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Biologie moléculaire des hémopathies lymphoïdes
WE Hémato-bio de l’AIH 23-24 Mai 2014
Cédric PASTORET
AHU Hématologie-Biologie moléculaire
Laboratoire d’Hématologie, Pr FEST
CHU Rennes
Leucémie aigue lymphoblastique – Bilan initial
• Recherche des transcrits de fusions
• Deletion IKZF1 (LAL B)
• Marqueurs oncogénétiques (LAL T)
– Maladie résiduelle
– Perspectives
Lymphomes B matures – Clonalité
– Lymphome folliculaire
– Lymphome du Manteau
– Maladie de Waldenström
Plan
Bilan initial LAL
Myélogramme
Blastes lymphoblastiques Cytochimie Peroxydase –
Phénotypage
Diagnostic
Classification EGIL
Thérapeutique: CD20+ (GRAALL-R)
Suivi (Maladie résiduelle)
Prise en charge des prélèvements SANG MOELLE LIQUIDES
(LCR, Ascite, Pleural)
GANGLION, PEAU
Ficoll ou lyse des GR (Si suspicion de SMP)
Suspension cellulaire de CMF
Fragment
Centrifugation,
Lyse des GR résiduels, Lavage en PBS
Culot cellulaire conservé
à -20°C (ADN) ou -80°C (ARN)
Conservation à -20°C
ou -80°C
ARN ADN
Extraction par le Trizol
Reverse transcription
PCR ou QPCR
Digestion avec la protéinase K et extraction par le NaCl 6M
Extraction par la résine CHELEX si nbre GB < 10.106
PCR
Reverse Transcription
Random hexamer
3’ 5’ ARN
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
Synthèse d’un ADNc complémentaire de l’ARNm
ARN ADNc
Reverse transcriptase
+ Reverse transcriptase + dNTP
+ Random hexamer
Elongation
+ RNase H
ADNc
Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (1)
• RT-PCR – Amplification de l’ADNc par PCR
– Visualisation des produits d’amplification sur gel d’agarose
PCR en point final= Résultat qualitatif
• RT-PCR en temps réel – Quantitation du transcrit
– Détection de fluorescence en cours de réaction
• Utilisation de sondes Taqman
• Agent intercalant Sybrgreen
PCR en point final
PCR en temps réel
quantité
d’ADN
nombre de cycles
Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (2)
dénaturation
hybridation
élongation
Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (3)
• LAL B
– t(12;21) TEL-AML1 25% enfants
– t(4;11) MLL-AF4 3% des enfants, 85% nourrissons <1an, 5% adultes
– t(1;19) E2A-PBX1 20% des LAL pré-B, 3% adultes
– t(9;22) BCR-ABL 3% enfants 40% adultes
Piu et al, Lancet 2008
Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (4)
Recherche de BCR-ABL
Patie
nt 2
Patie
nt
1
Patie
nt
3
K5
62
e1a2
e14a2
e13a2
Tém
oin
+
SD
1
e1a2
Tém
oin
-
Gel agarose 2%
Gabert et al, Leukemia 2003
–Localisation : 7p13
–code le facteur de transcription lymphoïde IKAROS
–Régulateur transcriptionnel précoce de la lignée lymphoïde
–7 exons codants, plusieurs transcrits (11 isoformes)
–Facteur pronostique péjoratif pour les délétions focales
–Suivi de la maladie résiduelle
Mulligan et al, Nature 2008
Délétion d’IKZF1 (1)
CGH-array (Comparative genomic hybridization)
Caye et al, hematologica 2013
Délétion d’IKZF1 (1)
11
Technique MLPA (Multiplex ligation probes assay)
Eijk et al, Methods in Mol Bio, 2011
Sondes gauche et droite spécifiques de la séquence génomique
1. Dénaturation de l’ADN et hybridation des sondes spécifiques
2. Ligation des sondes hybridées
3. PCR avec amorces universelles qui se fixent sur les séquences « amorces PCR» des sondes
4. Analyse de fragments (Migration des produits de PCR par électrophorèse capillaire)
Délétion d’IKZF1 (1)
Délétion d’IKZF1 (1)
Del 4-7 IKZF1
Exo
n 4
Exo
n 5
Exo
n 6
Exo
n 7
Caye et al, hematologica 2013
Délétion d’IKZF1 (1)
Deletion IKZF1
IKZF1 wt
Délétion d’IKZF1 (1)
Trinquard et al, JCO 2013
Marqueurs oncogénétique des LAL T
Maladie résiduelle
Cytométrie en flux
Recherche de marqueurs au diagnostic Abération phénotypique (asynchronisme ou expression aberrante)
Maladie résiduelle
Recherche des blastes identifiés au diagnostic
MRD en biologie moléculaire Ig/TCR (amorces ASO)
– Détermination des réarrangements au diagnostic
– Séquençage des allèles clonaux
– Fabrication d’amorces spécifiques de la région
jonctionnelle du clone du patient (ASO)
– Quantification par RQ-PCR (Taqman)
Maladie résiduelle
Dept. of Immunology, Erasmus MC, Rotterdam
pre-pre-B-cellCyCD79
pro-B-cell(CyCD79)
prothymocyte(CyCD3)
immaturethymocyte
CyCD3(pre-T complex)
commonthymocyte
CyCD3(pre-T complex)
(TCR-CD3)mature thymocyte
(CyCD3)
TCR -CD3
suppressor /cytotoxic T-lymphocyte
TCR -CD3
NK-cell
lymphoidprecursor cell
pre-B-cellCyCD79
pre-B-CyIg
(pre-B SmIg -CD79)
immature B-cellSmlg-CD79
mature B-cellSmlg-CD79
'alternative' T-lymphocyteTCR -CD3
helper / inducerT-lymphocyte
TCR -CD3
mature thymocyte (CyCD3)
TCR -CD3
plasma cellCylg
TCRD genes deleted (in most TCR + cells)
TCRG2 genes rearranged
TCRB genes rearranged: D-J to V-D-J (also in many TCR + cells)
TCRA genes rearranged (in TCR + cells)
TCRD genes rearranged
TCRG1
TdT TdT
(TdT)
(TdT)
TdTTdT
TdT
(TdT)
I IGK genes rearranged (C deleted in most Ig + cells)
IGL genes rearranged (in Ig + cells)
IGH genes rearranged IgH class switch may occur
TdT
Réarrangement des IGH
1 2 3 4 5 6 66 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6
VH DH JH Cs
D J joiningH H
V D -J joiningH H H
precursor mRNAIGH
mature mRNAIGH
transcription
RNA splicingV DJ C
27
IgH
IgL IgL
V V
C C
J J
IgHV V
D D
J J
C C
C
C
C
C
C
C
CD
79a
CD
79b
translation
junctional region
Structure des gènes du TCR
TCRA TCRD and gene complex (#14q11.2)
TCRB gene complex (#7q34)
TCRG gene complex (#7p14)
V 1 V 2 V 3 V 4 V 5 V n V 1 Rec
V 2 D J C
J J C
V 1 V 2 V 3 V 4 V 5 V n D 1 J 1 C 1 D 2 J 2 C 2
12 3 1 24 3
1 23 4 56 71 2 34 5 6
V 3
V 2 V 3 V 4 V 5 V 7 V 10 V 11V 8 V 9 J 1 C 1 J 2 C 2
1 2 3 31
functional V : 46 functional J : 53
functional V : 47
functional V : 6
Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2)
LAL B
IGH : 3 PCR FR1: VH (1-6) JH consensus FR2: VH (1-6) JH consensus FR3: VH (1-6) JH consensus
DHJH : 2 PCR si VH-JH négatif
Ig : 2 PCR Tube A: Vf Jk1-4 + Jk5 Tube B: Vkf Intron Kde
TCR : 2 PCR Tube A : VIf-V10 J1.1/2.3 - J1.3/2.3 Tube B : V9-V11 J1.1/2.3 - J1.3/2.3
TCR : 1 PCR V (1-6)+ D2 J (1-4) + D3
TCR : 3 PCR si <2 marqueurs disponibles
LAL T
DHJH : 2 PCR
TCR : 2 PCR Tube A : VIf-V10 J1.1/2.3 - J1.3/2.3 Tube B : V9-V11 J1.1/2.3 - J1.3/2.3
TCR : 1 PCR V (1-6)+ D2 J (1-4) + D3
TCR : 3 PCR
Van dongen et al, Leukemia 2003
Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2)
Exemple PCR multiples TCR
FAM HEX
Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2)
Vg10Jg1.3/2.3
Vg10Jg1.1/2.1
VgIFJg1.3/2.3
VgIFJg1.1/2.1
VgIFJg1.3/2.3
TCR PCR A
Témoin neg polyclonal
Patient LAL
Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2)
Séquençage
Méthode Sanger
Séquençage
Vg1F
Vg1,3/2,3
Définition de la jonction (IgBLAST, IMGT V-QUEST)
Design de l’amorce
V J TCR
ASO sens reverse sonde
Vg2-Jg1.3/2.3 (0/11/-10)
CGTCTTCAGTACTATGACTCCTACAACTCCAAGGTTGTGTTGGAATCAGGAGTCAGTCCAGGGAAGTATTATACTTACGCA
AGCACAAGGAACAACTTGAGATTGATACTGCGAAATCTAATTGAAAATGACTCTGGGGTCTATTACTGTGCCACCTGGGA
CGGGCCCCCCTAAAGAAGAAACTCTTTGGCAGTGGAACAACACTTGTTGTCACAGGTAAGTATCGGAAGAATACAACAT
TTCCAAGGTAATAGAGGGAAAGCAGGAAATTATTAAACTGGAATAATGTAATAATGTTTAGAAAAAAGAGGAATTGGAT
GGGGATTTGATGTAGAAAAC
Détermination de la MRD : Taqman
• Echantillons – Dilution de l’ADN de diagnostic dans pool de cellules mononuclées de 10
donneurs sains – 10-1 à 10-5 – analyse au moins en duplicate – obtention d’une courbe standard
– ADN témoin négatif – Détermination du bruit de fond
– MRD en triplicate
• Sensibilité – Plus grande dilution présentant un Ct < Ct du bruit de fond -1
• Zone de quantification – zone de la courbe pour laquelle la MRD peut être quantifiée de façon sûre et reproductible
Détermination de la MRD : Taqman
y = -1,4246Ln(x) + 22,94
R2 = 0,9806
0
10
20
30
40
1,E -05 1,E -04 1,E -03 1,E -02 1,E -01 1,E +00
10-1 10-2 10-3
5.10-4
10-4
MRD
LN
MRD positive 3.10-3
MRD1neg
MRD1<10-4
MRD1≥10-4MRD1 ≥ 10-4
ResponseMRD1
ResponseMRD2ornoresponse
Maladie résiduelle MRD1 seuil à 10-4
Maladie résiduelle
LAL B
genetic+/MRD+
genetic-/MRD+
Genetic+/MRD-
Genetic-/MRD-
Standard risk: MLL non réarrangé et IKZF1 non délété et MRD1 < 10-4
High Risk MLL réarrangé ou IKZF1 délété et/ou MRD1 < 10-4
LAL T
genetic+/MRD+
genetic-/MRD+
genetic+/MRD-
genetic-/MRD-
Standard risk: NOTCH et/ou FBXW7 muté MRD1 < 10-4
High Risk NOTCH et FBXW7 non muté et/ou MRD1 < 10-4
Mais encore…
Délétion ERG
E Clappier et al, leukemia 2014,
Délétion de ERG
Leucémie aigue lymphoblastique – Bilan initial
• Recherche des transcrits de fusions
• Deletion IKZF1 (LAL B)
• Marqueurs oncogénétiques (LAL T)
– Maladie résiduelle
– Perspectives
Lymphomes B matures – Clonalité
– Lymphome folliculaire
– Lymphome du Manteau
– Maladie de Waldenström
Plan
• Les lymphomes sont caractérisés par une prolifération clonale de cellules lymphoïdes
• La classification des lymphomes (OMS)
Recherche de réarrangements géniques dans les lymphomes
• Indications
– Suspicion clinique de lymphoprolifération
– Doute sur clonalité en anapath ou en CMF++
– Lymphome T > Lymphome B
– Atteinte cutanée
• Recherche d’un réarrangement clonal du TCR et/ou de la chaîne lourde des Ig (IGH)
– Toute population tumorale est monoclonale mais un clone n’est pas toujours tumoral (clone réactionnel)
• Amplification ADN par PCR, analyse sur gel de polyacrylamide ou en électrophorèse à capillaires
Recherche de clonalité
Recherche de clonalité
IGH polyclonal (JH FAM)
IGH monoclonal (JH FAM)
Recherche de clonalité
BIOMED-2 Concerted Action: BMH4-CT98-3936
Complémentarité des cibles
B-cell IGH IGK IGH T-cell TCRB TCRG TCRB
malignancies VH-JH V-J + IGK malignancies V-J V-J + TCRG
+ DH-JH + Kde + D-J
MCL (~50) 100% 100% 100% T-PLL (~35) 100% 94% 100%
B-CLL (~60) 100% 100% 100% T-LGL (~30) 97% 96% 100%
FCL (~110) 86% 84% 100% PTCL-U (~45) 98% 94% 100%
MZL (~50) 87% 76% 91% AILT (~35) 89% 92% 95%
DLBCL (~110) 83% 75% 91% ALCL (~45) 74% 74% 79%*
TOTAL (~380) 88% 85% 97% TOTAL (~190) 91% 89% 94%*(99%)
* 20% to 25 % of anaplastic large cell lymphomas do not have TCR gene rearrangements (null-ALCL)
BIOMED-2 Summary; JHJM van Krieken et al., submitted
Recherche de clonalité
• Lymphome folliculaire
• CD5- CD10+/- CD44 low
• prolifération des cellules du centre germinatif
• Translocation t(14;18) dans 80% des LNH folliculaires – Chromosome 14 : gène de la chaîne lourde des Ig
– Chromosome 18 : gène bcl2 (antiapoptotique)
Surexpression de l’oncogène Bcl2
• Lymphome B diffus à grandes cellules
• Translocation t(14;18) dans 40% des DLBCL
• Type GC
Réarrangement BCL2-JH
3 régions de cassure
PCR couvre 60% des réarrangements :
- MBR (major breakpoint cluster region) : 40%
- 3’MBR : 9%
- mcr/5’mcr (minor breakpoint cluster region) : 11%
BIOMED
Réarrangement BCL2-JH
• La translocation t(11;14) entraîne une hyperexpression de la cycline D1 qui n’est normalement pas exprimée dans les lymphocytes.
• Utilisable au diagnostic quand l’infiltration tumorale est suffisante (30% de cellules tumorales). Peu sensible.
• Technique de RT-PCR compétitive
coamplification des cyclines D1, D2 et D3
D1 D2 D3
REC1 1 2 3
Mise en évidence d’une hyperexpression de la cycline D1 par RT-PCR compétitive
Blood 2005 106:4315 :
6 cas de lymphomes du manteau typiques
sans hyperexpression de cycline D1 ni t(11;14)
Blood 2008;111:5683 :
8 cas de lymphomes du manteau typiques (histologie et immunophénotypage)
sans t(11;14) :
- 2 expriment la cycline D1 selon un mécanisme indépendant de la t(11;14)
- 2 expriment la cycline D2 et ont une t(2;12)
- 3 expriment la cycline D3 et ont une t(6;14) (translocation retrouvée dans les MM ou autre lymphomes B matures)
- 1 cas sans expression de cycline D
- 2 cas (forme blastoide) ont également une translocation t(2;14), expriment la cycline E et ont une surexpression de MYCN
L’absence d’hyperexpression de la cycline D1 n’exclut pas un diagnostic de lymphome du manteau
Mise en évidence d’une hyperexpression de la cycline D1 par RT-PCR compétitive
Premiers travaux sur LLC : répertoire IGVH non muté
1994 : dans la moitié des cas de LLC, nombre variable de mutations somatiques dans les gènes IGVH
1999 : mutations somatiques dans les gènes IGVH associées à une évolution très différente de la maladie
non mutées
mutées
Hamblin et al, Blood 1999, 94:1848
Analyse du statut mutationnel dans les LLC
- 1 bande/pic unique : séquençage direct
- Plusieurs bandes/pics : purification après excision des bandes du gel
Mw
M
PB
-MN
C
tonsil
IGH tube A V FR1–JH- H
ES
-6
GB
N-1
0
FR
-5
200 -
300 -
400 -
500 -600 -
700 -
800 -
bp 100
200
0
300
100 400300200
100
200
0
300
100 400300200
1500
3000
0
4500
100 400300200
100
200
0
300
100 400300200
100
200
0
300
100 400300200
PB-MNC
tonsil
ES-6
GBN-10
FR-5
310-360 nt
DH JH
J primerHV -FR1 primersH
VH
BIOMED-2 report: Leukemia 2003; 17: 2257-2317
PCR FR1-JH Séquençage dans les 2 sens
VH
JH
Excision et purification des bandes
Séquençage dans les 2 sens
VH
JH
PCR FR1-JH
Analyse des séquences
Analyse des séquences
Analyse du statut mutationnel dans les LLC
Cut-off = 98% homologie
! VH3-21 : mauvais pronostic quelque soit le statut mutationnel
Analyse du statut mutationnel dans les LLC
WM
MZL
MM
CLL
MGUS IgM
MGUS IgG
HD
Real-time AS-PCR
MYD88 L265P et Maladie de Waldenström
Sakata-Yanagimoto et al, Cancer Science 2014
Mais encore…
Yang Cancer Cell 2012; 21:723
Recherche de mutations pour une médecine personnalisée…
DLBCL ABC
Le nouveau meilleur ami des biologistes moléculaires en hématologie
Séquençage haut débit NGS
Merci de votre attention!
