BIOCHIMIE, 1975, 57, 369-373.

Biosynthdse de la phorcabiline, pigment biliaire bleu d'dctias selene (Lepidoptera, dttacidae).

Michble CHOUSSY (*), Michel BARRIER (* ~') et Monique VUILLAUME (**).

(*) Ins l i ln t de Chimie des Substances Naturelles, CNRS, 91190 Gif-sur-Yoelte. (**) Laboratoire de Zoologie, Universit~ de Paris IX, 91405 Orsa 9.

(12-2-1975).

Summary. - - The blue-green bile p~gments of Actias selene (Altacidae) have been investigated at different stages of its development. Coproporphyrinogen-14C, protopor- vhyrin-IX3H, and pterobilin-l~C, injected to larvae are metabolised into phoreabilin I, the main neopterobilin in this animal. It is concluded that phorcabilin I is a bile pigment of the IX V series and that pterobilin is its direct precursor. A method for the preparation of labelled protoporphyriu from quail egg-shell is reported.

INTRODUCTION.

La pt6robi l ine ou b i l ive rd ine IX ~., est un pig- ment b i l ia i re bleu-vert p rovenan t de l ' ouver tu re inhabi tuel le de la p ro toporphyr ine - lX au n iveau du pont m6th6ne ? [11. La pt6robi l ine a pr6c6- demment 6t6 trouv6e chez de nombreux ldpidop- t6res El-4, 61. A notre connaissance, eette sub- stance n 'a jamais 6t6 isol6e d 'autres sources natu- relies. A la suite de recherches systdmatiques sur les p igments bleus des Inseetes, deux pigments t6 l rapyr ro l iques nouveaux ont 6t6 mis en 6vi- dence chez les 16pidopt6res : la phorcab i l ine I e t la sarpddobi l ine [3-6]. Ces pigments , appelds n6opt6robil ines, out p r inc ipa l emen t 6t6 trouv6s chez les Papil ionidae et les Attacidae. Chez cer- taines espbces o6 la phorcab i l ine I e s t le p igment bleu pr inc ipa l , on a pu isoler 6galement des ailes de l ' imago, la p t f rob i l i ne et la sarpddobi l ine ; c 'est te eas d'Aetia selene. Cet insecte, dont les 61evages pouva ien t 6tre rdalisds sur mil ieu nature l a done 6t6 choisi pour l '6tude de la biosynthbse de ees pigments. En ce qui concerne la s t ructure des n6opt6robil ines, un poin t impor tan t 6tait de d6 te rminer si elles p rovena ien t bien de la proto- porhyr ine - IX et dans ce cas si elles appar tena ien t

la s6rie IX a comme la b i l iverd ine , IX V comme la ptdrobi l ine, ou encore si elles p rocdda ien t d 'une ouver ture diff6rente du noyau po rphyr in ique . Le prdsent t ravai l (*) rbpond h c e s questions. I1 a port6 6galement sur la local isat ion et le dosage

A qui toute correspondanee doit ~tre adressde. (*) Recherches effectudes dans le cadre de I'ATP

CNRS 4699-10.

de ces p igments h diffdrents stades du ddvelop- pement d'Actias selene.

CO 2 H CO2 t-I

H H H Pt6robiline.

MATERIEl , ET METHODES.

1) Elevages.

Les larves d'Actias selene ont 6t6 61evdes sur feuilles de pommier , dans des condi t ions de pho- topdriode et de temp6ra ture ambiante naturel les de juin h septembre. Aux stades L 1 et L:: les che- nilles sont b r u n - r o u g e ; elles dev iennen t vertes ribs leur Inue en L z et conservent ensui te cette conleur. La nymphe qui s ' en toure d 'un cocon de soie a une cut icule brun-foncd. L ' imago est un beau papi l lon vert pMe dont l ' envergure moyenne var ie entre 8 et 15 cm dans les condi t ions des 61evages.

2) Pr~curseurs radioacti[s.

Coproporphyr inogkne- I l l *',C. La coproporphy- r ine- I I I a4C (Calatomic, Los Angelbs) marqude dans la pa t t ie cyc l ique du squelette et d 'act ivi t6 sp6cifique 50-100 m C i / m M a 6t6 hydrog6n6e en coproporphyr inog6ne- I I I par l ' amalgame de so- dium dans la d im6thy l fo rmamide [7] ; (r6action effeetu6e sur 0,003 mCi). La solution de DMF a 6t6 utilisde d i rec te lnent aprbs filtration.

370 M. Choussg, M. Barbier el M. Vui l laume.

Protoporphgrine-IX SH. La caille Coturnix co- tarnix japonica accumule sur la coquille de ses ceufs la p ro toporphyr ine- IX faci lement isolable sons forme d'ester d imOhyl ique [8!. 1 mCi d 'acide 6-aminol~vul inique -2,3 3H (chlorhydrate , activit~ sp6cifique 33 Ci/mM, CEA Saclay) a ~t6 injee% h u.ne caille femelle h raison de 0,2 mCi par jouv pendan t 5 jours. Les in ject ions in t ramuscu!a i res ont ~t6 faites envi ron 12 h avant chaque ponie, la p ro toporphyvine ~tant d@os6e h la surface des ceufs dans l 'u tbrus 2 h 3 h avant la ponte. Les coquilles des cinq ,oeufs sont lav~es a l 'eau puts l 'acbtoue et aprbs broyage, sont laiss~es 15 h h 5°C dans le m6thanol absolu sulfur ique h 5 p. cent. La solution filtr~e est repr ise par l 'eau et le chloroforme. Les esters dim~thyliques obtenns dans la phase chloroformique (lav6e h l 'eau puts s4ch~e sur Na2SO ,) sont chromatograph%s sur couche mince (CCM) de SiO~ Merck en d4velop- pant par le m~lange benz~ne-6ther de p6trole- m4thanol 9:5:1. 1,05 mg d'ester mOhyl ique de la p ro toporphyr ine- IX ont ~t~ obtenus (1,86.10-a mM) avec une radioact ivi t6 totale de 3,15.105 c/rain ( rendement d ' incorpora t ion 0,01 p. c e n t ; aclivit~ sp6cifique 1,69.10 s c/tantruM soit 0,077 mCi/mM).

L'ester m6thyl ique est hydrolys~ par HCI 6 N penal:ant 15 h h 20°C et la pro toporphyr inc- IXaH lib6r~e est extraite par le butanol . Apr~s ~vapora- tion, on reprend par la d im~thyl formamide pour les inject ions.

Pt~robiline-~',C. 0,2 mCi d 'acide 5-aminolbvuli- nique-4 a4C (activit6 sp~cifique 41 mCi/mM) a ~t~ inject~ ~ 200 chenil les de Pieris brassicae au 5 ~ stadc larvaire (en solut ion dans 4 ~1 de Ringer par animal) . Apr~s 4 jours, chenil les et chrysa- lides sont broy~cs dans l 'ac6tone, lav~es par l 'ac~tone et l 'Oher de p~trole afin de d61ipider et deshydrater les tissus. La poudre ainsi obtenne est laiss~e 15 h "h 5°C dans le m~thanol absolu sulfuriqoe h 5 p. cent ; apr~s addi t ion de chloro- forme et d'eau, Fester mOhyl ique est ex~rait comme ci-dessus. On purifie par C CM sur SiO,_, Merck en d6veloppant par le systi~me benzbne- ('~ther de p~trole-m~thanol 9:5:1. On a obtenu 0,3 mg (5.10 -4 raM) d'estcr d imbthyl ique de pt~ro- bi l ine de radioact ivi tb totale 9,7.10~ c / ran (rende- ment d ' incorpora t ion 2,2 p. c e n t ; activit6 sp~ci- fique 1,9.10 ~o c / m n / M soit 8,65 mCi/mM).

Cet ester est hy'drolys~ par HC1 6 N (10 nan "~ 100°C) et extrait successivement par l 'acOate d 'Ohyle et le butanol . La pt6robiline-~4C lib~r~e est purifi~e par CCM sur film de Side Merck en d~veloppant successivement par l 'ac6tone puts l%thanol h 95 p. cent. En fin de puri f icat ion 0,09 mg de pt~robi l ine soit 1,47.10-~ mM est o b tenu avec une radioactivi t~ de 3,2.106 c/mn

(activit6 sp~cifique 2,15.10 TM c / n m / m M soit 9,1 mCi/mM).

3) Incorporations.

Les pr~curseurs radioactifs sont dissous dans la d im~thyl formamide et injec%s aux chenil les d'Actias selene au niveau d 'une fausse patte h raison de 5 ,~l par animal. Ces in jec t ions sont r~alis~es en fin de 4 ~ stade larvaire. Apr~s 7 ]ours, lorsque tons les an imaux sont au stade L:., on les tue par cong~lation "h - -20°C et les conserve ainsi jusqu'h extract ion du pigment. Les in ject ions ont port6 sur 32 chenil les pour le coproporphyr ino- g6ne-IIp4C, sur 34 pour ]a pro toporphyr ine- lXaH et sur 16 chenil les pour la pt6robiline-14C. Dans Ie dern ie r cas, 6 seulement des 16 larves inject6es seront pr61ev6es au stade L5 ; les 10 autres pour- suivent no rmalement leur d6veloppement jusqu"h l ' imago.

4) Extraction et purification des pigments.

Les larves entibres, les exuvies de roues lar- vaires, les c uticules des nymphes , les ceufs pr~- lev6s dans l ' abdomen de jeunes femelles et les ailes des imagos sont tons t ra i l , s de la mbme fafon : le materiel est broy~ dans l 'ac~tone puts lavb par l ' acOone et le pen tane en vue d 'b l iminer l ipides, carot~noides et chlorophylles. L'extrac- t ion sons forme d'esters m6thyl iqnes est alors obtenue par t ra i tement par le m~thanol absolu sulfur ique h 1 p. cent pe nda n t 15 h. La solut ion m6thanol iqne cst ensuite neutralis~e par NaOH N, ad'ditionn6e d 'ean et de chloroforme. Les phases chloroformiques sont ~vapor6es jusqn 'h un volume min imum. L 'addi t ion de pentane , pr~cipi te alors les p igments bil iaires. Aprbs f l t ra t ion , ces pig- ments sont repris par le chloroforme et chroma- tograph%s sur plaque de SiO2 Merck dans le m61ange benz~ne~ the r de p~trole-m6thanol 9:5:1. L'ester de la phorcab i l ine I e s t ensuite purifi6 par une seconde CCM dans ce m~me syst~me puts par une 3 ~ dans l 'ac~tate d 'Ohyle. Pour Fester m~thy- l ique de la p t~robi l ine le solvant de CCM est le benz&ne-~ther de pOro.le-m~thanol 9:5:1 (pour des Rf de ees esters voir I6]).

5) Dosages et mesures.

Les dosages ont ~t6 r~alis~s par spectrophoto- m~trie : en solutio.n dans le benz~ne pour In pro- toporphyr ine- IX 0~ max 535 nm ~ = 10500) et dans le m6thanol pour la pt6robi l ine (i~ max 650 nln ~ = 15000). Pour la phorcab i l ine I (L max 545 rim) et la sarp6dobi l ine (L max 600 rim) on util ise le coefficient d 'absorpt ion de la m6so- b i l iv iol ine 0~ max 565 n m e = 12,00.0 dans le m6thanol) .

BIOCHIMIE, 1975, 57, n" 3.

Biosgnth~se de la phorcabiline. 371

Les radioact ivi lds ont 06 mesur6es par un sein- t i l la teur Nuclear-Chicago darts le tolubne scin- t i l lant, les valeurs report6es 6rant corrig6es

RESULTATS OBTENUS ET DISCUSSION.

1) Dosage des pigments au coors du d~veloppe- ment d'Aetias selene.

Les moyennes de t o u s l e s dosages r6aiisds sont pr6sent6es dans le tableau I.

Nous eonstatons que la phoreabi l ine , isol6e pr6- e6demment des ailes de Fimago, existe pra l ique- ment h tous les stades du d6veloppement de Fin-

La pt6robi l ine qui, comme nous le verrons est pr6curseur de la phoreabi l ine , a 6galement 616 dos6e (lableau I). Les deux pigments sont en quart- tit6 6ga!e darts les ceufs lnais le rappor t pterobi- l i ne /pho rcab i l i ne d iminue rap idement du stade L~ au stade L:,.

La sarp6dobil ine qui est le p igment p r inc ipa l de P. graphium sarpedon el P. weiskei [6] (el se trouve 6galemenl comme n6opt6robi l ine secon- daire ehez P. Phorcas) n'a jamais 6t6 d6teel6e au eours de ees exp6riences off les an imaux utilis6s 6talent loujours f ra iehement tubs et conservbs h - -30°C avant extraction. Nous l 'avons eependant

T A B L E A U I .

Dosage des pigments biliaires aux diffdrents slades d'Actias selene.

Pigment correspondant a :

Phorcabiline en ~M

Ptdrobiline en ~M

Rapport

Pt~!robiline "Phorcabiline

I 1 chenille t exuvie I I chenille i I chenille rl cuticole

L:~. L~, L ~ - - oe m ~ ~ L~ nymphe. [

0,01 0,025 0,035 1 0,15 0,02

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secte : nous l 'avons trouv6 dans le vitellus des ceufs et les chenil les L~ b r u n e s ; elle disparai t presque totalement au stade L.~ pour repara i t re aux stades L3, L 4 el Ln off elle peut 6lre isol6e de l 'h6molymphe, de la cul icule et de l 'exuvie de mue. Au niveau de la nymphe, nous l 'avons d6- tect6e en faible quant i t6 darts la cuticule b rnn e ; cependant des dissections successives nous ont permis de constater qu 'une masse verd~lre d 'abord diffuse et m61ang6e au corps gras, se concen t ran t peu h peu au conrs du temps, en contenai t une grande quantit6. Chez les femelles, nous avons observ6 qu 'aux derniers jours du stade nymphal , les chapelets d'ceufs se formaient darts cette masse verd:~tre e t s e coloraient peu ~ peu. Le dosage pr6sent6 darts le tableau I a 6t6 fait d 'une par t sur d.es .oeufs pr61evds chez une jeune femelle, d 'autre par t sur des ,ceufs pondus, dont la coque devenue b rune masquai t le p i g m e n t ; les r6sullats obtenus dans les deux cas sont iden- tiques.

trouv6e 5 l '6tat de traces dans les ailes d'Actias selene stoek6s depuis plusieurs ann6es [63.

On peut se demander si la sarp6dobi l ine ne se forme pas au cours du temps ehez des an imaux eonserv6s sans prdcaut ions part iculibres. La pho- tod6gradat ion de la phorcab i l ine fera l 'objet d 'une dtude ult~rieure.

2) Biosgnth~se de la phorcabiline.

Les r6sullals des exp6riences sont pr6sent6s dans le tableau II : le eoproporphyr inog6ne-I I I , la p ro toporphyr ine- IX ainsi que la pt6robi l ine ont ~t~ incorpor6s avec de bons rendements dans la phorcab i l ine d'Aetias selene. Ces r6sultais per- met tent de conclure que la phoreab i l ine d6rive de la pt6robi l ine et comme elle appar t ien t -h ]a s6rie IX ~,.

Le schbma de biosynth6se propos6 est done le suivant :

02

i eoproporphvr inogbne- I I I ..... -. ...... )- p ro toporphyr ine- IX ---'--:----~pt6robiline ............ )- phoreab i l ine

J i 'g 3'

- -2CO 2 - -CO (r6arrangement)

- -10 H BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 3.

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B i o s g n t h ~ s e de la p h o r c a b i l i n e . 373

S i g n a l o n s que n o u s a v o n s p u r 6 a l i s e r la t r a n s - f o r m a t i o n d e p t 6 r o b i l i n e en p h o r c a b i l i n e en c h a u f f a n t en t u b e sce l l6 sous v i d e 2 h i4 lt~0 ° F e s t e r m 6 t h y l i q u e de p t 6 r o b i l i n e d a n s u n s o l v a n t p r o t i q u e : le m 6 t h a n o l ( t r a v a u x e n cou r s ) .

A p a r t i r des e x p 6 r i e n c e s u t i l i s a n t la p t 6 r o b i - l ine- l~C, o n p e u t e n c o r e t i r e r les c o n c l u s i o n s c i - ap r6s . L o r s q u ' o n l a i s se la c h e n i l l e L 5 se t r a n s - f o r m e r en p a p i l l o n , la p h o r c a b i l i n e I des a i l es n ' e s t p a s r a d i o a c t i v e a lo r s que ce l le des ceufs r e t i r 6 s de l ' a b d o m e n des f e m e l l e s l ' es t . Ceci t e n d & p r o u v e r q u ' u n e p a r t i e au m o i n s d u p i g m e n t a c c u m u l 6 d a n s les oeufs p r o v i e n t de ]a l a r v e a lo r s que le p i g m e n t des a i l es est i s su d ' u n e b i o s y n t h 6 s e de novo.

R a p p e l o n s que la s y n t h 6 s e des p t 6 r i n e s de Pieris brassicae a 6 g a l e m e n t 6t6 d 6 m o n t r 6 e d a n s les ai les , les d e r n i e r s j o u r s du s t a d e n y m p h a l fgJ.

Remerciements.

Nous remercions les Professeurs E. Lederer et J. Bergerard pour l ' in t6r6t qu ' i ls ont port6 & ce t rava i l et le C.E.A. Saclay pour une subven t ion a y a n t faeili t6 l ' acha t des radio616ments. Nous remerc ions M. Lueotte pour avoi r mis h notre d isposi t ion nn ~levage de

cailles et M n¢ Seug6 qui nous a fourn i une par t ie des Actias ayan t servi h c e s expdriences.

R~su,~iI2.

Les pigments b i l ia i res d'Actias selene (Attacidae) ont (~td ~tudi6s h diffdrents stades de son d6veloppement . Le coproporphyrinog6ne-III14C, la p ro toporphyr ine - IX3H et la pt6robiline-14C ont 6t6 inject~s h des che- nilles. Ces t rois pr6eurseurs sont incorpor6s dans la phocabi l ine I, n6opt6robi l ine pr inc ipa le de ce papi l lon. Ce p igment appa r t i en t done h la s6rie IX ,! et la pt6ro- b i l ine est son pr6curseur direct. Une m6tbode de pr6- pa ra t ion de la p ro toporpbyr ine - IX radioact ive est reportde.

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