TRAVAUX DIRIGES

BIOLOGIE MOLECULAIRE (HLBI307) L2

2015-16

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Structure des acides nucléiques

1. Hershey et Chase ont démontré que l'ADN était porteur de l'information génétique. Leurs expériences portaient sur le bactériophage T2, composé d'un noyau d'ADN entouré d'une capside protéique. Lors de l'infection, le virus se fixe à la cellule, injecte son matériel génétique mais ne pénètre pas. Afin d'identifier la nature du matériel génétique injecté, les chercheurs ont radiomarqué de manière spécifique les acides nucléiques ou les protéines du virus. Quels radioisotopes et quelles molécules précurseurs radioactives vont-ils utiliser pour marquer l'ADN ou les protéines? Des bactéries sont infectées durant un temps court avec des phages T2 marqués au niveau des protéines ou de l'ADN puis la suspension est fortement agitée afin de détacher le virus de la cellule. Les bactéries sont ensuite séparées des virus. Quelle technique est utilisée pour cette séparation? Le contenu en radioactivité des bactéries et des phages est ensuite mesuré. Donnez le résultat de cette expérience.

2. Structure de l’ADN 1. Analysez le modèle de paires de bases de la figure. Identifiez la position des purines et des pyrimidines,

du sucre et des phosphates. De quelle paire de nucléotides s’agit-il ?

2. Observez la structure des paires de bases AT et GC.

2

a. Indiquez la position de la liaison N- glycosidique b. Indiquez avec un trait la localisation, du grand et du petit sillon, sur la structure. c. Quels sont les atomes présents dans les sillons et susceptibles d’établir des liaisons hydrogènes

avec des protéines?

3. L’analyse de la composition de l’ADN isolé à partir du bactériophage M13 donne comme résultat : 25%A ; 33%T ; 22%C et 20%G. Ce résultat vous semble-t-il cohérent ? Quelles informations vous suggèrent ces résultats sur la structure de cet ADN ? Comment cet ADN peut-il se répliquer ? 4. Pourquoi l'ARN est-il hydrolysé en milieu basique alors que l'ADN ne l'est pas? 5. Après une hydrolyse complète d’une solution d’ARNt, on a pu identifier dans l’hydrolysat : le nucléoside A, le nucléoside diphosphate pGp et des nucléotides Ap, Gp, Cp, Up. Quelles sont les extrémités 5’ et 3’de cet ARNt ? 6. Quelle sera la longueur de la double hélice d'ADN du bactériophage T7 dont la masse molaire est 2,5 107? 7. Calculez le poids d'une double hélice d'ADN étalée entre la terre et la lune (320000 km) sachant que le poids d'une double hélice est de 1.10-18g par 1000 paires de nucléotides et que chaque paire de nucléotides s'étend sur 0,34nm. Comparez la masse obtenue avec le poids total d’ADN du corps humain (0,5 g). 8. Une fibre d'ADN est transférée d'un environnement à forte humidité dans un environnement à faible humidité et passe donc de la forme B à la forme A. Quel est son pourcentage de raccourcissement sachant que dans la forme A le pas de l'hélice n'est plus que de 2,8 nm et couvre une longueur de 11 nucléotides? 9. Qu’est ce qu’une nucléase ? Qu’est-ce qui différencie les endonucléases des exonucléases ?

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Dénaturation et hybridation des acides nucléiques.

1. Quelles sont les liaisons de faible énergie qui stabilisent la structure en double hélice de l’ADN ? 2. L'ADN est extrait de 2 espèces bactériennes distinctes. L'analyse de la composition en bases est la suivante: Espèce 1: A=32%. Espèce 2: A=17%. Les deux échantillons sont chauffés lentement et la densité optique à 260 nm est suivie en parallèle.

-A quelle courbe correspond l'espèce 1? Et l'espèce 2? -Une des deux espèces a été extraite d'une source chaude à 64°C (bactérie thermophile). Identifiez-la et justifiez votre réponse. -L'expérience précédente a été réalisée dans une solution de NaCl= 0,1M. Quel sera le résultat de l'expérience si l'ADN est dissout dans de l'eau? 3. La figure suivante décrit les courbes de dénaturation typiques d'un ADN et d'un ARN. Comment expliquez-vous cette différence de profils?

4. La dénaturation de la double hélice d'ADN est un processus réversible. La renaturation de l'ADN est facilitée par la présence de cations, une température en dessous du Tm et des concentrations élevées en chaque brin d'ADN. Expliquez en quoi ces 3 facteurs facilitent la renaturation. 5. Plusieurs ADN ont été renaturés dans les mêmes conditions expérimentales (température, concentration en sel, concentration en acides nucléiques...). Leurs courbes de renaturation sont présentées ci-dessous. Les tailles des génomes sont directement proportionnelles aux valeurs de Cot1/2 (valeur de Cot pour laquelle 50% de l'ADN est renaturé). Pourquoi? La taille du génome de E. coli étant 4,5 106 pb, quelle est la taille du génome de T4 et de MS-2?

T°

Abs

260nm

ARN:

ADN:

4

6. Soit le brin d’ADN 5’GGATCCGATGGAATTC3’ Parmi les molécules suivantes, quelles sont celles capables de s’hybrider avec ce brin d’ADN pour former une double hélice ? 5’…………TTAGAATTCCATCGGATCCTAG……..3’ (1000 nucléotides) 5’GAAUUCCAUCGGAUCC3’ 5’GGCTAGTTTCCGATATC3’ 7. La drépanocytose est une maladie génétique causée par une mutation ponctuelle au niveau du gène codant pour la E-globine. Cette anomalie peut être diagnostiquée grâce à la technique de dot blot. Elle consiste à fixer sur une membrane l'ADN préalablement dénaturé. La membrane est ensuite incubée en présence d'une courte séquence d'ADN simple brin radioactive, de séquence complémentaire au gène sauvage (dans la zone de la mutation). Quelles sont les conditions de température (sans faire de calculs) dans lesquelles devra se faire l'expérience d'hybridation afin que seul l'allèle sauvage soit détecté.

7. Soit la séquence d’ADN:

Identifiez des sites de restriction en précisant le principe qui guide la recherche. 8. Soit un fragment d'ADN de 100 000 pb. Estimez le nombre de sites EcoRI que l'on pourrait rencontrer le long de ce fragment 9. La carte de restriction d'une petite portion du génome de E. coli est représentée ci-dessous (1cm= 1 Kb). L'ADN de E. coli a été digéré par l'enzyme de restriction Eco RI. Les fragments d'ADN résultant de cette

Sonde

sauvage

mutée

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digestion ont ensuite été séparés par électrophorèse en gel d'agarose, puis analysés par la technique de Southern. La sonde d'ADN radioactive utilisée pour cette expérience est représentée sur le schéma. Donnez le résultat de cette expérience. 10. La drépanocytose résulte d’une mutation ponctuelle au sein du gène�E-globine. Cette mutation provoque la disparition d’un site de restriction MstI. Proposez un test permettant de diagnostiquer cette maladie basé sur l’absence ou la présence de ce site. Donnez le résultat du test dans le cas un individu homozygote sauvage, homozygote muté ou hétérozygote.

La réplication

1. Représentez à l’aide d’un schéma les caractéristiques principales de la réplication chez E.coli en indiquant : La direction de la synthèse de l’ADN par rapport à l’orientation du brin d’ADN matrice. Les propriétés des brins avancés, retardés et des fragments d’Okazaki. Les enzymes impliquées dans chaque étape. 2. L'ADN de E. coli contient 4,5.106 paires de bases. Si l’ADN polymérase progresse à la vitesse de 1000 nucléotides par seconde, en combien de temps le chromosome circulaire entier de E. coli est-il répliqué? Dans certaines conditions optimales de croissance, le temps de génération peut être de 20 minutes seulement. Etant donné que la vitesse de polymérisation reste la même et qu'il n'y a qu'un seul site d'origine de réplication sur l'ADN circulaire parental, comment peut-on envisager une telle rapidité? Dans ces conditions de croissance rapide, certaines régions du chromosome bactérien sont présentes en un plus grand nombre de copies que d'autres. Lesquelles? 3. Une origine de réplication est représentée ci-dessous sur l’ADN double brin. Indiquez la position de chaque nouveau brin en cours de synthèse ainsi que la direction de la synthèse réplicative.

4. Si la fourche de réplication progresse à une vitesse de 500 nucléotides par seconde, combien de rotation (tour d’hélice) par minute doit effectuer la double hélice d’ADN, qui précède le site de la réplication, pour se dérouler?

6

5. DnaB code pour une hélicase qui déroule l'ADN à la fourche de la réplication. Ses propriétés ont été analysées in vitro en incubant pendant le même temps la protéine purifiée, de l'ATP et les substrats comme ceux qui sont montrés dans la figure de gauche. Pour identifier chaque substrat, les fragments 5’ et 3’ d’ADN sont marqués au 32P et incubés avec l’hélicase en présence ou en absence de la protéine SSB. Les produits d’ADN obtenus après la réaction sont par la suite séparés d’après leurs tailles et formes sur un gel d’agarose. Le résultat de l’autoradiographie est montré dans la figure de droite :

A partir de vos connaissances, déterminer : - a) Quels substrats sont utilisés efficacement par l'hélicase ? b) Dans quelle direction l’hélicase se déplace sur l’ADN ? c) Pourquoi l'hydrolyse de l'ATP est-elle nécessaire pour la réaction ? - d) Si on rajoute à la réaction de la protéine SSB avant de rajouter DnaB, on inhibe la réaction. Si, au contraire, on rajoute SSB après DnaB, la réaction de déroulement par l'hélicase est stimulée. Expliquer ces résultats. 6. La synthèse de l’ADN par la Pol III est-elle processive sur les deux brins ? 7. Afin de comprendre le mécanisme de la réplication de l’ADN, Arthur Kornberg purifia l’ADN polymérase I (Pol I) de E.coli. L’identification de Pol I ne démontre pas qu’il s’agisse de l’enzyme qui synthétise l’ADN in vivo. Pour vérifier si cette enzyme était essentielle pour la synthèse de l’ADN in vivo, De Lucia et Cairns isolèrent un mutant thermosensible (ts) du gène PolA codant pour Pol I. Ce mutant était actif à 30 °C, mais inactif à 42 °C. Si Pol I était vraiment essentielle pour la synthèse de l’ADN in vivo, quels résultats attendriez-vous après avoir incubé une souche polAts à 42°C ? Justifiez votre réponse. 8. Les mutants dépourvus de l’activité d’édition de la pol III (mutD) forment des petites colonies de bactéries qui se multiplient très lentement, spécialement sur le milieu complet. Comment expliquez-vous ce phénotype ? 9. En 1960, Meselson et Stahl démontrèrent par une expérience originale comment l’ADN néo répliqué était distribué entre les cellules filles. Imaginez de reproduire ces résultats et de cultiver les bactéries pendant plusieurs générations en présence d’un milieu de culture contenant des isotopes « lourds » (15N) afin de rendre tout l’ADN de la cellule complètement substitué (heavy). Ensuite, vous changez le milieu de culture pour le remplacer avec un milieu contenant des isotopes légers (light) comme le 14N. A partir de ce moment, à chaque génération, vous collectez un échantillon des cellules pour en extraire l’ADN et le séparer sur un gradient de densité. La figure montre la distribution de l’ADN dans le gradient au cours des générations.

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a. Comment interprétez-vous les résultats ? b. Sont-ils en accord avec vos attentes ? 10. Vous effectuez une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro en présence d’une matrice d’ADN, de la polymérase I purifiée de E.coli et des dNTP. Décrivez par quels moyens vous pouvez quantifier la synthèse de l’ADN au cours de la réaction. a. Quels résultats attendez- vous si vous ajoutez un large excès de didésoxycytidine triphosphate (ddCTP) par rapport à désoxycytidine triphosphate (dCTP) dans la réaction ? b. Et si vous ajoutez seulement 10 % de ddCTP par rapport à la concentration finale de dCTP ? c. Quel effet produira sur la réaction l’ajout d’un excès de didésoxycytidine monophospate ? 11. La polymérase I possède (en plus de son activité de polymérisation) une activité exonucléasique 3'->5' nécessaire pour l'enlèvement des nucléotides appariés incorrectement. Pour mesurer cette activité, vous avez préparé un substrat artificiel montré dans la figure. Les résidus thymidine en caractère gras sont marqués par l'isotope 32P et les résidus cytosine sont marqués par l'isotope 3H.

Vous incubez ce substrat en présence ou en l'absence de dTTP avec la polymérase I purifiée et vous mesurez la quantité de radioactivité qui reste associée au substrat. Les résultats obtenus sont montrés dans les graphiques ci-dessous :

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a. Pourquoi utilise-t-on deux isotopes différents ? b. Comment interprétez-vous les résultats dans les deux conditions expérimentales ? c. Décrivez les résultats attendus si on remplace le dTTP par du dCTP. 12. Des Bactéries répliquant activement leur ADN, sont incubées pendant un temps court avec de la thymidine tritiée. L’ADN est alors isolé, dénaturé et examiné par électrophorèse suivi d’une autoradiographie.

Comment interprétez-vous le résultat de l’autoradiographie ? 13. Quelles sont les deux conséquences majeures pour la cellule de la perte de l’activité exonucléase 3’->5’de la polymérase ? Quels sont les quatre mécanismes qui contribuent à la fidélité de la réplication de l’ADN dans E.coli ? 14. De retour d’une mission vous découvrez un nouveau microorganisme qui réplique son ADN par deux polymérases distinctes, l’une capable de synthétiser l’ADN de façon continue en direction 5’->3’ et l’autre en direction 3’->5’. Quelles prédictions pouvez- vous faire sur la capacité et l’efficacité des deux polymérases de substituer les bases mésappariées sur l’ADN ? Expliquez votre raisonnement avec un schéma. 15. Les mutations conditionnelles sont très utiles pour caractériser un processus biologique. Dans le cas de la réplication, un grand nombre de mutants thermosensibles (ts) ont été isolés et caractérisés. Ces mutants conduisent à deux types de phénotypes d’arrêt de la division cellulaire : l’arrêt rapide de la synthèse de l’ADN ou un arrêt lent. a. Donnez votre prédiction sur le type de phénotype d’arrêt (rapide ou lent) pour les mutants suivants : DNA topoisomérase, DnaA, SSB, DnaB, DnaG, DNA ligase en justifiant votre réponse. b. Si vous préparez un extrait cellulaire à partir d’un mutant ts qui arrête la synthèse rapidement et d’un mutant qui arrête la synthèse lentement et si vous les mélangez dans un système de réplication in vitro quel effet allez-vous obtenir sur la réplication de l’ADN ?

100 �ư 1000

> 100 000 nucl�ƴotides

9

Réparation de l’ADN

1. Chez E. coli, la fréquence d’erreurs commises lors de la réplication est de 1 pour 109 nucléotides. Sachant que le chromosome de E. coli est composé de 4,5 106 paires de bases, combien de nucléotides seront mal appariés pour 104 cellules effectuant une division? Quelle propriété de la polymérase permet d’expliquer la haute fidélité de la réplication? 2.La réparation de l’ADN a lieu de préférence sur le brin néosynthétisé en utilisant le brin parental comme matrice. Quel est le sens de cette spécificité de correction ? Quelle serait la conséquence pour la cellule si le système de réparation ne tenait pas compte de cette spécificité ? 3. Les dommages sur l’ADN interfèrent fortement avec la réplication de l’ADN. Les rayons UV forment des dimères de thymine sur le même brin d’ADN. Quelles conséquences produisent ces lésions si elles ne sont pas réparées, sur la progression de la fourche de réplication ? Quel mécanisme permet à la cellule de ne pas compromettre définitivement la réplication ? 4. Des polymérases spécifiques sont capables de synthétiser de l’ADN en regard d’une matrice portant un dimère de pyrimidines. Certaines telles, la polymérase V bactérienne rajoutent des nucléotides de manière aléatoire en regard de la lésion. Une autre polymérase isolée dans les cellules humaines (polymérase�K), incorpore des adénines en regard du dimère de pyrimidine.

L’utilisation de la polymérase�K���ou d’une ADN polymérase ayant la même spécificité que K�� �est-elle une stratégie favorable pour la cellule, suite à une irradiation par les UV ? Calculer la fréquence de mutation générée par la polymérase V et la polymérase K (en ne considérant que l’addition des nucléotides en regard du dimère) 5. Plusieurs gènes de E.coli sont impliqués dans la réparation de l’ADN suite à une irradiation aux UV. Les souches de la bactérie mutée dans l’un des gènes uvrA, uvrB, uvrC et RecA sont très sensibles à la lumière UV comme il est illustré dans la figure (A). La combinaison de deux mutations dans les gènes uvr ne donne pas une sensibilité accrue aux UV. En revanche, la combinaison d’un mutant uvr avec un mutant recA, conduit à une augmentation drastique de la sensibilité aux UV.

ou

30%

10

Comment expliquez-vous ce comportement ? L’irradiation UV produit des mutations dans les bactéries. Si l’on compare la fréquence des mutations générée par les UV dans deux souches déficientes pour le gène recA ou uvrA , on observe une différence très importante dans le taux de mutations induites dans les cellules qui survivent. a. Comment peut-on expliquer cette différence ? b. Comment est-il possible que le mutant recA donne lieu à un taux de mutations plus faible que la cellule sauvage ?

c. Quelle voie de réparation est majoritaire dans la cellule sauvage ? 6. Le système SOS dans la bactérie E.coli représente une réponse d’émergence suite à un dommage de l’ADN. Dans les conditions normales, l’expression des gènes est maintenue réprimée par la présence du répresseur LexA. LexA réprime partiellement sa propre synthèse et celle de RecA. Suite à un dommage sur l’ADN, RecA est activée et clive LexA. En absence de LexA, les gènes de la réponse SOS sont transcrits et augmentent la survie des cellules. Paradoxalement, suite à l’activation du système SOS, l’expression du répresseur Lex A est également induite.

a. Quelle est l’avantage de ce type de régulation de la réponse SOS ? b. Bien que nécessaire pour la survie cellulaire, le système SOS serait nocif s’il était exprimé de façon constitutive. Pourquoi ?

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Transcription 1. L’ARN polymérase catalyse la transcription de différents ARNs. Complétez le tableau ci-dessous. ARN Fonction taux stationnaire taux de synthèse stabilité 2. Comment et à quel niveau l'ARN est-il marqué par le J-32P-ATP. La radioactivité spécifique de cette préparation d'ARN sera-t-elle élevée?

3. La photographie prise au microscope électronique montre un gène procaryote en cours de transcription. Légendez cette image de la façon la plus complète possible (sens de transcription, localisation du promoteur, ARN polymérase, ADN matrice, ARN en cours de synthèse)

4. Les différentes étapes de la transcription. a) Complétez ce schéma représentant les différentes étapes de la transcription. Légendez chacune des étapes numérotées. Nommez les éléments marqués par un “ ? ”.

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5. L'ARN polymérase est purifiée par chromatographie à partir d'un extrait bactérien. Chaque fraction d'élution est testée dans un système de transcription in vitro pour retrouver l'activité de l'ARN polymérase. Quels sont les réactifs présents dans un système de transcription in vitro?

Les fractions 4 et 5 sont positives. Les ARNs synthétisés in vitro à l'aide de ces fractions sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide-urée suivie d'une autoradiographie (pistes A et B).

Le résultat des pistes A et B est-il conforme au résultat attendu? Qu'en concluez-vous quant à la fonctionnalité de l'enzyme?

Dans la piste C, la synthèse in vitro d'ARN a été réalisée à l'aide de la fraction 5 à laquelle on a rajouter la fraction d'élution 13. Que contient la fraction 13? Quelle conclusion pouvez-vous tirer qu'en à l'association des différentes sous-unités de l'ARN polymérase?

6. Prédisez l'effet des mutations suivantes: 1) une mutation du facteur sigma empêchant sa dissociation de l'enzyme core. 2) une mutation de sigma permettant à ce facteur de se lier aux séquences promoteur en l'absence des autres sous unités de l'ARN polymérase.

7. Voici les séquences présentes au niveau du promoteur de l’opéron Lactose

mutations :

Quel sera l’effet des mutations dans la région -10 sur le taux de transcription de l’opéron ?

8. L'ARN polymérase reconnait spécifiquement dans le génome les portions d'ADN contenant l'information génétique (les gènes). Par une expérience simple, il est possible de mettre en évidence les régions de fixation de l'enzyme en 5' des gènes à transcrire.

a) Comment s'appellent ces régions? Principe de l'expérience: Quand l'ARN polymérase et un segment d'ADN contenant un promoteur sont mis en présence, il se forme un complexe. On peut repérer le site de liaison de la polymérase sur l'ADN par la technique des empreintes (footprint) ou méthode de protection contre la nucléase.

Le segment d'ADN est marqué au 32P à l'extrémité 5' d'un des brins Le segment marqué est ensuite digéré avec une quantité de nucléase suffisante pour produire statistiquement une seule incision par segment d'ADN (en présence ou en absence d’ARN polymérase). L'incision enzymatique est aléatoire et produit ainsi une population de fragments de tailles différentes. Ceux-ci sont séparés les uns des autres sur gel dénaturant de polyacrylamide

b) Quel est le principe de la séparation c) Seuls les fragments radiomarqués seront analysés. Comment? d) Donnez les positions relatives sur l’autoradiographie, des produits de la digestion par la nucléase,

représentés par l’enseignant au tableau. e)

Une telle expérience est réalisée sur un gène A (voir figure ci - dessous) dont la séquence est: 5' GTGCGTGTTGACAATTTTACCTCTGGCGGTTATAATGGTTGCCCGTACTAAGGA 3' région –10 +1

C B A

+ _

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f) Que remarque-t-on sur cette figure? Quelles sont les séquences reconnues par l'ARN polymérase?

9. Le domaine 2.4 du facteur V 70 d’E. coli et du facteur VA de B. subtilis joue un rôle critique dans la reconnaissance de la TATA box. Seuls un résidu Arg (en position 3) et un résidu (en position 6) sont conservés dans cette séquence de 9 acides aminés. Comment l’expliquer ? Quels types d’interactions sont mises en jeu ?

10. Deux expériences de transcription in vitro sont réalisées en parallèle. Chaque expérience se fait en présence d'un ADN matrice provenant du bactériophage T3 (il comporte un site d'initiation et de terminaison de la transcription) et de précurseurs radioactifs. Dans un des tubes le GTP est remplacé par de l'ITP. Ce nucléotide peut être incorporé dans la chaîne d'ARN à la place de la guanosine monophosphate. L'inosine peut établir deux liaisons hydrogène avec la cytosine. Les ARNs radioactifs synthétisés sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide- urée suivi d'une autoradiographie.

a) Que savez-vous des mécanismes de terminaison de la transcription? b) Quel sera l'effet de l'incorporation de l'inosine sur la structure de l'ARN. Interprétez le résultat de l'expérience. Quelle conclusion pouvez-vous en tirer concernant le processus de terminaison de la transcription?

ITP GTP

_ +

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La régulation de la transcription chez les procaryotes 1. Pourquoi dit-on que les gènes z, y, et a codant respectivement pour les protéines �E-galactosidase, E-galactoside perméase et galactoside transacétylase appartiennent au même opéron? Dans un milieu dépourvu de lactose les bactéries ne synthétisent pas ces enzymes. En présence de lactose ces protéines sont induites c’est à dire exprimées. Décrivez deux possibilités de régulation de l’expression génique rendant compte de ces observations. 2. Des bactéries E. coli sont cultivées en présence d’un analogue structural du lactose, l’IPTG. Au cours de la croissance bactérienne, on mesure la teneur en E-galactosidase et la quantité de protéines présente dans les cellules. La première partie de la courbe (A) est linéaire. -Comment interprétez-vous ce résultat? -En A quel est le pourcentage de E-galactosidase produite par rapport à la totalité des protéines bactériennes? Choisir la meilleure réponse: - a) Au point X un large excès de lactose a été ajouté au milieu de culture. - b) Au point X l’IPTG a été retiré du milieu de culture.

c) Indiquez sur le schéma comment varie au cours de l'expérience la quantité d'ARNm de l'opéron lactose 3. a) Les diploïdes partiels suivants ont été créés: i+z-/F’i-z+ et i-z+/F’i+z-. Chez ces deux diploïdes les trois enzymes sont inductibles. - Quelle conclusion pouvez-vous tirer de ces expériences? - La régulation se fait-elle en cis ou en trans? b) Un mutant d’E. coli synthétise de grandes quantités de E-galactosidase, que l’inducteur soit présent ou non. Un diploïde partiel formé de ce mutant et de F’i+z+ synthétise également de grandes quantités de�E-galactosidase que l’inducteur soit présent ou non. - Quelle sorte de mutation peut rendre compte de ce résultat? c) Un mutant Is (super répresseur) de l’opéron lactose se comporte comme un mutant non inductible. L’allèle Is est dominant sur I+ dans des bactéries diploïdes partielles.

- Quelle est la nature moléculaire probable de cette mutation? -

4. D'après l'expérience de footprint (exercice 8 transcription) où se lie le répresseur? Comparez l'empreinte du répresseur avec celle de l'ARN polymérase. 5. L'allolactose est l'inducteur naturel de l'opéron lactose. Le lactose est converti en allolactose par la E- galactosidase. Comment expliquez-vous que dans de nombreux mutants z-, la perméase et la transacétylase ne sont plus induits par le lactose. 6. Dans les mutants y-, le gène codant pour la�E-galactosidase n'est pas affecté. Pourtant, la E-galactosidase n'est plus induite par le lactose dans ce mutant. Pourquoi? 7. Certains mutants I-, ne lient plus le site opérateur, mais conservent la faculté de former un tétramère. Expliquez pourquoi la forme active du répresseur est un tétramère. Pourquoi une telle mutation est-elle partiellement dominante?

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8.E. coli se divise plus rapidement sur glucose que sur lactose pour les raisons suivantes: (1) le lactose est internalisé plus lentement que le glucose et (2) le lactose doit être d’abord hydrolysé au niveau intracellulaire en glucose et galactose (par la E-galactosidase) avant d’être métabolisé

Quand E. coli est cultivé sur un milieu contenant un mélange de glucose et de lactose, on observe une courbe de croissance au cours du temps ayant une allure complexe (voir figure, carrés). Les bactéries se multiplient rapidement au début de la culture, et il existe un délai entre les deux phases de croissance pendant lequel les bactéries arrêtent pratiquement de se multiplier. Le dosage des concentrations en glucose, lactose et E-galactosidase est entrepris tout au long de la multiplication bactérienne. On constate que le glucose diminue rapidement après un certain temps (voir figure, cercles). Par contre la E-galactosidase n’est induite qu’après plus de 100 minutes.

- a) Expliquez la cinétique de croissance bactérienne au cours de l’expérience, en particulier, la croissance initiale rapide, le taux de croissance plus lent en fin de culture et la très faible croissance au milieu de l’expérience.

- b) Expliquez pourquoi l’opéron lactose n’est pas induit par le lactose pendant la phase initiale de croissance rapide.

- c) Sur la figure, rajoutez la courbe de dosage du lactose.

9. Les sites de contrôle de l’opéron Lac fixent deux protéines régulatrices: la CAP (Catabolic Activator Protein) et la protéine répresseur. Les 4 états possibles de régulation impliquant les deux sites de contrôle sont montrés dans la figure suivante.

La transcription du gène Z est très faible quand les deux sites de contrôle sont vides (état a). Quels sont les taux de transcription dans les 3 autres états? Expliquez. Quelle est la composition du milieu de culture dans les différents états? 10. Un mutant incapable de se diviser sur galactose, lactose et arabinose a été isolé. Les variations de concentration en AMP cyclique sont normales chez ce mutant. Quel type de mutation pourrait donner ce résultat? Indiquez le niveau d'AMP cyclique de la bactérie dans les milieux suivants: arabinose, galactose+ glucose, lactose, glucose.

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11.L'opéron tryptophane code pour 5 enzymes (E, D, C, B, et A) qui transforment le chorismate en tryptophane. Des mutants de régulation ont été obtenus pour cet opéron. La production de l'enzyme trpE a été étudiée dans le mutant trpR-.

milieu + tryptophane milieu - tryptophane WT - +++ trpR- +++ +++ La protéine codée par trpR a été partiellement purifiée et son activité a été évaluée dans un système de transcription-traduction in vitro en présence d'ADN codant pour l'opéron tryptophane. La quantité de trpE synthétisée in vitro est mesurée Quel est le rôle de la protéine trpR? 12. La séquence partielle du promoteur de l'opéron tryptophane est présentée ci-dessous. Un fragment d'ADN comportant le promoteur de l'opéron tryptophane a été incubé en présence de répresseur ou d'ARN polymérase dans les conditions décrites sur la figure; puis digéré par l'enzyme HpaI (5'GTTAAC3'). Les produits de digestion sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'agarose. Analysez les résultats de cette expérience. Quelles conclusions pouvez-vous en tirer quant au mécanisme d'action de trpR? 1 2 3 4 1: ADN seul 2: ADN+ trpR 3: ADN + trpR + tryptophane 4: ADN + ARN polymérase

13. Les mutants trpR- produisent les enzymes de l'opéron tryptophane même en présence de tryptophane. Curieusement, lorsque ce mutant est placé dans un milieu dépourvu de tryptophane, la quantité d'enzyme produite augmente considérablement. Que suggère cette observation?

trpR

trpE synthétisé

_

+

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14. La transcription de l'opéron tryptophane a été étudiée dans le mutant trpR- par la technique de Northern blot; La sonde utilisée s'hybride avec les 1000 premiers nucléotides de l'ARNm. L'ARNm polycistronique de l'opéron fait 7000 nucléotides.

Pourquoi la synthèse des enzymes de l'opéron tryptophane augmente-t-elle dans le mutant trpR- en l'absence de tryptophane?

15.La séquence de la région leader est présentée sur le schéma ci-dessous. Le site attténuateur ressemble au site de contrôle de la terminaison de la transcription. Cette région peut-être traduite en un peptide leader.

L'expérience suivante a été réalisée afin de comprendre le mécanisme de l'atténuation. Des extraits ont été préparés à partir de cellules présentant une mutation thermosensible de la tryptophanyl tRNA synthétase (extraits préparés à température restrictive). L' ADN correspondant au site promoteur, opérateur et portant le gène E de l'opéron tryptophane est rajouté à l'extrait, afin de permettre la transcription traduction de la protéine E. Cette protéine ne contient pas d'acide aminé tryptophane. La production de la protéine E est évaluée aussi après avoir rajouté de la tryptophanyl-tRNA synthétase.

1: sans ADN 2: + ADN 3: + ADN + Trp 4: + ADN + trp + tryptophanyl tRNA synthétase

Quelle molécule est responsable des variations de production de la protéine E? Expliquez comment cette molécule régule la production des enzymes de l'opéron tryptophane.

+ tryp - tryp

7000

140

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La Traduction

1. la séquence en bases d’un ARNm peut-elle être prédite grâce à la séquence en aminoacides du polypeptide unique lui correspondant? Par exemple, combien d’ARNm peuvent coder pour la séquence tripeptidique Leu-Met-Tyr? Un seul ARNt peut-il reconnaitre tous les codons de la leucine? 2. Voici une petite portion de la séquence d'une protéine bactérienne X:

Ala-Pro-Trp-Ser-Glu-Lys-Cys-His Une série de mutants de cette protéine ont été isolés: mutant1: Ala-Pro-Trp-Arg-Glu-Lys-Cys-His mutant 2: Ala-Pro mutant 3: Ala-Pro-Gly-Val-Lys-Asn-Cys-His- Quelle est la nature de la mutation sur l'ADN pour les différents mutants? 3. Une mutation au sein d’un gène bactérien conduit à l’apparition d’un codon stop UGA au milieu de la séquence codant pour la protéine. Une mutation suppresseur dans un tRNA permet cependant de produire une protéine de taille correcte. Ce tRNA muté introduit un acide aminé tryptophane en regard du codon UGA. Quelle est la nature de la mutation sur le tRNA ? Quelle sera la conséquence de cette mutation sur la traduction des autres gènes bactériens ? 4. Quelle est la réaction catalysée par la PNPase ? Dans quelle condition cette enzyme catalyse-t-elle la synthèse d’ARNs ? 5. Au début des années 60 M. Nirenberg observa que si on incube un trinucléotide 5’UUU3’ en présence de ribosomes et de tRNA phenylalanine, un complexe se forme. En se basant sur cette observation, décrivez une expérience qui permettrait de déchiffrer le code génétique. 6. Des réticulocytes synthétisant activement de l’ D-globine sont incubés en présence de Leucine radioactive (acide aminé présent en de nombreuses positions tout le long de la protéine). Des échantillons sont prélevés régulièrement après l’addition du précurseur radioactif. Dans ces échantillons la protéine D-globine complète est isolée et la distribution de la radioactivité le long de la protéine est mesurée. Les régions sombres indiquent la présence de radioactivité.

Peut-on déduire à partir de cette expérience la direction de la synthèse protéique ? Justifiez votre réponse 7. Choisir la (les) affirmations exactes.

- Le nombre d’aminoacyl-ARNt synthétases est : a) déterminé par le nombre d’ARNt existants b) déterminé par le nombre de codons traductibles sur les ARNm c) déterminé par le nombre d’acides aminés utilisés d) déterminé différemment pour chaque espèce - Qu’est-ce que le site P des ribosomes? a)le site où l’ARNt quitte le ribosome b)le site de liaison du peptidyl-ARNt c)le site de liaison de l’aminoacyl-ARNt - Quelle(s) base(s) de l’anticodon contribuent à la dégénérescence (wobbling) dans la lecture des codons? a)la première b)la seconde c)la troisième d)la première et la seconde e)la seconde et la troisième

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- Quelles sont les étapes critiques pour la fidélité de la traduction? a)l’interaction codon-anticodon b)la formation des aminoacyl-ARNt c)la compétition des facteurs de terminaison avec les ARNt Comment la fidélité est assurée à chacune de ces étapes?

8. Schéma récapitulatif à légender

Donnez le nom des éléments et des étapes réactionnelles marquées d’un “ ? ”

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9. Combien de molécules de GTP et d'ATP sont consommées lors de la synthèse d'un pentapeptide (en tenant compte de l’étape de terminaison de la traduction)?

10. Des ribosomes ont été isolés à partir de bactéries ayant poussé dans un milieu lourd (13C et 15N) et à partir de bactéries ayant poussé dans un milieu léger 12C et 14N). Ces ribosomes 70S sont rajoutés à un système de traduction in vitro. Une fraction est prélevée après quelques heures et la densité des ribosomes est analysée par centrifugation en gradient de densité. Combien de bandes de ribosomes de type "70S" vous attendez-vous à voir dans le gradient de densité? 10. Quel est le phénotype de bactéries présentant une mutation au niveau du facteur d’élongation EF-Tu telle que l’hydrolyse du GTP est ralentie ? 11. Quel est le phénotype de bactéries présentant une mutation au niveau du facteur d’élongation EF-Tu telle que l’hydrolyse du GTP est ralentie ? 12. Soit la séquence d’un brin d’un fragment d’ADN isolé à partir de E. coli: 5’ GTAGCCTACCCATAGG 3’ 1) On suppose que tout cet ADN est transcrit en ARNm en utilisant comme brin matrice le brin complémentaire. Quelle sera la séquence de cet ARNm? 2) Quel peptide obtiendrait-on si la traduction commençait précisément à l’extrémité 5’ de cet ARNm? Quel ARNt se liera au ribosome après le départ de l’ARNtAla? Quelles sont, si il y en a, les liaisons rompues lorsque le groupement amine de l’alanine s’engage dans une liaison peptidique, et qu’arrive-t-il à l’ARNtAla? 13. La ribonucléase de E. coli est formée de 104 acides aminés. Dans les conditions intracellulaires, combien de temps durera la traduction de son ARNm (la bactérie synthétise 400 acides aminés en 20 secondes)? Comparez ce temps avec celui nécessaire à la transcription de son gène (vitesse de transcription : 70 nucléotides /sec). 14.Dans un système de traduction in vitro de E. coli, le polyribonucléotide 5'AUGUUUUUUUUUUUU3' permet la synthèse du peptide Met-Phe-Phe-Phe-Phe. En présence de farsomycine, un antibiotique, ce polyribonucleotide ne permet la synthèse que de Met-Phe. Quelle étape de la synthèse protéique est inhibée par cet antibiotique?Les peptides synthétisés seront-ils libres dans le milieu réactionnel ou liés au tRNA?

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La réplication et l’expression génique chez les eucaryotes

1. Les chromosomes humains contiennent une molécule d’ADN dont la taille moyenne est de 2,8 108 pb. Lors de la phase de mitose du cycle cellulaire les chromosomes ont une taille moyenne de 10Pm. Calculez le facteur de compaction de l’ADN dans les chromosomes mitotiques. Quelles structures et quelles protéines sont responsables de cette compaction?

2. Des cellules eucaryotes sont incubées durant 10 min en présence de thymidine 3H . Du milieu de culture est alors rajouté afin de diluer le précurseur radioactif. Après 10 min d’incubation en présence de précurseurs dilués, l’ADN est récupéré, étalé sur des lames de microscopie recouvertes d’émulsion photographique. Après plusieurs semaines, l’émulsion est révélée et le résultat est analysé par microscopie électronique. A partir de cette analyse que peut-on conclure quant au nombre d’origines de réplication par chromosome, quant à la direction de réplication sur les chromosomes eucaryotes?

3.Dans les cellules de souris, les fourches de réplication progressent à une vitesse de 50 nucléotides/ sec. Comparez cette vitesse à celle de la progression des fourches de réplication procaryote. Sachant que le génome haploïde de souris comporte 25 000 réplicons et que la taille de ce génome est de 2,6 109 pb, calculez le temps nécessaire à sa réplication. Comparez ce temps avec la durée de la phase S du cycle cellulaire : 8 heures. 4. Le chromosome bactérien est circulaire alors que les chromosomes eucaryotes sont linéaires. Expliquez pourquoi cette structure linéaire peut être un handicap. Quelles solutions sont mises en œuvre par les cellules eucaryotes pour y remédier ?

5. Lors des premières caractérisations des ARN polymérases eucaryotes, 3 pics d’activité polymérase (1, 2, 3) ont été obtenus en fractionnant un extrait cellulaire par chromatographie. Les fractions de ces 3 pics ont été incubées avec 1Pg/ml ou 10Pg/ml d’D-amanitine puis l’activité polymérase a été mesurée. Quel est l’effet de l’D-amanitine sur chacune des polymérases ? Quelles classes d’ARN sont synthétisées par chacune des polymérases ?

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5.Chez les organismes supérieurs, la plupart des gènes de classe II sont en mosaïque – ces gènes codent pour les protéines -. L’organisation morcelée du gène de l’ovalbumine a été montrée en hybridant le brin codant de l’ADN contenant le gène de l’ovalbumine avec l’ARN messager ( ARN m) correspondant de l’ovalbumine. Le schéma de l’hybride formé, vu en microscopie électronique, est montré en A

Combien d’introns comporte ce gène ? Dessinez la structure du gène en précisant les régions introniques et exoniques (se référer aux annotations du schéma). 6.L’ARN messager mature est obtenu après plusieurs étapes . Le gène de l’ovalbumine, par exemple, est transcrit dans son intégralité en un ARN précurseur ou ARN pré-messager, il subit des étapes de modifications post- transcriptionnelles dans le noyau de la cellule puis l’ARN messager mature est transféré dans le cytoplasme pour y être traduit . Citez les étapes de maturation .

7. l’ARN messager mature de l’ovalbumine a une séquence de 1872 nucléotides de long. C’est un ARNm monocistronique codant la protéine ovalbumine composée de 385 acides aminés.

a-Quelle est la longueur de la séquence codante pour l’ovalbumine ?

b-Faire un schéma annoté de la structure de l’ARN messager eucaryote, - vous délimiterez la séquence codante notamment-

8. Pourquoi l’extrémité 5‘ de l’ARN m ne peut-elle être digérée par une exonucléase ?

9. Contrairement aux procaryotes, les ARNm polycistroniques sont extrêmement rares chez les eucaryotes . Pourquoi ?

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Production de protéines recombinantes dans la bactérie

1. Les gènes eucaryotes sont de grandes tailles et en structure mosaïque. Ils sont donc difficiles à manipuler. C’est pourquoi des cDNA sont généralement générés. En vous appuyant sur le schéma ci-dessous expliquez ce qu’est un cDNA et quelles sont les séquences du gène présentes sur ce cDNA.

Qu’est ce que la réverse transcriptase ? Quelle est son activité enzymatique ? Dans quel organisme la trouve-t-on ? 2. L’hormone de croissance humaine utilisée en thérapeutique peut être produite en grande quantité dans la bactérie. Le schéma ci-dessous décrit les principales étapes de cette production.

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La première étape consiste à introduire l’ADN codant pour l’hormone de croisssance dans un vecteur d’expression bactérien. Pourquoi part-on du cDNA de l’hormone de croissance pour cette expérience ? Pourquoi retire-ton l’extrémité 5 du cDNA pour ensuite réintroduire la séquence codant pour les acides aminés 1 à 24 ? Les vecteur d’expression sont des molécules d’ADN permettant à la séquence qu’on y introduit de se maintenir dans la cellule cible, ici une cellule bactérienne, et y être exprimée et traduite en protéine. Le vecteur utilisé dans cette expérience est un plasmide portant un gène de résistance à l’ampicilline. Expliquer comment ce vecteur va se maintenir dans les bactéries de génération en génération . Quels éléments doivent être présents sur ce vecteur afin que l’ADN inséré soit transcrit et traduit en une protéine ? 3. La purification d’une protéine animale, peu abondante, est difficile. Aussi souhaite t-on l’obtenir sous forme fusionnée, avec un peptide X, facile à purifier, dans une bactérie comme E coli. Pour cette réalisation, vous disposez au laboratoire, de certains outils ou d’éléments nécessaires, que vous pourrez choisir dans la liste suivante : l’ADN génomique d’intérêt, l’ARN m purifié, des enzymes de restriction, des ADN polymérases, un vecteur de propagation type comme le plasmide pBluescript , un vecteur d’expression procaryote pGEX-2T ,

.En outre il faut des cellules E coli modifiées pouvant être transformées par ces vecteurs ( on choisira pour les expériences de clonage une souche d’E Coli- sensible à l’ampicilline, AMPS et ne métabolisant pas le lactose, phénotype Lac-) des milieux de culture et des milieux sélectifs, appareils pour électrophorèses d’acides nucléiques et de protéines a- Comparer les deux vecteurs de clonage, identifiez les éléments présents sur chacun. b-Mentionner les différentes étapes de la stratégie choisie depuis le clonage orienté de la séquence codante dans le vecteur approprié jusqu'à l’obtention de la protéine de fusion pure .

c-Réponder aux questions suivantes en les justifiant (ces questions peuvent vous guider pour b)

- -Préférez-vous partir de l’ADN génomique , de l’ARN m ou de l’ADNc pour réaliser le clonage?

- Comment sont sélectionnées les bactéries contenant un plasmide ? On supposera que les expériences de clonage sont réalisées dans une souche d’E Coli- (sensible à l’ampicilline,( AMPS) et ne métabolisant pas le lactose, phénotype Lac-)

- Pourquoi utilisera t-on un vecteur d’expression procaryote?

- Quelle est l’importance d’avoir la séquence de la protéine d’intérêt en phase avec la séquence codante du peptide X ?

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En général on réalise l’induction de la synthèse de la protéine de fusion dans la bactérie. Pour quelles raisons l’induction est-elle souhaitable ? Comment induit-on ,ici, la synthèse de la protéine de fusion dans la bactérie -dont les caractéristiques sont données précédemment.

Par quelles techniques peut-on détecter la protéine de fusion ? Comment attester que la protéine de fusion est composée du peptide d’intérêt ?

Comment pourrait-on obtenir la protéine d’intérêt pure séparée du peptide X ?

9- Dans certaines conditions, Il arrive que la protéine d’origine eucaryote, obtenue par génie génétique dans la bactérie n’ait pas les propriétés physiologiques attendues. Pourquoi ? Illustrer votre réponse par quelques exemples

Remarques importantes : - Chaque question est notée sur 2 points - Répondez à la question de manière complète, mais concise en justifiant brièvement votre réponse - Répondez comme demandé dans l'énoncé p.ex. en ne dépassant pas 2 lignes - Il sera tenu compte de la présentation et de l'orthographe 1. Pourquoi utilise-t-on de la Thymidine radiomarquée et non du dTTP marqué pour suivre la

synthèse d’ADN dans une culture bactérienne ? A l’inverse pourquoi la Thymidine ne peut-elle pas être utilisée pour étudier le mode de fonctionnement de l’ADN polymérase purifiée ? (Réponse : 5 lignes)

2. Pourquoi la séquence séparant les 2 boites conservées (-10 et –35) d’un promoteur bactérien est-

elle peu importante alors que la distance est importante ? (Réponse : 3 lignes et/ou schéma 3. Pourquoi ne peut-on synthétiser de l’ARN en présence de PNPase qu’à forte concentration en

nucléotides ? Pourquoi la PNPase n’est-elle jamais utilisée pour synthétiser de l’ARN dans les cellules intactes ? (Réponse : équation commentée)

4. Comment Okazaki a-t-il procédé pour mettre en évidence expérimentalement la synthèse discontinue d’un des deux brins d’ADN lors de la réplication ? (réponse : 2 lignes) 5.Quel rôle joue la séquence dite de Shine et Dalgarno dans la traduction ? Illustrez par un schéma. (réponse : schéma commenté) 6. Illustrez par un schéma détaillé le mécanisme de formation d’une liaison phosphodiester lors de la synthèse d’ADN par l’ADN polymérase. (Réponse : schéma commenté indiquant les structures des composés mis en jeu).

7. Quels rôles jouent les deux tRNA spécifiques de la méthionine dans la traduction d’une chaine polypeptidique chez E. Coli ? (réponse : 5 lignes). 8. Quel sera le phénotype d’un mutant bactérien où ont été introduits un exemplaire sauvage et un exemplaire muté de l’opérateur de l’opéron lactose ? (réponse : 2 lignes)

9. Représentez dans un schéma les composants de la fourche de réplication. Indiquez dans une légende la fonction de chaque protéine représentée (réponse : schéma commenté)

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10. Quel est le mécanisme de synthèse d’un aa-tRNA ? (réponse : équations commentées) 11. Comment l’AMP cyclique régule-t-il l’expression des enzymes de l’opéron lactose ? (réponse : schéma commenté) 12. Les chaines latérales des acides aminés jouent un rôle important dans la structuration d’une protéine. Quels types de liaison peuvent être mises en jeu pour chacun des acides aminés suivants : Valine, Sérine, Acide Aspartique, Cystéine 13. Sur quelles bases expérimentales Avery a-t-il pu écrire que « l’unité fondamentale du principe transformant…est un acide nucléique du type déoxyribose » ? (réponse : 5 lignes) 14. En quoi la transcriptase réverse (RT) virale se distingue-t-elle des ADN polymérases et des ARN polymérases cellulaires ? (réponse : en 3 lignes) 15. Pourquoi dit-on que la sous-unité 30S du ribosome est une RNP ? Quelle est la composition ? (réponse : 2 lignes)

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