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UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE-AIX-MARSEILLE II
FACULTE DE MEDECINE-LA TIMONE
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
THESE DE DOCTORAT
Présentée par
Laetitia NINOVE
En vue de l’obtention du grade de Docteur de l’Université de la Méditerranée
Spécialité: Maladies Transmissibles et Pathologies Tropicales
Approche optimisée du diagnostic moléculaire des infections virales :
application à la pandémie de grippe A/H1N1.
Soutenue le 13 Janvier 2011
COMPOSITION DU JURY
Pr Bruno POZZETTO Rapporteur
Dr Hervé BOURHY Rapporteur
Pr Xavier DE LAMBALLERIE Directeur de thèse
Dr Rémi CHARREL Examinateur
Dr Hervé TISSOT-DUPONT Examinateur
1
SOMMAIRE
Pages
Introduction et objectifs 2
I. Les techniques de PCR 5
II. Mise en place de la plate-forme de biologie moléculaire 13
Prévention des risques de contamination 14
Choix des systèmes de détection, préparation 17
des amorces/sondes, aliquotage et stockage
Extraction des acides nucléiques (AN) 20
Contrôles de PCR 21
Protocole de PCR-tr 26
III. Développement de la plate-forme de biologie moléculaire 28
Article 1: 31
“RNA and DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical virology:
a comprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests.”
Article 2 35
“A simple method for molecular detection of Swine-origin and human-origin
influenza a virus.”
Article 3 38
“Novel virus influenza A (H1N1sw) in South-Eastern France, April-August 2009.”
Article 4 43
“Point of care strategy for rapid diagnosis of novel A/H1N1 influenza virus.”
Conclusion et perspectives 47
Bibliographie 53
2
INTRODUCTION ET OBJECTIFS
3
Les pathologies d'étiologie virale occupent une place croissante dans la gestion des maladies
infectieuses humaines et animales. Cette évolution est liée d'une part aux progrès diagnostiques et
thérapeutiques dans la discipline, mais également à la prise en compte progressive d'une
épidémiologie complexe et évolutive, incluant des phénomènes épidémiques ou d'émergence dont les
conséquences sanitaires et économiques peuvent être considérables. Elle a créé des besoins nouveaux
et une demande importante en matière d’actes virologiques, tant à titre diagnostique, pronostique
qu’épidémiologique.
L’histoire du diagnostic virologique médical peut se scinder en trois grandes étapes.
La première phase a débuté en 1949 avec la culture in vitro du poliovirus par John Enders,
Thomas Weller et Frederick Robbins. Cette période a inauguré l’ère des cultures cellulaires qui a
permis l’isolement de nombreux virus à partir de divers prélèvements biologiques et leur
identification sous l’égide de programmes documentaires et descriptifs financés par le Centre
Rockefeller. Cette période a coïncidé de manière heureuse avec le développement des techniques de
microscopie électronique, qui ont apporté à cette nouvelle discipline un substratum d'identification
morphologique. Ceci lui a permis, outre de considérables progrès taxinomiques, une existence moins
abstraite.
La deuxième phase a connu son apogée dans les années 1970 avec l’avènement des
techniques immuno-enzymatiques (Stratis Avraméas) et la découverte des anticorps monoclonaux
(Georges Kohler et Nathan Milstein, 1975). Ces nouvelles approches ont permis le développement
de techniques sensibles, spécifiques et rapides pour le diagnostic direct et indirect des infections
virales. Cette période a coïncidé avec l'apparition de l'aciclovir, une molécule antivirale prodigieuse
par son activité anti-herpétique et son innocuité. L'arrivée de cette molécule marque un tournant
capital du diagnostic virologique médical dans la mesure où l'existence d'un traitement efficace allait
susciter une demande médicalement fondée de diagnostic étiologique des infections virales.
La troisième phase a été marquée par l’essor en virologie médicale de la technique
d’amplification de séquences nucléiques utilisée sous le terme de Polymerase Chain Reaction (PCR)
découverte par Kary Mullis qui a obtenu à ce titre, le prix Nobel de chimie en 1993.
4
Cette période coïncide avec l'apparition de l'épidémie du virus de l'immuno-déficience
humaine, puis la découverte -moléculaire- du virus de l'hépatite C. Pour ces pathogènes, et beaucoup
d'autres par la suite, le développement du diagnostic par biologie moléculaire et celui de
thérapeutiques antivirales ont permis l'entrée et le développement de la virologie dans le champ
habituel de la microbiologie clinique.
Notre propos portera ici sur le développement de techniques de biologie moléculaire (et plus
particulièrement des techniques d'amplification dites en temps réel) pour répondre aux demandes et
contraintes du diagnostic en milieu hospitalier. Il sera accompagné de considérations sur l'utilisation
de ces techniques dans les pays du Sud et la possibilité de transfert technologique en ce sens.
5
I. Les techniques de PCR
Les techniques de biologie moléculaire ont pris au cours des 20 dernières années une place
importante dans le diagnostic direct des pathogènes viraux [1,2]. Ces méthodes permettent de mettre
en évidence et parfois de quantifier les acides nucléiques (AN) des virus, et/ou des transcrits liés à la
réplication virale, et/ou des formes moléculaires rétrotranscrites dans le cas des rétrovirus.
Parmi les techniques diagnostiques, l'amplification génique -et singulièrement la technique
dite de PCR- a profondément bouleversé les capacités diagnostiques en virologie. Le principe et la
spécificité de la détection reposent fondamentalement sur la capacité d’une séquence monocaténaire
d’ADN ou d’ARN à se lier spécifiquement avec sa séquence complémentaire, puis à subir une
élongation par une polymérase. La réaction de PCR, prototype des techniques d’amplification
génique, a révolutionné les capacités de détection grâce à l'apport de polymérases thermostables
permettant un cycle continu alternant dénaturation, hybridation et élongation sans intervention
extérieure.
Dans la PCR dite "conventionnelle", l’amplification et la détection des amplicons se font de
manière indépendante et l'analyse des amplicons est associée à un risque de contamination.
L’analyse des produits amplifiés par électrophorèse sur gel d’agarose, par chromatographie ou par
hybridation est réalisée en point final et ne permet qu'une détection qualitative ou semi-quantitative.
Plus récemment, les techniques de PCR en temps réel (PCR-tr) ont permis le développement
rapide de la biologie moléculaire dans le diagnostic de routine [3]. L’amplification est évaluée grâce
à l’émission d’un signal fluorescent dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’amplicons
générés au fur et à mesure des cycles de PCR. Dans la PCR-tr, l’amplification et la détection des
amplicons se font simultanément en système fermé. L’analyse des produits amplifiés se fait en temps
réel. Le diagnostic par PCR-tr est au final plus rapide que celui par PCR conventionnelle (réduction
de la durée des cycles et de la taille des amplicons, absence de procédures techniques post-PCR et
possibilité d’avoir une lecture en continue de l’amplification grâce aux marqueurs fluorescents), mais
l’avantage déterminant repose sur la détection en "système fermé", c’est à dire sans ouverture des
tubes réactionnels, ce qui limite considérablement les risques de contamination à partir des produits
d’amplification générés au cours de la réaction enzymatique [4]. La sensibilité des techniques de
PCR-tr est bonne, généralement supérieure à celle des PCR conventionnelles en une étape, et
approchant souvent celle des protocoles de PCR nichée [5].
6
Il existe deux méthodologies principales pour la détection des amplicons : l'utilisation d'agents se
liant à l’ADN double brin (SYBR Green) et les sondes fluorescentes spécifiques de la cible
amplifiée.
1) La molécule SYBR® Green est un agent intercalant émettant de la fluorescence quand il est
lié à l'ADN (Figure 1). Le nombre de marqueurs fluorescents augmente au cours de
l’amplification proportionnellement à la quantité d’ADN double brin synthétisé et on réalise
une courbe de fusion en fin de réaction. Dans ce système, la spécificité de la réaction repose
sur la spécificité des amorces et la température de fusion des amplicons. L’inconvénient
principal de cette technique est l’absence de contrôle de la spécificité de la fluorescence
mesurée. Il existe par ailleurs de nombreux avantages à l'utilisation du SYBR Green: coût
modéré, simplicité de mise en œuvre, utilisation possible pour la détection d'un panel étendu
de séquences apparentées (par exemple: détection des tous les flavivirus, ou de tous les virus
de la grippe A, lors d'une réaction unique).
Figure 1. Technique SyBr Green : la molécule SYBR® Green est un agent intercalant de
l’ADN double brin qui lorsqu’elle est excitée, émet de la fluorescence.
2) Dans les techniques utilisant des sondes fluorescentes, la fluorescence est obtenue par
l’utilisation d’une sonde marquée. Il existe 4 technologies utilisant des sondes (Elyse Poitras
et Alain Houde, La PCR en temps réel: principes et applications, Reviews in Biology and
Biotechnology, Vol.2, No 2, December 2002. pp.2-11) :
a) Taqman ou hydrolyse de sondes
b) HybProbes (FRET) ou hybridation de 2 sondes
c) Molecular Beacons ou balises moléculaires
d) Scorpion ou amorces scorpion.
7
a) Dans la technologie Taqman, les sondes sont marquées à leur extrémité 5’ par un fluorochrome
émetteur (reporter), par exemple FAM, et à leur extrémité 3’ par un fluorochrome suppresseur
(quencher) fluorescent ou non, qui inhibe l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité.
Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée sur sa cible, elle est hydrolysée par l’activité 5’
exonucléasique de l’ADN polymérase [6]. Le reporter ainsi séparé du quencher émet un signal
proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de l’élongation (Figure 2A).
b) La technologie FRET utilise 2 sondes dont l’une est porteuse en 3’ d’un fluorochrome émetteur
et l’autre en 5’ d’un fluorochrome accepteur. Les sondes sont choisies de façon à s’hybrider à leurs
séquences cibles en n’étant séparées que de 1 à 5 bases. Lorsque les deux sondes sont séparées, le
fluorochrome donneur n’émet qu’un bruit de fond de fluorescence alors que lorsqu’elles sont
hybridées à moins de 10 nucléotides de distances, la proximité des 2 fluorochromes permet le
transfert de l’énergie du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur provoquant
l’émission fluorescente de ce dernier (FRET : fluorescent resonnance energy transfer). On mesure
alors l’acquisition de la fluorescence, proportionnelle à la quantité d’ADN synthétisée, au moment de
l’hybridation. Les sondes restant intactes (contrairement aux sondes Taqman qui sont hydrolysées), il
est possible de réaliser une courbe de fusion en fin de réaction (Figure 2B).
c) Les balises moléculaires (molecular beacons) sont des sondes d’hybridation en épingle à cheveux
portant 2 fluorochromes, un reporter et un quencher comme les sondes Taqman. Etant repliées à
l’état libre, elles n’émettent pas de fluorescence en raison de la proximité des 2 fluorochromes.
Lorsque les sondes sont hybridées, l’éloignement suffisant des 2 fluorochromes libère le reporter
permettant ainsi l'émission d'une fluorescence. La lecture de la fluorescence se fait au moment de
l’hybridation (Figure 3A).
d) Les amorces Scorpion sont une variante des molecular beacons avec une structure en épingle à
cheveu complétée après le quencher d’une molécule d’hexéthylène glycol (HEG) sur laquelle est
fixée une amorce. L’HEG empêche l’extension de la balise moléculaire par l’ADN polymérase et
l’amorce permet d’intégrer la balise moléculaire dans le nouvel amplicon. La boucle change de
conformation (retournement rappelant la queue d’un scorpion) lors d’une renaturation, pour
s’hybrider à sa séquence complémentaire sur l’amplicon, permettant l’éloignement du quencher et
l’émission du reporter (Figure 3B).
8
Figure 2A: technologie Taqman (a) Durant l’étape de dénaturation, la sonde est libre
en solution. (b) la sonde et les amorces s’hybrident à leurs séquences cibles respectives et la
proximité des fluorochromes permet l’inhibition de la fluorescence. La polymérisation
débute. (c) La polymérase déplace et hydrolyse la sonde. Le fluorochrome émetteur est libéré
de l’environnement du suppresseur permettant ainsi l’émission de la fluorescence.
Figure 2B: technologie FRET (a) Durant l’étape de dénaturation, les deux sondes
demeurent séparées et en solution. (b) les sondes s’hybrident à leurs séquences cibles
respectives et la proximité des fluorochromes permet l’émission de fluorescence rouge par le
principe FRET. (c) Les sondes retournent libres en solution.
9
Figure 3A: Balises moléculaires (Molecular Beacons). (a) Durant l’étape de dénaturation, la
balise moléculaire est sous forme relaxée et libre en solution mais la proximité des fluorochromes
permet l’inhibition de la fluorescence. (b) Lorsque la sonde s’hybride à sa séquence cible, le
fluorochrome émetteur est suffisamment éloigné de son suppresseur pour permettre l’émission de
fluorescence. (c) À l’étape de polymérisation, la balise moléculaire retourne en solution sous forme
d’épingle à cheveux.
Figure 3B: Amorces scorpion (Scorpion primer). (a) Durant l’étape de dénaturation, la
balise moléculaire est sous forme relaxée et libre en solution mais la proximité des fluorochromes
permet l’inhibition de la fluorescence. (b) L’amorce scorpion se fixe à sa séquence complémentaire
cible. (c) Polymérisation du brin complémentaire. (d) Dénaturation des brins d’ADN. (e)
Hybridation de la séquence complémentaire de la partie balise moléculaire à sa séquence cible
permettant l’émission de fluorescence.
10
La spécificité des techniques utilisant des sondes fluorescentes est liée à la fois à celle des
amorces et à celle de la sonde réduisant significativement le risque de fluorescence non spécifique
due à des mésappariements ou des dimères d’amorces mis en évidence avec le test SyBr Green.
Ces techniques présentent l’avantage de détecter plusieurs cibles dans le même tube en
utilisant différentes amorces et sondes marquées avec des fluorochromes ayant des spectres
d’émission différents. Ces réactions dites "multiplex" peuvent être élaborées en utilisant des
fluorochromes émetteurs distincts pour chacune des cibles moléculaires [7]. Ces techniques se sont
développées de manière importante au cours des dix dernières années. Dans différentes études, le
multiplexage a été utilisé pour détecter un panel de virus associé le plus souvent à un syndrome
donné. Il a été utilisé par exemple pour la recherche de virus responsables de méningites et
d’encéphalites [8,9]. Le liquide céphalorachidien (LCR) étant souvent prélevé en faible quantité, la
détection de plusieurs pathogènes dans un même tube permet donc d’utiliser une quantité moindre de
matériel biologique. Le multiplexage a également été utilisé pour la détection de virus respiratoires
[10], de virus impliqués dans l’immunosuppression [11], de virus présents dans des infections
génitales [12], et enfin de virus transmis par le don de sang [13].
La PCR multiplex est une technique attractive, mais il est nécessaire d’optimiser, d’évaluer et
de valider les protocoles techniques (en particulier la quantité d’amorces et de sondes) afin de ne pas
entraîner de compétition entre les différentes PCR réalisées dans le même tube. L’utilisation de
systèmes multiplex est limitée par le nombre de fluorochromes et de sources lumineuses
monochromatiques disponibles [14].
Les quatre techniques détaillées plus haut (hydrolyse, FRET, balises et Scorpion) peuvent
être utilisées en format multiplex. Les balises moléculaires permettent de détecter une variation de
l’ordre de un nucléotide et les amorces scorpion sont préférentiellement utilisées lors de PCR
comportant des cycles courts. Cependant, la conception des balises moléculaires et des amorces
scorpion est plus délicate que celle des systèmes "classiques" et leur prix reste élevé. Le tableau de la
page suivante résume les principales caractéristiques de ces 4 techniques de PCR-tr (Tableau 1).
11
Tableau 1. Principales caractéristiques des techniques de PCR-tr utilisant des sondes
fluorescentes
12
Au total, les techniques d'amplification moléculaire en temps réel ont connu un succès
considérable, tant dans le champ de la recherche que dans celui du diagnostic virologique. Les
problèmes initialement rencontrés et constituant un frein à l’optimisation de la sensibilité et la
spécificité de ces méthodes ont été progressivement résolus.
- le risque de contamination responsable de "faux-positifs" a été très rapidement identifié par
les laboratoires de biologie moléculaire et a constitué le point faible crucial des techniques de PCR
conventionnelle. La mise en place de pièces sectorisées pour pratiquer les différentes étapes de PCR
et l’utilisation des techniques de PCR-tr (sans ouverture de tube) ont permis de réduire
considérablement ce problème et d'accéder au diagnostic moléculaire à large échelle.
- la technique de PCR-tr est intrinsèquement d'une grande reproductibilité. Les procédures
d’aliquotage des réactifs, la mise au point de témoins positifs et de témoins internes synthétiques et
plus récemment l’automatisation des techniques d’extraction des acides nucléiques ont permis
d'atteindre un degré de standardisation sans précédent pour les tests moléculaires.
13
II. Mise en place de la plate-forme de biologie moléculaire
Le travail réalisé ici doit être analysé dans le contexte de la mise en place, au sein du
laboratoire de virologie de l’hôpital de la Timone, d’une plate-forme de biologie moléculaire adaptée
au diagnostic de routine qui n'est pas couvert par des kits et automates spécifiques. Cette approche
optimisée du diagnostic moléculaire des infections virales a été appliqué notamment à la détection de
la grippe pandémique A/H1N1v dans les laboratoires de routine hospitalière et « Point Of Care ».
Plusieurs étapes ont fait l'objet d'une analyse et de la mise en place d'évaluations et/ou
élaboration de méthodes optimisées:
La prévention des risques de contamination
Le choix des systèmes de détection, la préparation des amorces/sondes, l’aliquotage et le
stockage des réactifs
L’extraction des acides nucléiques (AN)
La mise au point de contrôles de PCR
L’optimisation de protocole de PCR-tr.
14
Prévention des risques de contamination
La gestion journalière d'un grand nombre d'échantillons et la grande sensibilité de la
technique de PCR peuvent, en l'absence de précaution, générer des résultats faussement positifs par
contamination [15]. De tels résultats sont inacceptables puisqu’ils peuvent induire à tort la mise en
place d’un traitement antiviral ou l’arrêt d’un traitement antibiotique, une hospitalisation, des
examens complémentaires, exclure dans certains cas les autres étiologies retenues par le clinicien et
conduire ainsi à un mauvais diagnostic. Les modes de contamination les plus fréquents sont :
la contamination inter-échantillons pré-PCR, c'est-à-dire la contamination d'un
échantillon négatif par un échantillon positif avant l'amplification (lors du
prélèvement, de l'échantillonnage, de l'extraction d'ADN)
la contamination des réactifs ou des échantillons avec de l'ADN amplifié provenant
d'amplifications précédentes
Lo et al. et Kwok et Higuchi ont publié dès 1989 des recommandations pour réduire le risque
de contaminations [16,17]. Ils recommandent de veiller à la parfaite séparation des étapes de
l'analyse PCR et des échantillons entre eux. Les manipulations pré-PCR et post-PCR devront donc
être réalisées dans des pièces séparées et un minimum de deux pièces est nécessaire pour les étapes
de pré-PCR. Il faut respecter le sens du déplacement de pièces en pièces, c’est le one-way only
protocol : déplacement en sens unique du matériel sans jamais de retour en arrière (Figure 5).
Figure 5. Organisation théorique d’un laboratoire de biologie moléculaire
15
Comme évoqué précédemment, dans la technique de PCR-tr, les risques de faux positifs par
contamination post PCR sont limités par rapport aux techniques de PCR conventionnelles. En effet,
la lecture du résultat ne nécessite pas l'ouverture des tubes réactionnels (contamination post-PCR) et
de nombreux kits intègrent l’un des systèmes de prévention des contaminations consistant à générer
des produits d'amplification dans lesquels l'Uracile remplace la Thymine. De ce fait, tout produit de
PCR potentiellement contaminant peut, à la différence de l'ADN naturel, être détruit par l'Uracil-N-
Glycosylase (UNG) qui est incorporée dans le mélange réactionnel d'amplification. L'UNG procède à
une décontamination en amont de l'amplification et est inactivée lors du premier cycle [18,19].
Le laboratoire de biologie moléculaire installé au sein du laboratoire hospitalier de virologie
de la Timone à Marseille a donc été structuré en respectant les règles maintenant classiques
d'organisation de Lo et al. (Figure 6).
Une pièce a été dédiée à la manipulation des prélèvements (aliquotage, traitement des
échantillons, etc…) et à l’extraction des acides nucléiques. Il s’agit d’un laboratoire L2 équipé de
hottes à flux laminaire.
Deux pièces ont été consacrées à la préparation des mélanges réactionnels de reverse
transcription (RT) et de PCR. Les mélanges réactionnels sont préparés et déposés dans des plaques
de 96 puits ou dans des barrettes à 8 puits.
Dans un troisième type de pièce, les AN issus de l’extraction ou les cDNA issus de la RT sont
déposés dans les plaques ou barrettes contenant les mélanges réactionnels de PCR ou de RT, dans
une enceinte de protection Biocap, qui peut se décontaminer par rayonnement U.V. Chaque pièce
possède son propre matériel (Tips, pipettes, gants, réactifs, etc…) et des congélateurs permettant de
stocker les réactifs, les prélèvements, les extraits et les cDNA.
Une pièce spécifique est enfin dédiée aux thermocycleurs en temps réel.
Il est important de noter que les étapes ultérieures de l'organisation, en particulier les
procédures de préparation et conservation des réactifs, ont également puissamment contribué à
l'élimination des épisodes de contamination (cf. sections suivantes).
16
Figure 6. Organisation du laboratoire de virologie au sein de la fédération de microbiologie
Pièce de traitement des échantillons et d’extraction des AN (1), pièces de préparation des mélanges
réactionnels de RT et de PCR (2 et 3), pièce de dépôt des extraits et des cDNA (4), pièce où sont
situés les automates de PCR en temps réel (5).
5
3
1ier
étage
Sous-sol
4
2
1
17
Choix des systèmes de détection, préparation des amorces/sondes,
aliquotage et stockage
Tous les systèmes de détection utilisés au sein de la plate-forme de biologie moléculaire ont
été mis au point par l’équipe de l’UMR190 ou par des équipes ayant publié leurs résultats dans la
littérature scientifique. Ces systèmes de PCR-tr "domestique" ont été évalués et optimisés sur une
gamme d’échantillons cliniques positifs ou de cultures cellulaires infectées par le virus au sein de
l’UMR190. Ils ont été optimisés en utilisant une stratégie basée sur des expériences systématiques
avec diverses concentrations d'amorces (5, 10, 15, 20, 25 pmol) et de sondes (2, 4, 6, 8, 10 pmol)
(Tableau 2a et 2b).
[Amorces S/R] (pmol) 5 10 15 20 25
5 Ct Ct Ct Ct Ct
10 Ct Ct Ct Ct Ct
15 Ct Ct Ct Ct Ct
20 Ct Ct Ct Ct Ct
25 Ct Ct Ct Ct Ct
(a) (b)
Tableaux 2. Stratégie d’optimisation de la quantité d’amorces (a) et de sonde (b) : la quantité
optimale de chaque amorce est déterminée et sera ensuite utilisée pour évaluer la quantité optimale
de la sonde. Dans les 2 cas, la quantité des autres composants du mix réactionnel (enzyme, tampon,
dNTP et Mg2+
) ne varient pas lors des différents tests.
En conformité avec les préconisations de Kwok et Higuchi, un aliquotage systématique des réactifs
de PCR (amorces et sondes) a été mis en œuvre pour:
1. limiter les risques de contamination
2. améliorer la qualité des tests moléculaires.
[Sonde] (pmol)
2 Ct
4 Ct
6 Ct
8 Ct
10 Ct
18
En effet, les réactifs de PCR ouverts et fermés de manière répétée ont plus de risque d’être
contaminés par des ADN amplifiés et les congélation/décongélation multiples des systèmes de
détection peuvent modifier leur stabilité (notamment la fluorescence des sondes). Dans le laboratoire
de l’UMR190 de la faculté de médecine, nous avons dédié une pièce à la régénération, à l’aliquotage
et au stockage des amorces et des sondes Taqman prêtes à l’emploi.
Les amorces et les sondes sont réceptionnées sous forme lyophilisées et sont régénérées avec
de l’eau stérile à une concentration de 100 µM (solutions mères). Les solutions mères sont diluées à
une concentration de 10 µM et aliquotées dans des barrettes de PCR (solutions filles). Ces barrettes
prêtes à l’emploi sont étiquetées et nominatives pour chaque virus. Ces aliquots d’amorces et de
sondes prêts à l’emploi sont testés et validés avant utilisation sur des témoins positifs quantifiés (cf.
sections suivantes) et sont stockés dans un congélateur à -40°C (Figure 7).
Figure 7. Portoirs utilisés pour le stockage de 96 microtubes 0,2 ml PCR
Tous les systèmes de détection utilisés dans le laboratoire sont répertoriés dans une base de
données informatique, où sont notées les séquences des différentes amorces et sondes, les quantités,
les stocks, les témoins positifs, les protocoles de PCR et les références des articles scientifiques
correspondant à chaque système (Figure 8). Les amorces et sondes aliquotées prêtes à l’emploi sont
stockés à la faculté de médecine (UMR190) et sont récupérées chaque semaine par les techniciens
hospitaliers pour assurer le diagnostic de routine. Les stocks de la base de données sont alors mis à
jour. Les réactifs non utilisés en fin de semaine sont jetés.
19
Figure 8. Paramètres répertoriés dans la base de données informatique
Statut Amorces
Sonde Séquences
Nombre de
bases
Nombre de
barrettes
Quantité
restante
(mL)
Nombre de
lyophilisats Protocole PCR Témoin positif
Référence
bibliographique
Nom du
Virus
-En développement
-Stockage
-Routine
-Recherche
Nom amorce S
5’----3’
-PCR-tr (Taqman ou SyBr Green)
-RT-PCR-tr
-PCR conventionnelle
-ARN synthétique
-Plasmide
Nom amorce R
5’----3’
Nom sonde
Reporter----Quencher
20
Extraction des acides nucléiques (AN)
L'étape d’extraction des acides nucléiques est l'une des plus importantes du processus
diagnostique. De sa qualité va dépendre le résultat quelle que soit la technique employée. Il existe de
nombreuses méthodes d’extraction. Initialement, les laboratoires utilisaient des solvants organiques
(phénol-chloroforme) et la précipitation des AN dans de l’éthanol ; ces techniques donnaient de très
bons résultats mais étaient fastidieuses et dangereuses pour le manipulateur (produits toxiques).
Aujourd’hui, trois types de techniques d’extraction sont commercialisés:
l’extraction des protéines par le thiocyanate de guanidine et la précipitation des AN
dans l’isopropanol,
la fixation et l’élution des AN sur la silice (billes ou colonne)
la complexation des protéines à une résine et récupération des AN.
Ces techniques d’extraction sont aujourd’hui automatisées ce qui permet de traiter de grandes séries
d’échantillons dans un temps limité (30 minutes à 1 heure).
Au sein de notre plate-forme, l’extraction des AN a été totalement automatisée et notre choix
s’est porté sur l’automate EZ1 Biorobot (plus récemment EZ1 XL), des extracteurs d’ADN et
d’ARN de la société QIAGEN (Figure 9). Le principe de la double extraction simultanée
(ADN+ARN), après évaluation, a montré des résultats identiques, et parfois meilleurs que certains
kits d’extraction d’ADN ou d’ARN seuls. Elle est rapide, (moins de 50 minutes) et économique
puisqu’elle a permis de réduire le nombre d’extraction, le temps de manipulation, les consommables
et le matériel à stocker. Elle est particulièrement avantageuse pour les prélèvements précieux tels que
LCR ou humeur aqueuse en réduisant le volume nécessaire à la recherche des pathogènes ADN et
ARN. Il est intéressant de noter que cette technique donne également d'excellents résultats pour la
détection des génomes bactériens.
21
Seuls quelques prélèvements testés avec des kits de PCR commercialisés (kits de PCR
quantitative de l’Epstein Barr Virus et de l’adénovirus, Argene) sont extraits sur l’extracteur
recommandé par le fabricant (MagnaPure, Roche) avec un kit d’extraction d’ADN seul (Figure 10).
Figure 9. Qiagen. BioRobot® EZ1 Figure 10. Roche MagNA Pure LC instrument
Contrôles de PCR
Il existe 2 types de contrôles :
1. Contrôles externes
Le témoin négatif est testé exactement comme les autres échantillons. Ce témoin permet de
détecter une contamination éventuelle des différents réactifs entrant dans la composition de la
PCR. Le plus souvent, il est représenté par de l’eau stérile.
Le témoin positif est traité dans des tubes séparés des prélèvements cliniques mais est testé
simultanément. Il utilise les mêmes amorces et la même sonde que le virus recherché. Il permet
de contrôler la bonne composition du mélange réactionnel. C’est une source potentielle de
contamination des échantillons induisant le risque de rendre des résultats faussement positifs. La
plupart du temps les témoins positifs utilisés sont représentés par des échantillons biologiques
positifs, des cultures positives ou des plasmides spécifiques du virus recherché.
22
Depuis 2007, nous avons mis en place au laboratoire de virologie, un nouveau type de témoin
positif externe. Il s’agit d’un gène synthétique spécifique d’un virus donné qui comporte les
séquences nucléotidiques des amorces, de la sonde du système de détection de ce virus et une
séquence exogène (ATTATAGCGGCCGCTTATTA) contenant un site de restriction par l'enzyme Not
I. Cette séquence exogène n’existe pas dans la nature. Afin de dépister les contaminations à partir
du témoin positif, elle peut servir de cible à une sonde spécifique ou à une coupure par Not I.
Pour chaque virus testé dans le laboratoire, un gène synthétique a été préparé et les témoins
utilisés sont sous forme ADN pour les pathogènes à génome ADN, et sous la forme d'un transcrit
ARN pour les pathogènes à génome ARN (Figure 11).
Séquence oligonucléotidique d’un contrôle externe (virus à ADN)
Séquence oligonucléotidique d’un contrôle externe (virus à ARN)
Figure 11. Mise au point des contrôles externes synthétiques ADN (a) et ARN (b)
Séquence spécifique de l’amorce sens
Séquence du promoteur T7
Séquence spécifique de la sonde
Séquence du site de restriction NOT I (ATTATAGCGGCCGCTTATTA)
Séquence virale
Séquence complémentaire de l’amorce reverse
F Specific Forward primer
R Specific Reverse primer
T7 T7 promoter primer
(a)
(b)
R
T7 F
R
F
23
2. Contrôles internes
La réaction de PCR peut facilement être perturbée par :
a) des substances inhibitrices dans les prélèvements (sang, biopsies, selles, héparine,
hémoglobine…)
b) des erreurs techniques lors de l’extraction du matériel génétique, de la RT ou de
l’amplification de l’AN.
En contraste avec les progrès importants apportés par la PCR-tr pour la prévention des
résultats faussement positifs dus aux contaminations, ces techniques n'ont pas apporté d'amélioration
notable pour la détection des résultats faussement négatifs. L'éventualité de tels faux négatifs est
pourtant difficilement acceptable car le diagnostic et la mise en place d’un traitement adapté seront
retardés [20]. A ce jour, plusieurs types de contrôles internes ont été imaginés, ciblant différentes
étapes de la réaction de PCR ou de RT-PCR : la lyse du virus, l’extraction de l’AN, la RT de l’ARN
et la PCR de l’ADN ou du cDNA. Les contrôles internes sont ajoutés à chaque prélèvement
biologique. Ils permettent de contrôler le déroulement de la réaction à l’intérieur de chaque tube [21].
Jusqu’en 2006, le laboratoire de virologie de la Timone utilisait un système de contrôle interne
d'amplification (gène de la bétaglobine) permettant de valider l'ensemble de la réaction de PCR pour
chaque échantillon mais pas l’étape d’extraction. Le seul modèle proposé permettant de contrôler
toutes les étapes réactionnelles (extraction des acides nucléiques, reverse transcription et PCR) sous
la forme d'un contrôle interne est la particule de type "armored RNA". Il s’agit d’ARN enveloppés
dans des protéines de phage [22,23]. Ce montage permet de reconstituer une pseudo-particule virale
et de protéger l’ARN des RNases présentes dans le prélèvement biologique. Les "armored RNA"
sont toujours dérivés du virus recherché ce qui limite leur utilisation à un virus spécifique :
Entérovirus [24], HIV [25], virus West Nile [26], Tick-Borne Encephalitis Virus [27]. La mise en
place d’un nouveau test diagnostique requiert donc la mise au point d’un nouveau "armored RNA"
spécifique.
Au sein de l’unité des Virus Emergents, nous avons mis au point un contrôle interne
permettant de vérifier le bon déroulement de toutes les étapes du processus moléculaire (extraction
des acides nucléiques, RT et PCR).
24
Nous avons choisi d’utiliser un mélange de bactériophages MS2 (ARN) et T4 (ADN). Ils
peuvent être utilisés :
1. pour tous les virus à ARN et à ADN (système "universel")
2. en PCR-tr multiplex avec le virus cible dans le même tube
3. amplifiés par des amorces spécifiques pour éliminer tout risque de compétition avec le
système cible de manière à assurer une sensibilité de détection optimale.
Ce type de contrôle interne est inoffensif pour le manipulateur, facile d’utilisation, absent des
échantillons cliniques et peu coûteux. Les bactériophages sont préparés sous forme lyophilisée et
régénérés dans de l’eau stérile. Ils sont ensuite quantifiés et aliquotés prêts à l’emploi à la
concentration prédéfinie (Ct=30 cycles en référence au test spécifique élaboré, cf. infra) et conservés
dans un congélateur à -80°C. Pour contrôler l’étape de purification des AN, il faut ajouter au
prélèvement, une quantité définie de bactériophages ; 10 µL d'un mélange de bactériophages T4 et
MS2 sont ajoutés à 200 µL de prélèvement clinique. Les génomes des bactériophages MS2 (ARN) et
T4 (ADN) sont ensuite co-extraits avec le prélèvement (Figure 12).
Figure 12. Utilisation du témoin interne
10µL d’un mélange de bactériophages T4 et MS2 est ajouté à 200µL de prélèvement. Les génomes
des bactériophages MS2 (ARN) et T4 (ADN) sont co-extraits avec le prélèvement. La détection des
bactériophages se fait dans un tube à part. La PCR T4 valide les PCR recherchant les virus à ADN
(bleu) et la PCR MS2 valide les PCR recherchant les virus à ARN (rouge).
Système détection
virus ARN Xn
Extrait 90µl
PCR-tr
Système détection
bactériophage T4
Système détection
virus ADN X1
Système détection
virus ADN X2
Système détection
bactériophage MS2
Système détection
virus ADN Xn
Système détection
virus ARN X1
Système détection
virus ARN X2
Spiking
(5 µL solution de MS2 + 5 µL solution de T4)
200 µL prélèvement
Extraction
ADN +ARN
25
Pour contrôler les étapes de RT et de PCR, il faut que les bactériophages soient détectés au Ct
attendu (référence). Si les bactériophages sont non ou mal détectés, cela signifie qu’il s’est produit
un problème lors de l’extraction des AN ou lors des étapes de RT ou de PCR. Il peut s’agir :
1. d’une erreur technique au niveau de l’extraction des AN, de la RT ou de la PCR
2. de la présence d’inhibiteurs de la réaction de PCR
Il n’est pas possible de faire la différence entre ces 2 types de problèmes. Nous avons donc décidé
dans le cas d’une mauvaise détection du témoin interne, de diluer les extraits au 1/10 et de les tester à
nouveau. Si le virus recherché est détecté après dilution, le résultat pourra être validé. Par contre, Si
aucun virus n’est détecté après dilution, le résultat ne pourra être validé et sera rendu ininterprétable
(Figure 13). La dilution est une des possibilités, d’autres équipes ont fait le choix de congeler puis
décongeler les prélèvements et de les ré-extraire.
Figure 13. Algorithme utilisé pour la validation des résultats de biologie moléculaire : à gauche
si le Ctφ≤référence, le résultat de la PCR du pathogène recherché sera validé (positif ou négatif). A
droite, si le Ctφ>référence ou le Ctφ est nul, le résultat de la PCR du pathogène recherché pourra être
validé si celui-ci est positif. Par contre si le résultat de la PCR du pathogène recherché est négatif,
l’extrait d’AN sera dilué au 1/10 et retesté. Le résultat sera validé si le pathogène recherché est
détecté, il sera rendu ininterprétable s’il n’est pas détecté.
*REF = reference (Ctφ attendu)
26
Nous avons évalué ce type de contrôle interne sur 8950 échantillons biologiques représentés
par 36 types de prélèvements différents sur lesquels ont été réalisés plus de 45,000 tests de PCR. Ce
témoin interne peut être utilisé en format multiplex, en RT-PCR one step ou two step, comme témoin
d’évaluation de kits d’extraction ou de PCR. Toute la mise au point, l’évaluation et les résultats de
cette étude ont fait l’objet d’un article accepté dans PLoS One, décrit ci-après : « RNA and DNA
bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical virology: a comprehensive study of more
than 45,000 routine PCR tests. »
Ce test a également été utilisé avec des sondes spécifiques T4 et MS2, mais également en
format SYBR Green [28].
Protocole de PCR-tr
Toutes les PCR réalisées au sein de la plate-forme de biologie moléculaire sont réalisées en
temps réel, sur des automates à plaques de 96 puits (Light Cycler 480, Roche ou Stratagène MX-
3005, Agilent) (Figures 14 et 15).
Dans le cas des virus à ARN, il est possible de réaliser :
une reverse-transcription (RT) et une PCR-tr en une seule étape (RT-PCR one step). Les
réactifs de RT et de PCR sont mélangés afin que les deux étapes puissent se faire sans
avoir à ouvrir le tube. Ce protocole est rapide et sensible. Son principal défaut est la
consommation d'une quantité importante d'extrait d'AN.
une RT puis une PCR-tr (RT-PCR two step). Dans ce cas, la RT est effectuée avec des
hexamères "random" (Kit TaqMan Reverse Transcription Reagent, Roche). Le diagnostic
moléculaire des virus à ADN et à ARN peut être fait avec les mêmes réactifs et protocoles
et la technique est très peu gourmande en matériel biologique. Par exemple, avec 200µl
de LCR, il est possible de réaliser 25 RT-PCR two-step contre 5 RT-PCR one step
seulement. Il sera donc possible de détecter un plus grand nombre de virus à ARN avec
une procédure two-step. De plus, le cDNA est plus stable que l’ARN. La conservation du
cDNA est meilleure, ce qui permettra une utilisation ultérieure avec une meilleure
reproductibilité.
27
Sur la plate-forme de biologie moléculaire, la majorité des techniques des tests sont réalisées en RT-
PCR two-step pour des raisons de sensibilité, de coût et d'organisation.
Figure 14. Stratagène MX-3005, Agilent Figure 15. Light Cycler 480, Roche
28
III. Développement de la plate-forme de biologie moléculaire
La mise en place de la plate-forme de biologie moléculaire a fait progresser de manière
considérable le diagnostic du laboratoire de virologie. Cette augmentation a été en partie due à
l’automatisation des techniques moléculaires, à la mise en place de la PCR-tr mais également, au
développement de nouveaux systèmes de détection permettant de rechercher un plus grand nombre
de virus. Une dizaine de systèmes de détection étaient disponibles par technique moléculaire en 2005
contre plus de 95 à ce jour (Tableau 3).
Tableau 3. Systèmes de détection disponible dans la base de données
Adenovirus 14 Rev Influenza A virus Parvovirus B19
Adenovirus A (typage) Influenza A virus (A/H1N1v) Pneumocoque
Adenovirus B (typage) Influenza A virus (A/H5) POX virus
Adenovirus C (typage) Influenza B virus Promoteur T7
Adenovirus D (typage) Hantavirus Punique virus
Adenovirus Damen Herpes virus 1 (typage) Rage
Adenovirus E (typage) Herpes virus 1+2 Rhinovirus
Adenovirus F (typage) Herpes virus 2 (typage) Rift Valley virus
Adenovirus Heim HHV6 Rotavirus
Alkurma virus HHV8 Rougeole
Astrovirus Japonese Encephalitis virus Rougeole H1 (Typage)
Bacteriophage MS2 JC + BK virus Rougeole N3 (Typage)
Bacteriophage T4 KFD (Kyasanur Forest Disease Virus) Rubella virus
BanaVirus Lassa virus Sandfly fever virus Napples
BK Virus LCMV (Lymphocytic choriomeningitis virus) Sandfly fever virus sicilian
Bocavirus Leptospira interrogans Tick Borne Encephalitis virus
CCHFV (Crimean-Congo haemorrhagic fever virus) Machupo virus (Bolivian hemorrhagic fever) Toscana virus
Chapare virus Marburg virus Usutu virus
Chikungunya virus Massilia virus Varicelle Zona Virus
Coronavirus 229E Mayaro virus Variole
Coronavirus KU1 Neisseria meningitidis VRS A
Coronavirus NL63 Metapneumovirus VRS B
Coronavirus OC43 Mycoplasma pneumoniae West Nile virus
Cytomegalovirus Nipah Virus Yellow Fever virus
Dengue 1 (typage) Norovirus groupe I
Dengue 1, 2, 3 et 4 Norovirus groupe II
Dengue 2 (typage) NOT I
Dengue 3 (typage) O'nyongnyong virus
Dengue 4 (typage) Oreillons
Ebola Sudan virus Oropouche virus
Ebola Zaire virus Para-Influenza Virus type1
Enterovirus Para-Influenza Virus type2
Enterovirus 71 Para-Influenza Virus type3
Epstein-Barr EBV Para-Influenza Virus type4
Flavivirus Parechovirus
29
Depuis la mise en place de cette plate-forme, nous avons été confrontés à l’émergence de
différents pathogènes. Au début de l’année 2006, le virus chikungunya a été responsable d’une
importante épidémie qui a touché plus d’un tiers de la population réunionnaise et qui s’est étendu au
reste de l’océan indien [29]. Au cours de l’été 2007, c’est l’Italie (région Emilia-Romagna) qui
rapporte 249 cas de chikungunya [30]. En février 2009, plusieurs cas de cowpox virus sont identifiés
en France dans plusieurs départements chez des personnes possédant des rats de compagnie achetés
dans des animaleries ayant le même fournisseur tchèque [31]. Il faut noter également les nombreuses
épidémies de Dengue, en Amérique du Sud (Bolivie) et en Afrique de l’Ouest en 2008 [32,33,34] ou
aux Antilles en 2010 et l’émergence des phlébovirus dans le bassin méditerranéen [35]. En Avril
2009, c’est le virus influenza A/H1N1v qui a causé une véritable pandémie à l’échelle mondiale [36].
Ensuite, ont été décrits au printemps et été 2010, un grand nombre de cas de rougeole en France et en
Europe.
Le laboratoire de virologie a du faire face à ces différentes épidémies et à l’apparition de ces
nouveaux pathogènes. Il fallait détecter rapidement les cas d’importation et les cas autochtones.
L’organisation de la plate-forme de biologie moléculaire a permis d'apporter une réponse rapide à
l’émergence de ces différents pathogènes. Les systèmes de détection et les contrôles externes adaptés
au diagnostic de ces différents virus épidémiques ont été choisis, optimisés et évalués afin d’assurer
un diagnostic de masse mis rapidement à disposition des cliniciens.
Le schéma ci-dessous montre l'évolution de l'activité du diagnostic moléculaire du laboratoire
de virologie (hors VIH, VHC et VHB) entre 2000 et 2009. Il s’agit du nombre de résultats de PCR
rendus chaque année, ce qui correspond en réalité en 2009 à environ 60,000 tests de PCR (Figure
16).
Figure 16. Nombre d’échantillons biologiques testés en PCR dans le laboratoire de
virologie de l’hôpital de la Timone entre 2000 et 2009
30
Nous recevons des échantillons biologiques des 4 hôpitaux du CHU de Marseille, mais
également des CHR situés en périphérie de Marseille et de certains établissements de soins privés.
Tous les prélèvements peuvent être testés par biologie moléculaire, nous avons répertorié dans
l’article intitulé « RNA and DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical
virology: a comprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests. », la nature des différents
prélèvements adressés au laboratoire de virologie.
En 2007, deux laboratoires « Point Of Care » ont été mis en place sur des deux sites
stratégiques : une salle du laboratoire de microbiologie de l’hôpital de la Timone et une pièce au sein
des urgences de l’hôpital Nord ont été dédiées au diagnostic d’urgence. Ils fonctionnent 24h/24 et
7j/7 et permettent un diagnostic rapide (30 minutes à 4 heures) dans une approche syndromique avec
notamment le diagnostic moléculaire des méningo-encéphalites virales et bactériennes, des infections
respiratoires bactériennes (coqueluche et à mycoplasma pneumoniae), les détections antigéniques des
infections respiratoires (grippe et bronchiolite à Virus Respiratoire Syncitial), des gastro-entérites à
rotavirus et adénovirus, des tests rapides sérologiques des fièvres au retour des tropiques (paludisme
et dengue) et des accidents d’expositions au sang (VIH). Un panel de 40 tests est disponible dans ces
laboratoires [37].
Mon travail a en grande partie porté sur la mise en place du diagnostic de la grippe A
pandémique dans le laboratoire de routine de virologie et ensuite, dans le cadre d’une stratégie
« POC ». Ce travail nous a permis de réaliser plusieurs publications indexées PubMed dont trois sont
détaillées ci-après : "A simple method for molecular detection of Swine-origin and human-origin
influenza a virus " [28], "Novel virus influenza A (H1N1sw) in South-Eastern France, April-August
2009" [38] et "Point of care strategy for rapid diagnosis of novel A/H1N1 influenza virus" [37].
31
RNA and DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical
virology: a comprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests.
Laetitia NINOVE, Antoine NOUGAIREDE, Celine GAZIN, Ilenia DELOGU,
Christine ZANDOTTI, Remi N. CHARREL, Xavier de LAMBALLERIE.
PLoS One, in press
32
En 2006, il n'existait pas dans la littérature, de contrôle interne permettant de vérifier le bon
déroulement de toutes les étapes du processus moléculaire (extraction des acides nucléiques, RT et
PCR) qui serait utilisable pour tous les virus à ARN et à ADN (système « universel ») en PCR-tr
multiplex avec le virus cible dans le même tube et amplifié par des amorces spécifiques pour
éliminer tout risque de compétition avec le système cible.
Le but de notre étude était de mettre au point un contrôle interne permettant une utilisation
polyvalente (plusieurs virus ciblés) en routine hospitalière dans le diagnostic virologique et
répondant au cahier des charges ci-dessus. Pour contrôler l’étape de lyse (extraction), il faut ajouter à
l’échantillon biologique un témoin ayant la même nature et le même comportement que l’élément
recherché. Il nous fallait donc un virus à ARN ou à ADN, non pathogène pour l’homme et
systématiquement absent des échantillons cliniques. Nous avons choisi d'utiliser des bactériophages,
qui nous semblent réunir ces différentes caractéristiques. Découvert par F. W. Twort (1915), puis par
F. d'Hérelle (1917), qui leur donna ce nom, il s'agit de virus infectant les bactéries. Nous avons
sélectionné deux bactériophages bien caractérisés : le bactériophage T4 (T4) à ADN double brin
circulaire (169Kbp) surmonté d’une capside icosaédrique appartenant à l’ordre Caudovirales, famille
Myoviridae, genre T4-like viruses (Enterobacteria phage T4, NCBI Reference Sequence:
NC_000866) et le bactériophage MS2 (MS2) à ARN simple brin de polarité positive (3569
nucléotides) surmonté d’une capside de symétrie icosaédrique appartenant à la famille Leviviridae,
au genre Levivirus (Enterobacteria phage MS2, NCBI Reference Sequence: NC_001417).
. Nous avons mis au point un système de détection (Taqman) pour chacun des
bactériophages. Pour cela, à partir des séquences génomiques, nous avons choisi deux amorces et
une sonde spécifique pour chacun d’eux. Le couple reporter-quencher utilisé pour MS2 est VIC-
TAMRA, celui utilisé pour T4 est FAM-TAMRA. L’utilisation de deux fluorochromes (VIC et
FAM) permet d’utiliser ces témoins internes en PCR multiplex. Nous avons optimisé d’une part les
quantités d’amorces et de sondes a ajouter au mélange réactionnel de PCR en suivant la procédure
mise en place par Christian Drosten (Bernhard Nocht Institute, Hamburg, Allemagne) et d’autre part,
la quantité optimale de phages qui sera ajoutée à l’échantillon biologique.
Après avoir développé et évalué un système de détection des bactériophages, nous avons
réalisé une étude de faisabilité sur un modèle expérimental. Nous avons validé plusieurs procédures
techniques d’utilisation des phages comme contrôle interne. Les premiers essais ont été effectués sur
des surnageants de cultures cellulaires infectées par du cytomegalovirus (CMV, ADN) ou par de
l’enterovirus (EV, ARN).
33
Nous avons tout d’abord évalué si l’ajout d’un mélange de T4 et de MS2 quantifiés à ces
surnageants de cultures cellulaires infectées modifiait le rendement de l’extraction des AN du CMV
et de l’EV [39,40]. Dans un deuxième temps, nous avons évalué si l’ajout du système de détection de
MS2 ou T4 au mélange réactionnel de PCR contenant le système de détection du CMV ou de l’EV
(format multiplex) modifiait les performances du système de détection de ces derniers. Enfin, nous
avons évalué notre contrôle interne en real time RT-PCR one-step et two-step. Il a été ensuite évalué
sur des échantillons biologiques positifs pour le CMV et l’EV en real time (RT)-PCR two-step en
format multiplex.
Une fois ce contrôle interne optimisé et évalué avec le CMV et l’EV, nous avons testé son
efficacité et évalué l’intérêt pratique de cette méthode sur les virus ADN et ARN recherchés en
routine dans le laboratoire de virologie de la Timone de Marseille. Entre Janvier 2007 et Mai 2008,
le contrôle interne MS2-T4 a été ajouté à 8950 prélèvements cliniques : 7937 ont été testés pour
rechercher des virus à ADN seulement, 337 pour rechercher des virus à ARN seulement et 1216 pour
rechercher les deux, ce qui correspond au total à plus de 45,000 résultats transmis aux cliniciens.
Pour la mise au point et la validation des procédures techniques, notre contrôle interne a été
utilisé en format multiplex c'est-à-dire détecté dans le même tube que le virus ciblé. Par contre dans
cette application en routine, la détection du contrôle interne n’a pas été faite en format multiplex. En
effet, sur chaque échantillon biologique, ont été pratiqués :
(i) des réactions de PCR ciblant un ou plusieurs virus ADN et/ou ARN suivant les prescriptions
médicales
(ii) une réaction de PCR ciblant le phage T4 ou MS2 dans un tube distinct (MS2 si la recherche
d’un virus à ARN était prescrite, T4 si la recherche d’un virus à ADN était prescrite).
Les résultats ont été interprétés de la manière suivante:
Lors de la mise au point, la quantité de phage MS2 et T4 ajouté au prélèvement a été
optimisée, les Ct du MS2 et du T4 étaient donc connus (référence).
Si la détection du phage est normale (Ctφ ≤ référence), le résultat du virus ciblé peut être
validé. Si la détection du phage est anormale (Ctφ > référence) ou nulle et si le résultat de la
PCR du virus ciblé est négative, ce dernier ne peut pas être validé.
34
Une détection anormale est définie par un (Ct > Ct moyen de la manipulation + 1 SD). Dans
ce cas, l’extrait est dilué au dixième et les PCR du phage et des virus recherchés sont à
nouveau pratiquées. Si la PCR des virus recherchés est positive, le résultat peut être validé.
Par contre, si elle est négative, le résultat ne peut pas être validé et sera rendu ininterprétable.
Dans le cas de techniques moléculaires quantitatives, si la détection du phage est anormale
(Ctφ > référence) ou nulle, quel que soit le résultat de la PCR des virus ciblés, l’extrait ne
peut pas être dilué et le résultat ne peut être rendu sous une forme quantifiée.
Dans cette étude, 36 types d’échantillons cliniques ont été testés et tous comportent des
inhibiteurs de PCR. Moins de 10% des liquides pleuraux, crachats, écouvillons pharyngés ou
génitaux, ganglions et placentas, 10 à 30% des sangs totaux prélevés sur EDTA, leucocytes, sérums,
biopsies, liquides péricardiques et aspirations bronchiques, 30 à 50% des plasmas, liquides broncho-
alvéolaires et des selles et plus de 50% des sangs héparinés et des moelles osseuses présentent des
inhibiteurs de PCR. Nous avons constaté que les échantillons stockés à -80°C avant l’étape
d’extraction, avaient tous un pourcentage d’inhibiteurs de PCR inférieur à 30% quelle que soit la
nature des prélèvements.
Plusieurs autres équipes ont utilisé des systèmes de contrôle interne basés sur un
bactériophage pour la détection de virus par PCR-tr sur des sérums [41], du LCR [42] et des
selles[43]. Dans ces trois études, les tests n’ont été réalisés que sur des échantillons positifs mais
n’ont pas été évalués sur de grandes séries d’échantillons cliniques en routine hospitalière. Notre
étude confirme que la performance des tests de biologie moléculaire domestiques peut être améliorée
par l’utilisation de notre contrôle interne sur une grande variété d’échantillons et sur un large éventail
de virus ADN et ARN et de méthodes de détection (PCR, RT-PCR "one-step" et "two-step"). Notre
contrôle a été également adapté au test de PCR-tr SYBR Green [28]. Le bénéfice principal attendu
est l'identification d'échantillons pour lesquels la détection du phage est anormale. Ceci témoigne
d'un problème dans le processus de détection moléculaire: problèmes techniques (pipetage,
extraction) ou de la présence d’inhibiteurs de PCR. Notre système est donc en priorité dédié à la
détection de possibles faux-négatifs.
Depuis 2007, nous avons également mis en place au laboratoire de virologie, un système de
témoins positifs externes synthétiques ADN ou ARN, distinguables des séquences naturelles ciblées
(cf. détails dans la section précédente et dans les annexes de notre article dans PloS One).
35
A simple method for molecular detection of Swine-origin and human-origin
influenza a virus.
Ninove L, Gazin C, Gould EA, Nougairede A, Flahault A, Charrel RN,
Zandotti C, de Lamballerie X.
Vector Borne Zoonotic Dis. 2010 Apr; 10(3):237-40.
36
En Avril 2009, l’Organisation Mondiale de la Santé a déclaré qu’un nouveau influenza A
virus, se propageait rapidement et constituait un risque pandémique pour la population mondiale. En
Mars 2009, un nouveau variant influenza A/H1N1 virus avait déjà causé des cas sporadiques de
syndrome respiratoire fébrile en Amérique du Nord [44] et au Mexique [45]. Il s’est ensuite propagé
très rapidement d’homme en homme à tous les continents. Il a rapidement été identifié comme
influenza A/H1N1 virus 2009 (H1N1 2009) issu d’un triple réassortant porcin d’origine nord
américaine et d’un influenza A virus porcin d’origine eurasienne [36,46]. Il s’agit donc d’un
quadruple réassortant contenant des gènes d’origine aviaire (PA, PB2), humain (PB1) et de deux
lignages porcins [36].
Le laboratoire de virologie de la fédération de microbiologie de l’hôpital de la Timone à
Marseille a été le centre de diagnostic de la zone de défense SUD en France (8 millions d’habitants),
durant les six premiers mois de la pandémie grippale.
Dès les premiers cas décrits au Mexique et aux Etats-Unis, notre laboratoire a du en
urgence mettre en place le diagnostic du nouveau variant influenza A/H1N1 (A/H1N1v).
La plupart des tests disponibles pour la détection de influenza A virus étaient dirigés contre les virus
saisonniers H3N2 ou H1N1 mais pas contre les souches aviaires ou porcines rarement rencontrées
chez l’homme. Depuis les cas de grippe aviaire H5N1 chez l’homme, plusieurs équipes ont
développé des tests de PCR-tr permettant de détecter différents sous-types de influenza A virus [47].
Depuis 2002, nous utilisons au laboratoire le système mis au point par Van Elden et al. [48] pour le
diagnostic moléculaire de routine. Les amorces (INFA-1 et INFA-23) amplifient un fragment du
gène de la matrice de 189 nucléotides. Ce test nous permettait de détecter les sous-types H1N1 et
H3N2 saisonniers. Cependant, le gène de la matrice de A/H1N1v d’origine porcine montre une
divergence nucléotidique d’environ 13% avec les souches humaines H3N2 et H1N1 qui circulaient.
En particulier, la région choisie par Van Elden et al. pour l’hybridation de la sonde comportait 4
nucléotides divergents pour les souches pandémiques, ce qui suggérait que cette sonde ne permettrait
pas une détection efficace des souches de A/H1N1v.
Nous décrivons ici, d’une part la mise au point d’un test SYBR Green utilisant les amorces du
système de Van Elden et al. et d’autre part, le choix d’une sonde spécifique pour la détection
spécifique du virus pandémique.
Le test SYBR Green a été évalué avec les amorces INFA-1 et INFA-23 sur une gamme de
dilution du contrôle externe synthétique que nous avons développé pour le diagnostic de la grippe A
(Ninove et al., PLoS One, in press). L’interprétation du test SYBR Green est basée sur l’analyse de
la température de dissociation des amplicons qui sera différente s’il s’agit d’un virus influenza A
saisonnier (Tm=79,5°C) ou influenza A/H1N1v (Tm=81°C).
37
Ensuite, les alignements de séquence du gène de la matrice des souches de A/H1N1v nous
ont permis de designer une sonde spécifique du virus pandémique.
Une fois, les deux tests optimisés, le diagnostic de la grippe A a été mis en place en routine
24h/24 dans le laboratoire de virologie. Notre témoin interne a été ajouté à chaque écouvillon nasal
ou aspiration naso-pharyngée adressés au laboratoire de virologie pour suspicion de grippe (Ninove
et al., PLoS One, in press). Pour chaque échantillon clinique, un test SYBR Green, une RT- PCR
"one-step" utilisant la sonde spécifique de A/H1N1v et les amorces INFA-1 et INFA-23 et une RT-
PCR "one-step" ciblant le bactériophage MS2 ont été pratiqués. Le test SYBR Green est simple, peu
coûteux et très efficace pour le dépistage de la grippe A. Les échantillons positifs en grippe A avec le
test SYBR Green doivent être secondairement testés en RT-PCR avec les même amorces et les
sondes dessinées par Van Elden et al. et nous même pour discriminer entre une grippe A saisonnière
et une grippe A pandémique à influenza A/H1N1v. Il faut noter que le séquençage des produits de
PCR du test SYBR Green permet de manière générale une excellente identification de la souche
(sous typage, identification du variant pandémique).
Enfin, les alignements des séquences encadrées par les amorces du système de Van Elden
et al. de souches humaines, porcines, aviaires et de diverses origines montrent que ces amorces
permettent de détecter les souches de grippe A saisonnière, une grande partie de souches porcines
mais qu’il existe d’importantes modifications au niveau de l’extrémité 3’ des amorces limitant la
détection de certaines souches aviaires. Nous avons donc modifié partiellement la séquence des
amorces INFA-1 et INFA-23 de manière à être capable de détecter correctement les souches aviaires
(panINFA-1 et panINFA-23).
Nous avons donc développé au sein de la plate-forme de biologie moléculaire plusieurs
tests optimisés et évalués pour le diagnostic de la grippe A.
Le test SYBR Green mis au point au cours de ce travail a été utilisé au cours des deux
premières vagues de la pandémie. Il s'est révélé d'une robustesse remarquable et a constitué une
référence rassurante dans une période où le système proposé à l'échelon national (système Taqman
dans le gène H1) était associé à un certain nombre de résultats faux négatifs. Mais ce système a
également été transféré et utilisé dans des laboratoires partenaires des pays du Sud (Laos, Bolivie) où
il a permis une détection efficace et très peu coûteuse des souches saisonnières et pandémiques du
virus de la grippe A ainsi que des virus de la grippe B (en multiplex SYBR Green) avec un témoin
interne MS2 SYBR Green.
38
Novel virus influenza A (H1N1sw) in South-Eastern France, April-August 2009.
Nougairède A*, Ninove L*, Zandotti C, Salez N, Mantey K, Resseguier N, Gazin
C, Raoult D, Charrel RN, de Lamballerie X.
* Contribution équivalente
PLoS One. 2010 Feb 17;5(2)
39
Le diagnostic de la grippe A a été mis en place au sein de la plate-forme de biologie
moléculaire du laboratoire de virologie de la fédération de microbiologie dès le début de la pandémie
en Avril 2009. Cette étude présente des résultats obtenus sur des échantillons cliniques reçus entre
Avril et Aout 2009 (1815 échantillons reçus).
Entre le mois d’Avril et mi-juillet 2009 (280 échantillons testés), la recherche du virus
influenza A/H1N1v était réalisée chez les patients présentant un syndrome grippal associé à un
syndrome respiratoire aigu et ayant soit voyagé dans une zone géographique touchée par la pandémie
soit eu un contact avec un cas suspect ou confirmé de grippe A/H1N1. A partir de mi-juillet, les
critères utilisés pour le diagnostic de la grippe A ont été modifiés. La confirmation biologique des
cas suspects n’était plus systématique et un grand nombre de personnes avec un syndrome grippal
n’ayant pas voyagé ou n’ayant pas eu de contact avec des cas documentés ont été testés (cas groupés,
présentations cliniques sévères ou atypiques, personnes à risque).
Nous rapportons ici, une évaluation de notre test de détection rapide de la grippe A par
technique immunochromatographique, l’investigation de cas groupés dans un camp de vacances, la
distribution des anticorps spécifiques de influenza A/H1N1v au sein de différentes tranches d’âge
chez 600 individus, l’analyse des séquences en acides aminés de l’hémagglutinine et de la
neuraminidase des souches disponibles sur la database NCBI et enfin, la détection d’autres virus
respiratoires au cours des quatre premiers mois de la pandémie.
Chaque écouvillon nasal a été "spiké" avec notre contrôle interne (Ninove et al., PLoS One,
in press). Tous les échantillons ont été testés avec le test SYBR Green pan-influenza A [28], un test
de PCR-tr spécifique du nouveau variant H1N1 mis au point par le centre national de référence [49]
et un autre ciblant le bactériophage MS2 (Ninove et al., PLoS One, in press).
A propos des échantillons testés durant les quatre premiers mois de la pandémie, les plus
forts taux de diagnostic de H1N1v ont été observés dans le groupe des 10-19 ans et 50% des
diagnostics positifs ont été retrouvés chez les moins de 20 ans alors que très peu de cas ont été
détectés chez les plus de 60 ans. L’analyse statistique montre que le nombre de cas de grippe
A/H1N1v est significativement plus bas chez les patients de plus de 40 ans. Une distribution
similaire a été montrée avec la grippe saisonnière H1N1 mais différente avec la grippe saisonnière
H3N2 qui touche plus de personnes âgées [50]. La proportion de cas de grippe A saisonnière H3N2
diminue durant la période de l’étude mais le nombre absolu de cas observé chaque semaine reste
constant, ce qui suggère que le virus influenza A/H3N2 a circulé à des taux bas durant l’été,
phénomène jamais observé précédemment.
40
L’analyse des résultats des tests rapides immunochromatographiques détectant la grippe A
et la grippe B (Directigen «BD EZ A+B», Becton Dickinson & company) a montré qu’aucun faux
positif n’a été identifié (spécificité et VPP = 100%) alors que des faux négatifs ont été détectés.
L’analyse de 233 échantillons testés en parallèle avec le test rapide et le test de PCR-tr a montré une
sensibilité optimale du test rapide chez les moins de 15 ans (75%) et plus faible chez les plus de 45
ans (25%). Les échantillons avec une charge virale élevée (>10 millions de copies/mL) étaient
toujours détectés avec un test rapide. La sensibilité du test rapide diminuait avec la charge virale et se
négativait pour des charges virales <0,11 millions de copies. En conclusion, ces résultats
confirmaient que les enfants avaient une excrétion virale plus prononcée [51,52], mais également que
l'utilisation des tests rapides disponibles pouvait être justifiée. Ces résultats nous ont amené, en
période de pic épidémique à tester en systématique tous les prélèvements avec le test rapide
immunochromatographique: les résultats positifs étaient validés et rendus aux cliniciens dans l’heure
qui suivait le prélèvement alors que les échantillons négatifs étaient secondairement testés par les
techniques de biologie moléculaires [28,49]. En ce qui concerne le coût, lorsque la prévalence de la
grippe est supérieure à 60%, la stratégie associant un test rapide immunochromatographique à un test
de PCR en temps réel pour tous les négatifs, est plus attractive que l’utilisation de tests moléculaires
seuls effectués sur tous les échantillons.
En juillet 2009, un groupe de cas dans un camp de vacances de Barcelonnette (Alpes-de-
Haute-Provence) a été investigué. Les 94 enfants étaient arrivés dans le camp le 20 juillet et étaient
encadrés par 28 adultes. Un écouvillon nasal a été prélevé chez 95% des personnes symptomatiques
et chez 85% des cas asymptomatiques. A J8 du cas index, 31 cas de grippe ont été rapportés. L’alerte
a été donnée et des mesures d’isolement des personnes symptomatiques ont été mises en place ce qui
a permis le déclin rapide de l’épidémie. Le taux d’attaque chez les enfants et les adultes était
comparable (38% et 37,5% respectivement). Parmi les prélèvements réalisés chez les personnes
asymptomatiques, 10,4% se sont révélés positifs en PCR temps réel pour le virus influenza
A/H1N1v : 2 ont développé par la suite une grippe, 3 une forme atypique et 2 sont restés
asymptomatiques.
L’analyse par inhibition de l’hémagglutination des anticorps dirigés contre le nouveau
variant H1N1 sur des sérums prélevés entre janvier et mars 2009 (avant la pandémie) chez des
patients appartenant à différentes tranches d’âge montre que la prévalence des différents titres
d’anticorps est significativement plus faible chez les personnes de moins de 40 ans.
41
L’analyse des séquences en acides aminés du gène de la neuramidase de 2 souches isolées
au laboratoire de virologie sur cellules MDCK en avril (premier cas isolé au laboratoire) et en juillet
(cas autochtone), montre des mutations non-synonymes avec notamment V106I et N248D. Lorsqu’a
été réalisé au mois d’octobre l’alignement de séquences en acides aminés du gène de la
neuraminidase de toutes les souches déposées dans la database NCBI, nous avons constaté une
séquence d'apparition spécifique des variants de la neuraminidase : les variants VN apparaissent dans
les souches les plus anciennes, puis des souches VD et IN et enfin un large groupe ID.
Enfin, nous avons développé au sein de la plateforme de biologie moléculaire, le diagnostic des virus
respiratoires. Nous avons sélectionné des amorces et des sondes nous permettant la détection de 18
virus respiratoires. Pour chaque système, nous avons optimisé et évalué un protocole de PCR-tr
(hormis la grippe C) et préparé les témoins positifs synthétiques correspondant à chaque pathogène.
Nous avons testé dans le cadre de la pandémie grippale, les 99 premiers échantillons cliniques
prélevés chez des patients présentant un syndrome grippal et ayant voyagé ou eu un contact avec une
personne ayant voyagé dans un pays touché par la pandémie. Nous avons montré que dans 41% des
cas, une étiologie virale a été identifiée : dans 15% des cas, une grippe A/H1N1 a été isolée et dans
26% des cas, un influenza virus H3N2, un rhinovirus, un métapneumovirus, un coronavirus, un
entérovirus, un polyomavirus ou un parainfluenzavirus ont été détectés. Aucune co-infection entre le
virus influenza A/H1N1v et un autre pathogène n’a été mise en évidence.
La mise en place au sein de la plate-forme de biologie moléculaire du test de détection de la
grippe A nous a permis de faire un diagnostic précoce dés le début de la pandémie grippale à H1N1v.
Les résultats obtenus les 4 premiers mois de la pandémie nous ont permis d’évaluer l’épidémiologie
du nouveau variant H1N1, mais également de la grippe saisonnière et des autres pathogènes
respiratoires au cours de la période printanière et estivale. La mise en évidence de grippe A
saisonnière H3N2 dans notre laboratoire au cours de cette période suggère que le virus influenza A
circule régulièrement tout au long de l’année. Il n’avait jamais été détecté auparavant par notre
laboratoire, probablement parce qu’il n’est pas recherché par nos systèmes standards de surveillance
durant la période estivale. Il peut être noté que nous avons également isolé 2 grippes A saisonnières
H3N2 chez des patients ayant voyagé en Angleterre et aux Etats-Unis, pays se situant comme la
France dans l’hémisphère Nord. Parmi les caractéristiques complexes de la circulation des virus
influenza, il faut donc inclure la présence de la grippe saisonnière au cours du printemps et de l’été,
bien évidemment dans l’hémisphère sud mais également à de faibles taux dans l’hémisphère Nord.
42
Les techniques de biologie moléculaires nous ont également permis de séquencer le
génome complet des différentes souches que nous avons isolées grâce à 46 systèmes de PCR
classique et de constater notamment dans le gène de la neuraminidase l’émergence de clones I106
D248
et le déclin des souches V106
N248
. À notre connaissance, ce phénomène n'a pas été associée à ce jour
avec un changement dans l'épidémiologie ou la présentation clinique de l'infection virale, mais
mérite certainement un suivi attentif au cours des prochains mois.
43
Point of care strategy for rapid diagnosis of novel A/H1N1 influenza virus.
Nougairede A, Ninove L, Zandotti C, de Lamballerie X, Gazin C, Drancourt M,
La Scola B, Raoult D, Charrel RN.
PLoS One. 2010 Feb 17;5(2)
44
Quelques mois après l'émergence du nouveau virus pandémique de la grippe A/H1N1
(A/H1N1v), le dépistage systématique de la grippe A/H1N1v a été abandonné en France. Le 7 Juillet
2009 il a été remplacé par les systèmes de réseaux de surveillance (Groupes Régionaux
d'Observation de la Grippe et Réseau Sentinelles) qui ont estimé le nombre de cas grippés dans
certaines populations notamment les populations à risque plus élevé de morbidité ou de mortalité
[49]. La suppression du diagnostic biologique des cas suspects a rendu plus difficile l'évaluation de
l’évolution de la pandémie en France. Les chiffres variaient de 28.000 à 130.000 cas hebdomadaires
pendant la même période en fonction de la source de données (Groupes Régionaux d'Observation de
la Grippe vs Réseau Sentinelles, France). Les données recueillies au début de la pandémie en Europe
indiquaient que la valeur prédictive positive (VPP) de l’examen clinique par les médecins
généralistes ou les spécialistes des maladies infectieuses se situaient entre 8 et 25% [49,53,54]. À la
fin de Juin 2009, nous avons mis en œuvre, pour les hôpitaux publics de Marseille, une stratégie
"Point Of Care" (POC) pour le diagnostic rapide du virus de la grippe A/H1N1v, afin de maintenir
une surveillance et d'évaluer localement la cinétique de la pandémie. Nous décrivons ici
l’organisation et les résultats obtenus dans nos deux laboratoires "POC". Les 2 laboratoires "POC"
sont ouverts 24h/24 et 7j/7, et pratiquent un grand nombre d’analyses orientées par syndromes
cliniques avec notamment les infections respiratoires, les gastro-entérites, les méningites, les fièvres
au retour de tropique, etc. (table 1). Les deux laboratoires sont situés à environ 10 km l’un de l’autre,
l’un dans le service des urgences du CHU Nord et l’autre dans le laboratoire de virologie de la
fédération de microbiologie, de manière à réduire les délais de transport des prélèvements et de rendu
des résultats au clinicien prescripteur. Certains paramètres sont contrôlés par le laboratoire de
virologie de routine au sein du CHU la Timone.
Dès que les cas secondaires de grippe A/H1N1v ont été documentés, nous avons installé les
tests de détection dans les laboratoires POC de manière à obtenir un diagnostic rapide et d’étudier les
niveaux et les variations de la circulation du virus. Les laboratoires POC ont été adaptés au niveau de
sécurité recommandé pour le diagnostic de la grippe et 2 tests ont été réalisés : un test
immunochromatographique rapide détectant les grippes A et B (Directigen «BD EZ A+B», Becton
Dickinson & company), un test de PCR-tr réalisé sur SmartCycler permettant la détection spécifique
du virus influenza A/H1N1v (système du centre national de référence des virus influenza, [49],
associé à notre témoin interne MS2, (Ninove et al., PLoS One, in press)).
45
Le coût nécessaire à l’installation de l’extraction d’AN et du test de PCR-tr a été évalué à
110.000 euros pour l’équipement et à 19 euros par échantillon. En théorie, un maximum de 36
échantillons par jour pouvait être analysé au sein des laboratoires POC. En réalité, les laboratoires on
été saturés au-delà de 20 à 25 échantillons par jour. Cet écart est du en partie au fait que les
échantillons à tester arrivent dans le laboratoire POC de manière discontinue sur les 24h et que
d’autres analyses microbiologiques sont effectuées dans les 24h par le seul opérateur présent.
Entre fin juin et fin septembre, le nombre d’échantillon reçu a considérablement augmenté, est passé
de 30 à 40 prélèvements par semaine au début, puis à plus de 150 prélèvements de mi-août à début
septembre et enfin à plus de 250 prélèvements, les 3 dernières semaines de septembre. Devant une
telle augmentation de demande, nous avons stoppé le test de PCR-tr au POC, fin août mais l’étape
d’extraction des AN et le test immunochromatographique ont été maintenus. Les tests de PCR en
temps réel étaient réalisés 2 fois par jour au sein du laboratoire de routine [38].
Les sensibilités du test immunochromatographique et du test de PCR-tr du "POC" étaient
de 57.7% et de 84.6%, respectivement. Les résultats du test immunochromatographique étaient
rendus en moins de 2h et ceux du test de PCR en 4 à 7 heures. Pour les échantillons qui n’ont été
testés qu’en laboratoire de routine, une extraction des AN continue au POC a permis un rendu de
résultats en 10 à 24 heures.
L'utilité de la stratégie « POC » dans le contexte de la pandémie A/H1N1v démontre que ce
type de laboratoire pourrait être utile au sein des hôpitaux, non seulement pour les situations
d'urgence, mais aussi comme outil quotidien pour améliorer la qualité des soins, réduire les durées
d’hospitalisation comme démontré précédemment [55,56].
Notre expérience montre que la mise en œuvre d'un laboratoire POC réduit dans tous les cas
les délais de rendu des résultats, même si les techniques moléculaires ne sont pas effectués au sein
même du POC. Même si la sensibilité des tests POC est généralement inférieure à celle des tests de
routine, leur VPP élevée permet de prendre des décisions cliniques plus rapidement que dans le
diagnostic standard. Dans le cas de la grippe, l’approche basée sur le dépistage systématique a été
rapportée comme plus efficace que les méthodes passives (diagnostic clinique) qui produisent des
données sous-estimées, puisqu’elles ne permettent pas de tenir compte du rôle de la grippe comme
facteur de co-morbidité chez les patients ayant des pathologies sous-jacentes comme les maladies
cardiovasculaires, l'hypertension chronique, les maladies pulmonaires et les troubles endocriniens
[57].
46
Enfin, une meilleure connaissance de l'écologie et de la saisonnalité des micro-organismes
responsables d’infections respiratoires doit contribuer à déterminer le groupe d'agents qui doit être
testés au sein du « POC ». A titre d'exemple, 34% des cas suspects étaient positifs pendant la période
incriminée pour le rhinovirus ce qui devrait théoriquement justifier le dépistage de ces virus dans le
cadre du « POC » [58].
47
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
48
Longtemps considérée comme une discipline difficile dans le domaine du diagnostic, en
raison des délais importants de réalisation des tests, la virologie est devenue désormais une discipline
adaptée au diagnostic de la routine médicale, en grande partie grâce au développement des
techniques moléculaires et tout spécialement des PCR dites en temps réel.
Notre activité au sein du laboratoire de virologie de l'AP-HM de l'UMR190 nous a permis de
mettre progressivement en place une plateforme de diagnostic moléculaire permettant
(i) la détection d'un grand nombre de pathogènes: plus de quatre-vingt
(ii) la réalisation des tests dans un format à haut débit: environ 40000 tests par an
(iii) la mise en place de procédures standardisées pour l'évaluation, la préparation et la
réalisation des tests moléculaires. Il ne s'agit nullement ici de procédures de recherche, mais de
l'application pratique d'un ensemble de travaux scientifiques à l'optimisation du diagnostic médical
de routine pour les agents pathogènes ne disposant pas d'un diagnostic par kits et automates dédiés.
Les apports les plus significatifs nous semblent être:
- la mise en place d'un système de témoins internes basés sur l'utilisation de bactériophages.
Cette procédure simple et peut couteuse (de l'ordre de 0.1 euros par tube) permet de détecter toute
fluctuation de qualité générale et toute défaillance technique des automates d'extraction ou
d'amplification, mais également d'éviter de rendre négatifs des échantillons techniquement non
interprétables. Il ne s'agit pas d'un point de détail, particulièrement dans le cas de certains
échantillons biologiques pour lesquels la présence d'inhibiteurs d'amplification est extrêmement
fréquente. Ce système pourra dans l'avenir se révéler d'une grande utilité pour évaluer les
performances de nouvelles procédures d'extraction ou amplification des acides nucléiques. Il a été
transféré à de nombreux autres laboratoires de virologie partenaires (CHU de Caen, de Reims, de
l'hôpital Necker, Centre Christophe Mérieux du Laos, Cenetrop en Bolivie etc..) et a fait l'objet d'une
adaptation pour la réalisation d'un kit par la société Argene.
- la systématisation de l'utilisation de témoins externes spécifiques, synthétiques et quantifiés.
Ceci participe à la maintenance d'un niveau de qualité constant, permet la détection des
contaminations accidentelles et la quantification des séquences cibles. Ces produits ADN ou ARN
ont également été largement distribués et permettent une comparaison aisée des performances inter-
sites.
49
- l'automatisation des procédures d'extraction des acides nucléiques et la pratique d'une
extraction simultanée des ARN et ADN. Elle a largement contribué à la reproductibilité et à la
praticabilité des tests mais nécessite encore une évolution améliorant la traçabilité des échantillons
(les automates actuellement utilisés ne permettent pas l'identification de échantillons testés). Il faut
noter que des différences de performances considérables ont été notées lors de l'évaluation
hospitalière de différents automates et kits d'extraction.
- La mise en place –prudente- des tests dans un format multiplex. Elle permet une économie
réelle de temps et de réactifs. Il est toutefois important de contrôler avec beaucoup de soins que le
multiplexage n'est pas associé à une modification de performance de l'un des tests, ce qui constitue
une procédure délicate, parfois mise à mal par l'expérience ultérieure de la routine.
- La pratique systématique de l'aliquotage des réactifs, sous forme de lots à usage unique. Elle
élimine virtuellement toute contamination liée aux réactifs, et permet de stabiliser durablement les
performances des tests en utilisant pendant de longues périodes des lots réactionnels identiques et
identiquement conservés. Un progrès sensible a été la centralisation de toutes les informations dans
une base de données unique permettant une gestion efficace des stocks et une disponibilité rapide des
réactifs.
Nos contrôles internes et externes et nos systèmes diagnostiques sont progressivement
transférés dans la Collection Européenne de Virus EVA (European Virus Archive) et pourront ainsi
être commercialisés et utilisés par d'autres laboratoires.
La collaboration avec des partenaires dans les pays du Sud (Laos, Mali, Bolivie, Ouganda
etc..) nous a montré que les techniques de PCR en temps réel sont transférables sans difficulté, et
avec des résultats totalement reproductibles, si un environnement procédural comparable est établi
entre les différents sites. Pour assurer cette reproductibilité, nous avons réalisé des séances de
formation spécifique (en France ou sur place) puis transféré des procédures diagnostiques complètes
(incluant nos témoins internes et externes), ainsi que des réactifs. Nous avons successivement
préparé des lots de sondes et amorces qualifiés, puis des plaques pré-distribuées contenant amorces
et sondes, puis des plaques pré-distribuées contenant amorces, sondes et mélange réactionnel de
PCR.
50
C'est ainsi qu'un laboratoire tel que le Cenetrop à Santa-Cruz (Bolivie) a pu passer en
quelques mois de l'absence total de diagnostic moléculaire de la dengue à un statut de Centre de
Référence National, délivrant des résultats de haute qualité et permettant pour la première fois une
totale autonomie du pays pour le suivi épidémiologique de la maladie. De la même manière, l'hôpital
Mahosot de Vientiane (Laos) a mis en place nos procédures de diagnostic moléculaire dans les
méningites et méningo-encéphalites et procédé en 2010 aux premiers traitements par l'aciclovir de
patients infectés par un virus herpès.
Ces expériences concluantes nous ont amené en retour à introduire les plaques pré-distribuées
dans le diagnostic de routine hospitalier ainsi que dans différents programmes collaboratifs inter-
hospitaliers auxquels nous participons. L'avancée est majeure en termes de temps de manipulation,
de reproductibilité et de protection contre les erreurs techniques lors de la réalisation des tests. La
technologie de pré-distribution des amorces et sondes et éventuellement des mélanges réactionnels
de PCR (mais pas de RT-PCR one step) est aujourd'hui robotisée et parfaitement maitrisée en
association avec la congélation à basse température.
Nous avons également mis en place une procédure de lyophilisation qui permet d'envoyer à
température ambiante des mélanges d'amorces et sondes, et même des mélanges réactionnels de
PCR. L'un de nos objectifs est l'introduction de ce type de réactifs dans la routine diagnostique. Il se
heurte encore à des difficultés techniques (instabilité des mélanges réactionnels de RT-PCR one step,
difficulté du contrôle de qualité pour la lyophilisation directe dans les tubes d'amplification) mais
présente des avantages majeurs en termes de conservation, stabilité et praticabilité.
Au total, cette plateforme est au cœur de la capacité du laboratoire de réagir de manière
rapide aux évènements d'émergence en mettant en place rapidement des procédures diagnostiques
standardisées, y compris dans le contexte difficile des laboratoires Point Of Care. Elle nous a permis
en particulier de suivre activement le développement de la pandémie grippale et de produire
efficacement des données scientifiques épidémiologiques ou procédurales dans ce cadre. Nous
envisageons maintenant son utilisation plus large pour une approche diagnostique sur une base
syndromique. Cette évolution aura dans un premier temps la vertu de préciser l'épidémiologie d'un
grand nombre de pathogènes dans des syndromes spécifiques. Nous avons de ce point de vue des
résultats préliminaires intéressants dans l'étude d'une cohorte de méningites et méningo-encéphalites
au Laos (près de 50% d'identifications étiologiques) et dans l'application aux syndromes pseudo-
grippaux.
51
Nous ne doutons pas dans un deuxième temps qu'un transfert s'opérera vers un apport
diagnostique direct au clinicien en fonction du syndrome incriminé. Cette approche syndromique
pourrait à terme s'appliquer au diagnostic Point Of Care après le franchissement de deux étapes
majeures:
(i) la détermination de panels diagnostiques pertinents sur la base d'analyses
épidémiologiques affinées (syndrome, âge, saisonnalité etc..)
(ii) la mise au point de protocoles techniques simplifiés incluant un contrôle de qualité sans
faille.
Le prix de revient et la flexibilité de ces procédures diagnostiques demeurent à ce jour sans
équivalence en comparaison avec les techniques commerciales multiplexées, associées ou non à des
puces oligonucléotidiques.
Une bonne illustration de cette orientation diagnostique est offerte dans notre travail intitulé
"Novel virus influenza A (H1N1sw) in South-Eastern France, April-August 2009" par les résultats
préliminaires sur la circulation des virus respiratoires durant une courte période. Nous avons depuis
poursuivis cette étude sur près de mille prélèvements négatifs pour les virus influenza A chez des
patients présentant un syndrome grippal associé à des signes respiratoires. Les résultats nous ont
permis d’obtenir des données sur la saisonnalité et l’épidémiologie de 19 pathogènes respiratoires
dans différentes tranches d’âge de la population (nourrissons, enfants, adultes et personnes âgées):
influenza B virus, virus respiratoire syncitial A et B, metapneumovirus, enterovirus, rhinovirus, 4
virus parainfluenza (1 à 4), 4 coronavirus (OC43, 229E, NL63 et KU1), adenovirus, bocavirus, 2
polyomavirus (KI et WU) et parechovirus. Ces résultats seront prochainement publiés.
L’analyse de ces résultats nous a poussés à poursuivre la surveillance des virus respiratoires
sur l'ensemble des saisons, afin de mieux préciser les profils épidémiologiques des différents
pathogènes. Ceci sera réalisé:
- sur les patients de l'AP-HM dans le cadre d'un projet PHRC inter-régional et en association
avec la mise en place d'une surveillance syndromique au sein des services d'urgence de l'AP-HM (Dr
D Thiberville, thèse en cours)
52
- sur les patients de la cohorte nationale de foyers CoPanFlu (environ 1500 personnes
constituant un échantillon de ménages représentatif à l'échelon national, et suivis activement pendant
une période de 2 ans) pour laquelle nous assurons la coordination du volet virologique
- au sein d'un projet PHRC national pour lequel une comparaison des technologies
diagnostiques disponibles sera opérée
- au sein d'un programme de surveillance syndromique en collaboration avec les réseaux
sentinelles et l'InVS
- au sein des cohortes internationales du consortium CoPanFlu (Laos, Bolivie, Mali) pour
lesquelles nous centraliserons le matériel biologique et les procédures diagnostiques.
Nous attendons de ces programmes en cours des progrès concrets dans la connaissance des
pathogènes viraux respiratoires circulant dans des écosystèmes différents. Ces informations sont
attendues à plusieurs titres:
- dans les pays du Sud, la connaissance de l'épidémiologie des virus respiratoires est presque
inexistante malgré la présomption de lien épidémiologique avec celle des pneumonies qui constituent
une cause de mortalité épouvantable. Des programmes internationaux se mettent donc en place pour
poser les bases d'une surveillance de ces pathologies et évaluer les possibilités d'intervention
(vaccination, prévention non spécifique, thérapeutique).
- en France, de grands progrès restent à accomplir pour associer les pathogènes potentiels à
des caractéristiques cliniques et épidémiologiques clarifiées (incluant les données de morbidité et
mortalité). Il ne peut par ailleurs être exclu que le couplage de ces études épidémiologiques à la
surveillance syndromique permette la découverte de nouveaux candidats pathogènes.
Le développement du diagnostic des virus respiratoires demeure donc une de nos priorités et
s’intégrera dans nos protocoles nationaux (France métropolitaine et Réunion) et internationaux
(Bolivie, Mali, Sénégal, Laos, Djibouti). Nous aurons l'opportunité de disposer de données de
cohortes de foyers (prélèvements sanguins et respiratoires) et de patients consultant à l'AP-HM, ainsi
que de données épidémiologiques de surveillance syndromique (réseaux sentinelles, urgences de
l'AP-HM). Nous entendons exploiter au mieux cette série convergente d'études pour améliorer notre
connaissance des pathogènes viraux respiratoires, mais également, à terme, offrir un service médical
amélioré aux patients concernés.
53
BIBLIOGRAPHIE
54
1. Vernet G (2004) Molecular diagnostics in virology. J Clin Virol 31: 239-247.
2. Niesters HG (2002) Clinical virology in real time. J Clin Virol 25 Suppl 3: S3-12.
3. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A (2002) Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res 30:
1292-1305.
4. Wittwer CT, Fillmore GC, Garling DJ (1990) Minimizing the time required for DNA
amplification by efficient heat transfer to small samples. Anal Biochem 186: 328-331.
5. Kim DM, Park G, Kim HS, Lee JY, Neupane GP, et al. (2010) Comparison of Conventional,
Nested, and Real-time Quantitative PCR for the Diagnosis of Scrub Typhus. J Clin
Microbiol.
6. Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH (1991) Detection of specific polymerase
chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus
DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A 88: 7276-7280.
7. Meng Q, Wong C, Rangachari A, Tamatsukuri S, Sasaki M, et al. (2001) Automated multiplex
assay system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA, hepatitis C virus RNA,
and human immunodeficiency virus type 1 RNA. J Clin Microbiol 39: 2937-2945.
8. Casas I, Pozo F, Trallero G, Echevarria JM, Tenorio A (1999) Viral diagnosis of neurological
infection by RT multiplex PCR: a search for entero- and herpesviruses in a prospective study.
J Med Virol 57: 145-151.
9. Casas I, Tenorio A, Echevarria JM, Klapper PE, Cleator GM (1997) Detection of enteroviral RNA
and specific DNA of herpesviruses by multiplex genome amplification. J Virol Methods 66:
39-50.
10. Fan J, Henrickson KJ, Savatski LL (1998) Rapid simultaneous diagnosis of infections with
respiratory syncytial viruses A and B, influenza viruses A and B, and human parainfluenza
virus types 1, 2, and 3 by multiplex quantitative reverse transcription-polymerase chain
reaction-enzyme hybridization assay (Hexaplex). Clin Infect Dis 26: 1397-1402.
11. Heredia A, Soriano V, Weiss SH, Bravo R, Vallejo A, et al. (1996) Development of a multiplex
PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of HIV-1, HIV-2, HTLV-I and
HTLV-II. Clin Diagn Virol 7: 85-92.
12. Lazarus P, Caruana S (1996) Typing of common human papilloma virus strains by multiplex
PCR. Anal Biochem 243: 198-201.
13. Drosten C, Weber M, Seifried E, Roth WK (2000) Evaluation of a new PCR assay with
competitive internal control sequence for blood donor screening. Transfusion 40: 718-724.
14. Elenitoba-Johnson KS, Bohling SD, Wittwer CT, King TC (2001) Multiplex PCR by multicolor
fluorimetry and fluorescence melting curve analysis. Nat Med 7: 249-253.
15. Wallace PS (2003) Linkage between the journal and Quality Control Molecular Diagnostics
(QCMD). J Clin Virol 27: 211-212.
16. Lo YM, Mehal WZ, Fleming KA (1988) False-positive results and the polymerase chain
reaction. Lancet 2: 679.
17. Kwok S, Higuchi R (1989) Avoiding false positives with PCR. Nature 339: 237-238.
18. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-
over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: 125-128.
19. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996) Real time quantitative PCR. Genome Res 6:
986-994.
20. Hartman LJ, Coyne SR, Norwood DA (2005) Development of a novel internal positive control
for Taqman based assays. Mol Cell Probes 19: 51-59.
55
21. Rosenstraus M, Wang Z, Chang SY, DeBonville D, Spadoro JP (1998) An internal control for
routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance. J Clin
Microbiol 36: 191-197.
22. Pasloske BL, Walkerpeach CR, Obermoeller RD, Winkler M, DuBois DB (1998) Armored RNA
technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards. J Clin
Microbiol 36: 3590-3594.
23. Donia D, Divizia M, Pana A (2005) Use of armored RNA as a standard to construct a calibration
curve for real-time RT-PCR. J Virol Methods 126: 157-163.
24. Beld M, Minnaar R, Weel J, Sol C, Damen M, et al. (2004) Highly sensitive assay for detection
of enterovirus in clinical specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA
internal control. J Clin Microbiol 42: 3059-3064.
25. Drosten C, Seifried E, Roth WK (2001) TaqMan 5'-nuclease human immunodeficiency virus
type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput
blood donor screening. J Clin Microbiol 39: 4302-4308.
26. Eisler DL, McNabb A, Jorgensen DR, Isaac-Renton JL (2004) Use of an internal positive control
in a multiplex reverse transcription-PCR to detect West Nile virus RNA in mosquito pools. J
Clin Microbiol 42: 841-843.
27. Schwaiger M, Cassinotti P (2003) Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with
internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA. J
Clin Virol 27: 136-145.
28. Ninove L, Gazin C, Gould EA, Nougairede A, Flahault A, et al. (2010) A simple method for
molecular detection of Swine-origin and human-origin influenza a virus. Vector Borne
Zoonotic Dis 10: 237-240.
29. Charrel RN, de Lamballerie X, Raoult D (2007) Chikungunya outbreaks--the globalization of
vectorborne diseases. N Engl J Med 356: 769-771.
30. Rezza G, Nicoletti L, Angelini R, Romi R, Finarelli AC, et al. (2007) Infection with chikungunya
virus in Italy: an outbreak in a temperate region. Lancet 370: 1840-1846.
31. Ninove L, Domart Y, Vervel C, Voinot C, Salez N, et al. (2009) Cowpox virus transmission from
pet rats to humans, France. Emerg Infect Dis 15: 781-784.
32. Gautret P, Simon F, Hervius Askling H, Bouchaud O, Leparc-Goffart I, et al. Dengue type 3
virus infections in European travellers returning from the Comoros and Zanzibar, February-
April 2010. Euro Surveill 15: 19541.
33. Roca Y, Baronti C, Revollo RJ, Cook S, Loayza R, et al. (2009) Molecular epidemiological
analysis of dengue fever in Bolivia from 1998 to 2008. Vector Borne Zoonotic Dis 9: 337-
344.
34. Ninove L, Parola P, Baronti C, De Lamballerie X, Gautret P, et al. (2009) Dengue virus type 3
infection in traveler returning from west Africa. Emerg Infect Dis 15: 1871-1872.
35. Charrel RN, Gallian P, Navarro-Mari JM, Nicoletti L, Papa A, et al. (2005) Emergence of
Toscana virus in Europe. Emerg Infect Dis 11: 1657-1663.
36. Dawood FS, Jain S, Finelli L, Shaw MW, Lindstrom S, et al. (2009) Emergence of a novel
swine-origin influenza A (H1N1) virus in humans. N Engl J Med 360: 2605-2615.
37. Nougairede A, Ninove L, Zandotti C, de Lamballerie X, Gazin C, et al. (2010) Point of care
strategy for rapid diagnosis of novel A/H1N1 influenza virus. PLoS One 5: e9215.
38. Nougairede A, Ninove L, Zandotti C, Salez N, Mantey K, et al. (2010) Novel virus influenza A
(H1N1sw) in South-Eastern France, April-August 2009. PLoS One 5: e9214.
39. Griscelli F, Barrois M, Chauvin S, Lastere S, Bellet D, et al. (2001) Quantification of human
cytomegalovirus DNA in bone marrow transplant recipients by real-time PCR. J Clin
Microbiol 39: 4362-4369.
56
40. Watkins-Riedel T, Woegerbauer M, Hollemann D, Hufnagl P (2002) Rapid diagnosis of
enterovirus infections by real-time PCR on the LightCycler using the TaqMan format. Diagn
Microbiol Infect Dis 42: 99-105.
41. Dreier J, Stormer M, Kleesiek K (2005) Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral
reverse transcription-PCR assays. J Clin Microbiol 43: 4551-4557.
42. Gerriets JE, Greiner TC, Gebhart CL (2008) Implementation of a T4 extraction control for
molecular assays of cerebrospinal fluid and stool specimens. J Mol Diagn 10: 28-32.
43. Rolfe KJ, Parmar S, Mururi D, Wreghitt TG, Jalal H, et al. (2007) An internally controlled, one-
step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol 39:
318-321.
44. (2009) Swine influenza A (H1N1) infection in two children--Southern California, March-April
2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 58: 400-402.
45. (2009) Outbreak of swine-origin influenza A (H1N1) virus infection - Mexico, March-April
2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 58: 467-470.
46. Shinde V, Bridges CB, Uyeki TM, Shu B, Balish A, et al. (2009) Triple-reassortant swine
influenza A (H1) in humans in the United States, 2005-2009. N Engl J Med 360: 2616-2625.
47. Brown IH (2006) Advances in molecular diagnostics for avian influenza. Dev Biol (Basel) 124:
93-97.
48. van Elden LJ, Nijhuis M, Schipper P, Schuurman R, van Loon AM (2001) Simultaneous
detection of influenza viruses A and B using real-time quantitative PCR. J Clin Microbiol 39:
196-200.
49. Levy-Bruhl D, Vaux S (2009) Modified surveillance of influenza A(H1N1)v virus infections in
France. Euro Surveill 14.
50. Khiabanian H, Farrell GM, St George K, Rabadan R (2009) Differences in patient age
distribution between influenza A subtypes. PLoS One 4: e6832.
51. Frank AL, Taber LH, Wells CR, Wells JM, Glezen WP, et al. (1981) Patterns of shedding of
myxoviruses and paramyxoviruses in children. J Infect Dis 144: 433-441.
52. Munoz FM (2002) The impact of influenza in children. Semin Pediatr Infect Dis 13: 72-78.
53. Lytras T, Theocharopoulos G, Tsiodras S, Mentis A, Panagiotopoulos T, et al. (2009) Enhanced
surveillance of influenza A(H1N1)v in Greece during the containment phase. Euro Surveill
14.
54. Rizzo C, Declich S, Bella A, Caporali MG, Lana S, et al. (2009) Enhanced epidemiological
surveillance of influenza A(H1N1)v in Italy. Euro Surveill 14.
55. Woo PC, Chiu SS, Seto WH, Peiris M (1997) Cost-effectiveness of rapid diagnosis of viral
respiratory tract infections in pediatric patients. J Clin Microbiol 35: 1579-1581.
56. Ninove L, Tan C, Nougairede A, Zandotti C, Richet H, et al. (2010) Impact of diagnostic
procedures on patient management and hospitalization cost during the 2000 and 2005
enterovirus epidemics in Marseilles, France. Clin Microbiol Infect 16: 651-656.
57. Hanshaoworakul W, Simmerman JM, Narueponjirakul U, Sanasuttipun W, Shinde V, et al.
(2009) Severe human influenza infections in Thailand: oseltamivir treatment and risk factors
for fatal outcome. PLoS One 4: e6051.
58. Follin P, Lindqvist A, Nystrom K, Lindh M (2009) A variety of respiratory viruses found in
symptomatic travellers returning from countries with ongoing spread of the new influenza
A(H1N1)v virus strain. Euro Surveill 14.
