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Anticorps monoclonaux & Protéines de fusion thérapeutiques Héloïse FLAMENT AHU Université Paris Diderot Centre de Recherche sur l Inflammation UMR1149 - Hôpital Bichat L3 - DFGSM3 UE6 Immunologie 22 Mars 2018

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Anticorps monoclonaux &

Protéines de fusion thérapeutiques

Héloïse FLAMENT

AHU

Université Paris Diderot

Centre de Recherche sur l’Inflammation

UMR1149 - Hôpital Bichat

L3 - DFGSM3

UE6 Immunologie

22 Mars 2018

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Plan

Introduction – définition

Domaines d’application

Production des anticorps monoclonaux (AcM) murins

Limites des AcM murins en thérapeutique

Humanisation des AcM murins

– AcM chimériques /humanisés /complètement humains

Nouvelles technologies

– Anticorps bispécifiques

– CAR T-cells

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Définition

Anticorps monoclonal (AcM)

– Population homogène

d ’anticorps issus d ’un

« seul et unique »

clone de cellules B

Avantage

– Spécificité

– Affinité

– Production massive et

constante

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Différence entre sérum polyclonal et anticorps monoclonal

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G. Köhler (1946-1995) et C. Milstein (1927-2002)

1975: premier article décrivant la génération d’un anticorps monoclonal (Acm) ayant une spécificité définie

Technique des hybridomes

Prix Nobel de médecine en 1984 avec N.K. Jernes – "for theories concerning the specificity in development and control

of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies"

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Applications des anticorps monoclonaux

Immunologie fondamentale – Etude des lignées cellulaires (CD = cluster de différenciation)

– Etudes des cellules pathologiques

– Protéomique, drug discovery

Diagnostic – Cytométrie en flux, immunohistochimie, immunofluorescence…

– Imagerie médicale

Thérapie – Traitement des rejets de greffes

1er AcM murin mis sur le marché en 1986: anti-CD3 humain

(Muromomab)

– Traitement de cancer

– Traitement de maladies auto-immunes

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Immunothérapie passive par les AcM

Fixation par la partie Fab et inhibition de l’interaction

récepteur / ligand

Serum immun dans la prévention/traitement de maladies

infectieuses (serum anti-diphtérique, début du 20e siècle)

Avantage des AcM

– Plus efficace

– Reproductible

– Absence de contaminants

Exemple :

– Mab anti cytomégalovirus (agent pathogène responsable de pneumonie)

– Mab anti synticial virus (responsable de maladie chez les jeunes enfants)

– Mab anti rhésus (prophylaxie de l'allo-immunisation fœto-maternelle)

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Immunothérapie active par les AcM

Fixation par la partie Fab et

recrutement d’effecteurs

immuns par la partie Fc

Destruction de la cible

ADCC (cytotoxicité

cellulaire dépendante des

anticorps)

CDC (cytotoxicité médiée

par le complément)

Opsonisation et

phagocytose

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1-Immunisation

2-Hybridation

3-Clonage

4-: criblage des

hybridomes sécrétant

(ELISA)

5-Sous-clonage

Etapes de production des anticorps monoclonaux

6-Production de l’AcM

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Exemple de calendrier de production

General Procedure

Step Time (month)

1 2 3 4 5 6 7 8

Immunisation of animals

Develop and test screening method

Fusion, selection and screening

Cloning and isotyping

Delivery of clones

http://www.covalab.co.uk

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Les animaux

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Immunisation

L'immunisation

– Les sources d'antigènes

degré de pureté: élimination des contaminants

haptènes, protéines porteuses

– L'immunisation de l'animal

dose et forme de l ’antigène

adjuvants

voie et nombre d ’injection

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Immunisation: adjuvants

Augmentation de l’intensité de la réponse immunitaire

Accroissement de l’effet mémoire

Stimulants non spécifiques de la réponse immunitaire

3 composantes principales:

– huile minérale/eau : protection de l ’antigène, transport de

l ’antigène

– particules : agrégation de l ’antigène, dépôt antigénique

– parois de bactéries : réaction inflammatoire

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Adjuvant complet de Freund (FCA)

Composition

– Mélange d’huile non métabolisable

L ’émulsion permet une grande répartition de l ’antigène

Effet de dépôt

– Surfactant : Arlacel A

– Mycobactéries : M.tuberculosis, M. butyricum

Immuno stimulation non spécifique importante

Considéré comme le plus efficace

Cause des inflammations chroniques, abcès,

ulcération, nécroses

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Autres adjuvants

Adjuvant incomplet de Freund (FIA)

– Idem FCA, sans les parois bactériennes

– Utilisé dans les deuxièmes injections.

Montanide® ISA (SEPPIC)

– mélange de surfactants (manide oléate) et d ’huile non

métabolisable

– Aussi efficace que le FCA

– Beaucoup moins toxique

– Émulsions eau/huile, huile/eau, eau/huile/eau

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Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome (1)

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Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome (2)

Lignée cellulaire murine de myélome non sécrétant

– Ex: P3X63Ag8.653, Sp2/0

– Déficientes en HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase)

Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG)

– fusion des membranes cytoplasmiques

Fusion physique : Electrofusion

– Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques

– technique onéreuse

– moins destructrice

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Sélection des hybridomes sur milieu sélectif HAT

2 voies de synthèse des acides nucléiques

– De novo (inhibée par l’aminoptérine)

– Voie de sauvetage (en présence d’HGPRT, d’hypoxanthine et thymidine)

Milieu HAT: Hypoxanthine Aminopterine Thymidine

LB non

fusionnés

Ne survivent pas

en culture

x x

Hybrides

HGPRT+

Plasmocytes

non fusionnés

HGPRT-

Aminoptérine Inhibition de la synthèse

de novo des nucléotides

Voie de sauvetage

Mort cellulaire Survie Mort cellulaire

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Criblage des hybridomes sécrétant

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Résumé de la technique des hybridomes

Ag

1

2 4

3

Epitopes Rate

Lymphos B

Plasmocytes

Cellules de

myélome

4

2

3

1

Fusion

Hybridomes

Acs 1 Acs 2 Acs 4 Acs 3

1

2

4

3

Sélection et Clonage par dilutions limites

Acs Monoclonaux

Y

Y

Antisérum polyclonal contenant des Acs de différentes spécificités.

1 1

1

2

2

2

3

3

3

4

4 4

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Production des AcM in vivo en ascites

Hybridomes cultivés in vivo

Injection des hybridomes dans le péritoine de souris

Développement d’une tumeur liquide : ascite

Prélèvement des anticorps par ponction de liquide

d’ascite

Purification du liquide d’ascite nécessaire

Rendement élevé 20 g/l

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Production des AcM in vitro

Production en batch

– flacons, ou plaques de cultures cellulaires

– 40 à 100ml

– rendement faible de de l ’ordre de 1µg/ml

– production relativement pure

– contamination par les composants du milieu de culture

Techniques de microencapsulation

– Capture des hydridomes dans des billes d ’alginate

– pas de contamination

– purification simplifiée

– meilleur rendement de l’ordre de 100µg/ml

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Production des AcM in vitro

Production en bioréacteurs

– Basé sur la technologie des fibres creuses (dialyse)

– Diminution des coûts, du temps.

– Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté

– Pas ou peu de contaminant

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Production in vivo

Avantages

– Concentration élevée en

AcM

– Pas d’intermédiaire

industriels

Inconvénients

– Utilisation de l’animal

– Présence de protéines

murines

– Contaminant

– Stress de la souris

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Production in vitro

Avantages

– Pas d’utilisation d ’animal

– Production de grandes

quantité d’anticorps

– Pas de contraintes légales

à l’utilisation d’animaux

– Pas de personnel

d’animalerie

– Pas de contaminant

Inconvénients

– Tous les hybridomes ne prolifèrent pas en réacteur

– Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal

– Productions moins concentrées.

– Contamination par les hybridomes morts

– Mab de plus faible affinité

– Plus chère pour de petites production

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Purification des liquides contenant les AcM

Chromatographie d’affinité

– spécifique du Fc (protéine A,

protéine G) pour les IgG

– spécifique de l’antigène

Chromatographie

échangeuse d’ions

– Pour les IgM

Ligand

Analyte

Impuretés

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Critères de qualité pour un AcM

Spécificité

– Reconnaissance d’un seul motif antigénique

– Réactions croisées, non-spécifiques.

– Maintient de l’activité après modification chimique (couplage à

des fluorochromes, enzymes)

L'affinité

– Élevée

– Constante et contrôlée

Avantages de ce type de production

– Constante

– Reproductible

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AcM murins en thérapeutique

Très peu d’AcM murins thérapeutiques sur le marché

Anti-huCD20 (Ibritumomab) marqué à l'yttrium–90 (lymphomes B)

Anti-huCD3 (OKT3®,Muromomab)

– Cible les lymphocytes T

– Indication: prévention du rejet aigu d’allogreffes rénales, hépatiques et

cardiaques.

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Limites des AcM murins en thérapeutique

La souris ne reconnaît pas tous les motifs antigéniques →

répertoire immunologique limité

Immunogénicité: l’infusion d’AcM de souris chez l’homme conduit

à l’apparition d’anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA)

– Réactions allergiques

– Neutralisation et clairance accélérée de l’AcM

– Chute de l’efficacité

Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de

l’immunité de façon optimale chez l’homme :

– Faible activation du complément

– Mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc: faible ADCC

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Vers l’obtention d’AcM humains…

Difficulté pour obtenir des AcM humains

– Immortalisation des cellules B humaines très difficile

– Volet éthique de la manipulation de cellules humaines

Solution: supprimer les parties immunogènes murines qui ne

participent pas à la reconnaissance de l’Ag et les remplacer par

des séquences humaines

Production dans des lignées cellulaires de mammifères,

bactéries ou champignons

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Les moyens actuels

Immunologie fondamentale

– Connaissance du génome des immunoglobulines

Génie génétique, clonage, systèmes d ’expression

– E.coli sécrétion périplasmique

– Levure Pichia pastoris

– Cellules d’insectes

Création de banques de données de gènes d’immunoglobulines

– Phage display Library

Développement de techniques d’indentification performantes

Industries pharmaceutiques et sociétés biotechnologies

– Sanofi Aventis, Genovac, GenmAb, etc

FDA, AFFSAPS

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Gènes des immunoglobulines

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Anticorps monoclonaux chimériques

Humanisation partielle

Régions constantes humaines

Régions variables de souris

65% de régions humaines

Risque d’immunisation réduit

Quelques AcM chimériques approuvés: Infliximab (anti-TNFα), Rituximab (anti-CD20), Abciximab (Fab

anti-GPIIbIIIa)

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Anticorps monoclonaux humanisés

Parties hypervariables - CDRs d’origine murine (5 à

10 % de la structure)

Parties constantes d’origine humaine

– Spécificité et affinité murine

– Immnunogénicité humaine

Avantages

– Peu immunogènes

– Demi-vie augmentée

les anticorps humanisés constituent la majorité des

anticorps thérapeutiques approuvés sur le marché.

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Anticorps monoclonaux humains

100% de séquences humaines

La production d’AcM humains repose sur l’utilisation

de

– banques combinatoires de phages +++

– souris transgéniques + hybridomes de souris

1er AcM humain mis sur le marché en 2003 Adalimumab (anti-TNFα) pour la polyarthrite

rhumatoïde

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Production des AcM humains

Production d’AcM humains

Banque combinatoire de

phages

Hybridomes souris transgéniques

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Principe d’obtention d’une banque combinatoire de phages « Phage Display Library »

Isolement d’ARNm de lymphocytes B

humains (sang, tissus lymphoïdes)

Rétrotranscription en ADNc des gènes

d’immunoglobulines

Clonage dans des phages filamenteux

Expression à la surface des phages des

Fab humains sous forme de peptides de

fusion sur la protéine gIII (“banque”)

Sélection des clones spécifiques d’un Ag

Introduction dans un système d’expression

Mise en culture

Extraction des anticorps sécrétés

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Principe d’obtention d’une banque combinatoire de phages « Phage Display Library »

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Avantages

Plus efficace que la technique des hybridomes

Culture bactérienne moins onéreuse et plus simple

que les cellules de mammifères

Pas d’immunisation, pas d’animaux

Banque de 108-109 anticorps fonctionnels

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Production des AcM humains

Hybridomes de souris transgéniques “humanisées”

Transgènes codant les chaines lourdes et légères

d’immunoglobulines humaines

Expriment un répertoire d’Ac humains de différents isotypes

Avantages:

– Non immunogènes chez l’homme

– Production par méthode conventionnelle d’hybridomes murins

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Résumé

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Nomenclature des AcM

Nom Type Exemples

xxmomab Mouse (souris) Muromomab anti-CD3

Ibritumomab anti-CD20

xxximab Chimeric (chimérique) Rituximab anti-CD20

Cetuximab anti-EGFR

xxzumab Humanized (humanisé) Trastuzumab anti-HER2

Alemtuzumab anti-CD52

xxmumab Fully human (humain) Panitumumab anti-EGFR

Adalimumab anti-TNFα

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AcM chimériques, humanisés et humains

Peu immunogènes

Production d’ADA (anti-drug antibodies): Ac anti-

idiotypes

½ vie comparable aux Ig humaines naturelles

Interaction efficace avec les effecteurs

(complément, cellules NK, phagocytes)

Distribution dans les compartiments vasculaire et

extravasculaire

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Exemple Anti-CD52: 1re génération – IgM de rat

Développement d’AcM anti-lymphocytes – Greffe de moelle osseuse (MO)

– Greffe d’organes

– Leucémies et lymphomes

– Maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde, sclérose en plaque)

– …

CD52: forte expression sur LT et LB, non exprimé sur les progéniteurs

médullaires

1980: CAMPATH-1M

– IgM de rat anti-HuCD52 , fixe le complément humain

– Prévention de la GVHD par déplétion des LT du donneur in vitro avant

greffe de MO

– En présence du sérum du donneur (source de complément)

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Exemple Anti-CD52: 2nde génération – IgG2b de rat

Développement d’un AcM anti-CD52 actif in vivo

– IgM (CAMPATH-1M) et IgG2a de rat anti-CD52 inefficaces pour dépléter des cellules

leucémiques in vivo

– L’isotype IgG2b de rat est le plus efficace pour induire la lyse cellulaire (ADCC)

1986: CAMPATH-1G

– IgG2b de rat anti-HuCD52

– Déplétion des cellules leucémiques réfractaires aux isotypes IgM et IgG2a

– Utilisation combinée de CAMPATH-1M et CAMPATH-1G dans la greffe de MO en

prévention de la GVHD et du rejet autorisant un conditionnement allégé (non myéloablatif)

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Exemple Anti-CD52: 3ème génération – Ac humanisé

CAMPATH-1M et CAMPATH-1G sont immunogènes

L’isotype IgG1 humain est le plus efficace pour induire la lyse cellulaire

(ADCC)

1987: CAMPATH-1H (IgG1 humanisé Alemtuzumab)

– Premier AcM humanisé

– Greffe des parties hypervariables de rat (CDR) sur une charpente d'Ig humaine

– Traitement de la leucémie lymphoïde chronique, sclérose en plaque

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Résumé des modes d’action des AcM à usage thérapeutique

Activation de mécanismes effecteurs innés via la région Fc

(CD20, CD52)

– ADCC (cytoxicité cellulaire dépendante des anticorps)

– CDC (cytotoxicité dépendante du complément)

– Phagocytose, production de cytokines et chimiokines

Neutralisation de l’interaction ligand soluble/ récepteur (TNF)

Blocage de l’activation d’un récepteur (récepteur du VEGF)

Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules

membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle

(CTLA-4)

Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a)

Induction de l’apoptose (CD20)

Ciblage d’une drogue

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AcM thérapeutiques: répartition par pathologie

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Ca

nce

rA

llogra

ft r

eje

ctio

nP

sori

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Anticorps thérapeutiques : anti cancer

Utiliser le système immunitaire pour détruire des tumeurs

– Toxicité contre les cellules tumorales (Rituximab, anti-CD20)

– Inhibition de la néoangiogénèse (Bevacizumab, anti-VEGF)

– Inhibition de la croissance tumorale (Trastuzuma, antagoniste anti-HER-2-récepteur)

– Stimulation de la réponse T (T cell checkpoint blockade anti-CTLA-4, anti-PD1)

– Vectorisation de molécules ciblant a tumeur

Radio-isotopes (anti-CD20 90Y, 131I)

Agents cytotoxiques (anti-CD30-aurisatine, lymphomes)

L’anticorps doit atteindre les cellules tumorales dans tout l’organisme

– Problème des tumeurs volumineuses

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Aspects industriels défavorisant

Faible marché

– Très grande variabilité des cancers

– Investissement très important pour la recherche clinique

– Plusieurs anticorps pour une même pathologie

– Besoin de grandes quantité de réactifs

– Propriété intellectuelle

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Maladies auto-immunes

Diabète

Arthrite rhumatoïde

Sclérose en plaque

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Polyarthrite rhumatoïde

Anti CD25 – Spécifique des cellules T activées

Anti CD4 – Blocage des cellules T helper

Anti CD18 – Inhibition de la migration des leucocytes du sang vers les

zones d’inflammation

Ig récepteur au TNF – Chimère :récepteur membranaire du TNF associé à un Fc

d’IgG1

– Blocage du TNF dans les phénomènes d’inflammation

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Limites des AcM humanisés / humains

Immunogénicité faible mais persistante

– Épitopes les plus immunogènes: idiotypes (parties variables

et hypervariables des Fab)

– Tous les AcM même humains peuvent induire des Ac anti-

idiotypes

La formation d’ADA accélère leur élimination et

diminue la réponse thérapeutique

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Protéines de fusion thérapeutiques

Principe : mimer un mécanisme de régulation physiologique ce qui est le

cas pour l’étanercept et l’abatacept dans la polyarthrite rhumatoïde

Etanercept

– Protéine recombinante humaine dimérique composée de la portion extracellulaire du

récepteur de type 2 (TNFR2) du TNF fusionnée à un fragment Fc d’une IgG1 humaine

– Mime partiellement l’effet du récepteur TNFR2 soluble qui est un antagoniste naturel du TNF

TNF soluble

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Protéines de fusion thérapeutiques

Abatacept

– Protéine recombinante humaine composée d’un

dimère des domaines extracellulaires du CTLA-4

(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) fusionnés aux

fragments Fc modifiés d’une IgG1

– Les modifications du fragment Fc sont des

mutations qui permettent la fixation aux

récepteurs des fragments Fc (FcγR) sans

induction de cytotoxicité par ADCC ou CDC

– L’abatacept permet d’inactiver les lymphocytes T car il entre en compétition avec CD28

pour la liaison aux molécules B7 (B7.1 et.2) exprimées par les cellules présentatrices de

l’antigène

– L’abatacept permet de reproduire ce phénomène inhibiteur physiologique, ce qui est mis

à profit dans des maladies auto-immunes caractérisées par une activation lymphocytaire

excessive.

CTLA-4

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Induction d’une réponse lymphocytaire T

AcM en monothérapie ne permettent pas toujours de

rejeter les tumeurs en l’absence d’une réponse T

Importance de la réponse lymphocytaire T surtout

cytotoxique dans la lutte antitumorale

Permet d’activer les LT indépendamment du CMH et

de leur spécificité antigénique

Nouvelles technologies:

– Anticorps bispécifiques

– CAR T cells

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Anticorps bispécifiques: Triomab

Catumaxomab (2009)

– AcM hybride de rat/souris anti-EpCAM

(molécule d'adhésion cellulaire épithéliale) /

anti-CD3

– Production par un hybridome hybride (fusion

d’un hybridome de souris et un hybridome de

rat)

– Trifonctionnel: se fixe sur les cellules

carcinomateuses (EpCAM), les lymphocytes

T (CD3) et les cellules effectrices innées

macrophages, NK et cellules dendritiques

(FcR)

– Induit l'activation des lymphocytes T et de

l’immunité innée (ADCC, CDC et phagocytose)

et aboutit à la destruction des cellules

tumorales

– Traitement d’ascites malignes chez les patients

atteints de carcinomes EpCAM-positifs (cancer

gastrique, ovarien)

Chaine lourde +

chaine légère de rat

Chaine lourde + chaine

légère de souris

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Dérivés d’anticorps: fragments et Ac bispécifiques

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Anticorps bispécifiques: BiTE

Blinatumomab (Blincyto®) (2014)

– BiTE: Bi-specific T-cell engager

– 2 domaines scFv (single-chain variable

fragment): anti-CD3 / anti-CD19

– Induit la formation d'une synapse cytolytique

entre le lymphocyte T et la cellule tumorale

– Induction d’une réponse T cytotoxique et

cytokinique

– Faible poids moléculaire (60 KDa) → ½ vie

courte, nécessité d’injections continues

– Mise au point de formes tétramériques avec

plus forte affinité pour le CD3 et ½ vie

augmentée permettant 1 injection / semaine

(AFM11)

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Avantages

Fragment de liaison minimal – taille variable et adaptable

– Facilite la pénétration dans les cellules tumorales

– Taux de dissémination plus rapide

Augmentation de la valence – valence supérieure à 2

Liaison à deux antigène différents

Augmentation de l’avidité – vitesse de réaction augmentée

Flexibilité augmentée – facilitation de la liaison avec l ’antigène

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Anticorps bispécifiques: autres indications

Tumeurs (anti-CD3/)

– Hématologiques (leucémies aigues) CD33, CD123

– Solides HER2, EpCAM, CEA

Ostéoporose

– Anti-sclerostin/anti-Dkk1 bloque la voie Wnt, augmente la

formation d’ostéoblastes et la croissance de l’os

Hémophilie A sévère

– Anti-FIXa/anti-FX permet leur interaction

Maladies auto-immunes

– Anti-IL-17/anti-TNFα (polyarthrite rhumatoïde)

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Avantage des anticorps bispécifiques

Dirigent des cellules effectrices cytotoxiques vers la

tumeur

Meilleure spécificité que les AcM monospécifiques

lorsqu’ils reconnaissent 2 épitopes différents sur la

même surface antigénique

Meilleure efficacité anti-proliférative en combinant

deux récepteurs de croissance sur la même cellule

tumorale

Réduit le risque d’apprition de résistances

Coût réduit par rapport à l’association de 2 AcM

monospécifiques

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Chimeric Antigen Receptor “CAR” T cells

Lymphocytes T modifiés exprimant un récepteur chimérique associant la

partie variable scFv d’une immunoglobline et les parties

transmembranaires/ cytoplasmiques de facteurs d’activation et de

costimulation

Réponse effectrice T maintenue dans le temps (cytokines)

Activation: chaine zeta du

CD3

Costimulation:

CD28 (Yescarta®)

4-1BB (Kymriah®)

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Chimeric Antigen Receptor “CAR” T cells

CAR-T cell anti-CD19: 90% de réponse complète dans les LAL-B

en rechute ou réfractaire

Production complexe et onéreuse 400.000$ par injection