UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Geneesmiddelenleer

Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie

Academiejaar 2008-2009

Stefanie ROGGE

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. Dr. Apr. D. Deforce

Commissarissen

Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer

Dr. K. Tilleman

ANALYSE VAN MEMBRANAIRE EIWIT

EXPRESSIEPATRONEN IN HET SYNOVIAAL

WEEFSEL VAN PATIËNTEN MET

INFLAMMATOIRE ARTRITIS

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promoter geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

Juni 2009

Promotor Auteur

Prof. Dr. Apr. D. Deforce Stefanie ROGGE

DANKWOORD

In de eerste plaats wil ik graag mijn promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce bedanken om mij de

mogelijkheid te bieden mijn onderzoekstage op zijn labo te mogen uitvoeren.

Mijn zeer oprechte dank gaat naar Dr. Kelly Tilleman die mij met mateloze toewijding heeft

begeleid bij de onderzoeken, de verbeteringen en het neerschrijven van deze masterproef.

Mijn vriend, Tom Verstraeten, wil ik ook in dit dankwoord betrekken voor de hulp bij

opzoekingen, zijn aanmoediging en zijn geduld bij alle informaticaperikelen die gepaard gingen

met deze scriptie.

Ik wens ten slotte de Research te danken voor de ondersteuning en de vriendschap die

gedurende mijn kort verblijf op de dienst is gegroeid.

Juni 2009

INHOUDSOPGAVE

Auteursrecht

Dankwoord

Inhoudsopgave

Lijst met gebruikte afkortingen

1. INLEIDING 1

1.1. REUMATISCHE AANDOENINGEN 1

1.1.1. Opbouw synoviaal gewricht 1

1.2. INFLAMMATOIRE ARTRITIS 3

1.2.1. Reumatoïde artritis 3

1.2.1.1. Klinische verschijnselen 3

1.2.1.2. Therapeutica 4

1.2.1.3. Pathologie 5

1.2.1.4. Serologische merker 9

1.2.2. Spondyloartropathieën 10

1.2.2.1. Klinische verschijnselen 10

1.2.2.2. Therapeutica 11

1.2.2.3. Pathologie 11

1.2.2.4. Serologische merker 12

1.3. PROTEOMICS 12

1.3.1. Definitie 13

1.3.2. Klassieke approach: gel-based 13

1.3.3. Gel-vrije approach 15

1.3.3.1. Stable isotope labelling with aminoacids in cells (SILAC) 16

1.3.3.2. Combined fractional diagonal chromatography (COFRADIC) 17

1.3.3.3. Isotope-coded affinity tag (ICAT) 17

1.3.3.4. Isobaric tag for relative and absolute quantification (iTRAQ) 18

1.3.4. Principe van massaspectrometrie 19

2. OBJECTIEVEN 23

3. MATERIAAL EN METHODEN 24

3.1. EIWIT-EXTRACTIE 24

3.1.1. Principe 24

3.1.2. Materialen 24

3.1.3. Methode 24

3.1.3.1. Detergent-gebaseerde methode 24

3.1.3.2. Fysische lyse 25

3.2. GELFILTRATIE 25

3.2.1. Principe 25

3.2.2. Materialen 26

3.2.3. Methode 26

3.3. EIWITBEPALING 26

3.3.1. Coomassie Protein assay 26

3.3.1.1. Principe 26

3.3.1.2. Materialen 27

3.3.1.3. Methode 27

3.4. SODIUM DODECYL SULFAAT GELELEKTROFORESE 28

3.4.1. Principe 28

3.4.2. Materialen 28

3.4.3. Methode 29

3.5. iTRAQ ANALYSE 30

3.5.1. Opstelling van de analyse 30

3.5.2. Opzuivering en aanconcentrering met Vivaspin 31

3.5.2.1. Materialen 31

3.5.2.2. Methode 31

3.5.3. Digestie met trypsine en labelling van de stalen 32

3.5.3.1. Materialen 32

3.5.3.2. Principe 32

3.5.3.3. Methode 32

3.6. OPZUIVERING 33

3.6.1. Strong Cation Exchange cartridge (SCX-cartridge) 33

3.6.1.1. Materialen 33

3.6.1.2. Principe 33

3.6.1.3. Methode 34

3.6.2. C18 opzuivering 34

3.6.2.1. Materialen 34

3.6.2.2. Principe 34

3.6.2.3. Methode 35

3.7. Twee-dimensionele vloeistof chromatografie 35

3.7.1. Fractionatie door scheiding op SCX 35

3.7.1.1. Materialen 35

3.7.1.2. Principe 36

3.7.1.3. Methode 36

3.7.2. Identificatie en kwantificatie dmv Online HPLC-ESI-QTOF-MS/MS 37

3.7.2.1. Materialen 37

3.7.2.2. Principe 37

4. RESULTATEN 38

4.1. OPZUIVERING MET GELFILTRATIE EN ANALYSE MET GELELEKTROFORESE 38

4.2. EIWITBEPALING VAN ALLE PATIËNTEN 40

4.3. OPZET iTRAQ ANALYSE 40

4.4. RESULTATEN iTRAQ ANALYSE 41

5. DISCUSSIE 51

6. CONCLUSIE 53

7. LITERATUURLIJST 54

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ACPA: anti-citrullinated protein antibody

APC: antigen presenterende cel

APS: ammonium persulfaat

AS: spondylitis ankylosans

Bcl-2: B-cel lymphoma-2

BFB: broom fenol blauw

CCP: cyclisch gecitrullineerde peptiden

CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate

COFRADIC: combined fractional diagonal chromatography

DIP: distal interphalengeaal

DMARD: Disease-Modifying-Anti-Rheumatic-Drugs

DTT: dithiothreitol

ESI: electrospray ionization

FLS: fibroblast-like synoviocyten

GAG: glycosaminoglycanen

HLA: human leukocyte antigen

ICAM-1: intercellular adhesion molecule-1

ICAT: Isotope-coded affinity tagging

IEF: iso-elektrische focussing

IFNγ: interferon gamma

Ig: immunoglobuline

IL-1: interleukine-1

IPG: geïmmobiliseerde pH gradiënt

iTRAQ: isobaric tag for relative and absolute quantitation

JCA: juveniele chronische arthritis

MALDI: matrix-assisted laser desorption ionization

MG: moleculair gewicht

MHC: major histocompatibility complex

MLS: macrofaag-like synoviocyten

MMP: matrix metalloproteïnase

MMTS: S-Methyl methanethiosulfonate

MQ: milli-Q water

MS: massaspectrometrie

NSAID: Niet-Steroïdale-Anti-Inflammatoire-Drugs

NK: natural killer

OA: osteoartritis

OD: optische densiteit

PAD: peptidylarginine deiminase

pI: iso-elektrisch punt

PP I: phosphatase protease inhibitor I

PP II: phosphatase protease inhibitor II

PsA: psoriasis artritis

PTM: post-translationele modificaties

Q: quadrupool

RA: reumatoïde artritis

ReA: reactieve arthritis

RF: reumafactor

RP-LC: reversed-phase liquid chromatography

SCX: strong cation exchange

SDS: sodium dodecyl sulfaat

SILAC: stable isotope labeling with aminoacids in cells

SLRP: small leucine rich protein

SpA: spondyloartropathieën

TBP: tributylphosphine

TCEP: tris(2-carboxyethyl)phosphine

TEMED: tetramethylethylenediamine

TNFα: tumor necrosis factor alfa

TOF: time-of-flight

UDPGD: Uridine Diphosphoglucose Dehydrogenase

USpA: ongedifferentieerde artritis

VCAM-1: vascular cell adhesion molecule-1

1. INLEIDING

1

1. INLEIDING

1.1. REUMATISCHE AANDOENINGEN

Reumatische ziekten kunnen onderverdeeld worden in inflammatoire en niet-

inflammatoire pathologieën.

Osteoartrose (OA) is een niet-inflammatoire, chronisch degeneratieve

gewrichtsaandoening die zich ontwikkelt ten gevolge van blijvende mechanische belasting of

verwonding van de gewrichtstructuren. De primaire target van OA is het kraakbeen, daar waar

bij reumatoïde artritis (RA) en spondyloartropathieën (SpA) de synoviale membraan de primaire

site van inflammatie is. Ondanks het feit dat OA veroorzaakt wordt door overbelasting of

verwonding, bepalen risicofactoren zoals leeftijd, geslacht en overgewicht mee de graad van

ernst van de klachten. De resulterende pijn verdwijnt evenwel bij rust. Meer dan 80 % van de 3e

leeftijd lijdt aan OA (Arden & Nevitt, 2006). Therapie bij OA bestaat uit symptomatische

behandeling.

RA en SpA zijn de meest voorkomende vormen van inflammatoire chronische artritis

(Baeten et al., 2004b). De naam artritis zegt het immers zelf: gewricht (arthro) en ontsteking

(itis). De oorzaak kan genetisch, infectieus of beiden zijn (Smith & Haynes, 2002) en deze

systemisch inflammatoire ziekten treffen bij voorkeur de diarthroïdale synoviale gewrichten

(Pratt et al., 2009; Poole & Dieppe, 2006).

1.1.1. Opbouw synoviaal gewricht

Een gewricht is de beweeglijke verbinding tussen twee botten (fig. 1.1). Het bestaat uit

gewrichtskraakbeen, ook wel het hyalien kraakbeen genoemd, dat rust op het subchondrale bot

en dat zorgt voor de compensatie van de incongruenties van de gewrichtsvlakken en voor een

reductie van de contactstress. Het kraakbeen is opgebouwd uit collageen, glycosaminoglycanen

en chondrocyten. Deze chondrocyten liggen in een avasculaire omgeving, geïsoleerd in een

lacune. Het collageen verankert in de diepere lagen het gewrichtskraakbeen aan het

subchondrale bot. Naast deze componenten is kraakbeen ook voor 70-75 % opgebouwd uit

water. Dit water zit samen met de aggrecanmoleculen geïmmobiliseerd tussen het

1. INLEIDING

2

collageennetwerk. Wanneer zich inflammatie of degeneratie voordoet, zien we echter de

hoeveelheid water stijgen. Dit fenomeen treedt op door enzymatische afbraak van het

kraakbeen. Hieruit kunnen we afleiden dat het anders zo dichte collageenweefsel niet meer in

staat is de controle over het volume kraakbeen te bewaren (Harris, 1997).

De niet-kraakbenige delen van het gewricht worden afgelijnd door een synoviale

membraan, die normaal 2 tot 4 cellagen dik is en niet bestaat uit epitheelcellen, maar uit

‘synoviale lining’ cellen. Dit synoviale membraan wordt onderverdeeld in een intima en

subintima, waarvan dit laatste losmazig bindweefsel van cellen (fibroblasten, macrofagen en

vetcellen) en bloedvaten is, dat de overgang van de verspreide fibrocyten naar het kapsel vormt

(Firestein, 1997).

De 2 grote celtypes die we terugvinden in de synoviale lining zijn:

Type A synoviocyten of Macrofaag-like synoviocyten (MLS): Ze zijn afgeleid uit

monocyten die hun oorsprong vinden in het beenmerg. Deze cellen hebben een

fagocytaire en antigen-presenterende functie. Zij vertonen een niet-specifieke

esterase activiteit en zijn CD68 positief (Edwards et al., 1993). Zij brengen HLA-DR

genen tot expressie en bezitten Fc-receptoren (Edwards, 1994).

Type B synoviocyten of Fibroblast-like synoviocyten (FLS): In tegenstelling tot type

A synoviocyten hebben deze cellen een secretorische functie. Deze cellen

brengen vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) tot expressie en hebben

een hoge Uridine Diphosphoglucose Dehydrogenase (UDPGD) activiteit. Ze zijn

prolyl hydroxylase positief (Edwards, 1994).

Deze synoviale cellen liggen in een gespecialiseerde extracellulaire matrix en hun functie

varieert naargelang omgevingsfactoren (Baeten & De Keyser, 2004b). Zo zullen de MLS

fagocyteren van zodra celdebris in de gewrichtsholte aanwezig is. De FLS zullen prolifereren en

specifieke proteasen en matrix componenten produceren onder invloed van groeifactoren en

inflammatoire cytokines (Edwards, 2000).

De buitenkant van het gewricht wordt gevormd door het gewrichtskapsel, een stevige

structuur van collageen vezels. Binnenin het gewricht bevindt zich de gewrichtsholte, of ook

synoviale holte genoemd, die gevuld is met synoviaal vocht. Dit vocht is samengesteld uit een

1. INLEIDING

3

geringe hoeveelheid proteïnen in een geconcentreerde hyaluronzuuroplossing: hyaluronzuur,

lubricin, en een ultrafiltraat van plasma. Hyaluronzuur (HA) wordt door de synoviocyten

gesynthetiseerd en gesecreteerd tussen de cellen, waarna het afvloeit naar de gewrichtsholte.

Daar dient het als coating van het synovium en ter diffusie van nutriënten in het kraakbeen.

Aangezien inflammatie gepaard gaat met een verhoogde vascularisatie en permeabiliteit, is het

resultaat een verhoogde aanmaak van dit intra-articulair vocht. Bij chronische inflammatie

produceren B-cellen en plasmacellen grote hoeveelheden immunoglobulinen (Ig), waardoor de

proteïneconcentratie aldaar dus stijgt en de samenstelling verandert (Harris, 1997).

FIGUUR 1.1: OPBOUW VAN HET SYNOVIALE GEWRICHT – DOORSNEDE VAN EEN GEZOND

GEWRICHT (www.boneandspine.com)

1.2. INFLAMMATOIRE ARTRITIS

Hoewel RA en SpA twee vormen van inflammatoire artritis zijn die de gewrichten

aantasten, zijn ze toch verschillend inzake klinische presentatie.

1.2.1. Reumatoïde artritis

1.2.1.1. Klinische verschijnselen

RA is een auto-immuunziekte, die gekarakteriseerd is door symmetrische polyarticulaire

artritis, en gepaard gaat met destructie van kraakbeen en omliggend bot (Firestein, 2003).

1. INLEIDING

4

Destructie van de gewrichten begint vroeg na het ontstaan van de ziekte, zelfs al van het

1e jaar (Harris, 1997). RA wordt getypeerd door een agressieve on-set, gevolgd door periodes

van remissie (Smith & Haynes, 2002). Het gewricht, meer bepaald de synoviale membraan,

wordt als eerste getroffen door inflammatie. Hierbij zien we voornamelijk aantasting en

bilaterale zwelling van de proximale interphalangeale (PIP) gewrichten van hand en voet (fig.

1.2(A)). Naast het gewricht kan deze aandoening ook complicaties veroorzaken ter hoogte van

andere organen, zoals ogen, huid, zenuwen, speekselklieren, longen, hart, nieren en centraal

zenuwstelsel. Extra-articulaire complicaties, zoals nodulen (fig 1.2(B)) en vasculitis, doen zich

ook voor. Niettegenstaande het om een lage graad van inflammatie met periodische opstoten

gaat, veroorzaakt de ontsteking in en rond de gewrichten klachten van pijn en stijfheid en leidt

zij vaak tot beschadiging van kraakbeen, bot en omliggende weefsels (Smith & Haynes, 2002).

De prevalentie van RA bedraagt 1 à 2 % (Firestein, 2003). Bovendien worden met een

verhouding van 3/2 meer vrouwen dan mannen getroffen door RA. Hoewel RA op alle leeftijden

kan ontstaan, doet het zich meer voor tijdens de 5e-6e levensdecade.

(A) (B)

FIGUUR 1.2: KLINISCHE MANIFESTATIES VAN RA – (A) AANTASTING PIP GEWRICHTEN EN ULNAIRE

DEVIATIE VAN DE VINGERS; – (B) SUBCUTANE NODULES (www.hopkins-arthritis.org)

1.2.1.2. Therapeutica

Reumatische gewrichtsaandoeningen kunnen niet genezen worden, enkel

symptomatische behandeling en het beperken van de graad van inflammatie kan verbetering

betrachten en de kwaliteit van het leven verhogen (Schett, 2006). Neerwaartse regulatie van

inflammatoire processen door middel van anti-cytokine therapie kan dus een oplossing bieden.

1. INLEIDING

5

Primaire targets zijn tumor necrosis factor alfa (TNFα) en interleukine-1 (IL-1). Zowel

infliximab, een monoklonaal antilichaam, als etanercept, een recombinante TNFα-receptor,

behoren tot de groep van TNFα-blokkers. B-cel depletie met monoklonale antilichamen tegen

het CD20 membraaneiwit op terminaal gedifferentieerde B-cellen is een nieuwe strategie in de

behandeling van RA. Rituximab biedt in dat opzicht een significante verbetering van de klinische

symptomen bij patiënten met RA die eerder faalden op anti-TNFα behandeling (Smith & Haynes,

2002). Deze nieuwere medicatie zorgt voor een significant betere ziektecontrole in vergelijking

met de oudere medicatie. De laatste jaren wordt ook meer gefocused op de inhibitie van de

angiogenese als optie in de behandeling van RA (Lainer-Carr & Brahn, 2007).

1.2.1.3. Pathologie

De pathogenese van RA is tot op heden niet volledig opgehelderd. Wel is geweten dat

het om een immunologisch antwoord gaat op een antigen. De triggers van dit immunologisch

antwoord kunnen zowel infectie, cross-reactieve immuniteit als auto-immuniteit zijn (Harris,

1997).

Het resultaat van het chronische inflammatoir proces en tevens het meest specifieke

kenmerk van de pathogenese van RA in het gewricht is de synoviale hyperplasie. Tijdens dit

proces verdikt het synoviaal membraan tot 8 à 10 cellagen. De proliferatie van de synoviale

lining cellen wordt, enerzijds, veroorzaakt door infiltratie van lymfocyten en macrofagen;

anderzijds, is vooral een stijging tot 80 % van de hoeveelheid macrofaag like synoviocyten

verantwoordelijk voor de verdikking van het gewrichtsweefsel (fig 1.3). Deze CD68 positieve

cellen secreteren ter hoogte van het synovium cytokines, zoals TNFα en IL-1, waardoor ook de

fibroblast like synoviocyten zullen prolifereren. Zoals hierboven beschreven, zijn de

synoviocyten verantwoordelijk voor de productie en secretie van synoviaal vocht. Proliferatie

van deze cellen resulteert dus in een evenredige stijging in productie van dit vocht. Door de

excessieve toename aan cellen wordt de synoviale holte nauwer; dit doet de intra-articulaire

druk stijgen, waardoor het vocht zich in alle richtingen verplaatst met een gezwollen gewricht

als resultaat.

In enkele studies werd bewezen dat een gewijzigde apoptotische respons ook aangeduid

kan worden als een van de oorzaken van de chronisch gestimuleerde immuniteit en hyperplasie

1. INLEIDING

6

bij RA (Korb, 2009). Wanneer de regelmechanismen in het lichaam verstoord zijn, treedt

reductie of inhibitie van eliminatie van weefselcellen op. Dit fenomeen zien we wanneer bij FLS

en T-cellen een hogere hoeveelheid van Bcl-2 tot expressie komt. Als gevolg van de geremde

apoptose kan klonale expansie van autoreactieve T-cellen verder woekeren, alsook de

proliferatie van synoviaal weefsel. Verscheidene factoren spelen dus een rol in de synoviale

hyperplasie. De verzwakte apoptose van type B synoviocyten is eveneens het gevolg van de

expressie van het p53 tumor suppressor gen en het anti-apoptotische proteïne sentrin-1

(Dhaouadi et al., 2007).

Door de hyperplasie verkrijgt men een hypoxisch microklimaat in het

gewrichtsmembraan; hierdoor stijgt de vraag naar zuurstof, waardoor nieuwe bloedvaten

gevormd worden. Deze angiogenese draagt eveneens bij tot het chronisch karakter van

inflammatoire artritis. Bij RA werd een verhoogde expressie van proangiogenetische

mediatoren, zoals de vascular endothelial growth factor (VEGF), aangetoond, waardoor de

endotheliale cellen prolifereren (Lainer-Carr & Brahn, 2007). Deze molecule wordt door

meerdere types cellen in het synovium gesynthetiseerd, inclusief macrofagen en fibroblasten

(FitzGerald & Bresnihan, 1995).

Te wijten aan de nieuwgevormde bloedvaten en het gebrek aan basale membraan

waardoor het synoviaal vocht in de holte accumuleert, infiltreren inflammatoire cellen (T-

lymfocyten) in de synoviale membraan en induceren aldaar het inflammatieproces. Dit doen ze

door zich vast te hechten aan het vezellumen via oppervlaktemoleculen aan adhesiemoleculen,

die tot expressie worden gebracht door endotheliale cellen. Specifieke adhesiemoleculen

worden tot expressie gebracht door de synoviale cellen: E-selectin op synoviaal endotheel,

vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) en intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) op

endotheliale cellen en macrofagen (Smith & Haynes, 2002). Cytokines en chemoattractanten,

zoals IL-1β en TNFα, regelen de expressie en de binding van deze adhesiemoleculen. Op die

manier migreren lymfocyten doorheen het endotheel naar het synovium. Vooral geheugen T-

cellen accumuleren in het synovium, maar het synovium bevat evengoed CD8+ cellen, natural

killer-cellen (NK-cellen) en B-cellen (Baeten & De Keyser, 2004a). Eens in het synovium worden

T-cellen geactiveerd door herkenning van een compatibel antigen, eventueel een auto-antigen,

1. INLEIDING

7

aldaar gepresenteerd door een antigen presenterende cel (APC); een macrofaag like type A

synoviocyt. De geactiveerde macrofaag activeert de T-cel via IL-1 en TNFα. De T-cel produceert

dan IL-2, hetgeen aanzet tot klonale expansie (fig. 1.4). Wanneer op die manier een

immunologische reactie in het gewricht wordt uitgelokt, treden klinische manifestaties van RA

op de voorgrond. Ze veroorzaken pijn en zwelling. De geactiveerde T-cellen kunnen dan via

cytokines B-cellen aanzetten tot differentiatie en proliferatie, met secretie van

immunoglobulinen.

FIGUUR 1.3: INFLAMMATIE IN HET SYNOVIALE GEWRICHT BIJ RA: NORMAAL VERSUS

GEÏNFLAMMEERD BIJ RA. DE SYNOVIALE MEMBRAAN IS NORMAAL 1-3 CELLAGEN DIK EN OVERLAPT DE

SUBSYNOVIALE LAAG DIE BESTAAT UIT FIBROBLASTEN, ADIPOCYTEN EN SYNOVIALE MACROFAGEN. BIJ EEN

NORMAAL GEWRICHT BEPERKT DE VASCULATUUR ZICH TOT DE SUBINTIMA. BIJ RA INVADEERT DE VASCULATUUR

WEL IN HET SYNOVIUM TE WIJTEN AAN ANGIOGENESE. HIERDOOR RECRUTEREN TALRIJKE INFLAMMATOIRE

CELLEN NAAR HET SYNOVIUM OM ALDAAR EEN VERDIKKING VAN HET SYNOVIUM TE VEROORZAKEN. DE STIJGING

IN AANTAL SYNOVIOCYTEN DRAAGT BIJ TOT DE ONTWIKKELING VAN PANNUS, BOTEROSIE EN GEWRICHTSAFBRAAK

(www.nature.com)

1. INLEIDING

8

De voorbestemdheid van RA zou ook gelinkt zijn aan de expressie van het human

leukocyte antigen DR-4 (HLA-DR4) gen. Dit gen maakt deel uit van de major histocompatibility

complex (MHC) klasse II moleculen en bestaat uit het ‘shared epitoop’ (SE) ter hoogte van de 3e

variabele regio van de DR-β keten. De aminozuren in deze regio zijn positief of neutraal geladen

en verkiezen bijgevolg negatief geladen peptiden om te binden. Deze peptiden worden er

gebonden in de HLA bindingsgroeve en gepresenteerd aan het oppervlak aan T-cellen. Maar de

shared epitoop beperkt zich niet tot binding van specifieke antigenen aan T-cellen, de manier

waarop ze gepresenteerd worden aan T-cellen zou evengoed van belang zijn (Smith & Haynes,

2002).

FIGUUR 1.4: CHRONISCHE INFILTRATIE VAN LYMFOCYTEN LEIDT TOT DESTRUCTIE

(www.nature.com)

ANGIOGENESE

INFILTRATIE INFLAMM. CELLEN

OSTEOCLASTVORMING

PRODUCTIE DESTRUCTIEVE ENZYMEN

1. INLEIDING

9

Synoviocyten die chronisch gestimuleerd worden door cytokines afkomstig van

geactiveerde macrofagen, fibroblasten en lymfocyten, worden getransformeerd tot invasief

pannusweefsel. Het pannusweefsel invadeert finaal het kraakbeen, hetgeen in de hand gewerkt

wordt door matrix metalloproteïnasen (MMP’s) (Miller et al., 2009). Deze MMP’s worden tot

expressie gebracht door fibroblasten op de grens tussen synovium en kraakbeen in RA

gewrichten, en zorgen voor afbraak van de collageen matrix. Aansluitend hierop wordt het

kraakbeen afgebroken. Ook krijgen we boterosie als gevolg van lokale osteoclast vorming

(Baeten & De Keyser, 2004a).

Door de structurele veranderingen in het gewricht krijgen we verlies van de

gewrichtsfunctie. Zo kunnen we zelfs stellen dat de graad van activiteit van de ziekte

rechtstreeks gelinkt is aan de mate van verlies van functionaliteit (Smolen et al, 2009).

1.2.1.4. Serologische merker

Reumafactor (RF) is de meest voorkomende serologische merker voor RA. Dit is een

antilichaam tegen het Fc gedeelte van een lichaamseigen IgG. De interactie tussen antilichamen

onderling vormt een immuuncomplex. 65 à 75 % van de RA patiënten zijn RF positief. RF kan

ook aangetoond worden bij andere ziekten (sclerodermie). Echter hoe hoger de titer, hoe meer

waarschijnlijk het wordt dat het om RA gaat en hoe slechter de prognose (Lisse, 1993).

Later werd bij RA ook nog een ander type auto-antilichaam geïdentificeerd, de anti-

citrullinated proteïn antibody (ACPA), dit zijn antilichamen tegen gecitrullineerde eiwitten.

Citrullinatie is een post-translationele modificatie waarbij een arginine omgezet wordt naar een

citrulline door het enzym peptidylarginine deiminase (PAD) (fig 1.5).

ACPA’s hebben een veel hogere specificiteit voor RA dan RF, nl. 96-98 %, en kunnen veel

vroeger gedetecteerd worden. ACPA-producerende plasmacellen werden gevonden in het

geïnflammeerd synoviaal weefsel van RA; dit wijst dus op de aanwezigheid van gecitrullineerde

eiwitten in het synovium. Zo werd in vorige studies reeds aangetoond dat het synovium

gecitrullineerde eiwitten, zoals fibrinogeen en vimentine, bevat (Lambrecht et al, 2008; Tilleman

et al, 2008a).

1. INLEIDING

10

FIGUUR 1.5: ENZYMATISCHE OMZETTING VAN ARGININE CITRULLINE: ARGININE WORDT

AANGEVALLEN DOOR CYSTEINE RESIDUE VAN HET PAD. HIEROP VOLGT NUCLEOFIELE AANVAL VAN WATER MET DE

VORMING VAN CITRULLINE EN VRIJSTELLING VAN AMMONIAK (György et al., 2006)

1.2.2. Spondyloartropathieën

1.2.2.1. Klinische verschijnselen

Spondyloartropathie (SpA) is een verzamelnaam voor een groep chronisch inflammatoire

reumatische ziekten, uitgelokt door omgevingsfactoren bij genetisch voorbestemde mensen

(Khan, 2002). Na RA is SpA de tweede meest voorkomende vorm van inflammatoire artritis.

Verschillende ziekten behoren tot het concept SpA, zoals spondylitis alkylosans (AS),

reactieve artritis (ReA), juveniele chronische artritis (JCA), artritis geassocieerd met ulceratieve

colitis en ziekte van Crohn, ongedifferentieerde artritis (USpA), psoriatische artritis (PsA)

(Baeten & De Keyser, 2004a). Ondanks hun variërende klinische eigenschappen mag aanvaard

worden dat de onderliggende pathologische oorzaak dezelfde is (Gaston, 2006). De

gemeenschappelijke kenmerken van deze verschillende ziekte-entiteiten zijn sacroiliitis,

spondylitis, enthesitis (fig. 1.6) en perifere artritis. SpA is een oligo-articulaire asymmetrische

gewrichtsaandoening, in tegenstelling tot RA die een polyarticulaire aandoening is.

Ongeveer 1 op 100 nieuwe gevallen van SpA komen er per jaar bij. De verhouding

man/vrouw is 3/2. SpA manifesteert zich tussen de 16 en 40 jaar, maar kan evengoed al in de

kinderjaren ontstaan (Khan, 2002).

1. INLEIDING

11

FIGUUR 1.6: KLINISCHE SYMPTOMEN SPONDYLOARTHROPATHIE: OVERWEGEND PAUCI-ARTICULAIR,

ASYMMETRISCH PATROON MET AANTASTING VAN KLEINE EN GROTE GEWRICHTEN.

1.2.2.2. Therapeutica

Aan patiënten die niet reageren op conventionele therapieën, zoals Niet-Steroïdale-Anti-

Inflammatoire-Drugs (NSAID’s) en Disease-Modifying-Anti-Rheumatic-Drugs (DMARD’s), wordt

net zoals bij RA patiënten gestart met TNFα-blokkers; infliximab of etanercept. Hierbij werd

bewezen dat er snel verbetering optrad van de perifere artritis, enthesitis en van de symptomen

in het algemeen (Khan, 2002).

1.2.2.3. Pathologie

SpA wordt, net zoals RA, gekarakteriseerd door synovitis; d.i. een ontsteking van de

synoviale membraan. Het inflammatoir proces gaat gepaard met een verhoogd aantal T-

lymfocyten en macrofagen en een hogere expressie van pro-inflammatoire cytokines (IL-1,

TNFα, interferon gamma (IFNγ)). De infiltratie van inflammatoire cellen, zoals bv. CD163+

macrofagen, en de hyperplasie van de lining cellen in het synovium geven een idee van de

globale ziekteactiviteit bij SpA, onafhankelijk van het subtype SpA (Baeten et al., 2004b). In

tegenstelling tot RA, is er naast aanwezigheid van bot-erosie ook een poging tot botherstel

(Baeten & De Keyser, 2004a).

De pathogenese van SpA wordt dikwijls gelinkt aan de aanwezigheid van bepaalde

genen. HLA-B27 (MHC I molecule) speelt hierin de belangrijkste factor. HLA I (HLA-A, HLA-B,

HLA-C) moleculen komen tot expressie op alle cellen met een kern en bestaan uit een zware α-

keten en een kleinere β2-microglobuline keten. Hun functie bestaat erin intracellulaire peptiden

te presenteren aan T-celreceptoren van CD8+ T-cellen (Gaston, 2006). HLA-B27 is een polymorfe

vorm van HLA-B die teruggevonden wordt in 95 % van de Europese bevolking met AS (Reveille &

Arnett, 2005). De meeste ziekten geassocieerd met deze HLA-allelen blijken van auto-immune

1. INLEIDING

12

aard te zijn (Gaston, 2006). Vrije zware ketens kunnen tot expressie komen op het oppervlak

van de cel, zonder het β2-micorglobuline, en toch hun bindingsgroeve behouden. Zo ook kunnen

homodimeren gevormd worden wanneer de 2 zware ketens aan elkaar hechten via een

disulfide binding aan de cysteïne-67 residues van het extracellulaire α1-domein. Bijgevolg is de

HLA-B27 molecule verkeerd opgevouwen, wat resulteert in een pro-inflammatoire respons in

het endoplasmatisch reticulum. Alsook de ‘artritogene’ peptide hypothese suggereert dat de

ziekte resulteert vanuit de mogelijkheid dat HLA-B27 een specifiek antigenisch peptide kan

binden in zijn groeve, waarop dan cytotoxische T-celrespons en NK-respons komt (McMichael &

Bowness, 2002). Echter een specifiek artritogenisch peptide werd nog niet aangetoond (Reveille

& Arnett, 2005).

1.2.2.4. Serologische merker

Afwezigheid van reumafactor (RF) werd vroeger beschouwd als een van de belangrijkste

discriminerende factoren tussen SpA en RA. Nu wordt steeds vaker overlap tussen beide

aandoeningen teruggevonden, waardoor de seronegativiteit zeker niet meer als enige zekerheid

kan gebruikt worden. Er zijn immers patiënten die RF-negatief en ACPA-negatief zijn en toch RA

ontwikkelen. Mede hierdoor worden ook radiologische criteria gehanteerd om tot een diagnose

te komen.

1.3. PROTEOMICS

Reumatische aandoeningen zijn complexe en verwante ziekten. Een onderscheid tussen

de verschillende reumatische subtypes, zoals RA en SpA, zou kunnen gebeuren aan de hand van

proteomics technieken die toelaten specifieke eiwit-biomerkers en tevens hoofdrolspelers in de

pathologie te identificeren (Tilleman & Deforce, 2008a). Een biomerker wordt door de

Biomarkers Definition Working Group als volgt gedefinieerd: “Een karakteristiek dat objectief

gemeten wordt en geëvalueerd als een indicator voor normale biologische processen,

pathogenische processen of farmacologische antwoorden biedt op therapeutische interventies”

(Biomarkers Definitions Working Group, 2001).

1. INLEIDING

13

De ziekte RA verloopt progressief, maar dikwijls atypisch en de oorzaak is eveneens nog

onbekend. Daarom zou de kennis van moleculaire merkers mogelijks bijdragen om het

ziekteverloop te voorspellen alvorens de eerste klinische tekenen op de voorgrond treden

(Lambrecht et al., 2008).

1.3.1. Definitie

Volgens Wilkins et al. (1996) is het proteoom : “Een grootschalige karakterisatie van het

volledige eiwit complement, inclusief alle eiwit isovormen en post-translationele modificaties,

van een cel”.

Proteomics is ontstaan wanneer men begreep dat het gedrag van de genoom-producten,

nl. de eiwitten, moeilijk te voorspellen was enkel en alleen door genomicstudies. Recente

studies hebben immers bewezen dat de mRNA expressie dikwijls niet overeenstemt met de

eiwit-niveaus. Dit komt omdat 1 gen overgeschreven kan worden tot meerdere eiwitten, die op

hun beurt post-translationele modificaties (PTM) of degradatie ondergaan of doordat eiwitten

in meerdere isovormen kunnen voorkomen (Nyman, 2001). De relatief lage hoeveelheid aan

menselijke genen kan dus een proteoom genereren van aanzienlijke complexiteit (Patterson &

Aebersold, 2003). Bijgevolg biedt onderzoek op eiwit-niveau een breder perspectief met

betrekking tot de opheldering van de biologische functies, gezien eiwitten betrokken zijn in alle

biologische processen.

1.3.2. Klassieke approach: gel-based

Er zijn 2 manieren om aan proteomics te doen, namelijk een gel-based en een gel-vrije

manier. De gel-based techniek maakt meestal gebruik van 2D-gelelektroforese om eiwitten te

scheiden, gevolgd door massaspectrometrie. 2D gelelektroforese is een hoge resolutie methode

om eiwitten onderling te scheiden in 2 dimensies, naargelang hun iso-elektrisch punt (pI) als 1e

dimensie en naar hun grootte in 2e dimensie (Görg et al., 2004).

Eiwitten worden in een IPG-strip gebracht. Dit is een strip met een geïmmobiliseerde pH

gradiënt. In deze strip gaan de eiwitten migreren onder invloed van een elektrisch veld tot ze

hun pI of iso-elektrisch punt bereiken. Hierdoor verkrijgt men allemaal bandjes naast elkaar.

1. INLEIDING

14

Deze bandjes stellen eiwitten voor ter hoogte van hun pI. Dit is de 1e dimensie van de scheiding

of iso-elektrische focussing (IEF).

Vervolgens worden de IPG-strips op een polyacrylamide gel gebracht, waaruit ze

verticaal zullen migreren doorheen de gel op basis van hun grootte of moleculair gewicht (MG).

De dichtheid van crosslinking van de gel kan selectief gekozen worden, naargelang de grootte

van de eiwitten. Op deze manier worden de in 1e dimensie bekomen eiwitbandjes gefocusseerd

tot eiwitspots (fig. 1.7).

Visualisatie van de eiwitten gebeurt met specifieke kleuringsmethoden. Coomassie Blue,

silver staining, radioactieve labeling en fluorescente kleuring zijn hier enkelen van. Deze

methoden moeten voldoende sensitiviteit en hoge lineaire dynamische range hebben. Verder

moeten ze reproduceerbaar en compatibel zijn met identificatie-procedures zoals MS (Görg et

al., 2004; Patton et al., 2002).

FIGUUR 1.7: PRINCIPE VAN 2D-PAGE: SCHEIDING VOLGENS ISO-ELEKTRISCH PUNT OP DE X-AS EN VOLGENS

MOLECULAIR GEWICHT OP DE Y-AS

(www.edoc.hu-berlin.de)

Een spot geeft informatie op 3 gebieden, de X-as staat voor het iso-elektrisch punt (pI),

de Y-as voor het moleculair gewicht (MG) en de kleur-intensiteit vertelt iets over de hoeveelheid

1. INLEIDING

15

eiwit. Spots van verschillende gels worden vergeleken met elkaar en met een controlestandaard

wat betreft hun intensiteit en relatief voorkomen. De spots van interesse worden uitgesneden

en enzymatisch verknipt met site-specifieke proteasen, zoals trypsine. Op die manier worden de

eiwitten verknipt tot peptiden en kunnen ze geïdentificeerd worden door massaspectrometrie

(MS) (fig. 1.8). De massa’s aldaar bekomen, worden dan vergeleken met de theoretisch

verwachte tryptische peptide massa’s van elk eiwit aanwezig in de database en zo kan het eiwit

geïdentificeerd worden (zie verder) (Tilleman et al., 2005).

FIGUUR 1.8: IN GEL DIGEST VAN EIWITTEN: SPOTS VAN INTERESSE WORDEN UITGESNEDEN EN

GEDIGEREERD MET SITE SPECIFIEKE PROTEASEN EN GEÏDENTIFICEERD MET MASSASPECTROMETRIE

Klassieke proteoomtechnologie gebaseerd op 2D gelelektroforese is complex, arbeids-

en kostintensief en gelimiteerd (Patterson & Aebersold, 2003). Ondanks de voordelen die 2D

gelelektroforese biedt in de scheiding en kwantitatieve analyse van eiwitten, heeft deze

techniek ook vele nadelen, zoals een lage throughput en problemen bij de detectie van eiwitten

die in lage hoeveelheden voorkomen. Ook extreem zure en basische eiwitten en eiwitten met

een hoog moleculair gewicht zijn moeilijk te bestuderen (Görg et al., 2004).

Toch wordt deze techniek nog steeds veel gebruikt bij scheiding en identificatie van

complexe eiwit mengsels. Het is immers nog steeds de beste methode om post-translationele

modificaties (PTM) (glycosylaties, fosforylaties, acetylaties,…) te onderzoeken.

1.3.3. Gel-vrije approach

Hoewel de gel-based methode zijn nut heeft, wordt de gel-vrije methode meer en meer

gebruikt gezien de mogelijkheid tot automatisatie. Bij deze techniek wordt d.m.v.

massaspectrometrie (MS) niet enkel het eiwit geïdentificeerd, maar ook gekwantificeerd.

Excise spot

of interest

Control condition

Experimental conditionSite-specific

cleavage

Mass

Spectrometry

Sample

clean-up

1. INLEIDING

16

Hiervoor worden de stalen gelabeld met een specifieke tag, afzonderlijk te onderscheiden in de

massa-analysator, waarbij via meting van de piekratio’s de peptiden gekwantificeerd kunnen

worden. Vervolgens wordt via tandem MS het eiwit geïdentificeerd. Figuur 1.9 vat enkele van de

methoden samen die gebruikt worden om cellen, eiwitten of peptiden te labelen. Deze worden

verder toegelicht.

FIGUUR 1.9: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EIWIT- IDENTIFICATIE EN

KWANTIFICATIEMETHODEN

1.3.3.1. Stable isotope labelling with aminoacids in cells (SILAC)

Stabiele isotoop labelling met aminozuren in celculturen (SILAC) is een eenvoudige

techniek om een label in vitro in eiwitten te incorporeren, om deze via MS kwantitatief te

analyseren. Bij SILAC worden cellen metabool gelabeld door ze op te kweken in media

gesupplementeerd met specifieke aminozuren. Deze aminozuren zijn verrijkt met een lichte of

zware isotoop vorm van C of N. Bij zo een experiment worden 2 celculturen opgegroeid die

identiek zijn behalve dat één ervan bestaat uit een zwaar aminozuur en het ander uit een licht

aminozuur. Na een aantal celdelingen zal elk natuurlijk voorkomend aminozuur vervangen zijn

door zijn isotoop gelabeld analoog. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar gezien de

GEL SILAC ICAT iTRAQ/COFRADIC

LABELING (NIVEAU)

• Cellen

extractie

• Eiwitten

in digest

• Peptiden

SCHEIDING gelelektroforese LC LC LC

KWANTIFICATIE gelkleuring MS MS MS/MS

IDENTIFICATIE MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS

1. INLEIDING

17

incorporatie van dit label 100% bedraagt. Bovendien is deze methode, door de afwezigheid van

chemische stappen, compatibel met opzuiveringsprocedures (Aebersold & Mann, 2003).

1.3.3.2. Combined fractional diagonal chromatography (COFRADIC)

COFRADIC is een diagonale chromatografische techniek om peptiden selectief uit een

complex mengsel te isoleren. Deze methode bestaat uit 2 identieke chromatografische

scheidingsstappen (omgekeerde fase vloeistofchromatografie (RP-LC)) met ertussen een

modificatiestap voor een selectieve klasse van peptiden. De gemodificeerde peptiden zullen een

hydrofiele of hydrofobe shift ondergaan en zullen zich op die manier onderscheiden van de rest

van het mengsel (Gevaert et al., 2007). Wanneer we enkel de methionyl peptiden willen,

kunnen we het verknipt proteoom een eerste maal over een RP-HPLC laten fractioneren om

vervolgens het mengsel te modificeren met H202 of waterstofperoxide. Hierdoor worden enkel

de methionyl residues geoxideerd ter hoogte van hun methionine sulfoxide groep. Te wijten aan

de gevormde dipool, ondergaan deze peptiden een hydrofiele shift waardoor ze bij een tweede

RP-HPLC fractionatie vroeger zullen elueren (Gevaert & Vandekerckhove, 2004).

1.3.3.3. Isotope-coded affinity tag (ICAT)

De isotope-coded affinity tagging (ICAT) is een techniek die kan differentiëren tussen 2

populaties van eiwitten door gebruik te maken van reactieve probes die verschillen in isotoop

samenstelling. Een ICAT reagens bestaat uit 3 delen: een proteïne reactieve groep, een

linkergroep en een biotine tag (fig 1.10). De reactieve groep bindt specifiek aan cysteïne

residues in proteïnen en peptiden. De linkergroep is opgebouwd uit 8 deuteriumatomen (d8,

zwaar reagens) of uit 8 waterstofatomen (d0, licht reagens). Na eiwitextractie worden de stalen

of met het licht of met het zwaar reagens gederivatiseerd. Na combinatie en digestie van de

stalen worden via avidine affiniteitschromatografie alle cysteïne bevattende peptiden

opgezuiverd. Via LC-MS kunnen de relatieve hoeveelheden van elk peptide in het staal gemeten

worden, door naar de ratio’s te kijken van de isotooppieken die 8 Dalton van elkaar verschillen.

ICAT kent een aantal beperkingen, zoals geen identificatie van proteïnen met geen of weinig

cysteïne residues, maar vooral de elutie van dezelfde peptiden naargelang ze gelabeld zijn met

het licht of zwaar reagens is licht verschillend, hetgeen de kwantificatie bemoeilijkt. Dit

probleem wordt opgelost door cICAT waarbij de C-atomen gelabeld worden. Ook wordt de ICAT

1. INLEIDING

18

tag beschouwd als zijnde groot voor de soms kleine peptiden, waardoor interferentie met het

ionisatieproces en moeilijkheden met de interpretatie van MS spectra kunnen vastgesteld

worden (Patton et al., 2002; Ross et al., 2004).

FIGUUR 1.10: ICAT REAGENS: BIOTINE TAG – LICHTE OF ZWARE LINKER – THIOL-SPECIFIEKE REACTIEVE GROEP

1.3.3.4. Isobaric tag for relative and absolute quantification (iTRAQ)

iTRAQ is een nieuwere gel-vrije techniek om eiwitten van verschillende stalen te

identificeren en kwantificeren in 1 experiment. Hiervoor werd een multiplex set van reagentia

ontwikkeld die bestaat uit isobare labels. Een volledige molecule bestaat uit een reporter groep,

een balance groep en een amine specifiek peptide reactieve groep (NHS-ester) (fig. 1.11). De

reporter groepen variëren in massa (m/z 114-117). Dit massaverschil wordt gecompenseerd

door de balance groep (31-28 Da), zodat iedere tag dezelfde totale massa (isobaar) heeft (145

Da). Deze tags binden covalent aan lysine of N-termini van peptiden met vorming van een

amidebinding. Labelling gebeurt bij deze techniek op peptide-niveau, dus moeten we het staal

eerst digereren alvorens te labellen (Ross et al., 2004). Na labelling worden de verschillende

stalen bijeengevoegd en onderworpen aan enkele opzuiveringsstappen, zoals fractionatie,

alvorens via chromatografie gescheiden te worden en geïdentificeerd in de massaspectrometer.

Gezien iTRAQ reagentia isobaar zijn, levert dit in single MS peptiden op van dezelfde massa.

Deze laatste zijn dus niet te onderscheiden. Identificatie en kwantificatie gebeuren beiden in

tandem MS. Als resultaat van de fragmentatie is er neutral loss van de balance groep en de

reporter groep vinden we terug in de m/z regio van 114 tot 117. Kwantificatie van de

piekoppervlakten van deze ionen toont ons de relatieve hoeveelheid van een bepaald peptide in

een bepaald staal (Wu et al., 2006).

1. INLEIDING

19

FIGUUR 1.11: iTRAQ ISOBAAR REAGENS: REPORTER GROEP – BALANCE GROEP – AMINE SPECIFIEK PEPTIDE

REACTIEVE GROEP

1.3.4. Principe van massaspectrometrie

MS is een analytische techniek die de massa van een molecule meet met hoge

sensitiviteit. Door de jaren heen heeft massaspectrometrie aan belang gewonnen om

biomoleculen met variërende complexiteit te analyseren en te karakteriseren. Per definitie

bestaat elke massaspectrometer uit 3 delen: een ionisatiebron, een massa-analysator en een

detector.

Om de massa of massa over lading (m/z) verhouding te bepalen in een

massaspectrometer moet het analiet eerst geïoniseerd worden. Er zijn 2 zachte

ionisatietechnieken, nl. electrospray ionization (ESI) en matrix-assisted laser desorption

ionization (MALDI), om biomoleculen te ioniseren (fig. 1.13). Bij MALDI wordt het staal

uitgekristalliseerd met een UV-absorberende matrix, opgebouwd uit zure fenolderivaten (bv.

dihydroxybenzoëzuur). Vervolgens wordt deze matrix bestraald met een laser waarbij de

matrixmoleculen de initiële energie van de laser opnemen en bij het terugvallen naar de

grondtoestand de energie overdragen aan de peptiden. Het resultaat is een wolk van

enkelvoudig geladen ionen. Bij ESI daarentegen wordt het analiet opgelost waarna het

1. INLEIDING

20

doorheen een capillair onder hoog voltage geloodst wordt. We krijgen verneveling van het staal

doordat gelijke krachten elkaar afstoten. Bij het overbruggen van de afstand naar de massa-

analysator verdampen de druppels verder en verkleint hun oppervlak, maar de lading blijft

behouden. Op die manier worden de coulombkrachten sterker en vallen de druppels uiteen tot

de watermantel finaal verdwijnt. Dit proces levert meervoudig geladen gasvormige ionen op. ESI

ioniseert analieten vanuit oplossing en kan daarom online gekoppeld worden aan vloeistof-

gebaseerde scheidingstechnieken (Aebersold & Mann, 2003).

(A) (B)

FIGUUR 1.12: (A) MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION (MALDI); (B)

ELECTROSPRAY IONIZATION (ESI)

(www.magnet.fsu.edu)

Na ionisatie worden de peptiden naar de massa-analysator geleid (Steen & Mann, 2004).

De meest gebruikte massa-analysatoren voor eiwitidentificatie zijn de quadrupool (Q) en Time

of Flight (TOF). Voor tandem MS worden 2 massa-analysatoren in serie gekoppeld, bv.

Quandrupool-Time of Flight (Q-TOF) en Time of Flight-Time of Flight (TOF-TOF). Bij tandem MS

worden ionen met een welbepaalde m/z waarde geselecteerd, gefragmenteerd in de collision

cel en de massa’s van de fragmentionen worden gescheiden door de 2e massa-analysator

(Aebersold & Mann, 2003; Nyman, 2001).

1. INLEIDING

21

Een quadrupool bestaat uit vier geleidende, evenwijdige staven op gelijke afstand van

elkaar binnen een paar isolerende ringen die gecoat zijn met een metaal of goud. De staven zijn

per paar elektrisch met elkaar verbonden en krijgen een gelijkspanning, waar bovenop nog een

wisselspanning wordt gesuperponeerd. Bij positieve gelijkspanning worden positieve ionen naar

het midden van de quadrupool gezogen. Bij negatieve gelijkspanning worden ze terug naar de

staven getrokken. Om te beletten dat de ionen niet geëlimineerd worden, moet een

wisselspanning aangelegd worden. De synergie tussen gelijkspanning en wisselspanning leidt

een smal venster van m/z waarden door de quadrupool. Door de frequentie van de

wisselspanning te variëren kan de massaspectrometer ingesteld worden om slechts bepaalde

peptiden met een bepaalde massa door te laten.

De Time of Flight (TOF) is een van de eenvoudigste massa-analysatoren. Hierbij worden

ionen versneld in een veldvrije buis alvorens bij de detector aan te komen. Alle ionen worden

met de zelfde energie versneld en de lengte van de buis blijft constant. Het is dus

vanzelfsprekend dat kleinere ionen sneller zullen aankomen dan zwaardere ionen. Op die

manier worden ze van elkaar gescheiden in de tijd. De tijd nodig voor een ion om de detector te

bereiken, kan dus geëxtrapoleerd worden naar zijn massa (Graham et al., 2007).

Door gebruik van 1 massa-analysator (MALDI-TOF) bekomen we de peptide mass

fingerprint van een eiwit, namelijk een scheiding op massa van de peptiden. Deze methode van

eiwitidentificatie biedt MS spectra aan met een lijst van proteolytische peptide fragment

massa’s. Deze kunnen we vergelijken met databanken waar via computerprogramma’s dezelfde

digestie werd uitgevoerd. Op die manier kunnen we het target proteïne identificeren. De

nauwkeurigheid van deze methode is afhankelijk van de specificiteit van het proteolytische

enzym, het aantal peptiden en de juistheid van de massaspectrometer (Patterson & Aebersold,

2003). Bij tandem MS wordt één bepaald peptide ion geïsoleerd en door botsingen met de

gasmoleculen in de collision cel wordt het peptide gefragmenteerd ter hoogte van de

amidebinding tussen aminozuren (Steen & Mann, 2004). Dochterionen die hieruit voortkomen,

worden ook wel eens b- of y-ionen genoemd (respectievelijk wanneer de lading op de

aminoterminus of carboxyterminus zit) (fig. 1.13). Op deze manier kan de aminozuursequentie

van het peptide bepaald worden en vervolgens het eiwit geïdentificeerd.

1. INLEIDING

22

FIGUUR 1.13: (A) FRAGMENTATIEPATROON VAN EEN PEPTIDE RESULTEREND IN DOCHTERIONEN

(B- OF Y-IONEN) WAARBIJ DE LADING RESPECTIEVELIJK OP DE N-TERMINUS OF C-TERMINUS ZIT;

(B) SCHEMATISCHE WEERGAVE VAN EEN MASSA-ANALYSATOR

(A) (B)

2. OBJECTIEVEN

23

2. OBJECTIEVEN

Deze onderzoekstage kadert in een functionele proteoomstudie waarbij het bestuderen

van eiwitprofielen, hun expressie, identificatie en kwantificatie, via de techniek van

proteoomanalyse centraal staat. Deze expressiepatronen van eiwitten bieden de mogelijkheid

om een vergelijking op te stellen enerzijds tussen inflammatoire pathologieën onderling en

anderzijds tussen inflammatoire en niet-inflammatoire aandoeningen.

We onderzoeken het membranair proteoom van geïnflammeerd synoviaal weefsel. Door

een analyse uit te voeren op een subset van klinisch goed gedocumenteerde stalen kunnen we

streven naar de ontdekking van een merker die los staat van inflammatie. In de literatuur zijn

reeds talrijke merkers geïdentificeerd die inflammatie-specifiek zijn, maar daarom niet zozeer

rechtstreeks gerelateerd zijn aan de ziekte. Net daarom voeren wij vooraf een scoring door op 3

parameters, nl. inflammatie, vascularisatie en infiltratie. Uiteraard kan dergelijk onderzoek, nl.

eiwitten identificeren en kwantificeren die een verschillende expressie vertonen tussen RA, SpA

en niet-inflammatoire artritis, ook bijdragen tot de kennis van de pathogenese achter de

verschillende reumatische pathologieën.

We maken hierbij gebruik van een gel-vrije proteomicstechniek gebaseerd op iTRAQ

labelling.

3. MATERIAAL EN METHODEN

24

Doel: lyse/opzuivering van eiwitten in een monster

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1. EIWIT-EXTRACTIE

3.1.1. Principe

De membranaire eiwitten worden geëxtraheerd door gebruik te maken van de

ReadyPrepTM Sequential Extraction Kit van Bio-Rad. Via deze kit kunnen eiwitten geëxtraheerd

worden uit cellysaten op basis van een verschillende oplosbaarheid.

De kit bestaat uit verschillende reagentia, nl. reagens 1, 2 en 3, die de extractie

bevorderen van respectievelijk goed oplosbare tot minder goed oplosbare eiwitten. Elk van de

reagentia lost een overlappende set van eiwitten op. Ze verschillen enkel in hun detergent en

chaotrope concentraties. Cytoplasmatische eiwitten zijn hydrofieler en dus beter oplosbaar dan

de hydrofobe membranaire proteïnen.

3.1.2. Materialen

ReadyPrepTM Sequential Extraction Kit Reagens 3 (Biorad, Hercules, CA, USA) -

Phosphatase inhibitor cocktail (I en II) (Sigma, Steinheim, Germany) - ReadyPrepTM TBP

Reducerend Reagens (Biorad, Hercules, CA, USA) - Benzonase® Nuclease (Sigma, Steinheim,

Germany) - Protease inhibitor cocktail tabletten (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).

3.1.3. Methode

3.1.3.1. Detergent-gebaseerde methode

Reagens 3 wordt aangemaakt met 6,3 ml MQ water en bestaat uit 5M ureum, 2M

thioureum, 2%(w/v) CHAPS, 2%(w/v) SB 3-10, 40mM Tris en 0,2%(w/v) Bio-Lyte 3/10

ampholyte. Dit zijn detergenten en chaotropen die de niet-covalente bindingen breken,

hierdoor ontplooit de molecule en wordt het eiwit oplosbaar.

1ml Reagens 3 + 10 µl TBP (reducing agent)

10 µl PP I

3. MATERIAAL EN METHODEN

25

10 µl PP II

korreltje protease inhibitor

150 U endonuclease

Aan elk staal (een pellet bekomen na extractie met reagens 1) wordt 500 µl Reagens

3 toegevoegd.

3.1.3.2. Fysische lyse

Naast de detergent-gebaseerde methode volgt nog fysische lyse.

Dit hele mengsel wordt gevortext, gesoniceerd en gemixt;

Na 30 min. incubatie worden de stalen gecentrifugeerd gedurende 25 min. op 20000

xg;

De supernatanten worden overgepipetteerd in nieuwe vials waar dan een

eiwitbepaling op uitgevoerd wordt.

3.2. GELFILTRATIE

3.2.1. Principe

Aangezien bij de extractie gebruik gemaakt werd van een detergent-gebaseerde

methode bevat het staal detergenten die verwijderd dienen te worden. Later hebben ze een

vernietigend effect op het enzym trypsine. Dit enzym wordt gebruikt bij eiwitdigestie nodig om

de peptiden daarna te labelen via de iTRAQ methode. Om deze reden willen we de

interfererende substanties uit ons staal verwijderen. Dit is mogelijk door een gelfiltratie uit te

voeren (= bufferswitch).

Gelfiltratie is een scheidingstechniek op basis van een verschil in grootte. Wij gebruiken

een sephadex G-25 Medium kolom. Deze laat een snelle scheiding toe tussen hoog moleculaire

en laag moleculaire substanties. Sephadex bestaat uit polymeer materiaal met

dwarsverbindingen tussen de ketens waardoor een 3D-netwerk met poriënstructuur ontstaat.

Moleculen groter dan de grootste poriën van de sephadex matrix zullen eerst elueren. Terwijl

molecules die kleiner zijn dan de grootste poriën eerst in de poriën zullen penetreren en pas

Doel: scheiding eiwitten van onzuiverheden op basis van grootte

3. MATERIAAL EN METHODEN

26

later zullen elueren. Eiwitten zijn hoogmoleculaire verbindingen en komen bijgevolg eerst van

de kolom. Zouten en andere onzuiverheden elueren laatst van de kolom.

3.2.2. Materialen

PD-10 Ontzouting Kolom bestaande uit Sephadex G-25 Medium (GE Healthcare,

Buckinghamshire, UK) - 96 microtiter well plaat: UV star (Greiner Bio-one, Frickenhausen,

Germany).

3.2.3. Methode

Verwijder het bovenste deksel van de kolom en giet de bewaarvloeistof af;

Snij de onderkant van de kolom af;

Spoel de kolom met 25 ml MQ water;

Pipetteer het staal (+/- 500µl van vooraf bekomen supernatans), aangelengd met

MQ water tot een volume van 2,5 ml bekomen wordt;

Vang het eluent op in een UV 96 well plaat per 5 druppels;

Laat 10 ml MQ water elueren en vang ook dit op per 5 druppels;

Analyse via absorptiemeting bij 280 nm.

3.3. EIWIT-BEPALING

3.3.1. Coomassie protein assay

Doel: Totale quantificatie van de eiwitten.

3.3.1.1. Principe

Na gelfiltratie worden de stalen aan een eiwitbepaling onderworpen. Het Coomassie

reagens bestaat uit Coomassie Blue G-250 Dye, methanol en fosforzuur in water. Bij binding van

het eiwit aan de Coomassie Dye in dit zure medium, zal een onmiddellijke kleurverandering van

bruin naar blauw plaatsvinden. Deze kleurverandering komt overeen met een stijging van het

absorptiemaximum van 465 nm naar 595 nm (fig. 3.1). Het is dus noodzakelijk per assay een

standaardcurve mee te runnen, aangezien de intensiteit van kleuromslag niet-lineair is met de

eiwitconcentratie. Een 4-parameter curve zal dan ook meer accurate resultaten opleveren.

Doel: totale kwantificatie van de eiwitten

3. MATERIAAL EN METHODEN

27

FIGUUR 3.1: PRINCIPE COOMASSIE BEPALING

3.3.1.2. Materialen

Coomassie® Proteïn Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) - 96 microtiter well plaat

(Greiner Bio-one, Frickenhausen, Germany).

3.3.1.3. Methode

TABEL 3.1: CONCENTRATIES STANDAARDREEKS COOMASSIE-BEPALING

Voeg 250 µl Coomassie reagens toe aan lege vials;

Pipetteer hierbij 5 µl staal (uit de gepoolde vials en standaarden). Goed vortexen;

Pipetteer 120 µl van dit mengsel in de 96 wellplaat;

Absorptiemeting bij 595 nm.

STANDAARD CONCENTRATIE BSA-STOCK (2 mg/ml)

standaard A 2000 µg/ml

standaard B 1500 µg/ml

standaard C 1000 µg/ml

standaard D 750 µg/ml

standaard E 500 µg/ml

standaard F 250 µg/ml

standaard G 125 µg/ml

standaard H 25 µg/ml

standaard I 0 µg/ml

3. MATERIAAL EN METHODEN

28

3.4. SODIUM DODECYL SULFAAT POLYACRYLAMIDE GELELEKTROFORESE (PAGE)

3.4.1. Principe

3.4.1. Principe

SDS denatureert eiwitten zodat de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur

verloren gaat. Het eindresultaat zijn eiwitten met enkel nog hun primaire structuur. SDS geeft

aan de eiwitten een negatieve lading in verhouding met hun lengte. Wanneer deze eiwitten in

een elektrisch veld worden geplaatst, migreren ze naar de positieve pool. Dit gebeurt voor alle

moleculen met dezelfde snelheid. Echter als we via MG willen scheiden, moeten we de

proteïnen in een omgeving brengen waar de geladen moleculen met verschillende snelheden

migreren. Polyacrylamide is hiervoor geschikt. Het is een polymeer dat omgevormd wordt tot

een gel met tunnels van verschillende diameters. Al naargelang de MG van het te scheiden

monster kunnen deze diameters kleiner of groter gemaakt worden. De kleinere eiwitten zullen

sneller en verder migreren in de gel dan de grotere.

3.4.2. Materialen

Laemmli Resolving Gel: Acrylamide/Bis (Biorad, Hercules, CA, USA) - Tris HCl pH 6,8 (MP

Biomedicals, Solon, Ohio) - Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) (MP Biomedicals, Solon, Ohio) -

N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine (TEMED) (Sigma, Steinheim, Germany) - Ammonium

persulfaat (APS) (Sigma, Steinheim, Germany) - Milli-Q water (MQ) (Millipore).

Laemmli Stacking Gel: Acrylamide/Bis (Biorad, Hercules, CA, USA) - Tris HCl pH 8,8 (MP

Biomedicals, Solon, Ohio) - Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) (MP Biomedicals, Solon, Ohio) - Milli-Q

water (MQ) (Millipore) - N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine (TEMED) (Sigma, Steinheim,

Germany) - Ammonium persulfaat (APS) (Sigma, Steinheim, Germany).

CriterionTM Cell (Biorad, Hercules, CA, USA) - Laemmli sample buffer (Pierce, Rockford, IL,

USA) - B-mercapto ethanol (Merck, Hohenbrunn, Germany) - Sypro Ruby protein gel stain

(Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) - Methanol (Merck, Hohenbrunn, Germany) - Azijnzuur

(Merck, Hohenbrunn, Germany).

Doel: scheiding van eiwitten op basis van moleculair gewicht (MG)

3. MATERIAAL EN METHODEN

29

3.4.3. Methode

Giet de gel in de cassette;

De gel is opgebouwd uit 2 delen, nl. Laemmli Resolving gel en Stacking gel.

TABEL 3.2: SAMENSTELLING LAEMMLI RESOLVING EN STACKING GEL

Bereken het volume (per fractie) dat geladen moet worden per laantje op de gel, d.i.

het volume dat overeenkomt met 20 µg staal (dit weten we door de vooraf

uitgevoerde Coomassie bepaling) en pipetteer dit volume over in nieuwe vials;

Droog deze vials in de Speedvac;

Resuspendeer in 20 µl Laemmli sample buffer + 1 µl β-mercapto ethanol;

TABEL 3.3: SAMENSTELLING LAEMMLI SAMPLE BUFFER

Plaats de vials gedurende 5 min. in de thermomixer op 95 °C;

Centrifugeer 5 min. 10000xg;

Detectie van de eiwitten gebeurt door kleuring met SYPRO Ruby; dit is een fluorescente

kleuring.

Gel 30 min. in fixatie-oplossing brengen: 10 % methanol, 7 % azijnzuur;

RESOLVING GEL 10 %

40 % Acrylamide/bis 25 ml

1,5 M Tris HCl (pH 8,8) 25 ml

10 % SDS 1 ml

MQ 48,5 ml

TEMED 50 µl

10 % APS 500 µl

STACKING GEL 4 %

40 % Acrylamide/bis 2,5 ml

0,5 M Tris HCl (pH 6,8) 6,3 ml

10 % SDS 250 µl

MQ 15,9 ml

TEMED 25 µl

10 % APS 125 µl

LAEMMLI SAMPLE BUFFER

50 mM Tris HCl (pH 6,8)

2 % SDS

5 % β-mercapto ethanol

10 % glycerol

BFB

3. MATERIAAL EN METHODEN

30

Laten schudden op schudder;

Verwijder de fixatie-oplossing;

Breng de gel in SYPRO Ruby proteïn gel kleuring-oplossing; verhinder lichtinval!

Incubeer 3u;

2 x 15 min. wassen in fixatie-oplossing;

Visualisatie van de fluorescente kleuring m.b.v. Versadoc.

3.5. iTRAQ ANALYSE

3.5.1. Opstelling van de analyse

Bij RA en SpA, twee vormen van inflammatoire artritis is synoviale hyperplasie een

belangrijk kenmerk. Dit is te wijten aan 3 grote processen, nl. inflammatie, infiltratie en

vascularisatie. Aangezien we de verschillen tussen RA en SpA willen onderzoeken,

randomniseren we de stalen aan de hand van deze 3 parameters, nl. inflammatie, vascularisatie

en infiltratie; deze mogen immers niet doorslaggevend zijn in onze conclusie. Meer specifiek

betekent dit dat differentieel verschillende eiwitten niet mogen gelinkt worden aan een

verhoorde inflammatie-, vascularisatie- of infiltratiegraad. Daarnaast nemen we ook nog een

aantal controlegroepen mee, deze zijn zowel van inflammatoire (RA acpa-, PsA) als van niet-

inflammatoire (OA) aard.

TABEL 3.4: OPSTELLING iTRAQ-ANALYSE

We poolen 60 µg staal per label en splitsen finaal in 2, op die manier kunnen duplicaten gerund

worden. Aangezien we beschikken over 8 labels, moeten we de analyse opsplitsen in 2.

PATHOLOGIE STAAL N°

RA ACPA- 208 234

OA 162 315 377 768

Psa 1137 1136 1129

RA inflammatie (RA A) 130 947 1145

SpA inflammatie (SpA A) 1085 524 350

RA vascularisatie (RA B) 262 1111 1145

SpA vascularisatie (SpA B) 1128 720 142

RA infiltratie (RA C) 882 969 482

SpA infiltratie (SpA C) 1185 1128 350

3. MATERIAAL EN METHODEN

31

TABEL 3.5: OPSPLITSING iTRAQ-ANALYSE: RUN A EN RUN B

3.5.2. Opzuivering en aanconcentrering met vivaspin

3.5.2.1. Materialen

Vivaspin kolom (Santorius, Goettingen, Germany) - Sodium Dodecyl Sulfaat ( SDS) (MP

Biomedicals, Solon, Ohio).

We maken gebruik van Vivaspin 2000 Da cut off hydrosart membraan ultrafiltratie kolommen.

3.5.2.2. Methode

Laad de gepoolde stalen op de concentrator;

Was 3x met 2ml MQ;

Centrifugeer telkens 15 min op 3000 xg;

Voeg 200 µl 0,01 % SDS toe;

Vortex goed en soniceer;

Reverse spin gedurende 5 min op 4000 xg;

Vloeistof overpipetteren in de originele vials;

Drogen in Speedvac.

run A run B

RA ACPA- RA ACPA-

OA OA

Psa Psa

RA inflammatie (RA A) RA vascularisatie (RA B)

SpA inflammatie (SpA A) SpA vascularisatie (SpA B)

RA infiltratie (RA C)

SpA infiltratie (SpA C)

Doel: opzuivering en aanconcentreren van het staal

3. MATERIAAL EN METHODEN

32

3.5.3. Digestie met trypsine en labelling van de stalen

3.5.3.1. Materialen

3.5.3.1. Materialen

Trypsine (Promega, Madison, WI, USA) - iTRAQ Dissolutie buffer: Triethylammonium

bicarbonaat (TEABC) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - Denaturant: Sodium Dodecyl

Sulfaat (SDS) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - Reducerend reagens: tris(2-

carboxyethyl)phosphine (TCEP) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - Cysteïne blocking: S-

Methyl methanethiosulfonate (MMTS) in isopropanol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

- Ethanol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - iTRAQ Reagent 8 Plex Multi-Plex Kit

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

3.5.3.2. Principe

De proteïne inhoud van elk gepoold staal wordt na aanconcentratie met Vivaspin

kolommen behandeld met trypsine. Trypsine is een proteolytisch enzym dat het eiwit klieft aan

het carboxy-terminaal uiteinde van arginine of lysine. Dit levert peptide fragmenten op met

minstens één van deze basische aminozuur residues (voordelig aangezien MS enkel geladen

fragmenten meet).

3.5.3.3. Methode

Voeg aan elk staal 19 µl dissolutie buffer (5M Triethylammonium bicarbonaat

(TEABC) buffer)+ 1 µl denaturant (2% SDS) toe;

Voeg 2 µl reducerend reagens (50 mM TCEP of 10 mM DTT) toe;

Incubeer 1u op 60 °C;

Voeg 1 µl cysteine blocking (200 mM MMTS in isopropanol) toe;

Meng een trypsine glazen vial samen met 40 µl TEABC buffer;

Voeg 10 µl hiervan bij elk staal.

Doel: Eiwitten verknippen tot peptiden en labellen van

peptiden ter identificatie en kwantificatie

peptiden ter identificatie en quantificatie

3. MATERIAAL EN METHODEN

33

PROTOCOL LABELLING:

Kies per staal een label;

Voeg aan elk label-vial 70 µl EtOH toe;

Voeg elk label bij het staal;

Vortex + centrifugeer kort;

Incubeer 2u;

100 µl MQ bij elk staal;

Voeg alle stalen bijeen;

Droog dit gepooled staal in de Speedvac.

3.6. OPZUIVERING

3.6.1. Strong cation exchange cartridge (SCX-cartridge)

3.6.1.1. Materialen

De cartridge is opgebouwd uit POROS® 50 HS kolom met 50 µm partikel grootte.

De ICATTM CATION EXCHANGE BUFFER PACK bestaat uit verschillende buffers

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA);

Load buffer: 10 mM KH2PO4, 25 % ACN, pH 3.0;

Elute buffer: 10 mM KH2PO4, 500 mM KCl, 25 % ACN, pH 3.0;

Clean buffer: 10 mM KH2PO4, 1M KCl, 25 % ACN, pH 3.0.

3.6.1.2. Principe

We gebruiken RP chromatografie om het iTRAQ Reagent-labeled staal te zuiveren van

interfererende substanties en overmaat label. De peptiden worden door ionische interacties op

de kolom gehouden, terwijl de zouten en het ongereageerd label geen affiniteit vertonen voor

de kolom en elueren. Door vervolgens de zoutconcentratie te verhogen, worden de peptiden

geëlueerd.

Doel: Verwijderen overmaat label

3. MATERIAAL EN METHODEN

34

3.6.1.3. Methode

Loop steeds 2 blanco runs alvorens het staal te laden.

1 ml clean buffer;

2 ml load buffer;

1 ml load buffer;

1 ml load buffer;

500 µl elute buffer;

1 ml clean buffer.

Na de 2 blanco runs, kan het staal gerund worden.

Voeg bij aan het staal 1 ml load buffer toe;

1 ml clean buffer;

2 ml load buffer;

Injecteer traag het staal (1 druppel/sec), vang eluens op + drogen;

1 ml load buffer (1 druppel/sec), vang eluens op + drogen;

500 ul elute buffer (1 druppel/sec), vang eluens op + drogen;

1 ml clean buffer.

3.6.2. C18-opzuivering

3.6.2.1. Materialen

Atlantis dC18 trap Column 5/pack (Waters, Milford, MA, USA)

5µm x 0.18mm x 23.5mm;

Buffer A: 0,1 % FA (Biosolve, ULC-MS grade);

Buffer B: 80 % ACN/0,1 % FA (Biosolve, ULC-MS grade).

3.6.2.2. Principe

Bij de SCX-cartridge worden de peptiden geëlueerd met een hoge zoutconcentratie.

Deze zoutconcentratie moet terug naar 0 % gereduceerd worden, als we ons staal willen

fractioneren. We gaan dus opnieuw een opzuivering doen, maar deze keer gebaseerd op

hydrofobiciteit. De kolom wordt geconditioneerd met 0,1 % FA. Zouten zijn hydrofiel en

vertonen bijgevolg geen affiniteit voor deze kolom. Peptiden bevatten aminozuren met

3. MATERIAAL EN METHODEN

35

hydrofoob karakter, die blijven hangen aan de C18 kolom. We elueren de peptiden met 80 %

ACN/0,1 % FA.

We gebruiken 2 C18-kolommen om voldoende trapping vermogen te hebben. Het trap

vermogen van 1 kolom bedraagt 1mg.

3.6.2.3. Methode

FIGUUR 3.2: ELUTIE PEPTIDEN ZONDER GRADIËNT

Voeg aan de gedroogde stalen 60 µl 0,1 % FA toe;

Vang het eluens op gedurende 20 min.;

Droog staal in speedvac.

3.7. TWEE-DIMENSIONELE VLOEISTOF CHROMATOGRAFIE

3.7.1. Fractionatie door scheiding op SCX

3.7.1.1. Materialen

Poros 10S SCX Column (LC-Packings, Sunnyvale, CA, USA)

300µm i.d. x 10 cm;

Buffer A: 5mM KH2PO4; 15 % ACN; pH 2,7;

3. MATERIAAL EN METHODEN

36

Buffer B: 5mM KH2PO4; 500 mM KCl; 15 % ACN; pH 2,7;

Buffer C: 5mM KH2PO4; 500 mM KCl; 25 % ACN; pH 2,7.

3.7.1.2. Principe

Het staal bestaat uit verscheidene peptiden afkomstig van verscheidene eiwitten. Om

de complexiteit van het staal te reduceren, doen we nog een 2-dimensionele LC, maar met

gradiëntelutie. We vangen het eluens op in 15 fracties.

3.7.1.3. Methode

Gedroogd staal oplossen in 40 µl 0,1 % FA;

Staal in 2 delen: 2 x 20 µl in 500 µl epjes;

FIGUUR 3.3: ELUTIE PEPTIDEN MET OPBOUW GRADIËNT

3. MATERIAAL EN METHODEN

37

3.7.2. Identificatie en kwantificatie dmv Online HPLC-ESI-QTOF-MS/MS

3.7.2.1. Materialen

C18 Trapkolom (LC-Packings, Sunnyvale, CA, USA) - NAN 75-15-03 C18 PM (LC-

Packings, Sunnyvale, CA, USA);

Stationaire fase: C18 pepMAP100

3µm x 30 cm x 75 µm.

3.7.2.2. Principe

De 15 fracties worden online geïnjecteerd op een RP-HPLC kolom en één voor één

gerund via LC-MS/MS. De peptiden worden eerst over een C18 trapkolom gebracht. Dit dient

om het staal aan te concentreren en te ontzouten, alsook om de levensduur van de analytische

kolom te verhogen. De loading pomp voert eluens A (0,1 % FA) over de trapkolom. Hierdoor

zullen alle zouten en andere onzuiverheden van de kolom lopen. Echter de peptiden blijven op

de kolom plakken. Bij switchen van richting van de loading pomp is het de bedoeling de

peptiden te elueren in de richting van de analytische kolom. Dit doen we door een gradiënt op

te bouwen van eluens B (80 % ACN + 0,1 % FA). Zo krijgen we een scheiding van peptiden op de

analytische kolom. Het chromatogram geeft ons een idee of deze scheiding correct verlopen is.

We gebruiken Glufib ter controle van de gevoeligheid en massa-accuraatheid van de

massaspectrometer.

Processing van de data gebeurt aan de hand van het software programma Mascot

Distiller, waarna gebruik gemaakt wordt van een in-house Mascot server om de eiwitten te

identificeren en te kwantificeren.

4. RESULTATEN

38

4. RESULTATEN

4.1. OPZUIVERING MET GELFILTRATIE EN ANALYSE MET GELELEKTROFORESE

Als voorbereidend werk werd eerst een gelfiltratie uitgevoerd op al de stalen, met als

doel de eiwitten te scheiden van onzuiverheden. In figuur 4.1 worden de resultaten van de

gelfiltraties van stalen PsA 1136, PsA 1129, RA 130 en RA 234 weergegeven. Bij elk staal is er

een stijging in optische densiteit (OD) van fractie 11 21 en van fractie 35 63 zichtbaar. Deze

pieken noemden we respectievelijk piek 2 en 4 (aangeduid met pijltje). De fracties voor piek 2

en voor piek 4 vertoonden geen stijging in OD en noemden we respectievelijk piek 1 en 3.

We illustreren dit voor 4 stalen, nl. staal PsA 1136, PsA 1129, RA 130, RA 234.

FIGUUR 4.1: ABSORPTIE METINGEN BIJ 280NM VAN DE VERSCHILLENDE FRACTIES

Bij een volgende stap werden alle fracties per piek samen gepooled, zodat per staal de 4

pieken apart konden onderworpen worden aan een eiwitbepaling. Dit om een ruwe schatting te

krijgen van de concentratie eiwit aanwezig in de stalen (tabel 4.1). Let wel, niet alle fracties in

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63

SpA 1136

2

31

4

Fractie

OD

(2

80

nm

)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61

Spa 1129

2

3

1

4

Fractie

OD

(2

80

nm

)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67

RA 130

2

3

1

4

OD

(2

80

nm

)

Fractie

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59

RA 234

3

1

4

Fractie

OD

(2

80

nm

)

2

PsA

PsA

4. RESULTATEN

39

piek 1, 3 en 4 werden meegenomen voor een concentratiemeting. Er is dus een verschil in

volume tussen de pieken.

TABEL 4.1: RESULTAAT COOMASSIE EIWITBEPALING PER PIEK VOOR DE 4 STALEN

Uit de eiwitbepalingen werd duidelijk dat de hoogste concentratie aan eiwitten in de

fracties afkomstig was van piek 2. Bij staal PsA 1129 bijvoorbeeld, was de eiwitconcentratie in

piek 2 442,76 µg/ml. Het materiaal uit de pieken werd geanalyseerd met gelelektroforese

waarna een totale eiwitkleuring uitgevoerd werd (fig 4.2). Fluorescente kleuring van de eiwitten

met SYPRO Ruby® toonde aan dat de eiwitten voornamelijk in piek 2 voorkwamen. Anderszijds

toonde de gel eveneens aan dat er eiwitten in piek 3 aanwezig waren. Er was echter nooit een

significante kleuring van piek 1 en piek 4 te zien. Hieruit kon met zekerheid besloten worden dat

de eiwitten zich situeerden in piek 2 en 3, meer bepaald van fractie 11 37. Deze fracties

werden dan ook afgezonderd en verder geprocessed voor iTRAQ analyse.

FIGUUR 4.2: RESULTAAT GELELEKTROFORESE VOOR DE 4 STALEN

STAAL

piek 1 piek 2 piek 3 piek 4

Psa 1136 18,61 162,30 14,58 /

Psa 1129 46,06 442,76 82,57 35,00

RA 130 55,27 165,75 80,34 35,31

RA 234 17,18 132,92 46,32 32,20

COOMASSIE (µg/ml)

STAAL 1136 STAAL 1129 STAAL 130 STAAL 234 merker

Piek 2

Piek 2

Piek 2

Piek 1

Piek 3

Piek 3

Piek 3

Piek 3

Piek 1

Piek 1 Piek 4

Piek 1 Piek 4

Piek 4Piek 2

4. RESULTATEN

40

Gebaseerd op het resultaat van de 4 besproken stalen, werd besloten om bij de

volgende stalen de fracties van piek 2 en 3 onmiddellijk samen te poolen in één epje en hiermee

verder te werken. Met de fracties van piek 1 en 4 werd aldus niet meer verder gewerkt.

4.2 EIWITBEPALING VAN ALLE PATIËNTEN

Tabel 4.2 geeft de resultaten weer van de eiwitbepalingen van al de stalen. Zoals reeds

eerder gezegd, zijn dit de concentraties van piek 2 en 3 samen verwerkt tot 1 geheel.

TABEL 4.2: RESULTAAT COOMASSIE EIWITBEPALING VOOR ALLE PATIËNTEN

4.3 OPZET iTRAQ ANALYSE

Gezien we in de 8-plex-MultiPlex Kit slechts over 8 labels beschikken, diende de analyse

in 2 opgesplitst te worden. Run A bevat de RA en SpA stalen die gescoord werden op

inflammatie, en bestaat bijgevolg uit 5 labels. RA en SpA stalen die gescoord werden op

vascularisatie en infiltratie behoren tot run B, en deze bestaat uit 7 labels.

STAAL COOMASSIE (µg/ml) STAAL COOMASSIE (µg/ml)

RA 130 275,83 PsA 1137 168,03

RA 947 455,12 PsA 1136 320,31

RA 1145 313,06 PsA 1129 658,17

RA 262 410,87 RA acpa - 234 264,90

RA 1111 249,71 RA acpa - 208 303,65

RA 882 442,05 OA 162 292,90

RA 969 421,04 OA 315 344,85

RA 482 381,87 OA 768 234,88

Spa 1085 430,58 OA 377 248,39

Spa 524 459,32

Spa 350 183,57

Spa 1128 553,14

Spa 720 325,77

Spa 142 513,03

4. RESULTATEN

41

TABEL 4.3: INDELING iTRAQ ANALYSE + TOEKENNING LABELS PER STAAL

4.4 RESULTATEN iTRAQ ANALYSE

Ruwe data uit de Masslynx werden geprocessed via de Mascot Distiller en werden samen

met de Database Search verwerkt door Mascot Daemon software.

Bij run A is er een probleem opgetreden te wijten aan een verlies van staal, waardoor te

weinig eiwitten konden identificeerd worden. Deze run zal in de toekomst opnieuw

geanalyseerd worden. De onderstaande resultaten zijn bijgevolg enkel afkomstig van run B.

In deze analyse is het de bedoeling om biomerkers te identificeren die los staan van de

parameters vascularisatie (= B) en infiltratie (= C). Daarom zijn we enkel geïnteresseerd in

eiwitten die eenzelfde ratio bezitten ongeacht of ze gescoord werden op vascularisatie of

infiltratie. Het belangrijkste verschil dat bekeken werd, is de ratio RA/SpA. De andere stalen die

meegenomen werden ter controle (OA, PsA, RA ACPA-), waren potentieel belangrijk omdat er

andere verschillen naar boven konden komen. Echter deze stalen werden niet gescoord op

vascularisatie of infiltratie omdat dit de enige stalen in onze cohorte waren. Ze zijn dus klinisch

niet goed gedefinieerd waardoor mogelijke verschillen, die niet consistent zijn, te verklaren zijn.

Voor de bespreking van de resultaten in deze thesis beperken we ons tot de RA/SpA ratio.

Wij zochten in de Uniprot databank (www.uniprot.org), meer specifiek nog in de humane

databank waarin enkel humane eiwitten met gekende functionaliteit terug te vinden zijn. Op

deze manier konden 43 eiwitten geïdentificeerd worden. Hieruit wordt 1 voorbeeld in detail

besproken, nl. fibrinogeen alfa (FIBA_HUMAN).

STAAL iTRAQ-LABEL STAAL iTRAQ-LABEL

RA A 113 RA B 118

SpA A 114 RA C 119

OA 115 SpA B 121

Psa 116 SpA C 113

RA acpa- 117 OA 114

Psa 115

RA acpa- 116

Run A Run B

4. RESULTATEN

42

TABEL 4.4: EIWITRATIO VAN FIBA_HUMAN

Gezien de peptidesequentie van een eiwit uniek is, kon fibrinogeen alfa, een eiwit met

massa 108897 en pI van 5.7, geïdentificeerd worden aan de hand van 21 peptiden. De eiwit

‘coverage’ bedraagt 12,2 %. ‘N’ betekent hier het aantal peptiden waarop de kwantificatie voor

de gegeven ratio gebaseerd is en ‘weighted’ is de manier waarop de ratio’s bepaald worden.

Wanneer we kijken naar de ratio’s weergegeven in tabel 4.4, dan zien we dat de eiwitratio’s van

fibrinogeen alfa, ongeacht ze gescoord werden op vascularisatie of infiltratie, dezelfde trend

volgen, nl. verhoogd aanwezig in SpA in vergelijking met RA.

4. RESULTATEN

43

TABEL 4.5: LIJST 21 PEPTIDEN WAARMEE FIBA_HUMAN GEÏDENTIFICEERD WERD

De finale eiwitratio (tabel 4.4) wordt berekend uit de ratio van de geïdentificeerde

peptiden (tabel 4.5). Eenentwintig peptiden werden geïdentificeerd (weergegeven in tabel 4.5)

waarvan het merendeel 3-waardig geladen is. ‘exp_mz’ is de gemeten m/z waarde; ‘exp_mr’ is

de omgerekende massa van het peptide; ‘exp_z’ is de experimentele lading van het peptide;

‘calc_mz’ is de theoretische massa van het peptide; ‘delta’ is het verschil tussen de

experimentele en de theoretische massa van het peptide; ‘miss’ duidt aan hoeveel keer het

protease niet geknipt heeft in het geïdentificeerde peptide; ‘expect’ is de expectancy waarde,

nl. een maat voor de kwaliteit van het MS/MS spectrum en drukt de kans uit hoeveel keer je

deze score of een betere score voor identificatie zou hebben voor dit fragmentatiespectrum.

Met andere woorden, hoe lager deze kans, hoe robuuster de identificatie van het peptide; ‘seq’

geeft de sequenctie weer van het peptide en tenslotte ‘var_mod’ geeft de geïdentificeerde

modificaties aan voor het peptide.

Tabel 4.6 geeft de individuele peptide ratio’s weer voor elk peptide en hun gegeven

ratio. Het peptide met massa 727,6823 werd niet meegenomen in de kwantificatie (---)

aangezien het iTRAQ label gebonden zat op het tyrosine residue. Wanneer een peptide met een

‘(-)ratio’ bekomen werd, werd deze eveneens niet geïncludeerd in de kwantificatie van het

eiwit. De ratio werd hier echter wel berekend; dit is het getal weergegeven na de (-). Het

exp_mz exp_mr exp_z calc_mr delta miss expect seq var_mod747,8207 1493,6269 2 1493,7417 -0,1148 0 0,061 QFTSSTSYNR768,9249 1535,8353 2 1535,9496 -0,1143 0 0,0089 QLEQVIAK818,926 1635,8375 2 1635,9082 -0,0707 0 0,017 NSLFEYQK

858,0983 1714,1821 2 1714,0715 0,1106 0 0,013 VQHIQLLQK583,6255 1747,8547 3 1747,9566 -0,1019 0 0,013 GSESGIFTNTK912,9215 1823,8284 2 1823,932 -0,1036 0 6,50E-05 GLIDEVNQDFTNR608,9636 1823,8691 3 1823,932 -0,063 0 0,00099 GLIDEVNQDFTNR938,8895 1875,7645 2 1875,8753 -0,1108 0 1,10E-06 GGSTSYGTGSETESPR938,8945 1875,7744 2 1875,8753 -0,1009 0 5,60E-05 GGSTSYGTGSETESPR626,2706 1875,7899 3 1875,8753 -0,0855 0 6,80E-07 GGSTSYGTGSETESPR626,2803 1875,819 3 1875,8753 -0,0563 0 0,00019 GGSTSYGTGSETESPR938,9394 1875,8642 2 1875,8753 -0,0111 0 1,20E-06 GGSTSYGTGSETESPR727,6823 2180,025 3 2180,0807 -0,0556 0 0,013 GGSTSYGTGSETESPR iTRAQ8plex (Y)756,6496 2266,927 3 2267,047 -0,1199 0 4,60E-08 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR756,6663 2266,977 3 2267,047 -0,07 0 9,50E-08 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR756,6893 2267,0461 3 2267,047 -0,0009 0 3,10E-08 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR756,9797 2267,9172 3 2268,031 -0,1138 0 3,90E-09 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)756,985 2267,9331 3 2268,031 -0,0979 0 9,80E-10 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)

756,9954 2267,9644 3 2268,031 -0,0666 0 8,80E-09 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)757,0167 2268,0282 3 2268,031 -0,0028 0 4,90E-09 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)785,5206 2353,54 3 2353,396 0,144 0 0,035 MKPVPDLVPGNFK

4. RESULTATEN

44

algoritme plaatst er een (-) voor omdat of het verschil te groot is en biologisch mogelijks niet

verklaard kan worden, of omdat de kwantificatie van de piek niet goed kon uitgevoerd worden

door een slechte piekvorm of afwezigheid van de piek.

TABEL 4.6: INDIVIDUELE PEPTIDENRATIO’S VOOR FIBRIOGEEN ALFA

Een overzichtstabel van alle geïdentificeerde eiwitten wordt weergegeven in tabel 4.7.

Hierbij zijn de eiwitten, die eenzelfde ratio in RA B/SpA B en RA C/SpA C vertoonden, aangeduid

in grijswaarden. De functie van de eiwitten werd opgezocht in de uniprot database

(www.uniprot.org).

In deze tabel betekent ‘accession’ de identificatiecode uit de uniprot databank; ‘eiwit’

naam van het eiwit; ‘RA B/SpA B’ staat voor de ratio wanneer de stalen gescoord werden op

vascularisatie, net zoals ‘RA C/ SpA C’ staat voor de ratio wanneer gescoord werd op infiltratie

en ‘functie’ is een korte beschrijving van het eiwit.

exp_mz RA B/SpA B RA C/ SpA C RA B/ OA RA C/ OA RA B / Psa RA C/ Psa RA B/ acpa- RA C/ acpa- SpA B/ OA SpA C/ OA SpA B/ Psa SpA C/ Psa SpA B/ acpa- SpA C/ acpa-

747,8207 0,524 1,212 1,595 4,326 0,559 1,462 1,498 3,879 3,326 4,323 0,999 1,304 3,004 4,186768,9249 0,287 0,349 2,927 1,761 0,94 0,545 2,883 1,656 11,126 6,101 3,063 1,686 10,536 6,196818,926 0,317 0,468 -4,809 -3,559 1,084 0,774 5,772 4,079 -16,581 -9,209 3,205 1,787 19,132 11,396

858,0983 0,688 0,466 -3,106 -4,061 2,592 3,267 -26,257 -32,776 -4,931 -10,558 3,527 7,582 -40,072 -92,017583,6255 0,656 1,994 2,04 5,372 0,668 1,695 2,28 5,731 3,399 3,262 0,954 0,919 3,652 3,758912,9215 0,306 0,317 -4,472 -2,388 0,966 0,498 3,571 1,821 -15,977 -9,126 2,96 1,698 12,266 7,515608,9636 0,442 0,338 1,832 0,927 0,848 0,414 1,222 0,59 4,533 3,315 1,8 1,321 2,908 2,28938,8895 0,278 1,103 -3,299 -7,768 0,544 1,234 2,338 5,257 -12,951 -8,528 1,829 1,209 8,825 6,232938,8945 0,242 0,933 -2,775 -6,668 0,478 1,108 -5,397 -12,382 -12,509 -8,651 1,848 1,283 -23,391 -17,349626,2706 0,202 0,769 -1,806 -5,248 0,269 0,755 0,973 2,698 -9,792 -8,262 1,252 1,061 5,068 4,586626,2803 0,416 0,581 2,575 3,991 0,495 0,74 -4,76 -7,045 6,767 8,31 1,116 1,376 -12,028 -15,842938,9394 0,26 1,101 -3,329 -7,72 0,537 1,201 -6,059 -13,413 -14,003 -8,487 1,937 1,179 -24,497 -15,924727,6823 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---756,6496 0,287 1,18 -2,43 -8,568 0,445 1,511 -4,369 -14,705 -9,263 -8,789 1,452 1,384 -16,007 -16,29756,6663 0,33 1,235 -3,999 -8,374 0,588 1,186 1,406 2,811 -13,253 -8,212 1,669 1,039 4,479 2,977756,6893 0,248 1,082 -2,487 -7,9 0,465 1,424 -4,459 -13,519 -10,959 -8,839 1,757 1,423 -18,884 -16,334756,9797 0,338 1,196 -3,227 -8,394 0,523 1,312 -5,152 -12,793 -10,422 -8,498 1,448 1,185 -15,994 -13,986756,985 0,367 0,657 -2,905 -4,891 0,588 0,955 -5,884 -9,459 -8,655 -9,009 1,503 1,571 -16,855 -18,816

756,9954 0,446 0,946 -3,679 -6,314 0,513 0,849 -5,792 -9,49 -9,012 -8,084 1,077 0,97 -13,639 -13,121757,0167 0,39 0,972 -3,295 -6,873 0,548 1,102 -5,458 -10,868 -9,224 -8,564 1,315 1,226 -14,685 -14,623785,5206 0,558 0,565 -43,571 -88,31 1,853 3,62 -19,649 -38,021 -85,388 -189,166 3,112 6,923 -37,017 -87,952

4. RESULTATEN

45

TABEL 4.7: OVERZICHT VAN ALLE GEÏDENTIFICEERDE EIWITTEN

ACCESION EIWIT RA B/SpA B RA C/SpA C FUNCTIE

RA < SpA FIBA_HUMAN fibrinogen alpha chain precursor 0,323 0,760

RA < SpA LUM_HUMAN lumican precursor 0,816 0,837 Binds lamin.

RA < SpA FIBG_HUMAN fibrinogen gamma chain precursor 0,284 0,496

RA < SpA CO6A3_HUMAN collagen alpha-3(VI) chain precursor 0,824 0,771Collagen VI acts as a cell-

binding protein.

RA < SpA FIBB_HUMAN fibrinogen beta chain precursor 0,298 0,410

RA > SpA H2B1A_HUMAN Histone H2B type 1-A 11,200 2,878

RA > SpA LMNA_HUMAN lamin-A/C 1,259 2,200

RA > SpA KAC_HUMAN Ig kappa chain C region 1,267 2,027 immunoglobulin C region, has an immunologic role.

RA > SpA VIME_HUMAN vimentin 1,994 1,485

RA > SpA PDIA1_HUMAN protein disulfide isomerase precursor 2,603 1,835

CO1A1_HUMAN collagen alpha-1(I) chain precursor 1,482 0,606

HBB_HUMAN hemoglobin subunit beta 0,898 2,864

CO3A1_HUMAN collagen alpha-1(III) chain precursor 1,544 0,443

CO1A2_HUMAN collagen alpha-2(I) chain precursor 1,165 0,685

MLE3_HUMAN myosin light chain 3 0,117 55,171

ACTB_HUMAN actin, cytoplasmic 1 (beta-actin) 0,549 4,303

ACTC_HUMAN actin, cardiac muscle 1 (alpha-cardiac-actin)0,390 4,525

FINC_HUMAN fibronectin precursor 0,809 1,332

ALBU_HUMAN serum albumin precursor 0,565 1,303

PRELP_HUMAN prolargine precursor 0,710 1,098

CO6A1_HUMAN collagen alpha-1(VI) chain precursor 1,068 0,774 Collagen VI acts as a cell-binding protein.

HBA_HUMAN hemoglobin subunit alpha 0,740 2,602

H2A1B_HUMAN histone H2A type 1-B 6,986 0,886

Zie HBB_HUMAN

Core component of nucleosome. Nucleosomes wrap and compact DNA into

chromatin, limiting DNA accessibility to the cellular machineries which require

DNA as a template. Histones thereby play a central role in transcription

regulation, DNA repair, DNA replication and chromosomal stability.

May anchor basement membranes to the underlying connective tissue.

Serum albumin, the main protein of plasma, Its main function is the

regulation of the colloidal osmotic pressure of blood.

Fibrinogen has a double function: yielding monomers that polymerize into

fibrin and acting as a cofactor in platelet aggregation.

Involved in oxygen transport

Actins are highly conserved proteins that are involved in various types of cell

motility and are ubiquitously expressed in all eukaryotic cells.

Zie ACTB_HUMAN

Zie FIBA_HUMAN

Zie FIBA_HUMAN

Zie H2A1B_HUMAN

Lamins are components of the nuclear lamina, a fibrous layer on the

nucleoplasmic side of the inner nuclear membrane, which is thought to

provide a framework for the nuclear envelope and may also interact with

chromatin.

This multifunctional protein catalyzes the formation, breakage and

rearrangement of disulfide bonds. At the cell surface, seems to act as a

reductase that cleaves disulfide bonds of proteins attached to the cell. May

therefore cause structural modifications of exofacial proteins. Inside the cell,

seems to form/rearrange disulfide bonds of nascent proteins. At high

concentrations, functions as a chaperone that inhibits aggregation of

misfolded proteins. At low concentrations, facilitates aggregation (anti-

chaperone activity). Also acts a structural subunit of various enzymes such

as prolyl 4-hydroxylase.

Vimentins are class-III intermediate filaments found in various non-epithelial

cells, especially mesenchymal cells.

Type I collagen is a member of group I collagen (fibrillar forming collagen).

Collagen type III occurs in most soft connective tissues along with type I

collagen.

Zie CO1A1_HUMAN

Regulatory light chain of myosin. Does not bind calcium.

Fibronectins bind cell surfaces and various compounds including collagen,

fibrin, heparin, DNA, and actin. Fibronectins are involved in cell adhesion, cell

motility, opsonization, wound healing, and maintenance of cell shape.

4. RESULTATEN

46

TABEL 4.7: OVERZICHT VAN ALLE GEÏDENTIFICEERDE EIWITTEN (VERVOLG)

TPM1_HUMAN tropomyosin-1 alpha chain 0,111 26,194

PGS2_HUMAN decorin precursor 1,694 0,610 May affect the rate of fibrils formation.

H4_HUMAN histone H4 4,240 0,965 Zie H2A1B_HUMAN

CO6A2_HUMAN collagen alpha-2(VI) chain precursor 0,845 1,034 Collagen VI acts as a cell-binding protein.

A1AT_HUMAN alpha-1-antitrypsine precursor 1,263 1,104

CO5A2_HUMAN collagen alpha-2(V) chain precursor 2,432 1,050

MIME_HUMAN mimecan precursor 1,002 0,918

TTHY_HUMAN transthyretin precursor 3,534 0,833

G3P_HUMAN glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase0,902 3,825

PRTN3_HUMAN myeloblastin precursor 0,228 1,000

MYG_HUMAN myoglobin 0,238 2,790

ATPA_HUMAN ATP synthase subunit alpha 0,125 3,417

PGBM_HUMAN

basement membrane-specific heparan

sulfate proteoglycan core protein

precursor

1,505 0,702

TPIS_HUMAN triosephosphate isomerase 0,195 6,797

IGHG1_HUMAN Ig gamma-1 chain C region 0,854 1,258

ASPN_HUMAN asporin precursor 0,043 1,023

ANXA2_HUMAN annexin A2 1,092 3,118

TLN1_HUMAN Talin-1 1,861 0,736

MLRV_HUMAN Myosin regulatory light chain 2 0,080 6,262

K2C1_HUMAN keratin, type II cytoskeletal 1 0,541 1,570

Binds to actin filaments in muscle and non-muscle cells. Plays a central role,

in association with the troponin complex, in the calcium dependent regulation

of vertebrate striated muscle contraction. Smooth muscle contraction is

regulated by interaction with caldesmon. In non-muscle cells is implicated in

stabilizing cytoskeleton actin filaments.

Inhibitor of serine proteases. Its primary target is elastase, but it also has a

moderate affinity for plasmin and thrombin. Irreversibly inhibits trypsin,

chymotrypsin and plasminogen activator. The aberrant form inhibits insulin-

induced NO synthesis in platelets, decreases coagulation time and has

proteolytic activity against insulin and plasmin.

Type V collagen is a member of group I collagen (fibrillar forming collagen). It

is a minor connective tissue component of nearly ubiquitous distribution. Type

V collagen binds to DNA, heparan sulfate, thrombospondin, heparin, and

insulin. Type V collagen is a key determinant in the assembly of tissue-

specific matrices.

Induces bone formation in conjunction with TGF-beta-1 or TGF-beta-2.

Thyroid hormone-binding protein. Probably transports thyroxine from the

bloodstream to the brain.

Independent of its glycolytic activity it is also involved in membrane trafficking

in the early secretory pathway.

Polymorphonuclear leukocyte serine protease that degrades elastin,

fibronectin, laminin, vitronectin, and collagen types I, III, and IV (in vitro) and

causes emphysema when administered by tracheal insufflation to hamsters.

Probably involved in connections of major cytoskeletal structures to the

plasma membrane. High molecular weight cytoskeletal protein concentrated

at regions of cell-substratum contact and, in lymphocytes, at cell-cell

contacts.

May regulate the activity of kinases such as PKC and SRC via binding to

integrin beta-1 (ITB1) and the receptor of activated protein kinase C.

Serves as a reserve supply of oxygen and facilitates the movement of oxygen

within muscles.

Mitochondrial membrane ATP synthase (F1F0 ATP synthase or Complex V)

produces ATP from ADP in the presence of a proton gradient across the

membrane which is generated by electron transport complexes of the

respiratory chain.

This protein is an integral component of basement membranes. It is

responsible for the fixed negative electrostatic charge and is involved in the

charge-selective ultrafiltration properties. It serves as an attachment

substrate for cells.

Has an immunologic role.

Calcium-regulated membrane-binding protein whose affinity for calcium is

greatly enhanced by anionic phospholipids. It binds two calcium ions with

high affinity. May be involved in heat-stress response.

Triosphosphate is the glytolytic enzyme that catalyses the reversible

interconversion of glyceraldehyde-3-phosphaat and dihydroxyacetone

phosphaat. Plays also an important role in several metabolic pathways and is

efficient for energy production.

Binds TGF-β, a key cytokine in OA pathogenes and inhibits TGF-β induced

chondrogenesis.

Moves alang with actine filaments, while hydrolysing ATP.

4. RESULTATEN

47

Eiwitten die verlaagd aanwezig waren bij RA ten opzichte van SpA zijn de subunits van

fibrinogeen (alfa, beta en gamma), lumican en de collageen alfa-3(VI) keten.

A) Fibrinogeen RA < SpA

Fibrinogeen, een 340 kDa glycoproteïne gecodeerd op chromosoom 4 en tevens

precursor van fibrine, bleek uit de bekomen data een hogere expressie te hebben in SpA dan in

RA. Dit acute-fase reactant wordt vrijgesteld als antwoord op inflammatie, infectie of auto-

immuniteit. Het is gekend dat fibrinogeen gamma net als de alfa en de beta keten een belangrijk

gecitrullineerd auto-antigen vormt in RA (Matsuo et al., 2006). De immuuncomplexen gevormd

met gecitrullineerd fibrinogeen spelen eveneens een rol bij synovitis en de vorming van

pannusweefsel. Het is zelfs zo dat als hypothese genomen wordt dat auto-antilichamen tegen

gecitrullineerd fibrinogeen bijdragen aan het onevenwicht tussen coagulatie en fibrinolyse. Dit

door structurele en functionele veranderingen aan te brengen aan het eiwit (Zhao et al., 2008).

Fibrinogeen is dus voornamelijk gekend in de reumatologische wereld als antigen, althans zijn

gecitrullineerde vorm. De studie van Chapuy-Regaud et al. (2005) toont aan dat fibrinogeen en

gecitrullineerd fibrinogeen in eiwitextracten van synoviaal weefsel aanwezig zijn. Deze studie

heeft tot doel het bestuderen van gecitrullineerd fibrinogeen en de antilichaamrespons ertegen

in verschillende reumatologische aandoeningen. In hun analyse wordt echter niet gekeken naar

de totale eiwitexpressie van fibrinogeen. Toch is het eiwit in alle pathologieën aantoonbaar (6 x

RA, 2 x AS, 2 x PsA, 1 x OA) en is de hoeveelheid ervan is sterk patiëntafhankelijk. De resultaten

uit de iTRAQ analyse tonen duidelijk aan dat alle subunits waaruit fibrinogeen bestaat

verminderd aanwezig zijn in RA tov SpA. Over de citrullinatiestatus van dit eiwit kunnen we uit

de bekomen data geen conclusies trekken. Alhoewel citrullinatie als variabele modificatie werd

aangeduid, werden geen peptiden geïdentificeerd met een citrullineresidue.

B) Lumican precursor RA < SpA

Lumican behoort tot de familie van de smal leucine rich proteins (SLRP) en wordt

hoofdzakelijk teruggevonden in de extracellulaire matrix van het kraakbeen. Dit eiwit bindt aan

fibrillair collageen en belemmert zo hun groei en werking. Neerwaartse regulatie van lumican

leidt tot een verhoogde accumulatie van type II-collageen in synthetisch kraakbeen. Meer

4. RESULTATEN

48

collageen maakt het kraakbeen sterker. Uit de resultaten bleek lumican meer voor te komen bij

SpA dan bij RA. Nochtans wordt SpA eerder gekenmerkt door botopbouw, maar het zou best

kunnen dat de verhoogde lumican waarden geproduceerd worden in het erosieve stadium

(Kafienah et al., 2008). Het is gerapporteerd dat lumican gesynthetiseerd wordt door in vitro

gecultiveerde synoviale fibroblasten (Seiki et al., 1998). Verder is er geen additionele

functionele informatie over dit eiwit te vinden specifiek voor inflammatoire artritis. De meeste

reumatologische studies linken dit eiwit met OA en degeneratieve artritis. Dit SLRP zou wel eens

een rol kunnen spelen in de proliferatie en differentiatie van het synovium tot invaderend

pannusweefsel. Het wordt nl. geassocieerd met heel wat vormen van agressieve kanker

(Ishiwata et al., 2007; Matsuda et al., 2008). De manier waarop lumican proliferatie of

metastase van cellen zou beïnvloeden, ligt in zijn effect op het cytoskelet van de cellen

(Radwanska et al., 2008).

C) Collageen (VI) RA < SpA

Collageen type VI is exclusief aanwezig in de pericellulaire matrix van chondrocyten. In

normaal kraakbeen, zijn chondrocyten omkapseld door een dun weefsel dat uitsluitend bestaat

uit deze vorm van collageen. Aangezien deze pericellulaire matrix elke chondrocyt omgeeft,

wordt het gezien als een filter of omzetter voor biochemische signalen ofwel van het kraakbeen

ofwel van de extracellulaire matrix. Knock-out muizen voor dit type collageen vertoonden een

structureel normaal uitziende pericellulaire matrix, maar ze vertoonden wel een versnelde

degeneratieve artritis (alexopoulus et al., 2009). Verder wordt collageen type A3 geassocieerd

met een diffuus type van tenosynoviale giant cell tumor. Dit is een goedaardige, maar

agressieve proliferatie van de synoviale mononucleaire cellen met inflammatoire infiltraten

(Möller et al., 2008).

4. RESULTATEN

49

Eiwitten die verhoogd aanwezig waren in RA ten opzichte van SpA zijn het vimentine en

lamin A/C, histone H2B, IgG kappa chain en proteïne disulfide isomerase.

A) Vimentine RA > SpA

Vimentine, een intermediair filament dat tot expressie komt in synoviale fibroblasten,

werd bij ons hoger geëxpresseerd in RA dan in SpA. Zheng et al. (2009) bewees dit recent met

zijn studie van het humaan plasma proteoom bij RA. Deze structurele eiwitten zijn van groot

belang bij de opbouw van het cytoskelet en de integriteit van de cel (Wilke et al., 1995). In 2003

werd door een studie van Mor-Vaknin aangetoond dat fragmenten van vimentine gesecreteerd

werden door geactiveerde macrofagen tijdens inflammatie. Eveneens bleken antilichamen

tegen vimentine een merker te zijn voor de inflammatoire activiteit bij patiënten met

inflammatoire gewrichtsaandoeningen (Mayet et al., 1990). Dit alles wijst erop dat vimentine

mogelijks een rol speelt in het inflammatoir proces. Daarbij komt nog dat vimentine werd

aangeduid als potentieel auto-antigen, nl. het Sa antigen, dat zeer specifiek is voor RA

(Vossenaar et al., 2004). Uit voorgaand onderzoek in het laboratorium is gebleken dat

gecitrullineerd vimentine meer aanwezig is in RA dan is SpA (Tilleman et al., 2008b).

B) Lamine RA > SpA

Lamine-A/C maakt, net zoals vimentine, deel uit van de groep van intermediaire

filamenten maar deze keer van de nucleaire lamina. Uit onze resultaten bleek dat dit lamine-A/C

meer voorkomt bij RA dan bij SpA. Lamine-A/C is verlaagd aanwezig in osteoblasten van oudere

muizen in vergelijking met jonge muizen. Duque en Rivas (2006) concludeerden dat er een

reductie in lamine-A/C expressie was naargelang de leeftijd. Dit heeft uiteraard gevolgen voor

de functie van de osteoarticulaire cellen (Duque & Rivas, 2006). Verder is er weinig informatie te

vinden over dit eiwit in relatie met inflammatoire artritis.

C) Ig kappa chain C region RA > SpA

Ig kappa is het constante deel van de lichte keten van de immunoglobuline molecule. De

verhoogde aanwezigheid van dit eiwit werd eveneens gerapporteerd door Chang X et al. (2009)

in een klassieke proteoom analyse van synvoiaal weefsel afkomstig van RA, AS en OA.

4. RESULTATEN

50

D) protein disulfide isomerase RA > SpA

Protein disulfide isomerase of kortweg PDI is een enzyme van het endoplasmatisch

reticulum. Bij laag zuurstofgehalte verhoogt de aanmaak van procollageen hydroxylasen, oa.

ook de prolyl-4-hydroxylasen. Deze enzymen katalyseren de vorming van 4-hydroxyproline wat

nodig is voor de stabiele triple-helix vorming van collageen. Het protein disulfide isomerase doet

dienst als beta subunit van dit enzym prolyl-4-hydroxylase (Grimmer et al., 2006). Zo kunnen we

stellen dat PDI ook onrechtstreeks meebouwt aan de vorming van collageen, dat op zijn beurt

bijdraagt aan de sterkte van de kraakbeenmatrix.

5. DISCUSSIE

51

5. DISCUSSIE

Proteomics is een techniek met veel toekomst op gebied van reumatologie. Met deze

techniek streven we er naar eiwitten te ontdekken die een specifiek expressiepatroon volgen in

RA of SpA en zo een sprong vooruit te maken in de kennis van de pathogenese van RA en SpA.

Dit kan dan op zijn beurt resulteren in nieuwe therapeutische targets.

Het gebruik van de high-throughput gel-vrije iTRAQ approach was dan ook onontbeerlijk

in dit onderzoek. Tandem MS, in combinatie met iTRAQ labelling, werd toegepast om het

membranair proteoom van het synovium te identificeren en te kwantificeren.

Uit bovenstaande resultaten bleek dat de membranaire eiwitprofielen van RA duidelijk

verschilden van deze van SpA. Omdat eventuele verschillen niet mochten toegeschreven

worden aan verschillen in synoviale microarchitectuur, werden de patiënten gestratificeerd over

3 groepen. Groep A werd gescoord op gelijke inflammatiegraad, groep B op gelijke

vascularisatie en groep C had dezelfde infiltratiegraad. Scoring op synoviale lining kan in de

toekomst ook nuttig zijn. Uit een totaal van 43 geïdentificeerde eiwitten selecteerden we enkel

die eiwitten welke eenzelfde expressieprofiel vertoonden, ongeacht vascularisatie en infiltratie.

Zo reduceerden we de resultaten tot een tiental eiwitten.

De bekomen data waren afkomstig uit een run die gemerged werd, nl. run B werd in

duplo gerund. Dit houdt in dat er 2 technische replicaten van run B samen geanalyseerd

werden. Hierdoor is de identificatie en kwanitificatie van de eiwitten robuuster omdat ze

gebaseerd zijn op een groter aantal peptiden. Dit was echter niet het geval voor de Ig Kappa

chain C region en histone H2B type 1-A die op basis van 1 peptide geïdentificeerd en

gekwanitificeerd werden. Deze peptiden haalden weliswaar een zeer lage expectancy ( 0,00056

en 0,0038 respectievelijk) wat wijst op een kwalitatief hoog MS/MS spectrum. Eveneens kon de

differentiële aanwezigheid van eiwitten in RA en SpA niet worden toegeschreven aan

histologische parameters, zoals vascularisatie en infiltratie, gezien hiervoor gestratificeerd werd.

Met andere woorden wil dit zeggen dat deze 10 eiwitten geen merkers waren voor

vascularisatie en infiltratie.

5. DISCUSSIE

52

Zoals eerder gezegd, moet run A worden herhaald in de toekomst. We moeten de

resultaten hiervan nog afwachten. Pas dan kunnen we met zekerheid ons besluit doortrekken

over de hele lijn, nl. dat de geïdentificeerde eiwitten geen merkers zijn voor inflammatie,

vascularisatie en infiltratie, maar gewoon zuivere merkers zijn voor RA of SpA.

De andere helft van de stalen zal eveneens later geanalyseerd worden. Deze keer zal een

RP/RP-HPLC techniek toegepast worden. Deze toepassing biedt voldoende hoge scheiding van

zowel kleine als hydrofobe peptiden. Dit maximaliseert bijgevolg de sensitiviteit van de MS

analyse (Rogatsky & Stein, 2006). Bij RP/RP zullen de peptiden zowel in 1e als in 2e dimensie

gescheiden worden op basis van hun hydrofobiciteit. Lui et al. toonde in 2007 aan dat de RP/RP

methode te verkiezen is boven de conventionele SCX/RP methode, gezien de hogere

fractionatiekwaliteit (Lui et al., 2007).

Echter, wanneer we zochten in de literatuur, vonden we slechts 1 recente studie met als

doel eiwitprofielen van inflammatoire pathologieën te vergelijken/correleren. De studie van

Chang et al. (2009) gebruikte een klassieke proteomicsapproach en een totaal eiwit extract van

synoviaal weefsel. In deze analyse werden dan ook veelal andere eiwitten differentieel terug

gevonden. Bij de meeste onderzoeken wordt echter steeds gezocht naar inflammatiemerkers

door RA te vergelijken met een niet-inflammatoire aandoening zoals OA. In dit opzicht is de

opzet beschreven in deze thesis uniek.

Bij een korte literatuurzoektocht over de geselecteerde eiwitten werd geconstateerd dat

er weinig informatie te vinden is over eiwit expressiepatronen in biologische stalen van SpA

patiënten. Toch wijzen onze data op een mogelijks verschil tussen deze twee inflammatoire

artritis vormen.

6. CONCLUSIE

53

6. CONCLUSIE

In deze studie voerden we een screening uit naar het synoviaal membranair eiwit

expressiepatroon bij patiënten met RA en SpA. Hierbij maakten we gebruik van de iTRAQ

proteomicstechniek, die reeds enkele jaren geleden werd geïntroduceerd in het labo

Farmaceutische Biotechnologie.

Met onze proteoomstudie hebben we een totaal van 43 eiwitten kunnen identificeren.

Hiervan vertoonden slechts 10 eiwitten een significante kwantificatie-ratio, d.w.z. een ratio die

zowel bij vascularisatie als bij infiltratie in dezelfde lijn ligt. Vergeleken met SpA vertoonden de

eiwitten, H2B1A, LMNA, KAC, VIME en PDIA1 een hogere expressie in het synoviaal weefsel van

RA. FIBA, FIBB, FIBG, LUM en CO6A3 daarentegen kwamen meer voor bij SpA.

Ter conclusie kunnen we stellen dat het expressieniveau van bepaalde eiwitten bijdraagt

tot de differentiatie van inflammatoire pathologieën onderling. Mede hierdoor kunnen we de

moleculaire biologie van artritis beter begrijpen om zo op zoek te gaan naar biomerkers en

nieuwe therapeutica.

7. LITERATUURLIJST

54

7. LITERATUURLIJST

Artikels en boeken

Alexopoulos, L. G.; Youn, I.; Bonaldo, P.; Guilak, F. (2009). Developmental and osteoarthritic

changes in Col6a1-knockout mice: biomechanics of type VI collagen in the cartilage pericellular

matrix. Arthritis Rheum, 60(3), 771-9

Arden, N. and Nevitt, M. C. (2006). Osteoarthritis: epidemiology. Best Pract. Res. Clin.

Rheumatol., 20, 3-25

Aebersold, R. and Mann, M. (2003). Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 422, 198-

207

Baeten, D. and De Keyser, F. (2004a). The histopathology of Spondyloarthropathy, Current

Molecular Medicine, 4, 1-12

Baeten, D.; Kruithof, E.; De Rycke, L.; Boots, A. M.; Mielants, H.; Veys, E. M.; De Keyser, F.

(2004b). Infiltration of the synovial membrane with macrophage subsets and

polymorphonuclear cells reflects global disease activity in spondyloarthropathy. Arthritis

Research & Therapy, 7(2), 359-369

Chang, X.; Cui, Y.; Zong, M.; Zhao, Y.; Yan, X.; Chen, Y.; Han, J. (2009). Identification of proteins

with increased expression in rheumatoid arthritis synovial tissues. J Rheumatol., 36(5), 872-80

Chapuy-Regaud, S.; Sebbag, M.; Baeten, D.; Clavel, C.; Foulquier, C.; De Keyser, F.; Serre, G.

(2005). Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but

commonly occurs during synovitides. J Immunol., 174(8), 5057-64

Dhaouadi, T., Sfar, I., Abelmoula, L., Jendoubi-Ayed, S., Aouadi, H., Ben Abdellah, T., Ayed, K.,

Zouari, R., Gorgi, Y. (2007). Role of immune system, apoptosis and angiogenesis in pathogenesis

of rheumatoid arthritis and joint destruction, a systematic review. Tunis Med., 85(12), 991-8

Duque, G.; Rivas, D. (2006). Age-related changes in lamin A/C expression in the osteoarticular

system: laminopathies as a potential new aging mechanism. Mech Ageing Dev., 127(4), 378-83

7. LITERATUURLIJST

55

Edwards, J. C., Wilkinson, L. S., Pitsillides, A. A. (1993). Palisading cells of rheumatoid nodules:

comparison with synovial intimal cells. Ann Rheum Dis., 52(11), 801-5

Edwards, J. C. (1994). The nature and origins of synovium: experimental approaches to the study

of synoviocyte differentiation. J. Anat., 184, 493-501

Edwards, J. C. (2000). Fibroblast biology: development and differentiation of synovial fibroblasts

in arthritis. Arthritis Res., 2, 344-347

Firestein, G. S. (1997). Rheumatoid synovitis and pannus. Mosby, Londen, pp. 13.11- 13.15

Firestein, G. S. (2003). Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature, 423, 356-361

FitzGerald, O.; Bresnihan, B. (1995). Synovial membrane cellularity and vascularity. Ann Rheum

Dis., 54(6), 511-515

Gaston, H. (2006). Mechanisms of disease: the immunopathogenesis of spondyloarthropathies.

Nature Clinical Practice, 2, 383-392

Gevaert, K.; Van Damme, P.; Ghesquière, B.; Impens, F.; Martens, L.; Helsens, K.;

Vandekerckhove, J. (2007). A la carte proteomics with an emphasis on gel-free techniques.

Proteomics, 7, 2698-2718

Gevaert, K. and Vandekerckhove, J. (2004). COFRADIC™: the Hubble telescope of proteomics.

Drug Discovery Today, 3, 16-22

Grimmer, C.; Balbus, N.; Lang, U.; Aigner, T.; Cramer, T.; Müller, L.; Swoboda, B.; Pfander, D.

(2006). Regulation of type II collagen synthesis during osteoarthritis by prolyl-4-hydroxylases:

possible influence of low oxygen levels. Am J Pathol., 169(2), 491-502

Görg, A.; Weiss, W.; Dunn, M. J. (2004). Current two-dimensional electrophoresis technology for

proteomics. Proteomics, 4, 3665-3685

Graham, R. L-J.; Graham, C.; McMullan, G. (2007). Microbial proteomics: a mass spectrometry

primer for biologists. Microbial Cell Factories, 6, 26

7. LITERATUURLIJST

56

György, B.; Tóth, E.; Tarcsa, E.; Falus, A.; Buzás EI. (2006). Citrullination: a posttranslational

modification in health and disease. Int J Biochem Cell Biol, 38, 1662-77

Harris, E. D. (1997). Rheumatoid Arthritis. W.B. Saunders Company, Philadelphia

Ishiwata, T.; Cho, K.; Kawahara, K.; Yamamoto, T.; Fujiwara, Y.; Uchida, E.; Tajiri, T.; Naito, Z.

(2007). Role of lumican in cancer cells and adjacent stromal tissues in human pancreatic cancer.

Oncol Rep, 18(3), 537-43

Kafienah, W.; Cheung, F. L.; Sims, T.; Martin, I.; Miot, S.; Von Ruhland, C.; Roughley, P. J.;

Hollander, A. P. ( 2008). Lumican inhibits collagen deposition in tissue engineered cartilage.

Matrix Biology, 27, 526- 534

Khan, M. A. (2002). Update on spondyloarthropathies. Annals of Internal Medicine, 136, 896-

907

Korb, A.; Pavenstädt, H.; Pap, T. (2009). Cell death in rheumatoid arthritis. Apoptosis., 14(4),

447-454

Lainer-Carr, D. and Brahn, E. (2007) Angiogenesis inhibition as a therapeutic approach for

inflammatory synovitis. Nature Clinical Practice, 3, 434-442

Lambrecht, S.; Tilleman, K.; Elewaut D.; Deforce, D. (2008). Proteomics in rheumatology: the

beginning of a fairy tale? Proteomics Clin. Appl., 2, 1-9

Lisse, J. R. (1993). Does rheumatoid factor always mean arthritis. Postgrad Med, 94, 133-134,

139

Matsuda, Y.; Yamamoto, T.; Kudo, M.; Kawahara, K.; Kawamoto, M.; Nakajima, Y.; Koizumi, K.;

Nakazawa, N.; Ishiwata, T.; Naito, Z. (2008). Expression and roles of lumican in lung

adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Int J. Oncol., 33(6), 1177-85

Matsuo, K.; Xiang, Y.; Nakamura, H.; Masuko, K.; Yudoh, K.; Noyori, K.; Nishioka, K.; Saito, T.;

Kato, T. (2006). Identification of novel citrullinated autoantigens of synovium in rheumatoid

arthritis using a proteomic approach. Arthritis Res Ther, 8(6), R175

7. LITERATUURLIJST

57

Mayet, W. J.; Hermann, E.; Bachmann, M.; Manns, M.; Meyer zum Büschenfelde, K. H. ( 1990).

Correlation of anti-cytoskeleton antibody activities in synovial fluid with interleukin-6 in patients

with osteoarthritis and inflammatory joint disease. Klin Wochenschr., 68(13), 685-91

McMichael, A. and Bowness, P. (2002). HLA-B27: natural function and pathogenic role in

spondyloarthritis. Arthritis Res, 4, 153-158

Miller, M-C.; Manning, H. B.; Jain, A.; Troeberg, L.; Dudhia, J.; Essex, D.; Sandison, A.; Seiki, M.;

Nanchahal, J.; Nagase, H.; Itoh, Y. (2009). Membrane Type 1 Matrix Metalloproteinase is a

crucial promotor of synovial invasion in human rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism,

60, 686-697

Möller, E.; Mandahl, N.; Mertens, F.; Panagopoulos, I. (2008). Molecular identification of

COL6A3-CSF1 fusion transcripts in tenosynovial giant cell tumors. Genes Chromosomes Cancer,

47(1), 21-5

Mor-Vaknin, N.; Punturieri, A.; Sitwala, K.; Markovitz,,D. M. (2003). Vimentin is secreted by

activated macrophages. Nat Cell Biol., 5(1), 59-63

Nyman, T. A. (2001). The role of mass spectrometry in proteome studies. Biomolecular

engeneering, 18, 221-227

Patterson, S. D. & Aebersold, R. H. (2003). Proteomics: the first decade and beyond. Nature

genetics supplement, 33, 311-323

Patton, W. F.; Schulenberg, B.; Steinberg, T. H. (2002). Two-dimensional gel electrophoresis;

better than a poke in the ICAT?. Current Opinion in Biotechnology, 13, 321-328

Poole, A. R. and Dieppe, P. (1994). Biological markers in rheumatoid arthritis. Semin Arthritis

Rheum, 23, 17-31

Pratt, A. G., Isaacs, J.D., Mattey, D.L. (2009). Current concepts in the pathogenesis of early

rheumatoid arthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol., 23(1), 37-48

7. LITERATUURLIJST

58

Radwanska, A.; Baczynska, D.; Nowak, D.; Brézillon, S.; Popow, A.; Maquart, F. X.; Wegrowski, Y.;

Malicka-Blaszkiewicz, M. (2008). Lumican affects actin cytoskeletal organization in human

melanoma A375 cells. Life sci, 83(19-20), 651-60

Reveille, J. D. and Arnett, F. C. (2005). Spondyloarthritis: update on pathogenesis and

management. The American Journal of Medicine, 118, 592-603

Ross, P. L.; Huang, Y. N.; Marchese, J. N.; Williamson, B.; Parker, K.; Hattan, S.; Khainovski, N.;

Pillai, S.; Dey, S.; Daniels, S.; Purkayastha, S.; Juhasz, P.; Martin, S.; Bartlet, M.; He, F.; Jacobson,

A.; Pappin, D. J. (2004). Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using

amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics, 3.12, 1154-1169

Schett, G. (2006). Rheumatoid arthritis: inflammation and bone loss. Wien Med Wochenschr,

156/1-2, 34-41

Seki, T.; Selby, J.; Häupl, T.; Winchester, R. (1998). Use of differential subtraction method to

identify genes that characterize the phenotype of cultured rheumatoid arthritis synoviocytes.

Arthritis Rheum., 41(8), 1356-64

Smith, J. B.; Haynes, M. K. (2002). Rheumatoid Arthritis- A molecular understanding. Ann Intern

Med., 136, 908-922

Shao-En Ong, Leonard J. Foster and Mann, M. (2003). Mass spectrometric-based approaches in

quantitative proteomics. 39, 124-130

Smolen, J. S.; Aletaha, D.; Steiner, G. (2009) Does damage cause inflammation? Revisiting the

link between joint damage and inflammation. Ann Rheum Dis, 68, 159-162

Steen, H. and Mann, M. (2004). The ABC’s (and XYZ’s) of peptide sequencing. Nature reviews, 5,

699-711

Tilleman, K.; Deforce, D.; Elewaut, D. (2005). Rheumatology: a close encounter with proteomics.

Rheumatology, vol, 1-10

7. LITERATUURLIJST

59

Tilleman, K.; Van Beneden, K.; Dhondt, A.; Hoffman, I.; De Keyser, F.; Veys, E.; Elewaut, D.;

Deforce, D. (2005). Chronically inflamed synovium from spondyloarthropathy and rheumatoid

arthritis investigated by protein expression profiling followed by tandem mass spectrometry.

Proteomics, 5, 2247-2257

Tilleman, K. and Deforce, D. (2008a). Proteomics in rheumatology. Expert Rev. Proteomics, 5(6),

1-5

Tilleman, K.; Van Steendam, K.; Cantaert, T.; De Keyser, F.; Elewaut, D.; Deforce, D. (2008b).

Synovial detection and autoantibody reactivity of processed citrullinated isoforms of Vimentin

in inflammatory arthritides. Rheumatology, 47(5), 597-604

Vossenaar, E. R.; Després, N.; Lapointe, E.; van der Heijden, A.; Lora, M.; Senshu, T.; van

Venrooij, W. J.; Ménard, H. A. (2004). Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target

citrullinated vimentin. Arthritis Res Ther., 6(2), R142-50

Wilke, A.; Schönian, U.; Herzum, M.; Hengstenberg, C.; Hufnagel, G.; Brilla, C. G.; Maisch, B.

(1995). The extracellular matrix and cytoskeleton of the myocardium in cardiac inflammatory

reaction. Herz., 20(2), 95-108

Wilkins, M.R.; Sanchez, J.C.; Gooley, A.A.; Appel, R.D.; Humphery-Smith, I.; Hochstrasser, D.F.;

Williams, K.L. (1996). Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome

should be identified and how to do it. Biotechnol Genet Eng Rev., 13, 19-50

Zhao, X.; Okeke, N. L.; Sharpe, O.; Batliwalla, F. M.; Lee, A. T.; Ho, P. P.; Tomooka, B. H.;

Gregersen, P. K.; Robinson, W. H. (2008). Circulating immune complexes contain citrullinated

fibrinogen in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther, 10(4), R94

Zheng, X.; Wu, S. L., Hincapie, M.; Hancock, W. S. (2009). Study of the human plasma proteome

of rheumatoid arthritis. J Chromatogr A., 1216(16), 3538-45

7. LITERATUURLIJST

60

Websites

http://boneandspine.com/wp-content/uploads/2007/10/clip_image002.jpg

(FIGUUR 1.1)

http://www.hopkins-arthritis.org/arthritis-info/rheumatoidarthritis/images/clinical/ex-

artdis1.jpg

(FIGUUR 1.2)

http://www.nature.com/nrrheum/journal/v3/n8/images/ncprheum0559-f1.jpg

(FIGUUR 1.3)

http://www.nature.com/nrd/journal/v2/n6/images/nrd1109-f2.gif

(FIGUUR 1.4)

http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/xie-jing-2003-12-15/HTML/xie_html_12a07b27.png

(FIGUUR 1.7)

http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/images/ionization-maldi.jpg

http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/images/ionization_esi.jpg

(FIGUUR 1.12)

http://www.uniprot.org