Application des méthodes de typage génomique au laboratoire d’hygiène

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JUIN 2013 - N°453 // 65

ENVIRONNEMENT ET HÔPITAL : DU DÉPISTAGE AUX CONTRÔLES ENVIRONNEMENTAUX

article reçu le 17 janvier, accepté le 8 février 2013.

© 2013 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

SUMMARYUsefullness of genotyping methods in infection

control

The study of infection epidemiology should allow to identify the mode of acquisition of microorganisms, ways of transmission, dynamic of colonization and risk factors of infection. This type of study implies that the comparison of strains isolated from patients and their environment allow establishing the degree of genetic similarity. Development and assessment of phenotypic and genotypic typing methods are essential in this framework both for community or hospital-acquired infections.

Molecular typing – nosocomial infection – epidemiology

– multidrug-resistant bacteria.

RÉSUMÉL’étude de l’épidémiologie des infections doit permettre d’identifier le mode d’acquisition du micro-organisme responsable, les modes de transmis-sion, la dynamique de la colonisation, et les facteurs de risque d’infection. Ce type d’étude suppose que la comparaison des souches isolées des malades et de leur environnement permette d’établir leur degré de simili-tude génétique. C’est dans ce cadre que se placent le développement et l’évaluation des marqueurs phénotypiques et génotypiques et la valida-tion des stratégies de typage adaptées aux différents micro-organismes impliqués dans les infections nosocomiales et communautaires.

Typage génomique – infection nosocomiale – épidémiologie –

bactéries multirésistantes.

Pascal Cholleya, Michelle Thouvereza, Houssein Gbaguidi-Haorea, Xavier Bertranda, Daniel Talona,*

Application des méthodes de typage génomique au laboratoire d’hygiène

a Service d’hygiène hospitalièreUMR 6249 Chrono-environnement – CICCentre hospitalier et universitaire de Besançon et Université de Franche-ComtéHôpital Jean-MinjozBd Fleming25030 Besançon cedex

* [email protected]

1. Introduction

L’environnement hospitalier représente un danger pour les patients admis à l’hôpital. Ce danger est lié d’une part à la richesse, à la diversité et à la nature des agents bactériens, fungiques et/ou viraux constitutifs de cet environnement et d’autre part à la fragilité des patients vis-à-vis de l’infection du fait de la rupture de l’intégrité cutanéo-muqueuse, de l’immunodéficience secondaire à la thérapeutique ou à la maladie motivant l’hospitalisation et au caractère toujours plus invasif des moyens thérapeutiques et/ou diagnos-tiques mis en œuvre.Ces infections acquises en milieu hospitalier (nosocomiales) peuvent être d’origine variée : endogène (auto-infections), la propre flore commensale du patient est responsable de l’infection ou exogène (hétéro-infections), avec comme réservoirs possibles de contamination du patient l’envi-ronnement inerte (air, eau, surfaces,…) (exo-infections), les patients voisins colonisés ou infectés, le personnel de soins, les visiteurs (xéno-infections). Ces infections peuvent

survenir sur un mode sporadique, mais de nombreuses épidémies sont décrites dans les hôpitaux survenant soit sur un mode cataclysmique soit à l’inverse sur un mode tor-pide. La prévalence de ces infections dans certains services ou liées à certaines espèces bactériennes est quelquefois suffisamment importante pour que la situation soit consi-dérée comme endémique. Une partie de ces infections nosocomiales, plus ou moins importante en fonction de la nature, de la taille de l’hôpital et de la nature des services, est liée à des bactéries « résidentes » hospitalières qui ont pour caractéristique fréquente une multi-résistance aux antibiotiques : résistance intrinsèque et résistances acquises. L’existence de ces bactéries multirésistantes (BMR) pose des problèmes thérapeutiques majeurs.L’étude de l’épidémiologie de ces infections doit permettre d’identifier le mode d’acquisition du micro-organisme responsable, les modes de transmission, la dynamique de la colonisation, et les facteurs de risque d’infection, facteurs de risque liés à l’hôte et à sa prise en charge et/ou au micro-organisme (virulence et pouvoir patho-gène). Lorsque c’est une BMR qui est responsable, il faudra également tenter d’identifier les facteurs de risque d’émergence et d’implantation de cette multirésistance. Ces études supposent que la comparaison des souches isolées des malades et de leur environnement permette d’établir leur degré de similitude génétique (quel degré de parenté ?). C’est dans ce cadre que se placent le déve-loppement et l’évaluation des marqueurs phénotypiques et génotypiques et la validation des stratégies de typage adaptées aux différents micro-organismes impliqués dans les infections nosocomiales.

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En pratique, deux méthodes reposant sur la restriction de l’ADN présentent un intérêt certain pour le typage bactérien : la technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP) qui repose sur l’utilisation d’enzymes de macrorestriction (faible nombre de sites de restriction sur l’ADN bactérien donc faible nombre de fragments mais fragments lourds impossibles à déplacer par électrophorèse standard) et le ribotypage basé sur le polymorphisme des fragments de l’ADN codant pour les ARNr (microrestriction puis migration électrophorétique, transfert du gel sur filtre puis hybridation par sondes nucléiques ARN16S/23S marquées) [1, 4]. Les méthodes d’amplification génique sont très nombreuses : elles reposent sur l’usage de séquences connues (REP, ERIC, IS) qui sont des motifs répétés et situés à différents endroits du chromosome ou sur l’emploi d’une seule amorce choisie au hasard (RAPD) ou enfin sur le polymorphisme génomique de séquences ou locus déterminés (MLVA et MLST) [5, 6]. Le tableau I rapporte une comparaison des performances des différents marqueurs génotypiques. Les règles d’interprétation des méthodes par restriction sont bien établies et doivent prendre en compte l’aspect spatio-temporel de l’origine des souches (nombre d’événements génétiques susceptibles d’intervenir dans un délai donné et évolution génétique conditionnée par l’environnement dans lequel les souches circulent) [7]. Les règles d’interprétation des méthodes de typage générant des fragments par PCR sont plus floues sauf pour la MLST. Les stratégies de typage doivent être adaptées aux objectifs mais la plus courante consiste à utiliser une méthode simple (par exemple APPCR) en première intention puis d’appliquer une méthode plus discriminante (par exemple ECP) pour une exploration plus fine.

3. Applications des méthodes de

typage génomique au laboratoire

d’hygiène hospitalière

On différencie trois types d’application des techniques de typage en hygiène hospitalière : l’usage à visée épidé-miologique, l’usage à des fins de diagnostic individuel, et l’usage à visée phylogénétique.

2. Définition et principe du typage

et marqueurs épidémiologiques

Le typage consiste à différencier des souches au sein d’une même espèce de micro-organismes sur la base de l’identifi-cation de caractères présents dans l’espèce et variables au sein de cette espèce. Un caractère répondant à ces deux critères est utilisable en tant que marqueur épidémiologique car son étude permettra au sein d’une espèce donnée de différencier entre elles des souches sans lien temporo-spatial (non épidémiologiquement liées) et de reconnaître l’identité ou la forte similitude de deux souches isolées au cours d’une même chaîne de transmission. Pour être un bon marqueur épi-démiologique, un caractère doit répondre à un certain nombre de critères [1, 2] : 1) ce caractère doit être présent chez tous les individus de l’espèce pour permettre de typer chacune de ces souches (typabilité) ; 2) la méthode d’observation de ce caractère doit permettre de donner un résultat identique lorsqu’elle est appliquée à plusieurs reprises sur la même souche (reproductibilité) ; 3) sur un espace-temps défini, le caractère doit rester stable (stabilité) et 4) ce caractère doit permettre de reconnaître comme différentes deux souches sans aucun lien épidémiologique (pouvoir discriminant).Les premiers marqueurs utilisés reposaient sur des carac-tères exprimés par les bactéries : il s’agissait donc de mar-queurs phénotypiques rapidement abandonnés du fait d’un manque de reproductibilité mais aussi de leur faible pouvoir discriminant et quelquefois aussi de leur faible typabilité. Ces marqueurs phénotypiques étaient nombreux : biotypes (caractères morphologiques et physiologiques), antibiotypes (profils de résistance aux antibiotiques ou antiseptiques), sérotypes (antigènes de surface), lysotypes (profil de sensi-bilité à une série de bactériophages), bactériocinotypes (profil de sensibilité d’une collection de souches aux bactériocines produites par la souche à typer) ou encore profil protéique (extraction des protéines bactériennes puis séparation par électrophorèse) [3].Face aux performances limitées des marqueurs phénoty-piques, de nombreux marqueurs génotypiques ont été déve-loppés reposant soit sur la restriction de l’ADN suivie d’une électrophorèse soit sur l’amplification de certains gènes.

Tableau I – Performances des différents marqueurs génotypiques.

Marqueur Typabilité Reproductibilité Stabilité Pouvoir discriminant Praticabilité

Méthodes par restriction

Electrophorèse en champ pulsé

100 %Technique délicateBonne inter-série, mauvaise inter-laboratoires

++ ++++Technique longue et coûteuse

Ribotypie 100 % +++ +++ +++Automatisable, si manuelle procédure complexe

Méthodes d’amplification

Séquences connues

Proche de 100 %

Bonne inter-série, mauvaise inter-laboratoires

+++ +++Technique rapide, simple et peu onéreuse

Amorce choisie au hasard

Proche de 100 %

Mauvaise inter-série, mauvaise inter-laboratoires

+Difficulté de standardisation

Moyen, augmentée par l’emploi de plusieurs amorces

Technique rapide et peu onéreuse Difficulté de lecture et d’interprétation

Polymorphisme de séquences ou locus déterminés

Applicables à de nombreux pathogènes

Bonne reproductibilité intra et inter-laboratoires

+++Méthodes applicables à des études macro-épidémiologiques

Coût élevé, technique pointue réservée à des techniciens expérimentés



3.1. L’usage à visée épidémiologiqueL’enquête épidémique représente l’application des mar-queurs épidémiologiques la plus évidente. Différentes questions sont posées par une augmentation de l’incidence d’infections ou de colonisations par une bactérie patho-gène : cette augmentation de l’incidence est-elle liée à la dissémination d’un ou de plusieurs clones ? Quels sont les réservoirs, vecteurs et modes de transmission du ou des clones impliqués ? Les mesures de contrôle mises en place ont-elles permis la maîtrise du phénomène épidémique ? Le suivi de l’incidence représente ici le point de départ de l’enquête épidémiologique et ceci est souvent le cas lors d’épidémies cataclysmiques (augmentation brutale du nombre de cas) [8]. Mais le typage moléculaire peut être le point d’accroche de cette suspicion, notamment dans certaines épidémies torpides concernant des infections dont l’incidence est assez élevée en l’absence de tout phénomène épidémique [9]. Dans tous les cas, épidémie cataclysmique ou torpide, seul le typage permet de faire la part entre une accumulation des cas (cas groupés) liée par exemple à une mauvaise asepsie lors de gestes invasifs (augmentation brutale des infections urinaires sur sonde correspondant à une accumulation de cas sporadiques) et une véritable épidémie avec transmission de la bac-térie chez plusieurs patients au sein d’un même service, d’un même établissement ou même au sein de plusieurs établissements dans une région ou une inter-région. Ces épidémies peuvent d’ailleurs être d’une extension beaucoup large et concerner un pays, un continent ou même présenter une extension mondiale (pandémie). Une fois l’épidémie confirmée, les marqueurs vont pouvoir être utilisés pour identifier les réservoirs et/ou vecteurs impliqués autres que les patients eux-mêmes infectés (identifiés à travers des prélèvements à visée diagnostique) ou simplement colonisés (identifiés à travers des prélèvements à visée épidémiologique : écouvillons de nez, de gorge, écouvillons rectaux,…) : environnement (eaux ou surfaces) matériel et dispositifs médicaux (endoscopes,…), ou encore antisep-tiques ou produits perfusés ou alimentation (toxi-infection alimentaire collective)… [10]. Enfin après avoir confirmé l’existence d’une épidémie clonale puis identifier les réser-voirs et vecteurs de transmission du ou des clones impli-qués, l’utilisation des marqueurs à de nouvelles souches isolées chez des patients ultérieurement positifs avec la même espèce permet de confirmer ou infirmer l’efficacité des mesures de prévention mises en place. Pour cet objectif épidémiologique, les marqueurs comparatifs suffisent afin de discriminer les isolats clonalement liés de ceux sans lien épidémiologique. Une précaution importante consiste à effectuer le typage de plusieurs colonies, de préférence 3 à 5 à partir des isolements cliniques et au moins 5 à partir de cultures de réservoirs environnementaux car dans de nombreuses circonstances il peut coexister plu-sieurs clones. D’autre part l’interprétation des résultats doit prendre en compte l’échelle espace-temps car le nombre de cycles infectieux peut générer des variations du génome bactérien à travers des phénomènes d’insertion, de délétion ou de mutation ponctuelle (figure 1) (notion d’horloge moléculaire). Les mêmes méthodes de typage et d’interprétation peuvent être utilisées pour les épidé-mies hospitalières et pour les épidémies communautaires.

On préférera les systèmes polyvalents adaptables à une diversité d’espèces et de haut pouvoir discriminant, tels que l’ECP. En tout état de cause, si le laboratoire utilise un système « maison » dont le pouvoir discriminant n’est pas validé, il est nécessaire d’estimer celui-ci en incluant un échantillon de souches « témoins » non épidémiologique-ment liées (au minimum 30) provenant de cas d’infections sporadiques.

3.2. L’usage à des fins

de diagnostic individuelAu niveau individuel et dans le domaine de l’infection nosocomiale, trois questions importantes peuvent être résolues par le typage : faire la part entre récidive et réin-fection, établir le foyer initial d’une infection disséminée ou non ou encore confirmer ou infirmer l’origine endogène d’une infection acquise à l’hôpital.Comparer les souches isolées d’une infection avant et après traitement antibiotique permet d’authentifier les échecs d’éradication et d’émettre ainsi des hypothèses relatives aux causes de ces échecs avec évidemment un intérêt majeur pour l’optimisation du traitement mais aussi avec un intérêt

Figure 1 – Interprétation des profils de macrorestriction

au vu du nombre d’événements génétiques survenus.

Selon Tenover et coll.

1a.

1b.


physiopathologique (figure 2) [11]. L’hypothèse d’une réinfection avec un nouveau clone dans les suites d’une première infection confirmée par le typage montre une prédisposition particulière du patient à l’infection, celle-ci pouvant être liée à des malformations et/ou un déficit immunitaire. Si à l’inverse le typage démontre l’isoclonalité du premier isolat et du second, il faudra alors s’orienter soit vers l’existence d’un foyer infectieux résiduel, une colonisation persistante soit vers un échec du traite-ment lié à la non-compliance du patient, à l’émergence d’une tolérance ou d’une résistance bactérienne ou à un schéma thérapeutique mal adapté à la situation clinique (posologie insuffisante, rythme d’administration inadapté ou mauvais choix de la/les molécule(s).Toute l’importance de l’identification de la voie de contami-nation d’un site infectieux par le typage des souches peut être mise en exergue à travers l’exemple des infections sur cathéter à staphylocoque à coagulase négative [12]. Les choix curatifs et/ou préventifs des infections sur cathéter dépendent en effet de la voie de contamina-tion : retrait ou maintien du cathéter avec changement du pavillon ou traitement antibiotique d’un foyer endo-gène. La comparaison des souches isolées du point d’insertion du cathéter, du pavillon, du cathéter et/ou de l’hémoculture permet en effet (figure 3) d’attribuer la contamination à un site initial et de déterminer ainsi la meilleure stratégie thérapeutique. Ce type d’application (identification de la voie de contamination) concerne de très nombreuses infections et permet souvent de classer ces infections selon leur caractère endogène ou exogène. Ainsi, à titre d’exemple, il est proposé dans certains établissements de réaliser une recherche sys-tématique d’un portage nasal de Staphylococcus aureus chez les patients devant bénéficier d’une prothèse de hanche ou de genou. Les souches de S. aureus sont alors conservées et comparées en cas d’infection sur prothèse à la souche isolée de cette infection. Le carac-tère endogène (souche de l’infection identique à celle du portage nasal) de la souche infectante exonère pour partie le chirurgien et/ou l’établissement de la respon-sabilité de l’infection en cas de demande de réparation. Au total dans la prise en charge des infections, si les méthodes de typage génomique ne se substituent pas à l’analyse épidémiologique et clinique des cas, elles permettent d’infirmer ou de confirmer des hypothèses physiopathologiques et sont ainsi des outils précieux pour les choix secondaires en matière de prévention des infections.

3.3. L’usage à visée phylogénétiqueSur le plan phylogénétique, l’application des méthodes de typage moléculaire permet différentes applications à travers l’étude de l’hétérogénéité d’une espèce bacté-rienne : répartition géographique et diversité génomique des souches résistantes au sein d’une espèce, identi-fication des caractéristiques génomiques de souches plus virulentes ou encore association de caractéristiques génomiques à des caractéristiques phénotypiques de type « sérotype ». Un premier exemple concerne la dif-fusion en France de staphylocoques dorés résistants à l’oxacilline et producteurs de leucocidine de Panton et

Figure 2 – Place du typage moléculaire dans une récidive

d’angine à streptocoque du groupe A (SGA)

par analyse des profils de restriction enzymatique.

D’après d’Humieres, et coll. [11].

Figure 3 – Voies de contamination des cathéters

et place du typage moléculaire.

Selon Bingen, et coll. [12].

Figure 4 – Représentation schématique des pulsotypes de

souches cliniques de staphylocoques dorés résistants à

l’oxacilline et producteurs de leucocidine de Panton et Valentine.

Selon Dufour et coll. [13].



Valentive (LPV). Dufour et coll. a montré que l’association chez une même souche du gène LPV et du gène mecA (qui confère la résistance à l’oxacilline) a permis l’émer-gence d’une souche superadaptée qui a diffusé dans la communauté et qui a été responsable de nombreuses infections graves et quelquefois mortelles (figure 4) [13]. Pour illustrer l’identification génomique de souches plus virulentes au sein d’une espèce, l’étude de Bidet et coll. sur la diversité génétique des streptocoques du groupe B est particulièrement démonstrative. Dans cette étude portant sur 129 souches de streptocoques B de sérotype III dont 92 responsables de méningites néonatales et 37 responsables de simples colonisations, la distribution des souches au sein des groupes phylogénétiques montrait que si 50 % des souches de groupe 1 étaient respon-sables de méningites, seulement 25 % des souches des groupes 2 et 3 étaient responsables de méningites [14]. Les îlots de pathogénicité sont des segments chromo-somiques de taille relativement importante (> 30 Kb) qui regroupent des gènes de virulence et dont l’acquisition ou la perte détermine le niveau de pathogénicité d’une souche. L’approche de la virulence des souches impli-quées dans les phénomènes infectieux peut se faire par l’usage de ces marqueurs moléculaires comme le montre l’étude de Houdouin et coll. (figure 5).

4. Prospectives

La spectrométrie de masse (technologie MALDI-TOF) qui analyse les protéines bactériennes en quelques minutes représente peut-être une opportunité pour un retour vers le phénotypage pour l’ensemble des applications actuelles du typage moléculaire. La figure 6 illustre cette possibilité.L’avènement des techniques de séquençage haut débit couplé à une réduction importante des coûts rend aujourd’hui possible l’utilisation du séquençage complet du génome (whole genome sequencing) comme outil de génotypage bactérien. Cette technique de typage « ultime » qui permet de distinguer chaque variation nucléotidique au sein du génome est parfaitement adaptée à la carac-térisation des transmissions croisées, l’investigation des épidémies ou la phylogénie bactérienne, elle fournit de plus des informations sur la présence de gènes de résis-tance ou de virulence [16]. Toutefois, l’utilisation de cette technique ne sera possible en routine, que lorsque les coûts seront encore réduits, ainsi que les délais de réa-lisation et surtout la mise à disposition d’infrastructures d’analyses bio-informatiques.

5. Conclusion

Au total, la place actuelle du génotypage au sein des laboratoires d’hygiène apparaît essentielle participant aux différents axes d’activité : investigation des épidé-mies hospitalières, identification de la physiopathologie des infections nosocomiales et évaluation des stratégies de prévention.

Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de

conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Figure 6 – Technologie MALDI-TOF et typage bactérien :

un retour possible vers le phénotypage.

Schéma emprunté à E. Bingen.

Figure 5 – Identification d’un îlot de pathogénicité

chez E. coli par typage par champ pulsé.

Selon Houdouin, et coll. [15].

5a.

5b.


Références

[1] Talon D, Cailleaux V, Thouverez M, et al. Discriminatory power and usefulness of pulsed-field gel electrophoresis in epidemiolo-gical studies of Pseudomonas aeruginosa. J Hosp Infect 1996;32: 135-45.[2] Hunter PR. Reproducibility and indices of discriminatory power of microbial typing methods. J Clin Microbiol 1990;28:1903-5.[3] Joly-Guillou ML, Bergogne-Berezin E, Vieu JF. A study of the rela-tionships between antibiotic resistance phenotypes, phage typnig and biotyping of 117 clinical isolates of Acinetobacter spp. J Hosp Infect 1990;16:49-58.[4] Blanc DS, Siegrist HH, Sahli R,et al. Ribotyping of Pseudomonas aeruginosa: discriminatory power and usefulness as a tool for epide-miological studies. J Clin Microbiol 1993 ;31:71-7.[5] Saulnier P, Bourneix C, Prevost G, et al. Random amplified polymor-phic DNA assay is less discrimant than pulsed-field gel electrophoresis for typing strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1993;31:982-5.[6] van Mansfeld R, Willems R, Brimicombe R, et al. Pseudomonas aeruginosa genotype prevalence in Dutch cystic fibrosis patients and age dependency of colonization by various P. aeruginosa sequence types. J Clin Microbiol 2009;47:4096-101.[7] Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: cri-teria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995;`33:2233-9.[8] Moolenaar RL, Crutcher JM, San Joaquin VH, et al. A prolonged outbreak of Pseudomonas aeruginosa in a neonatal intensive care unit:

did staff fingernails play a role in disease transmission? Infect Control Hosp Epidemiol 2000;21:80-5.[9] Bertrand X, Thouverez M, Patry C, et al. Pseudomonas aeruginosa: antibiotic susceptibility and genotypic characterization of strains isola-ted in the intensive care unit. Clin Microbiol Infect 2001;7:706-8.[10] Cholley P, Thouverez M, Floret N, et al. The role of water fittings in intensive care rooms as reservoirs for the colonization of patients with Pseudomonas aeruginosa. Intensive Care Med 2008;34:1428-33.[11] d’Humieres C, Cohen R, Levy C, et al. Decline in macrolide-resistant Streptococcus pyogenes isolates from French children. Int J Med Microbiol 2012;302:300-3.[12] Bingen E, Barc MC, Brahimi N, et al. Randomly amplified polymor-phic DNA analysis provides rapid differenciation of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococcus bacteremia isolates in pediatric hospital. J Clin Microbiol 1995;33:1657-9.[13] Dufour P, Gillet Y, Bes M, et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in France: emergence of a single clone that produces Panton-Valentine leucocidin. Clin Infect Dis 2002;35:819-24.[14] Bidet P, Brahimi N, Chalas C, et al. Molecular characterization of serotype III group B-streptococcus isolates causing neonatal meningi-tis. J Infect Dis 2003;188:1132-7.[15] Houdouin V, Bonacorsi S, Brahimi N, et al. A uropathogenicity Island contributes to the pathogenicity of Escherichia coli strains that cause neonatal meningitis. Infect Immun 2002;70:5865-9.[16] Price JR, Didelot X, Crook DW, et al. Whole genome sequencing in the prevention and control of Staphylococcus aureus infection. J Hosp Infect 2013;83:14-21.

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