspondant au récepteur NOR-1 intégral ou tronqué n’a été identifée par

buvardage Western dans les fibroblastes de nos souris NOR-1 -/-. De Young et al suggérait

que le phénotype obtenu par Ponnio et al puisse résulter d’une allèle NOR-1 hypomorphe.

Cette affirmation était basée sur le fait que seulement 19 acides aminés (212-231) du

domaine N-terminal avaient été éliminés par Ponnio et al. Cependant, la création de notre

souris NOR-1 -/- infirme cette hypothèse puisque les séquences délétées correspondent aux

mêmes acides aminés (182-318) que DeYoung et collaborateurs. Pourtant les phénotypes

que nous observons s’avèrent similaires à ceux du groupe de Ponnio. Finalement, les

souches de souris utilisées peuvent grandement influencer l’expressivité d’un gène et

conséquemment moduler l’impact d’une mutation chez un individu. Nous avons effectué

l’inactivation du gène NOR-1 chez des souches de souris 129cc X (75% 129/Sv, 20%

C57BL/6J, 5% SJL) tandis les équipes de DeYougn et Ponnio ont respectivement travaillé

avec des souches de souris C57BL X 129/Sv et C57BL/6 X 129/Sv (Ponnio, Burton et al.

2002; DeYoung, Baker et al. 2003). Il aurait été nécessaire que DeYougn et collaborateurs

utilisent deux lignées de cellules ES différentes pour engendrer des souris NOR-1 -/- et

ainsi confirmer l’authenticité de leur phénotype. Pour le moment les résultats suggèrent

169

qu’une région du génome autre que le locus NOR-1 ait simultanément été mutée au cours

de la recombinaison homologue.

Selon les travaux de Ponnio et al. (Ponnio, Burton et al. 2002) NOR-1 n’affecterait pas la

différenciation initiale des structures de l’oreille interne, mais aurait plutôt un influence sur

la croissance des canaux semi-circulaires en affectant la prolifération des cellules

épithéliales non-sensorielles. Différentes protéines sont associées au développement de

l’oreille interne, notamment les facteurs de croissance de la sous-famille BMPs (bone

morphogenic proteins). Ces protéines appartiennent à la superfamille des TGF-β

(transforming growth factor β) et ont été identifiées par leur capacité à induire de façon

ectopique la formation de tissus osseux. Chez les mammifères, on retrouve les protéines

BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7 et BMP8, qui participent à l’embryogenèse et au

développement d’une grande variété d’organes. La coexpression des protéines BMPs

permettrait une coopération fonctionnelle, essentielle à la différenciation des tissus (Oh,

Johnson et al. 1996). BMP2, BMP4, BMP5 et BMP7 participeraient à la formation de

l’oreille interne. BMP4 possèderait une fonction plus spécifique dans le développement des

canaux semi-circulaires. Il a été démontré que la présence ectopique de Noggin, un

antagoniste de BMP2 et BMP4, inhibait la croissance des canaux semi-circulaires de

l’oreille interne chez le poulet (Chang, Nunes et al. 1999; Gerlach, Hutson et al. 2000). Il a

également été démontré que les acides rétinoïques régulaient négativement l’expression de

BMP4 dans l’oreille interne chez le poulet et affectaient conséquemment le développement

des canaux semi-circulaires (Thompson, Gerlach-Bank et al. 2003). L’influence de NOR-1

sur la formation des canaux semi-circulaires chez la souris suggère la possibilité d’un lien

entre l’activité du récepteur nucléaire et la signalisation BMP. En somme, il serait

intéressant d’analyser par hybridation in situ la coexpression de NOR-1 et de BMP4 dans

les différents tissus chez la souris et d’établir s’il y a une différence dans le patron

d’expression de BMP4 en l’absence du récepteur nucléaire chez la souris NOR1-/-.

Les protéines de la famille BMPs pourraient présenter un certain intérêt dans le cadre de

nos travaux portant sur les fonctions du récepteur nucléaire NOR-1. En effet, ce dernier est

impliqué dans le développement des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques suite à

des translocations chromosomiques. Ces tumeurs osseuses dites extrasquelettiques se

170

développent dans les tissus mous, principalement au niveau de la musculature. La tumeur

présente l’apparence mucoïde du cartilage hyalin et les cellules montrent des

caractéristiques histologiques similaires à ceux des chondroblastes. Il a été démontré que

les facteurs BMPs étaient requis pour la formation du cartilage. Chez la souris, BMP4

stimulerait la différenciation chondroblastique et participerait à la synthèse du cartillage

(Tsumaki, Nakase et al. 2002). NOR-1 pourrait soit être régulé par la signalisation BMP et

ainsi se situer en aval des facteurs de croissance et de leur récepteurs, soit se trouver en

amont et contrôler l’expression de gène essentiel à la signalisation BMP. Il serait

éventuellement intéressant d’analyser la réponse de cultures primaires de cellules (ES,

neurones, fibroblastes, chondrocytes) NOR-1 +/+ et -/- à une stimulation par les protéines

BMPs. Une analyse du niveau d’expression des protéines BMPs et de leur récepteurs dans

les lignées de chondrocytes exprimant de façon stable la protéine de fusion EWS/NOR-1

pourrait également être effectuée. Les protéines Smads constitue des transducteurs

signalitiques des récepteurs de la famille TGF-β dont fait partie les BMPs (Massagué 1998;

Massagué and Wotton 2000). Successivement à leur activation par les TGF- β, les Smads

sont transloqués du cytoplasme au noyau où ils peuvent agir comme cofacteurs ou facteurs

de transcription. Il interagissent avec un grand nombre de facteurs de transcription et

possèdent l’habilité de recruter certains coactivateurs tel que p300 et CBP. Des interactions

avec les protéines Smads et des récepteurs nucléaires ont été démontrées, notamment avec

VDR, ER et AR (Yanagisawa, Yanagi et al. 1999; Páez-Pereda, Giacomini et al. 2003; Van

Der Poel 2005). Il serait intéressant d’établir si les protéines Smads possèdent la capacité de

lier NOR-1 et ainsi apporter certaines indication sur la possibilité d’une relation entre la

signalisation BMP et le récepteur nucléaire.

Des protéines impliquées dans la chondrogénèse et l’ostéogène, autres que les BMPs,

pourraient constituées des candidats de choix pour l’étude de la fonction du récepteur

nucléaire NOR-1. Les facteurs de croissance IGF-I et IGF-II (Insuline-like growth factors)

sont notamment exprimés dans les chondrocytes en prolifération ou différentiation situés

dans les plaques de croissance des os longs ou dans le cartillage articulaire (Seong,

Matsumura et al. 1994). Ils stimulent la synthèse de protéoglycans constituant la matrice

extracellulaire du cartillage (Takigawa, Okawa et al. 1997). La réponse du récepteur IGF-

IIR serait d’ailleurs médiée par une augmentation de la concentration intracellulaire de

171

calcium. De plus, IGF-I est fortement impliqué dans la regénération des muscles. Il induit

l’expression de facteurs myogéniques et stimule la prolifération et la différentiation des

cellules satellites dans les tissus musculaires. Chez l’humain, le cœur et les muscles

squelettiques contituent les tissus dans lesquels NOR-1 est le plus fortement exprimé. Tout

comme pour les BMPs, il serait intéressant de vérifier si les facteurs IGFs entraîne une

induction de l’espression de NOR-1 ou si certaines protéines impliquées dans la

signalisation IGF dans les muscles ou le cartillage constituent des gènes cibles du récepteur

nucléaire.

Les souris NOR-1 -/- créées par l’équipe de Ponnio et al. (Ponnio and Conneely 2004)

montraient également une malformation de l’hippocampe, tel que décrit en détail

précédemment. Bien que l’apparence structurale semblait normale au premier abord, une

observation minutieuse révélait une désorganisation des cellules pyramidales des régions

CA1 et CA3 chez la souris NOR-1 -/- adulte. Au niveau du gyrus denté une innervation

anormale des neurones de la couche granulaire par les fibres mossus originaires de l’hilus

était observée et résultait d’une perturbation de la migration axonale. En somme, ces

malformations corrélaient avec une augmentation de la gravité des crises convulsives

provoquées par l’acide kainique chez les souris NOR-1 -/-.

Ces résultats montrent l’importance que peut avoir NOR-1 pour le maintien et le

développement du système nerveux central bien que les phénotypes découlant de son

absence puissent se manifester de façon subtile. De plus, ils montrent que malgré le

chevauchement des patrons d’expression de NOR-1, NGFI-B et NURR1, la redondance

fonctionnelle exercée par ces trois récepteurs, demeure partielle pour certains types

cellulaires. Outre l’hippocampe, le cortex cérébral et le cervelet pourraient constitués des

tissus intéressants en vue d’effectuer d’éventuelles analyses. La présence de messager

NOR-1 dans le cortex cérébral, principalement au cours du développement embryonnaire, a

été mise en évidence par plusieurs travaux de recherche (Zetterstrom, Solomin et al. 1996).

De plus, l’interaction entre NOR-1 et le facteur de transcription à homéodomaine SIX3 a

été démontrée (Ohkura, Ohkubo et al. 2001; Laflamme, Filion et al. 2003). Une

coexpression de NOR-1 et de SIX3 dans la portion antérieure de l’encéphale a lieu

notamment au jour E18 de la vie embryonnaire. Il est intéressant de rappeler que SIX 3 est

172

essentiel à la formation des yeux et de la ligne médiane du cerveau. Durant le

développement et à la naissance seul NOR-1, parmis les trois membres de la sous-famille

Nur, est exprimé dans le cervelet. Bien que ce tissu semble intègre chez nos souris NOR-1 -

/-, l’observation détaillée des circonvolutions ainsi que l’analyse des différents types

cellulaires et de leur projections axonales, pourrait peut-être permettre d’identifier de

nouveaux phénotypes. De plus, le cervelet est aussi impliqué dans l’équilibre et la

coordination des mouvements. Nous pourrions d’abord procéder, par hybridation in situ, à

une identification des cellules exprimant le messager NOR-1, puis à une comparaison de

ces cellules, entre les souris NOR-1 +/+ et -/- par immunohistochimie à l’aide d’anticorps

dirigés contre des marqueur cellulaires spécifiques.

Pour terminer, l’augmentation de l’expression de NOR-1 dans le striatum et le noyau

accumbens, suite à une administration d’halopéridol chez la souris, suggère un rôle

potentiel du récepteur nucléaire dans la régulation de gènes responsables de la réponse

pharmacologique à cette drogue (Werme, Olson et al. 2000; Ethier, Beaudry et al. 2004;

Maheux, Ethier et al. 2005).Les antipsychotiques exercent leur effets en liant et blocant le

récepteur D2 de la dopamine. Les expériences préliminaires effectuées sur les souris NOR-

1 -/- montraient un résultat différent de celui obtenu pour les souris NGFI-B. L’état

cataleptique provoqué par l’administration d’halopéridol était observé tant chez les

individus NOR-1 -/- que NOR-1 +/+. Ces résultats suggèrent que NOR-1 contrairement à

NGFI-B ne participe pas aux voies de signalisation du récepteur D2 conduisant à ce

comportement. Il avait été démontré que la contribution de NGFI-B dans l’apparition de

l’état cataleptique, était médié par l’hétérodimère NGFI-B/RXR et modulé par les

rétinoïdes (Ethier, Beaudry et al. 2004; Ethier, Kagechika et al. 2004). Ce qui exclue la

possibilité d’une redondance fonctionnelle par NOR-1, qui est incapable de former un

complexe avec RXR. Dans ce contexte expérimental, NGFI-B, tout comme NOR-1, n’était

pas impliqué dans la signalisation D1. Par contre, une étude avait montré que l’expression

de NOR-1, notamment dans le cortex et le striatum, était modulée par l’activité des

récepteurs des opioides (Werme, Thoren et al. 1999). En somme, malgré un patron

d’expression comparable de NGFI-B et NOR-1 dans le cerveau en réponse aux

antipsychotiques, des fonctions distinctes seraient exercées par ces deux récepteurs

nucléaires en réponse aux antipsychotiques.

173

7.3 Apoptose Les récepteurs nucléaires NOR-1 et NGFI-B exerceraient une fonction apoptotique dans

différents types cellulaires. Leur rôle dans le mécanisme de sélection négative des

thymocytes ou des hybridomes de cellule T, en réponse à une activation du récepteur TCR,

a plus spécifiquement été établi. Ces résultats suggèrent la possibilité d’une redondance

fonctionnelle exercée entre NGFI-B et NOR-1. Différentes expériences ont montré que

NURR1, le troisième membre de la sous-famille, ne possèderait pas ces mêmes fonctions

proapoptotiques dans les cellules T (Cheng, Chan et al. 1997).

La régulation post-traductionnelle de NGFI-B par phosphorylation a également été décrite.

Il a été démontré que AKT phosphorylait NGFI-B au niveau de la sérine 350. Cette

modification du récepteur se produirait dans le cytoplasme où se trouve AKT et exercerait

un effet inhibiteur sur le processus apoptotique des cellules T. Le sentier phosphatidyl

inositol 3-kinase-AKT serait plus spécifiquement impliqué dans la transmission du signal

de survie (Masuyama, Oishi et al. 2001; Pekarsky, Hallas et al. 2001).

Par ailleurs, aucun gène cible du récepteur nucléaire NGFI-B, susceptible de posséder une

fonction dans le déroulement de l’apoptose, n’a été mis en évidence. Malgré son rôle

fondamental de facteur de transcription, les recherches tendent également à montrer la

participation de NGFI-B dans l’apoptose par sa translocation dans la mitochondrie.

Un changement de compartimentation de NGFI-B, du noyau aux mitochondries,

surviendrait en réponse à différents stimuli proapoptotiques. Une libération du cytochrome

C, puis la mort cellulaire succéderaient à cette translocation (Li et al. Science 2000).

L’action de NGFI-B aux mitochondries, dans le contexte du processus apoptotique a été

mis en évidence dans une variété de cellules tumorales provenant des poumons, de la

prostate, de l’ovaire, du colon et de l’estomac. Jusqu'à récemment, le rôle de NGFI-B aux

mitochondries demeurait abstrait. Il a maintenant été démontré que le récepteur nucléaire

NGFI-B interagissait avec Bcl-2. Cette liaison entraîne un changement de conformation de

Bcl-2, modifiant ainsi son potentiel antiapoptotique en propriété proapoptotique.(Lin,

Kolluri et al. 2004). Il a été démontré que cette translocation de NGFI-B aux mitochondries

et l’interaction avec Bcl-2 avait lieu sous forme d’hétérodimère NGFI-B/RXR. De plus, la

174

présence du ligand de RXR (9-cis-RA) favorisait une survie de la cellule et inhiberait le

ciblage des mitochondries par NGFI-B/RXR (Cao, Liu et al. 2004).

Tel qu’énoncé précédemment, NGFI-B et NOR-1 semblent exercer des fonctions

identiques dans le processus apoptotique des thymocytes et des hybridomes de lymphocyte

T. Chez la souris NGFI-B -/-, l’absence de phénotype suggère une redondance

fonctionnelle exercée par NOR-1. En parallèle, nos souris NOR-1 déficientes ne semblent

pas affectées par une perturbation du système immunitaire. L’aspect du thymus apparaît

identique entre les souris NOR-1 -/- et sauvages. Une analyse sommaire a été effectuée sur

nos lignées de fibroblastes NOR-1 en réponse à une induction de l’apoptose par un

traitement à la staurosporine. Tant dans les lignées NOR-1 +/+ que -/- on observe le clivage

de la PARP et de la caspase-8, qui témoigne du déroulement de la mort des cellules. Nos

résultats appuient l’hypothèse d’une redondance fonctionnelle exercée par NGFI-B, tel que

décrit par le groupe de Milbrandt pour la souris nulle NGFI-B (Lee, Wesselschmidt et al.

1995; Katagiri, Hirata et al. 1997).

Ce rôle physiologique similaire de NOR-1 et NGFI-B pourrait également se traduire par

certains modes d’action comparables. Dans un premier temps, il pourrait être intéressant de

déterminer si le récepteur NOR-1 subit une translocation entre les différents compartiments

cellulaires, du noyau au cytoplasme et du cytoplasme à la mitochondrie puis de montrer si

la présence de NOR-1 à la mitochondrie est associée à une libération subséquente du

cytochrome C. Dans un deuxième temps, établir si NOR-1 est également phosphorylé par

AKT. En effet, les séquences consensus de reconnaissance et de phosphorylation de AKT,

situées dans le domaine de liaison à l’ADN de NGFI-B sont également présentes chez

NOR-1. Finalement, déterminer si NOR-1 interagit avec Bcl-2 pour transformer le potentiel

antiapoptotique de ce dernier en propriété proapoptotique. Toutefois, ces différents

mécanismes de régulation de NGFI-B sont exercés dans un contexte d’hétérodimérisation

avec RXR, ce dont NOR-1 serait incapables, ainsi il est fort probable que ces interactions

ne soient pas redondantes chez NOR-1.

Les trois membres de la sous-famille de récepteurs nucléaires, NOR-1, NURR1 et NGFI-B

montrent une forte homologie de séquence en acides aminés. On constate une grande

similarité entre les domaines de liaison à l’ADN (entre 90 et 100%). Par ailleurs, ces

175

protéines se distinguent davantage dans la portion N-terminale ainsi qu’au niveau du

domaine de liaison au ligand. Cette dernière région contient les séquences essentielles à

l’interaction de NGFI-B avec la protéine Bcl-2. Une homologie de 66% prévaut entre

NOR-1 et NGFI-B au niveau du fragment C-terminal. L’hélice-α putative circonscrite par

les acides aminés 471-488 est identique à 66%. Par ailleurs, la leucine en position 487

considérée comme importante dans l’interaction de NGFI-B et Bcl-2 n’est pas conservée

chez NOR-1. Une lysine, un acide aminé basique, est présente à cette position plutôt qu’une

leucine possédant une chaîne latérale hydrophobe. Cette observation va à l’encontre de la

possibilité qu’une interaction entre NOR-1 et Bcl-2 puisse avoir lieu. Il est possible que la

redondance fonctionnelle exercée entre NOR-1 et NGFI-B ne se limite qu’à leur activité de

facteur de transcription. En effet, la fonction proapoptotique redondante de NOR-1 et

NGFI-B n’a à ce jour été démontré que dans les thymocites, lors du processus de sélection

négative. Dans ce type cellulaire, la translocation de NGFI-B aux mitochondries n’a pas été

mise en évidence.

Des travaux récents ont montrés que la prostaglandine A2 (PGA2) constituerait un

coactivateur potentiel du récepteur nucléaire NOR-1 (Kagaya, Ohkura et al. 2005). Elle

aurait pour effet d’accroître l’activité transcriptionnelle de NOR-1. PGA2 possèderait la

capacité de lier le LBD toutefois la présence du domaine AF-1 serait essentielle à la

synergie des deux molécules. PGA1 montrerait également une affinité pour le LBD du

récepteur nucléaire. Ces résultats s’avèrent intéressant dans la mesure où PGA2 est

impliqué dans la régulation du cycle cellulaire, l’apoptose ainsi que l’inhibition du la

croissance. PGA2 induirait l’expression de p21 et supprimerait celle de cycline D1 menant

finalement à l’arrêt du cycle en G1. Dans le contexte d’une interaction avec le récepteur

nucléaire, PGA2 favoriserait l’activité proapoptotique de NOR-1 dans les cellules T

(Kagaya, Ohkura et al. 2005).

7.4 Promoteur de NOR-1 Une activation de l’expression de NOR-1 a été mise en évidence dans des cellules MCF-7,

une lignée cellulaire du cancer du sein humain, en réponse à une induction de la mort

cellulaire causé par le calcium ionophore (Ohkubo, Ohkura et al. 2000). Ce composé active

176

l’apoptose par une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium. Dans les

thymocytes, le signal apoptotique induit par l’activation du récepteur TCR est également

dépendant du niveau de Ca2+ dans la cellule. Tel que déterminé par northern blot, le

calcium ionophore produit une augmentation importante de la quantité d’ARNm de Nor-1

dans la cellule MCF-7, 6 heures après la stimulation. L’expression diminue rapidement

mais le signal demeure 24h après l’induction. Une région promotrice de NOR-1 impliquée

dans cette régulation a été identifiée. Tel que démontré par mesure de l’activité luciférase,

on note un pic d’activité 3 heures puis 18 heures après la stimulation au calcium ionophore.

Une région contenant trois éléments de réponse CRE (cAMP response element), 95

nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription, a plus spécifiquement été

circonscrite (Ohkubo, Ohkura et al. 2000).

Le CRE binding factor (CREB) constitue le facteur de transcription spécifique à l’élément

de réponse CRE. Son activité est régulée par la phosphorylation et s’accroît en réponse à

différents signaux extracellulaires. En outre, la forme phosphorylée du CREB est mise en

évidence dans les cellules MCF-7 30 min après une stimulation au calcium ionophore. Le

signal persiste jusqu’à 6 heures après l’activation. La dynamique de la protéine CREB

concorde avec le profil d’expression de NOR-1. Ces résultats montrent que NOR-1 se

comporterait comme un « immediate early gene » dans le contexte de régulation de la mort

cellulaire. Ils suggèrent également que la liaison du facteur de transcription CREB au

niveau des trois séquences CRE, situées dans le promoteur de NOR-1, soit impliquée dans

le contrôle de la transcription de NOR-1 en réponse au signal apoptotique.

Nous avons caractérisé le gène NOR-1 chez la souris afin, entre autre, de procéder à la

construction d’un vecteur de ciblage génique. Lors de ces analyses, le site putatif

d’initiation de la transcription a été établit par la technique de RACE (Rapid amplification

of cDNA end). À partir de ce point, nous avons procédé à la caractérisation de la séquence

en 5’ afin de mettre en évidence des éléments de réponses potentiels. Trois sites spécifiques

à la protéine CREB ont été identifiés dans le promoteur de la souris (Maltais and Labelle

2000). Tout comme chez l’humain, ils se situaient plus précisément dans les 100 premiers

nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription. La conservation des éléments

de réponses CRE dans le promoteur de NOR-1 chez la souris et l’humain, montre

177

l’importance de ces séquences régulatrices pour l’activité du gène. Elle renforce

l’hypothèse de l’influence de la concentration intracellulaire de Ca2+ sur l’expression de

NOR-1 à travers ces éléments de réponse.

L’analyse de la séquence promotrice du gène NOR-1 humain a permis de mettre en

évidence la présence d’un motif MyoD également conservé chez la souris. L’existence de

cet élément pourrait expliqué en partie l’expression élevée des NOR-1 dans les tissus

musculaires (Ohkura, Ito et al. 1998).

7.5 Cofacteurs de NOR-1 et domaine AF2 La fusion des gènes EWS/NOR-1, TAF2N/NOR-1, TCF12/NOR-1 et TFG/NOR-1 causées

respectivement par les translocations t(9;22)(q22;q12), t(7 ;17)(q22 ;q11),

t(9 ;15)(q22 ;q21) et t(9;3), a été mise en évidence dans des chondrosarcomes myxoïdes

extrasquelettiques. Ces réarrangements chromosomiques sont à l’origine de protéines de

fusions qui ont en commun la séquence complète du récepteur nucléaire NOR-1. Bien que

EWS, TAF2N, TCF12 et TFG puissent avoir un impact important dans le développent des

chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques, NOR-1 constitue l’élément clé dans la

spécification de ces tumeurs.

EWS est le partenaire de fusion de NOR-1 le plus fréquemment identifié, dans les

chondrosarcomes myxoïdes extrasqelettiques. La fusion EWS/NOR-1 a d’ailleurs été mise

en évidence dans ces tumeurs osseuses par les travaux de Labelle et al. (Human molecular

genetics. 1995). La protéine chimérique a donc été privilégiée pour étudier en parallèle le

potentiel d’activateur de la transcription de NOR-1 et de EWS/NOR-1. Il avait été

démontré par Labelle et al. (Oncogene. 1999) que la protéine EWS/NOR-1 était capable de

lier l’élément de réponse NBRE, spécifique des récepteurs de la sous-famille NGFI-

B/NURR1/NOR-1, et que la portion N-terminale de EWS en amont du récepteur NOR-1

accroissait de façon importante le potentiel d’activation de la transcription de NOR-1. Dans

des cellules COS-1 et C-20/A4 transfectées avec EWS/NOR-1 et NOR-1, le niveau

d’activité d’un gène rapporteur était respectivement 270 et 50 fois supérieure en présence

de la protéine de fusion. Tel que décrit précédemment, EWS est impliqué dans une variété

de tumeurs suite à des translocations chromosomiques qui produisent la fusion de la portion

178

N-terminale de EWS avec un facteur de transcription. Ce patron récurrent s’accorde avec

l’observation que la séquence EWS stimule l’activité transactivatrice du facteur impliqué. Il

avait d’ailleurs été démontré que la portion N-terminale de EWS, fusionnée au domaine de

liaison à l’ADN de Gal 4, possédait un potentiel intrinsèque d’activation de la transcription

(May, Lessnick et al. 1993; Bailly, Bosselut et al. 1994). Il est intéressant de noter que

EWS et TAF2N, de la même sous-famille et constituant des partenaires de fusion de NOR-

1, interagissent in vitro avec le facteur TFIID de l’ARNpol II. En somme, ces résultats

suggéraient une participation majeure de la portion EWS au potentiel d’activation de la

transcription des protéines de fusion (Bertolotti, Melot et al. 1998).

Dans le contexte de la protéine EWS/NOR-1 une série de délétions de la séquence EWS

avait été effectuée afin d’évaluer son rôle dans l’activité de l’oncogène. Ainsi l’absence des

65 premiers acides aminés, constituant la portion N-terminale EWS de 265 aa, entraînait

une diminution de 75% du potentiel de transactivation de la protéine de fusion (Labelle,

Bussieres et al. 1999). La diminution de l’activité se poursuivait ensuite en corrélation avec

le nombre d’acides aminés délétés. En parallèle, le rôle de la portion C-terminale de Nor-1

dans l’activité transactivatrice de la protéine de fusion avait également été étudié. Il existe

une variante du transcrit de type 2 EWS/NOR-1, mise en évidence dans les

chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques (Brody, Ueda et al. 1997). Cette isoforme

EWS/NOR-1ΔC résultant d’un épissage alternatif est produit selon le même patron que le

récepteur tronqué Nor-1ΔC normalement présent dans la cellule. La protéine EWS/NOR-

1ΔC s’avère un activateur modéré de la transcription comparativement à EWS/NOR-1. Elle

possède une capacité transactivatrice légèrement inférieure à celle de Nor-1 dans les

cellules Cos-1 et C-20/A4. En fait, tout comme NOR-1ΔC, la protéine chimérique

EWS/NOR-1ΔC possède une faible affinité pour le NBRE (Labelle, Bussieres et al. 1999).

Les travaux décrits dans le deuxième article de cette thèse avaient pour objectif de

comprendre davantage la contribution des séquences NOR-1 dans le potentiel

transactivateur de la protéine de fusion EWS/NOR-1. La capacité d’activation de la

transcription de la portion EWS avait clairement été définie dans le cadre de plusieurs

études. L’importance de NOR-1 dans le développement spécifique des chondrosarcomes

myxoïdes extrasquelettiques avait également été établit par l’identification de nouveaux

179

partenaires de fusion, TAF2N et TCF12. Par contre, quel rôle possède les domaines de

transactivation du récepteur nuclaire NOR-1 au sein de la protéine de fusion? Nous nous

sommes attardé plus spécifiquement à la fonction du domaine AF-2, dont la région centrale

s’avère fortement conservée parmi l’ensemble des récepteurs nuclaires de la superfamille.

Différentes constructions d’ADNc codant pour des mutants EWS/NOR-1 et NOR-1 ont été

produites. La région centrale du domaine AF-2 a ainsi été délétée entièrement ou modifiée

par substitution d’acides aminés. Nous avons ensuite effectué des transfections transitoires

dans des COS, C20, TC28 et NIH 3T3 puis évalué l’activité transactivatrice des protéines

mutantes au niveau d’un élément de réponse NBRE en mesurant le niveau d’expression

d’un gène rapporteur.

Dans les cellules TC28, la délétion du domaine AF-2 entraîne une diminution d’environ

30% de l’activité de EWS/NOR-1, alors que dans les cellules C20 ont observe une

réduction de 15%. Ces résultats indiquent la participation importante du domaine AF-2 de

NOR-1 dans le potentiel d’activation de la transcription de l’oncogène EWS/NOR-1.

L’étude en parallèle de mutants EWS/NOR-1 et NOR-1 révèle que le domaine AF-2, tant

dans la protéine de fusion que dans le récepteur natif, semble exercer des fonctions

identiques. En effet, la modulation du niveau d’expression, résultant de la substitution d’un

acide aminé, se révèle similaire pour les deux protéines, bien qu’à une échelle distincte.

Outre la possibilité d’une interaction avec un ligand ou une modification post-

traductionnelle de la portion NOR-1, l’interaction de protéines coactivatrices au niveau du

domaine AF-2, importantes tant pour l’activité de EWS/NOR-1 que de NOR-1, pourrait

constituer une explication intéressante. Ainsi, ces cofacteurs participant au potentiel

tumorigénique de EWS/NOR-1 pourraient être des partenaires impliqués dans l’activité

normale du récepteur nucléaire NOR-1.

Les différents travaux portant sur l’interaction de cofacteurs avec les membres de la sous-

famille NOR-1/NGFI-B/NURR1 soulignaient davantage l’importance du domaine AF-1.

Dans des lignées C2C12, issues de cellules musculaires lisses, la capacité transactivatrice

des différents domaines du récepteur nucléaire NOR-1 a été étudiée (Wansa, Harris et al.

2003). La portion N-terminale, contenant le domaine AF-1, et plus précisément les acides

aminés 1 à 112, semblent essentiels à la fonction transactivatrice de NOR-1. Les cofacteurs

180

SRC 1, 2 et 3 montrent, in vitro, une affinité plus importante pour cette région que pour

l’extrémité C-terminale de NOR-1, contenant le domaine AF-2. Les cofacteurs, spécifiques

aux récepteurs nucléaires, p300, Drip 205, PCAF, et SRC interagissent directement avec

NOR-1 in vitro. Le complexe de coactivateurs se forme au niveau de la région N-terminale

du récepteur. Toutefois, la présence aditionnelle du LBD renforce ces interactions. Des

résultats identiques étaient obtenus pour NGFI-B montrant l’importance du domaine AF-1

pour l’activité du récepteur nucléaire (Wansa, Harris et al. 2002). Il avait également été

démontré dans des cellules AtT20 que l’association du CBP (Creb binding protein) au

SRC1 accentuait fortement le potentiel de transactivation des récepteurs NOR-1, NGFI-B

et NURR1 (Maira, Martens et al. 2003). Le recrutement de ces cofacteurs s’effectuait par le

biais du domaine AF-1 de manière dépendante de la protéine kinase A (PKA). En somme,

l’ensemble de ces résultats mettaient l’accent sur l’importance du domaine AF-1 dans

l’activité des récepteurs de la sous-famille NOR-1/NGFI-B/NURR1. Dans le cadre de

certaines recherches, la fonction de l’extrémité C-terminale consistait même à consolider

les liens créés entre les différents cofacteurs et l’extrémité N-terminale des récepteurs

nucléaires. Le domaine AF-2 de NURR1 avait néanmoins fait l’objet d’études. Dans des

cellules 293 humaines, une délétion des séquences AF-2 du récepteur entraînait une perte

importante de son activité transactivatrice au niveau d’un élément de réponse NBRE

(Castro, Arvidsson et al. 1999).

Chez les récepteurs nucléaires de la sous-famille Nur, on retrouve au cœur du domaine AF-

2 une lysine, inhabituelle parmi l’ensemble des récepteurs nucléaires de la super-famille qui

contiennent à cette position un acide glutamique hautement conservé. La substitution de

cette lysine pour une alanine ou un acide glutamique accroît le potentiel d’activation de la

transcription de NURR1 dans le contexte de lignées cellulaires neuronales C172 (Castro,

Arvidsson et al. 1999). Ces résultats appuyaient l’idée que l’activité transactivatrice des

récepteurs de la sous-famille Nur était atténuée au niveau du domaine AF-2,

comparativement à d’autres récepteurs nucléaires, et s’exerçait d’avantage par l’extrémité

N-terminale. Dans le cadre de nos expériences nous avons également remplacé la lysine du

domaine AF-2 de NOR-1 par une alanine. Toutefois, l’analyse du potentiel d’activation de

la transcription des mutants EWS/NOR-1 et NOR-1 ne montraient pas une variation

significative causée par cette substitution.

181

L’interaction du récepteur nucléaire NOR-1 et de la protéine à homéodomaine Six3 avait

été mise en évidence (Ohkura, Ohkubo et al. 2001). Le domaine de liaison à l’ADN ainsi

que l’extrémité carboxy-terminale de NOR-1 était nécessaire à cette interaction. Des

expériences de transfections dans des cellules MCF-7 d’adénocarcinomes humains avaient

ensuite montré que la présence de Six3 exerçait un effet suppressif de manière dose

dépendante sur l’activité transactivatrice de NOR-1 au niveau de l’élément de réponse

NBRE. (Ohkura, Ohkubo et al. 2001). L’influence putative de Six3 sur l’activité

tumorigénique de EWS/NOR-1, dans le contexte des chondrosarcomes myxoïdes

extrasquelettiques avait ensuite été investiguée (Laflamme, Filion et al. 2003). L’expression

de Six3 a été détectée dans des tumeurs contenant les transcrits EWS/NOR-1 de type 1 et 2.

L’interaction in vitro avec la protéine de fusion et le récepteur NOR-1 a ensuite été

confirmée. Le domaine de liaison à l’ADN de NOR-1 est essentiel à l’interaction entre Six3

et NOR-1, cependant la portion C-terminale du récepteur n’était pas requise. Quant à la

protéine de fusion, Six3 montre une affinité pour la portion EWS. Contrairement à l’effet

répressif de Six3 sur l’activité transcriptionnelle de NOR-1 dans les cellules MCF-7

(Ohkura, Ohkubo et al. 2001), une fonction coactivatrice de Six3 sur le récepteur nucléaire

NOR-1 est exercée dans des lignées de chondrocytes TC-28 et C-20/A4. Curieusement,

Six3 produit un effet inhibiteur sur la protéine de fusion EWS/NOR-1 dans les lignées de

chondrocytes (Laflamme, Filion et al. 2003). L’influence variable que peut exercer la

protéine homéotique Six3 sur le récepteur nucléaire NOR-1, selon le contexte cellulaire ou

en fonction de son état, natif ou fusionné, suggère la participation majeure de tierces

protéines régulatrices sur l’activité du complexe Six3 et NOR-1. De plus, ces résultats

montrent une fonction importante de l’interaction de Six3 avec la portion EWS de la

protéine de fusion. Il est possible que la présence de Six3 empèche la liaison de cofacteurs

participant habituellement au potentiel de transactivation de la portion EWS. Ces

observations illustrent à nouveau l’importance que peuvent exercer les cofacteurs et nous

ammènent à conclure que l’étude des fonctions transactivatrices de NOR-1 requiert une

meilleure connaissance de ses partenaires.

La charactérisation fonctionnelle du domaine AF-2 du NURR1 par mutagénèse avait

montré que les résidus I588, D589 et F592 étaient essentiels à l’activité transcriptionnelle

du récepteur nucléaire et leur substitution par une alanine abolissant cette fonction du

182

récepteur nucléaire (Castro, Arvidsson et al. 1999). Ces trois résidus également présent

dans le domaine AF-2 de NOR-1 s’avèrent extrêmement important pour l’activité du

récepteur nucléaire. En effet, nos analyses ont montré que la substitution des acides aminés

correspondants I616A, D617A et F620A entraînaient une forte diminution de l’activité

transcriptionnelle de NOR-1 ainsi que de la protéine de fusion EWS/NOR-1 (Maltais,

Filion et al. 2002). Les acides aminés I588 et L591 constituant l’hélice 12 de NURR1 et

formant le cœur du domaine AF-2 contribuent à l’obstruction de la cavité de liaison au

ligand (LBPocket), caractère qui concorde avec l’idée d’un récepteur nucléaire ligand

indépendant et constitutivement actif (Wang, Benoit et al. 2003). Ces résidus sont

également conservés dans le motif AF-2 de NOR-1. Ces similitudes pourraient suggérer des

mécanismes régulateurs comparables entre les deux récepteurs. Une corrélation entre

l’activité transcriptionnelle de NURR1 et la stabilité de son LBD, qui peut être influencée

notamment par une modulation de l’état de phosphorylation, a été établie (Wang, Benoit et

al. 2003). Ainsi l’importance du domaine AF-2 de NOR-1 pour son activité

transcriptionnelle pourrait découler du rôle de certaines résidus à assurer une stabilité de la

protéine.

Bien qu’une fonction prépondérante du domaine AF-2 de NURR1 soit attribuée à son rôle

de stabilisateur, il n’est pas exclus que des interaction avec des cofacteurs puissent exercer

une certaine influence. Des expériences de spectroscopie NMR (Nuclear Magnetic

Resonance) ont permis d’identifier un sillon entre les hélice 11 et 12 du LBD qui pourrait

servir de site d’interaction pour des cofacteurs (Codina, Benoit et al. 2004). Ces

expériences d’empreintes NMR ont été réalisées plus précisément avec des peptides dérivés

des co-répresseurs SMRT et NcoR. L’interaction de SMRT avec NGFI-B avait initialement

été démontrée (Sohn, Kwak et al. 2001). Les résidus F574, F592 et L593 de NURR1

seraient importants pour la liaisons aux peptides et constitueraient une région hydrophobe

propice à l’interaction de co-répresseurs. Ces acides aminés sont conservés chez NOR-1,

toutefois le LBD de NOR-1 pourrait posséder une structure distincte ainsi que des

propriétés différentes. En effet, bien que la séquence en acide aminé des hélice 11 et 12 de

NURR1 et NGFI-B soit très similaire, la structure tridimensionnelle de cette région diffère

(Flaig, Greschik et al. 2005).

183

En conclusion, il serait intéressant d’établir si la diminution importante de l’activité

transcriptionnelle du récepteur NOR-1 et de la protéine de fusion EWS/NOR-1 suite à la

mutation du domaine AF-2 résulte d’une perte de stabilité des protéines ou de l’interruption

d’interactions essentielles avec des cofacteurs.

Fig. 1 Modèle expliquant le rôle du domaine AF-2 du récepteur nucléaire NOR-1 et de

la protéine de fusion EWS/NOR-1. A) Le domaine AF-2 pourrait avoir comme fonction

d’assurer la stabilité d’interactions de cofacteurs liant la portion N-terminale de NOR-1 et

de EWS. B) Le domaine AF-2 pourrait également s’avérer essentiel pour l’activité

transcriptionnelle de NOR-1 et EWS/NOR-1 par le recrutement de cofacteurs.

7.6 Isoformes Dans le premier chapitre, les travaux portant sur l’isoforme NOR-1 tronquée à l’extrémité

C-terminale ont d’abord permis de montrer la présence du transcrit court dans l’ensemble

des tissus où est exprimé le récepteur pleine longueur (Maltais and Labelle 2000). Bien que

le niveau de messager NOR-1ΔC soit inférieur à celui de NOR-1, sa variation entre les

différents organes est identique à celle observée pour le récepteur intégral. Le transcrit

NOR-1ΔC, produit par épissage alternatif, est conservé chez l’humain, le rat et la souris

(Petropoulos, Part et al. 1995; Ohkura, Ito et al. 1998; Maltais and Labelle 2000). Il existe

également une isoforme tronquée en C-terminale du récepteur nucléaire NURR1 désignée

NURR2 (Ohkura, Hosono et al. 1999). Les expériences de gel de retard de mobilité et de

184

transfection ont montré la faible affinité de NOR-1ΔC humain pour le NBRE. Toutefois, en

effectuant une délétion des acides aminés en C-terminal spécifiques de la forme courte ou

en les substituant par la séquence correspondante de souris, on constate que le NOR-1ΔC

modifié acquière la capacité de lier le NBRE. En somme, il est possible que la faible

affinité pour le NBRE ne soit pas une caractéristique des formes tronquées du récepteur

NOR-1. L’analyse du potentiel de transactivation montre une activité réduite des isoformes

NOR-1ΔC, comparativement au récepteur NOR-1 pleine longueur ,et ce, qu’elles puissent

ou non lier le NBRE. Ces résultats révèlent à nouveau l’importance des séquences en C-

terminale, incluant le domaine AF-2, pour la capacité transactivatrice du récepteur

nucléaire NOR-1. Par ailleurs, ils n’expliquent pas la fonction que pourrait exercer la forme

courte du récepteur nucléaire dans la cellule ou du moins son impact. L’activité

transcriptionnelle de NURR2, avait été évaluée et comparée à celle de NOR-1, NGFI-B et

NURR1 lors d’analyses par transfections et s’avérait très faible (Ohkura, Hosono et al.

1999). Des cotransfections dans des cellules MCF-7 avaient ensuite montré qu’une

présence croissante de NURR2 dans la cellule réduisait le potentiel de transactivation des

récepteurs NURR1, NGFI-B et NOR-1, suggérant un effet inhibiteur de l’isoforme

tronquée sur les récepteurs de la sous-famille Nur. Il est possible que NOR-1ΔC puissent

également exercer une répression sur les récepteurs nucléaires NURR1, NGFI-B et NOR-1

pleine longueur, notamment par compétition pour le recrutement de cofacteurs liant la

portion N-terminale. Bien que le transcrit NOR-1 codant pour une forme du récepteur

tronquée en C-terminale ait été mis en évidence chez différentes espèces, la présence de la

protéine endogène NOR-1ΔC, n’a pas encore été détectée. Il est possible que la production

de protéine ne soit pas corrélée au niveau de messager présent dans les différents types

cellulaires. En supposant l’existence de NOR-1ΔC, il est envisageable que le récepteur ne

soit traduit que de façon très ponctuelle dans le contexte d’une réponse physiologique

précise.

7.7 Prolifération cellulaire L’établissement des lignées de fibroblastes NOR-1 +/+ et -/- à partir d’embryons de souris

avait dans un premier temps pour objectif de créer un modèle biologique simple permettant

de mieux comprendre la participation du récepteur nucléaire aux différents mécanismes

185

cellulaires. Nous avons d’abord tenté de mettre en évidence la présence de la protéine

NOR-1 dans les cellules en état de prolifération. Nous avons procédé à une mise en

quiescence des cellules par privation de sérum, puis à une induction de la croissance par

l’ajout d’un milieu de culture riche. La présence du récepteur nucléaire NOR-1 était

détectée et atteignait son niveau maximum deux heures après la stimulation. À 4 heures la

protéine demeurait encore présente bien qu’en quantité plus faible. Après 8 heures le

récepteur n’était plus décelé. En outre, il s’agissait du premier buvardage western effectué à

partir d’extraits cellulaires mettant en évidence l’existence de NOR-1. En comparant le

niveau de messager NOR-1, par RT-PCR semi-quantitatif, à celui de la protéine, on

constate une régulation distincte de l’expression de l’ARNm et de la protéine. Au temps 0,

alors que les cellules sont en quiescence, l’ARNm de NOR-1 est détecté, mais aucun signal

n’indique la présence de protéine. Deux heures après l’induction on observe une

augmentation de la quantité de messager et une apparition importante de la protéine.

D’après ces résultats, une régulation majeure de NOR-1 pourrait être exercée à l’étape de la

traduction tandis qu’un niveau basal des transcrits seraient maintenu dans les cellules. De

plus, le récepteur nucléaire n’apparaîtrait que de façon ponctuelle, en réponse à un signal,

pour ensuite être dégradé. Dans la littérature, la présence du récepteur nucléaire NOR-1 est

principalement établie d’après le patron d’expression de l’ARNm. Tel que démontré par

nos travaux, la modulation du niveau de messager peut être un indicateur de la variation de

la protéine NOR-1, mais pourrait ne pas corréler avec la présence ou non du récepteur

nucléaire dans la cellule à l’état basal. Il est évident que les techniques d’immunodétection

par buvardage western et d’amplification par RT-PCR ne possèdent pas le même seuil de

sensibilité. Une analyse par buvardage Northern pourrait s’avérer un indicateur plus précis

du niveau d’ARNm NOR-1.

Parmi l’ensemble des récepteurs de la superfamille, trois mécanismes de régulation

prédominent. L’activité transactivatrice peut être modulée par la liaison du ligand au

récepteur ou à son partenaire d’hétérodimérisation, par un changement de l’état de

phosphorylation ou par une interaction avec d’autres protéines tel que des cofacteurs. Nous

avons mis en évidence précédemment l’influence importante que peuvent exercer les

cofacteurs sur l’activité de la protéine NOR-1 dans différents types cellulaires. Dans des

fibroblastes en prolifération, nous avons montré qu’une certaine forme de régulation de

186

l’activité du NOR-1 pouvait être exercé par une présence fugace du récepteur dans la

cellule. Sa fonction pourrait consister, telle qu’établit initialement, en une activation

constitutive de la transcription, limitée par son apparition importante mais de courte durée.

Dans ce même contexte expérimental, nous avons ensuite analysé la modulation du niveau

de NGFI-B et NURR1 par buvardage western. Nous voulions, dans un premier temps,

déterminer si la présence ou l’absence de NOR-1 dans la cellule pouvait affecter la

régulation des deux autres protéines de la sous-famille, en d’autres termes, si une

redondance fonctionnelle avait lieu. Dans un deuxième temps, nous désirions comparer la

variation du niveau de NGFI-B et NURR1 à celle de NOR-1, suite à une induction de la

prolifération cellulaire. Dans les fibroblastes en culture, NURR1 se comporte de façon

comparable à NOR-1 en réponse à un signal de croissance. Ainsi le récepteur nucléaire

apparaît ponctuellement et atteint un pic d’expression 2 heures après la stimulation.

Toutefois, à 4 heures, NURR1 a disparu alors que NOR-1 demeure encore présent. NGFI-B

répond à une stimulation de la prolifération selon un profil différent de NOR-1 et NURR1.

Ainsi le récepteur semble davantage réagir par un changement de son état de

phosphorylation, que par une modulation de son niveau d’expression dans nos lignées de

fibroblastes. En effet, la quantité de protéine NGFI-B demeure relativement constante

durant les 8 heures suivant la stimulation. Au temps 30 minutes, une seconde bande

apparaît et l’expression du récepteur NGFI-B se poursuit sous la forme d’un doublet. La

phosphorylation de NGFI-B en réponse à une induction avec les facteurs FGF et EGF ou

suite à une dépolarisation membranaire avait déjà été mise en évidence dans des cellules

PC12. La phosphorylation d’une sérine constituait une forme de régulation du récepteur

nucléaire (Hazel, Misra et al. 1991).Une analyse de l’expression de l’ARNm de NGFI-B

dans ce contexte expérimental apportent des informations importantes sur la régulation du

récepteur nucléaire.

La principale information tirée de ces analyses de NGFI-B et de NURR1 par buvardage

western consiste d’abord en l’absence de différence entre les lignées de fibroblastes NOR-

1+/+ et -/-. En effet, ces résultats montrent qu’il n’y a pas de variation du niveau de

synthèse ou de modulation de la régulation post-traductionelle des récepteurs NGFI-B et

NURR1 dans les cellules déficientes pour le récepteur NOR-1. En somme, ils ne permettent

187

pas de déceler, du moins par une surexpression, une redondance fonctionnelle des

récepteurs de la sous-famille Nur dans ce contexte cellulaire. Bien que dans le cadre de

diverses expériences, les fonction identiques de NGFI-B, NURR1 et NOR-1 aient été

démontrées, plusieurs travaux ont également permis de mettre en évidence des rôles

distincts pour chacun de ces récepteurs. Nos résultats révèlent une régulation distincte de

NOR-1 et NGFI-B dans des fibroblastes soumis à une induction de la prolifération alors

qu’une réponse comparable de NOR-1 et NURR1 est mise en évidence.

L’établissement du patron d’expression du gène NOR-1 par buvardage Northern ainsi que

par RT-PCR avait permis de mettre en évidence la présence d’ARNm NOR-1 dans

plusieurs tissus. Le profil ubiquitaire de NOR-1 s’accordait avec l’analyse de la région

promotrice qui révèlait l’absence de boîtes TATA ou CCAAT, caractéristique des gènes

« housekeeping ». Ainsi ces résultats suggéraient la possibilité que NOR-1 puisse exercer

des fonctions régulatrices communes à une grande variété de types cellulaires. À ces

observations se sont ajoutées les informations obtenues par l’analyse de la protéine NOR-1.

Ainsi, bien que le messager puisse être présent de façon constante dans la cellule, la

production du récepteur nucléaire semble être un événement ponctuel induit en réponse à

certains signaux. Alors que pour l’ensemble des récepteurs nucléaires constituant la

superfamille, le modèle général établi propose une régulation de l’activité par une

interaction au ligand, nos résultats portant sur NOR-1 suggèrent plutôt un contrôle serré au

niveau de la présence du récepteur dans la cellule.

Conclusion et perspectives Suite à la création de la souris déficiente pour le récepteur NOR-1, nous avons effectué une

variété d’analyses afin d’identifier des phénotypes associés à l’absence de la protéine.

L’ensemble des expériences effectuées constituaient principalement des tests sommaires

permettant d’orienter nos recherches éventuelles. En effet, au premier abord nos souris

semblaient tout à fait normales. De plus, l’absence de phénotype chez les souris mutantes

pour NGFI-B, attribuée à une redondance fonctionnelle exercée par les membres de la sous-

famille Nur, laissait présager des résultats identiques pour nos souris.

Parmi les analyses réalisées, l’étude portant sur la prolifération cellulaire constituait

l’avenue la plus intéressante. En effet, à ce jour peu de travaux ont mis en évidence la

présence de la protéine NOR-1 dans le cadre de différentes fonctions cellulaires. Les

recherches ont davantage été axées sur le patron d’expression de l’ARNm de NOR-1. Outre

l’apparation ponctuelle et importante du récepteur nucléaire dans nos lignées de

fibroblastes, en réponse à une induction de la prolifération, il est intéressant d’observer la

régulation de NURR1 et NGFI-B dans le même contexte expérimental. Pour NURR1, on

constate un profil similaire à celui de NOR-1, soit un pic d’expression de la protéine deux

heures après une induction au sérum. Pour NGFI-B on observe plutôt une présence

régulière de la protéine, qui serait toutefois régulée par phosphorylation dès l’ajout de

sérum, tel que suggéré par la présence d’un doublet. D’éventuelles expériences pourraient

être réalisées afin de poursuivre ces travaux. Dans un premier temps il serait nécessaire de

confirmer les analyses westerns par immunocytochimie sur nos fibroblastes. La

compartimentation cellulaire des protéines, qui pourra être mise en évidence par cette

technique, représentera également une information importante pour l’étude de la fonction

des récepteurs. Dans un deuxième temps, il serait intéressant de vérifier s’il y a redondance

fonctionnelle exercée par NURR1 et NGFI-B dans le mécanisme de prolifération cellulaire

en l’absence du récepteur NOR-1. A cette fin l’utilisation de siRNA NURR1 et de siRNA

NGFI-B constituera une approche intéressante afin d’inhiber l’expression des récepteurs

nuclaires dans les fibroblastes NOR-1 -/-. Les profils d’expression comparables de NURR1

et de NOR-1 suggèrent effectivement qu’ils puissent exercer des fonctions identiques.

189

L’étude de la fonction des récepteurs de la sous-famille Nur dans la prolifération cellulaire

cadre bien dans le contexte des travaux du Dr. Labelle qui oriente principalement ses

recherches sur le rôle de NOR-1 dans la tumorigénèse, plus précisément dans le

développement des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques. En effet, il a été

démontré que la protéine NOR-1 joue un rôle majeur dans l’apparition des

chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettique au sein de la protéine de fusion EWS/NOR-1.

Nous avons montré, au cours de ces travaux, la participation importante de la portion AF-2

du récepteur nuclaire dans l’activité transcriptionnelle de EWS/NOR-1. La présence

d’autres partenaires de fusion, soit TAFIIN, TCF12 et TFG, avec le récepteur NOR-1

indique également sa fonction majeure dans l’origine de ces tumeurs. En approfondissant

davantage nos connaissances sur l’activité du récepteur nucléaire NOR-1 dans le processus

de prolifération cellulaire nous seront davantage en mesure d’identifier des gènes cibles du

récepteur ou des cofacteurs spécifiques qui participeraient au potentiel tumorigénique des

protéines de fusion.

Notre meilleur compréhension de la dynamique d’expression du récepteur nucléaire NOR-1

dans le contexte d’une induction de la prolifération des fibroblates pourrait nous permettre

l’identification de gènes cibles par la technique d’immunoprécipitation de chromatine

(ChIP). En effet, un des problèmes majeur dans l’étude de NOR-1 était le faible niveau de

protéine détectable dans la cellule. La mise en place du protocole expérimental de

stimulation de la croissance des fibroblastes NOR-1 nous a permis d’identifier un moment

ponctuel durant lequel le récepteur nucléaire endogène est présent de façon importante.

Dans ce contexte, il sera possible d’identifier des gènes directement régulés par NOR-1,

impliqués dans la prolifération cellulaire et possiblement dans le développement des

chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques causés par EWS/NOR-1.

Une autre avenue intéressante pour l’étude du récepteur NOR-1 sera de spécifier sa

fonction dans les tissus musculaires. En effet, il a été montré, par analyses Northern, que le

cœur et le muscle squelettique constituaient les tissus humains dans lesquels l’ARNm

NOR-1 (Labelle, Zucman et al. 1995) était le plus fortement exprimé. En établissant le

profil d’expression du récepteur nucléaire chez la souris par buvardage Northern et RT-

PCR nous avons mis en évidence l’expression prépondérante du messager dans le cerveau

190

ainsi qu’une expression importante, mais légèrement plus faible dans le muscle squelettique

et le cœur. Ainsi l’expression conservée de l’ARNm NOR-1 dans les cellules musculaires

entre ces deux espèces, contrairement aux tissus nerveux, indique qu’il pourrait y exercer

des fonctions intéressantes. De plus, la présence de la protéine NOR-1 dans ces tissus

demeure encore peu étudiée.

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ANALYSE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DU RÉCEPTEUR … · 2009-03-23 · NOR-1 is a member of the nuclear receptor superfamily which comprises a great diversity of transcription factors