BIO1540 Laboratoire 2Perméabilité du Globule Rouge

Source: ©Wellcome Images

Objectifs

• Mesurer le taux de pénétration de différentes solutions non-électrolytes à travers la membrane des globules rouges (GR) en utilisant l’hémolyse comme élément de mesure.

• Identifier les facteurs qui affectent la vitesse de pénétration de ces substances à travers la membrane des GR.

• Observer et mesurer des globules rouges (GR) soumis à différentes conditions osmotiques

• Observer le phénomène d’hémolyse à l’échelle microscopique

Partie I: Perméabilité des Globules rouges.

• Vous travaillerez avec une des 2 séries de solutions:

• Série 1: Eau bidistillée (ddH2O), glycérol, éthylène glycol, sucrose et urée.

• Série 2: ddH2O, thiourée, Triton X-100, dextrose et éthanol.

• Concentration des solutions: 0.3MBudget

temps

60 min.

Procédure:

1. Versez le contenu des flasques dans 3 tubes à essai (3x5ml) en utilisant les tubes en plastique comme mesure.

2. Numérotez chacun des tubes à essai (1.1, 1.2 etc…)3. Préparez un morceau de parafilm.4. Ajoutez une goutte de sang sur la paroi du tube à

essai.5. Placez rapidement le morceau de parafilm sur le

tube et inversez UNE FOIS le tube pour homogénéiser (temps=0 à cet instant). Observez en face du carton blanc.

Procédure (suite)

6. Notez le temps d’hémolyse en secondes= temps auquel vous distinguez nettement la ligne tracée sur le carton.

7. Si l’hémolyse est instantanée, notez « <2 » comme résultat (utilisez 2 comme valeur pour les calculs)

8. Si l’ hémolyse ne se produit pas après 5 minutes, examinez le tube toutes les 30 secondes.

9. Si rien ne se passe après 20 minutes, notez « >1200 » secondes (utilisez 1200 pour calculs)

Enregistrez vos données:

• Répétez les mesures pour les 5 solutions• Calculez la moyenne (m) et l’erreur-type (SE)

du temps d’hémolyse pour les 5 solutions• Voir démonstration pour calculer la moyenne

et l’erreur-type en utilisant Excel.

Partie II: GR et solutions salines

• Sortez et mettez en place le microscope composé• Connectez délicatement la caméra du microscope

à composé à l’ordinateur• Connectez VOTRE ordinateur à VOTRE microscope

(pas de fils croisés)• Ouvrez Infinity Capture et prenez une photo-test • Sauvegardez vos images au format JPEG dans le

dossier « My Documents:/BIO1540/BIO1540XX » (XX=votre section)

Partie II: GR et solutions salines

Procédure:• Déposez une petite quantité de sang sur une

lame de microscope (voir démonstration par les TA)

• Ajoutez une petite goutte de la solution de NaCl (n’ajoutez pas trop de liquide)

• Recouvrez d’une lamelle.• Placez le montage sur la platine du

microscope. Budget

temps

50 min.

Procédure (suite)

• Ajustez la mise au point, le condenseur, la luminosité et faites la balance des blancs (voir guide Biolabo)

• Nettoyez la lentille si nécessaire (demandez à votre démo comment)

• Observez la forme et mesurez le diamètre des GR en micromètres (µm) – utilisez l’objectif 40x– Astuce: Pour bien observer la forme des cellules,

ajustez le diaphragme d’ouverture du microscope:• Fermé: plus de contraste, moins de lumière• Ouvert: moins de contraste, plus de lumière et de couleurs Essayez plusieurs ouvertures

Procédure (fin)

• Répétez cette procédure pour les trois solutions de NaCl (0.350M, 0.145M et 0.065M).

• Vos démonstrateurs circuleront pour évaluer vos compétences à prendre des photos. Assurez-vous de:– Ajuster correctement le condenseur et l’intensité

lumineuse– Effectuer la balance des blancs– Sauvegarder vos images dans le bon répertoire et

dans le bon format (JPG)

Mesure du diamètre des cellules

• Ouvrez une de vos images montrant les cellules

• Utilisez la taille du champ de vision de la caméra pour mesurer la taille des cellules.

• Si nécessaire, vous pouvez augmenter le facteur zoom des images en cliquant le bouton droit de la souris.

• N’utilisez pas l’objectif 100x

Évaluation: Rapport

Lisez le fichier d’instructions dans la page du lab2 sur le site web des laboratoires

Contenu du rapport (3 pages total) – à remettre dans une semaine:

1- Page de titre2- Tableau présentant les temps d’hémolyse pour toutes

les solutions testées (moyenne et erreur type)Lisez l’annexe du manuel de laboratoire pour des

instruction sur les tableauxSolution Time standard error

A 12 1B 1 0.3C 3 0.7D 4 1E 5 0.8

NON!

Évaluation: Rapport

3- Répondez aux 2 questions suivantes:1- Quels sont les facteurs qui ont un effet sur la

diffusion des solutés testés aujourd’hui?2- Comment les facteurs cités en (1) influent-ils la

diffusion des solutés?

Max. 1 page (peut être plus court)Les rapports sont des travaux individuels

Attention au plagiatLisez le fichier d’instruction sur le site web des

laboratoires.

Souvenez-vous (note technique!)

• Nettoyez !– Jetez les pipettes et microtubes dans les sacs de déchets biologiques

(rouges).– Jetez les déchets liquides dans les béchers, rincez les tubes avec de

l’eau déionisée (robinet blanc) et déposez-les sur les portes-tubes).– Jetez les lames et lamelles dans le bécher de verre brisé.– Nettoyez la platine du microscope et toutes les surfaces salies.– Nettoyez les surfaces optiques du microscope avec un papier

‘kimwipe’ et un peu d’eau distillée.– Lavez-vous les mains.– N’eteignez pas les ordinateur ni les moniteurs, faites un « Log Off »

uniquement.

• Quiz portant sur le lab3 au début du prochain laboratoire. Arrivez à l’heure.