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BRANCHE Emilie Janvier 2009 Rapport bibliographique Master 2 : Génétique fonctionnelle et pathologie cellulaire (25 170 caractères) Formation du complexe glycoprotéique du VIH-1 en présence ou non de l’interface gp120/gp41 Institut de Biologie et Chimie des Protéines Unité Mixte de Recherche n° 5086 - CNRS / Université Lyon 1 7, Passage du Vercors - F-69367 Lyon Cedex 07 Responsable : Mr.VERRIER

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BRANCHE Emilie Janvier 2009

Rapport bibliographique

Master 2 : Génétique fonctionnelle et pathologie cellulaire

(25 170 caractères)

Formation du complexe glycoprotéique

du VIH-1 en présence ou non de

l’interface gp120/gp41

Institut de Biologie et Chimie des Protéines Unité Mixte de Recherche n° 5086 - CNRS / Université Lyon 1

7, Passage du Vercors - F-69367 Lyon Cedex 07

Responsable : Mr.VERRIER

1

Sommaire

Abbréviations ……………………………………………………………………………..p.2

Introduction………………………………………………………………………………...p.3

Partie I : Synthèse du complexe glycoprotéique d’enveloppe.

A- Synthèse du précurseur et modifications post traductionnelles………….p.6

B- Assemblage des sous-unités gp120 et gp41…………………………………p.8

C- Importance des domaines transmembranaire et

cytoplasmique de la gp41...……………………………………………………p.8

Partie II : Stabilisation de l’interface gp120-gp41 par création de liaisons covalentes.

A- Nécessité de délétion du domaine transmembranaire et cytoplasmique de

la gp41………………………………………………………………………….p.11

B- Stratégie évolutive de stabilisation : modèle SOS…………………………p.12

C- Antigénicité et immunogénicité du complexe stabilisé…………………...p.14

Partie III : Cas des protéines de fusion gp120/gp41 et gp120/∆gp41.

A- Stratégies de modification du site de clivage dans un contexte gp160 ou

gp140..………………………………………………………………………….p.16

B- Stabilité et incorporation dans un virion des protéines de fusion gp160 ou

gp14. ………………………………………………………………………… . p.17

C- Antigénicité et immunogénicité des protéines de fusion, stabilisées……p.18

Conclusions et perspectives……………………………………………………………..p.20

Références…………………………………………………………………………………p.22

2

Abbreviations

Ac: anticorps

AcN: anticorps neutralisants

CCR5: C-C chemokine receptor 5

CD4: cluster of differentiation 4

CD4i : CD4 induced (épitopes induits par la liaison du CD4)

CHR : C-terminal heptad repeat

C-terminal : extrémité carboxyterminale

CT : domaine cytoplasmique

CXCR-4:C-X-C chemokine receptor 4

env : enveloppe (gène)

Env : enveloppe (protéine)

GP: glycoprotéine

gp41: glycoprotéine 41

gp120: glycoprotéine 120

gp140: glycoprotéine 140 (gp120/∆41)

gp140unc: glycoprotéine 140 soluble non clivée

gp140SOS : glycoprotéine 140 soluble stabilisée par des ponts disulfure

gp160: glycoprotéine 160 (précurseur)

LTR: long terminal repeat

MPER : région externe de la gp41 proche de la membrane

N-terminale : extrémité aminoterminale

NHR : N-terminal heptad repeat

PP : pseudo-particules

PR : région polaire de la gp41

RE : réticulum endoplasmique

SIDA: syndrome de l’immunodéficience acquise

SP : peptide fusion de la gp120

TCLA : souche VIH de laboratoire (T-cell laboratory adapted)

TM : domaine transmembranaire

VIH : Virus de l’immunodéficience humaine

VLP : virus-like particules

3

Introduction

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un lentivirus de la

famille des rétrovirus. Il a été isolé pour la première fois en 1983 et identifié comme

l’agent causal du syndrôme de l’immunodéficience acquise (SIDA).

Le VIH-1 a un génome à ARN positif simple brin composé de neuf gènes (Figure 1).

Les trois principaux, gag pol et env, codent pour des protéines qui définissent en

partie la structure et sont communs à tous les rétrovirus. Les six autres sont des

gènes régulateurs (tat, rev et nef) et accessoires (vif, vpr et vpu).

Figure 1 : A) Organisation génétique et protéique du VIH-1. Les gènes sont en

italique. B) Le gène env code pour un précurseur protéique gp160 qui après

maturation donne une sous-unité gp120 de surface et une gp41 transmembranaire.

Ce génome est protégé par une nucléocapside, elle-même entourée par une capside

composée de protéines p24. Puis, il y a la matrice protéique composée de protéines

p17. Une enveloppe, composée de restes de la membrane des cellules infectées, dans

laquelle sont ancrées les glycoprotéines (GP) d’enveloppe virale dont une gp41,

4

transmembranaire, et une gp120 de surface liée à la précédente de façon non

covalente, entoure l’ensemble (Figure 2).

Figure 2 : Structure générale de la particule virale du VIH-1

Le SIDA reste un problème majeur de la santé publique à travers le monde : d’après

ONUSIDA, le nombre de personnes vivant avec le VIH à la fin de l’année 2007 était

estimé à 33,2 millions. De plus la situation s’aggrave de jours en jours avec

l’émergence de nouveaux virus résistants aux médicaments et le nombre toujours

élevé de néo-infections (2,7 millions en 2007 d’après ONUSIDA).

Il y a donc un besoin urgent de trouver un vaccin anti-VIH efficace. Le principal

problème dans les efforts effectués pour trouver ce vaccin est l’incapacité à faire un

immunogène qui génère des anticorps neutralisants (AcN) à large spectre. Les AcN

inhibent l’entrée du virus dans les cellules cibles, en empêchant par exemple la

liaison de la GP d’enveloppe avec le récepteur (CD4) ou avec le co-récepteur (CCR5

ou CXCR4). Et les AcN à large spectre sont efficaces dans différents isolats primaires

de VIH-1. Ces AcN ont été trouvés dans le sérum de quelques patients infectés par le

VIH-1 et ils sont au nombre de six : 2G12, b12, 447-52D, 2F5, 4E10 et Z13. Cependant

l’apparition de ces AcN à large spectre est tardive et rare chez les patients

séropositifs. L’objectif d’un vaccin prophylactique pourrait être l’induction de ces

AcN à large spectre.

5

La GP est le seul composant viral exposé à la surface des virions et représente la cible

des AcN, 2G12, b12 et 447-53D dirigés contre la gp120 et 2F5, 4E10 et Z13 contre la

gp41. Ainsi la GP d’enveloppe du VIH-1 est un immunogène de choix pour

l’induction des AcN.

Les premiers immunogènes d’enveloppe produits ont dans un premier temps donné

lieu à des résultats prometteurs. Ces immunogènes correspondaient à la gp120

monomérique, puisque exprimée seule, cette protéine est incapable de s’oligomériser

[1]. Les Ac dirigés contre la gp120 permettaient de neutraliser l’infection des cellules

en culture par des souches virales de laboratoire. Cependant, il est apparu très vite

que si ce vaccin induisait des Ac capables de neutraliser l’infection des cellules par

des souches de VIH-1 adaptées à la culture (TCLA), ces anticorps se révélaient

incapables de neutraliser des virus primaires. La difficulté d’induction des réponses

humorales neutralisantes dirigées contre des isolats primaires du VIH-1 avec cet

immunogène [2] est sûrement due au fait que la structure antigénique de la protéine

gp120 ne mime pas le trimère fonctionnel de la protéine d’enveloppe du VIH-1 [3].

En effet, des différences significatives ont été observées entre les propriétés

antigéniques et immunogéniques d’une enveloppe native présente à la surface des

virions et une protéine gp120 monomérique [4]. Les Ac induits après immunisation

de souris avec le monomère gp120 reconnaissent moins efficacement la GP

d’enveloppe trimérique fonctionnelle que le monomère gp120 [2], confirmant la

différence structurale et conformationnelle entre le trimère d’enveloppe natif et le

monomère gp120. Tout ceci nous montre bien la nécessité d’utiliser la forme

trimérique du complexe d’enveloppe pour l’induction d’AcN à large spectre.

6

Partie I : Synthèse du complexe glycoprotéique

d’enveloppe

A-Synthèse du précurseur et modifications post-

traductionnelles.

La GP d’enveloppe est codée par le gène env en un précurseur glycoprotéique, la

gp160 qui est clivée par des endoprotéases cellulaires de la famille des furines au

niveau d’un site Arg-Glu-Lys-Arg↓ pour former les deux sous-unités qui composent

la GP d’enveloppe : la gp120, la sous-unité de surface liant la gp41,

transmembranaire [5] (Figure 3).

Figure 3 : Représentation

schématique du précurseur

gp160.

A) Dans la gp120 : le peptide

signal, les cinq régions constantes

(C1, C2, C3, C4, C5) ainsi que les

cinq boucles variables (V1, V2, V3,

V4, V5).

Dans la gp41 : le peptide fusion, la

région polaire (PR), la N-terminal

heptad repeat (NHR), la C-

terminal heptad repeat (CHR), la

région externe proche de la

membrane (MPER), le domaine

transmembranaire (TM) et la

queue cytoplasmique (CT). B) Le

peptide signal est indiqué en noir

(SP). La glycoprotéine de surface

gp120 est indiquée en bleu (les

régions conservées en bleu foncé (C1-C5) et les boucles variables en bleu clair (V1-V5)). La

glycoprotéine transmembranaire gp41 est représentée en gris et contient une boucle formée par un

pont disulfure. Les sites de glycosylation sont représentés en noir. Les résidus cystéines sont

numérotés et indiqués en rouge, ainsi que les ponts disulfure.

Après la synthèse de la chaine polypeptidique, le précurseur gp160 est fortement

glycosylé (1) durant le passage à travers le réticulum endoplasmique (RE) [5]. Il existe

7

des O et des N-glycosylations ; mais on retrouve majoritairement des N-

glycosylations, dans la gp160, présentes sur un site précis Asn-X-Ser/Thr (où X

représente un acide aminé quelconque sauf une proline) [6]. Certaines N-

glycosylations facilitent la génération de ponts disulfure (2) afin que le précurseur ait

la bonne conformation et d’autres sont impliquées dans le masquage d’épitopes [7].

Dans le RE, le précurseur est aussi trimérisé via des interactions non covalentes entre

les parties gp41 (3). Puis des endoprotéases de la famille des furines clivent ce

précurseur gp160 en gp120 et gp41 dans le trans golgi (4). Le complexe d’enveloppe

fonctionnel est un homotrimère d’hétérodimères contenant trois sous-unités gp120 et

trois sous-unités gp41 associées par des liaisons non covalentes. Ces complexes

d’enveloppe complètement maturés sont ensuite transportés à la surface cellulaire (5),

grâce à la séquence signal se trouvant dans la région N-terminale de la gp120, où ils

sont incorporés dans les virions bourgeonnants (6) (Figure 4).

Figure 4 : Cinétique de maturation de la GP d’enveloppe du VIH-1

8

B-Assemblage des sous-unités gp120 et gp41.

L’association entre les sous-unités gp120 et gp41 implique des interactions non

covalentes essentiellement entre des résidus de l’ectodomaine de la gp41 [8] et des

résidus des structures discontinues de la gp120 comprenant notamment les

extrémités N et C terminales [7, 9]. Deux études récentes confirment l’interaction

entre l’ectodomaine de la gp41 et les régions C1 et C5 de la gp120 [10, 11].

Le complexe d’enveloppe joue un rôle important dans les étapes précoces de

l’infection par le VIH-1 ; la gp120 se lie au récepteur des cellules cibles (CD4) puis au

co-récepteur (CCR5 ou CXCR4), entraînant des changements de conformation de la

GP, menant à l’exposition du peptide fusion de la gp41. Cette étape permet à la

membrane du virion de fusionner avec la membrane de la cellule afin d’expulser la

capside contenant le matériel génétique et les enzymes nécessaires à la réplication

virale (transcriptase inverse, intégrase) [12].

L’importance de l’assemblage de la gp120 et de la gp41 est illustrée par les deux

fonctions principales de la GP d’enveloppe. D’une part, la gp120 protège la gp41 des

AcN lors des étapes précoces de l’infection. D’autre part, la labilité de cette

interaction permet à la gp120 de se libérer très facilement des virions et ainsi de

leurrer le système immunitaire. On remarque que si les gp41 des isolats primaires

ont une grande capacité à retenir la gp120, un certain pourcentage est malgré tout

libéré dans le milieu extracellulaire. Cette labilité pose un réel problème pour la

conception d’immunogène stable utilisant un complexe gp120-gp41, c’est pour cela

que différentes stratégies ont été mises en place afin de stabiliser cette interface.

C- Importance des domaines transmembranaire et

cytoplasmique de la gp41.

Le domaine transmembranaire (TM) de la gp41 est composé de 22 acides

aminés, hautement conservés dans les différents isolats du VIH-1, ancrés dans la

bicouche lipidique. Cette région joue un rôle important dans la fusion puisque la

9

délétion de cette région inhibe la fusion de la membrane du virus avec celle de la

cellule [13]. Dans les études précédentes, la délétion du domaine transmembranaire

s’accompagnait forcément de celle du domaine cytoplasmique, récemment le

domaine transmembranaire a été substitué par celui du virus influenza, permettant

ainsi de conserver le domaine cytoplasmique. Ceci a confirmé, que cette partie était

directement impliquée dans la formation d’une protéine d’enveloppe compétente

pour la fusion [14].

La partie adjacente au domaine transmembranaire, la région externe proche de

la membrane (MPER) joue également un rôle dans le processus de fusion et par

conséquent dans l’entrée virale. Elle se compose de 23 acides aminés dont la

séquence est très conservée au sein des différents isolats du VIH-1. Cette région est

importante pour la conception d’un immunogène vaccinal puisqu’elle est la cible de

deux AcN, 4E10 et 2F5 (Figure 5). Ces deux AcN reconnaissent des épitopes linéaires,

2F5 en N-terminale et 4E10 en C-terminal de la MPER [15].

La queue cytoplasmique des protéines d’enveloppe des rétrovirus est

significativement plus longue que celle des lentivirus, suggérant qu’elle joue un rôle

important. Des études de mutagénèse de cette région ont montré qu’elle pouvait

moduler le niveau de fusion, l’expression de la GP d’enveloppe à la surface et

l’incorporation des protéines matures dans les particules virales [16]. En effet, le fait

de tronquer cette région augmente la fusion et l’expression de la GP d’enveloppe à la

surface cellulaire [17]. Une étude a clairement démontré que le domaine

cytoplasmique via une interaction avec une protéine de la matrice jouait un rôle

important dans l’incorporation de la GP dans les virions bourgeonnants dans

certains types cellulaires. En effet, les résultats obtenus ont démontré que dans la

majorité des lignées cellulaires T et dans les cellules primaires qui servent de cible

naturelle à l’infection du VIH-1 in vivo, la queue cytoplasmique de la gp41 est

essentielle pour l’incorporation efficace dans les virions, puisque la délétion de ce

domaine diminue fortement l’incorporation de GP d’enveloppe [18]. Cette même

étude a également constaté que dans quelques types cellulaires (Hela et MT-4), le fait

de tronquer la gp41 n’a qu’un léger effet sur l’incorporation. Le rôle du domaine

10

cytoplasmique dans l’incorporation est donc dépendant du type cellulaire, suggérant

ainsi que d’autres facteurs joueraient un rôle dans les processus d’incorporation.

Le domaine transmembranaire et la queue cytoplasmique jouent également un rôle

sur la stabilité de la GP d’enveloppe, puisque la délétion d’une partie du domaine

transmembranaire et du domaine cytoplasmique résulte en une diminution de la

stabilité de cette protéine [19].

Figure 5 : Modèle structurale de la GP d’enveloppe du VIH-1 et localisation des

épitopes reconnus par les principaux AcN à larges spectre dont 2F5 et 4E10 dans la

MPER de la gp41.

11

Partie II : Stabilisation de l’interface gp120-gp41 par

création de liaisons covalentes.

A- Nécessité de délétion des domaines transmembranaire

et cytoplasmique de la gp41.

Dans le but de produire des grandes quantités de GP d’enveloppe pour

produire un vaccin sous-unitaire, le complexe d’enveloppe a été exprimé dans

différentes lignées cellulaires, malheureusement ce complexe étant

transmembranaire il est insoluble et délicat à sur-exprimer. Les données précédentes

indiquent l’importance des domaines transmembranaire et cytoplasmique, et on

pourrait facilement en déduire que la délétion de ces deux domaines permettrait

d’obtenir une GP d’enveloppe stable et soluble. Néanmoins, la conception de cette

gp140 (c'est-à-dire gp120/∆gp41) n’a pas été simple puisque la délétion a du être

faite à un acide aminé près. En effet, nous avons vu précédemment que l’épitope de

l’AcN 4E10 se trouvait dans la partie C-terminale de la région MPER, juste en amont

du domaine transmembranaire. Pour l’élaboration d’un immonogène susceptible

d’induire une réponse anticorps neutralisante, il est impensable d’éliminer un

épitope reconnu par un AcN.

Après différents essais, la GP gp120/gp41 délétée précisément du domaine

transmembranaire et cytoplasmique a été créée et a été nommée gp140.

Cette protéine soluble possède la capacité de s’oligomériser. Les oligomères

trimériques gp140 peuvent induire des AcN mais en faible quantité. Cette faible

induction pourrait être dûe au caractère labile de l’association entre gp120 et ∆gp41,

résultant en de multiples formes d’oligomères dans les préparations de gp140 [20].

C’est pour augmenter la stabilité de ce complexe que deux stratégies de stabilisation

ont été développées. L’une utilisant l’ajout de ponts disulfures entre les différentes

sous-unités du complexe d’enveloppe et l’autre éliminant le site de clivage.

12

B- Stratégie évolutive de stabilisation : modèle SOS.

L’instabilité entre les sous-unités gp120 et gp41 joue probablement un rôle essentiel

dans les changements de conformation déclenchés par la liaison de la gp120 avec le

récepteur CD4. Mais cette instabilité pose des problèmes pour l’expression du

complexe d’enveloppe, notamment lorsqu’il s’agit d’exprimer des mutants

démasquant des épitopes. De plus la dissociation de gp120 mène à l’exposition

d’épitopes non neutralisants [21, 22], alors que c’est l’exposition des épitopes

neutralisants ou inhibiteurs qui est recherchée pour la création d’un immunogène.

Cette labilité a nécessité la mise au point de stratégies stabilisantes, comme

l’introduction de ponts disulfure artificiels entre les deux sous-unités afin de créer la

protéine gp140SOS.

La gp140SOS est la première construction qui utilise une stratégie de stabilisation.

Cette protéine recombinante contient des ponts disulfure reliant les deux sous-unités

formant la GP d’enveloppe [7]. L’étude de ces protéines a montré qu’un

positionnement approprié des ponts disulfure est essentiel. En effet, parmi différents

mutants évalués, seule la protéine double mutante ayant des Cystéines aux positions

501 dans la gp120 et 605 dans la gp41 donne un complexe protéique gp120-gp41

stable, correctement replié, ayant des propriétés antigéniques favorables [22].

L’introduction de Cystéines en d’autres positions peut avoir un effet négatif sur le

bon repliement de la protéine ou sur l’efficacité de formation des ponts disulfure [7].

Malgré une réussite dans la stabilisation de l’interface gp120-gp41, la gp140SOS

présente un manque de stabilité au niveau des interactions entre les sous-unités gp41

d’un trimère, puisqu’elle se présente exclusivement sous forme monomérique. Afin

de résoudre ce problème, la substitution d’une Pro par une Ile en position 559 (en N-

terminale de la gp41) en plus de la mutation SOS a permis de créer un complexe

protéique plus stable au sein duquel l’interaction gp41-gp41 est solidifiée [9, 23,1].

Cette nouvelle protéine, appelée gp140SOSIP, est majoritairement exprimée sous

forme trimérique.

Une étude récente a observé que la substitution de 5 résidus présents dans les

gp140SOS ou gp140SOSIP d’un isolat de sous-type B du VIH-1 par ceux d’un isolat

13

de sous-type A (Ile 535 Met, Glu 543 Leu, Ser 553 Asp, Lys 567 Glu et Arg 588 Gly)

réduit l’hétérogénéité des formes oligomériques dans les surnageants de culture [24].

Cette dernière, nommée gp140SOSIP KNH1144, est trimérisée plus efficacement que

la gp140SOSIP. En effet, on observe une réduction importante de la quantité de GP

dimériques et tétramériques à la surface cellulaire alors que la quantité de trimères

reste inchangée [25].

L’évolution des constructions de gp140 stabilisées par des ponts disulfure est

représentée en Figure 6.

Figure 6 : Schéma des différentes constructions de gp140 recombinantes, SOS,

stabilisées par des ponts disulfure. Les ponts disulfure sont représentés en rouge, la

mutation qui a permis la conception de la gp140SOSIP en vert et celles ajoutées dans

la GP140SOSIP KNH1144 en bleu.

14

C- Antigénicité et immunogénicité du complexe stabilisé.

La protéine gp140SOS est clivée et antigénétiquement similaire à la protéine

d’enveloppe native. En effet, les épitopes neutralisants qui sont exposés et les non-

neutralisants qui sont cachés dans la GP d’enveloppe native, le sont également dans

la protéine gp140SOS [7, 22]. La réalisation de différentes immunoprécipitations a

mis en évidence que cette gp140SOS était bien reconnue pas les AcN 2G12, b12, 2F5

et 4E10 mais pas par les Ac non-neutralisants (comme 23A, 2.2B) [26]. Le masquage

des épitopes non-neutralisants peut être la conséquence de la formation de ponts

disulfure, mais ceci est encore discuté. La préservation des épitopes neutralisants

dans les protéines gp140SOS (b12 et 2G12 dans la gp120 et 2F5 et 4E10 dans la gp41)

combinée avec l’élimination des épitopes non-neutralisants est intéressant pour la

mise au point d’un immunogène. Toujours est-il que cette protéine est exprimée sous

forme monomérique. Par conséquent sa structure reste éloignée de celle d’une GP

native. C’est pourquoi des études ont optimisé cette stratégie en créant la

gp140SOSIP [9,23]. Cette protéine présente des propriétés de trimérisation améliorées

[9, 12], et les AcN, b12, 2G12 et 2F5 ont une plus grande affinité pour les formes

trimériques que monomériques [7]. La réactivité de cette protéine a été étudiée, et il a

été observé que la mutation ajoutée dans cette gp140SOSIP n’affectait pas

l’antigénicité par rapport à la gp140SOS. En effet, les épitopes neutralisants comme

2G12, b12, 2F5 et 4E10 sont toujours bien exposés [9]. Des tests d’immunisations ont

été réalisés sur des lapins et il a été observé que cette gp140SOSIP était capable

d’induire une activité neutralisante contre certaines souches du VIH-1, comme SF162

ou NL4/3 ou MN ou encore JR-FL. Cependant cette activité neutralisante varie entre

les lapins immunisés et il est difficile d’induire une réponse neutralisante efficace

dans tous les isolats primaires hétérologues du VIH-1 [12].

Différentes immunoprécipitations ont été réalisées afin d’analyser l’antigénicité de la

gp140SOSIP KNH1144. Les résultats diffèrent sur la capacité de reconnaissance de

cette protéine par les AcN 2F5 et 4E10. Dans une première étude, ces AcN ne sont pas

capable de se lier à la protéine, concernant 2F5, il est expliqué que la séquence de

cette GP recombinante contient un polymorphisme au niveau de cet épitope qui

15

serait suffisant pour empêcher sa reconnaissance [27]. Et dans une deuxième étude,

ces AcN reconnaissent aussi bien cette protéine gp140SOSIP KNH1144 que la

GP140SOS [24]. En revanche, aucune ambigüité n’est observée sur les AcN dirigés

contre la gp120. En effet les épitopes 2g12 et b12 sont parfaitement exposés dans ces

deux protéines.

Ce concept de stabilisation par ponts disulfure est en constante évolution, afin d’être

affiné et amélioré. Par conséquent, la protéine possédant les propriétés antigénique et

immunogénique les plus favorables pour un vaccin sous unitaire est la gp140SOSIP

KNH1144.

16

Partie III : Cas des protéines de fusion gp120 + gp41 et

gp120+ ∆gp41

A- Stratégies de modification du site de clivage dans un

contexte gp160 ou gp140.

Pour augmenter la stabilité du complexe trimérique d’enveloppe, une autre stratégie

est également décrite. Elle consiste en une modification dans le site de clivage

protéolytique afin de fusionner soit la gp120 et gp41 pour obtenir une gp160 non

clivée (gp160unc) soit la gp120 et la ∆gp41(délété du domaine transmembranaire et

cytoplasmique) et ainsi obtenir une gp140 non clivée (gp 140unc).

Le site de clivage des endoprotéases de la famille des furines se trouve dans les

précurseurs gp160 au niveau d’acides aminés spécifiques Arg-Glu-Lys-Arg↓.

Différentes constructions de GP non clivées ont été décrites. Par exemple la

substitution de la séquence lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Val (la

partie c-terminale de la gp120 et les deux premiers résidus de la gp41) par un motif

hexamérique Leu-Arg [7], ou la substitution de la deuxième ou des deux Arg par des

Ser [21, 3], ou encore la substitution de la première Arg par une Ile et de la Lys par

un Gly [26]. Quoi qu’il en soit, toutes ces constructions permettent d’obtenir des

gp160unc ou des gp140unc où les sous-unités de la GP sont fusionnées afin d’avoir

des protéines d’enveloppe stables (Figure 7).

Figure 7 : Evolution des GP non clivées.

17

B- Stabilité et incorporation dans un virion des protéines

de fusion gp160 ou gp140.

Une simple mutation dans le site de clivage est nécessaire et suffisante pour

permettre la formation d’oligomères stables. La trimérisation du précurseur gp160 se

produit avant le clivage, ainsi la modification du site de clivage n’empêche pas

l’oligomérisation de la protéine (Figure 4). La gp140unc est exprimée sous formes

trimérique, monomérique et tétramérique [28].

Bien que la théorie ait longtemps indiqué que seules les protéines d’enveloppe

clivées étaient incorporées dans les virions, des protéines d’enveloppe non clivées

sont capables de former des spicules dans l’enveloppe virale [14, 29]. Les protéines

gp160 non clivées sont donc transportées à la surface cellulaire et incorporées dans

les virions bourgeonnants. Toutefois ces virions seront essentiellement non infectieux

[29].

Les stratégies alternatives pour exposer la GP d’enveloppe du VIH-1 sont en

évolution permanente, la plus récente est l’incorporation de cette GP dans des

pseudo-particules virales comme les virus-like particles (VLP). Ce sont des particules

hautement organisées qui s’auto-assemblent à partir d’un antigène structural dérivé

de virus, comme le précurseur Gag dans le cas des VLP du VIH-1. En effet, il code

principalement pour les protéines de structure de la matrice, de la capside et de la

nucléocapside et est capable de s’auto-assembler en VLP. Dans le but d’induire une

réponse humorale efficace dirigée contre la GP d’enveloppe du VIH-1, Env est

associée à Gag. Ce procédé permet de présenter l’antigène dans une conformation

proche de la conformation native. De plus, la forme particulaire facilite la prise en

charge de ces VLP par les cellules présentatrices de l’antigène. Ces VLP ont donc un

avenir très prometteur dans la recherche d’un vaccin contre le VIH-1.

Concernant la gp140unc, nous avons vu précédemment que la queue

cytoplasmique permettait une incorporation efficace de la GP d’enveloppe dans les

virions bourgeonnants, par conséquent cette GP est assez faiblement incorporée.

18

Mais cette protéine est également délétée du domaine transmembranaire, elle ne peut

donc ni s’ancrer dans une membrane ni être incorporée dans les virions. Ces

protéines étant solubles, elles ne sont pas utilisées dans les VLP ou dans les PP.

C- Antigénicité et immunogénicité des protéines de

fusion stabilisé.

À l’exception de l’anticorps 2G12, les AcN b12, 17b et 2F5 reconnaissent la GP

d’enveloppe non clivée plus efficacement que la GP d’enveloppe clivée [20]. Ce n’est

pas simplement dû à la diminution de la dissociation de la gp120 qui est associée aux

molécules défectueuses pour le clivage. En effet, il semblerait que le clivage

protéolytique entraînerait une conformation de la GP où les différents épitopes

seraient plus efficacement masqués [21]. Cet avantage immunogénique n’est décrit

que dans une publication et est couramment contesté. Il s’avèrerait plutôt que la

protéine 140unc est antigénétiquement et structuralement différente des protéines

clivées [14]. Il y a des épitopes exposés sur la protéine gp140unc qui ne sont pas

exposés sur les virions natifs [7]. De plus les AcN anti-gp120 se lient plus fortement

et plus rapidement aux gp140SOSIP qu’aux gp140unc alors que l’inverse est observé

pour les anticorps non-neutralisants [9, 26]. Deux possibilités peuvent être à l’origine

de ces différences : les épitopes de neutralisation seraient générés seulement après le

clivage protéolytique du précurseur gp160 et/ou l’élimination du site de clivage

perturberait la structure de la protéine d’enveloppe et donc les épitopes

neutralisants. Il apparaîtrait que la suppression du site de clivage altèrerait la

conformation des sous-unités gp120 [7], car la maturation protéolytique permet un

subtil mais néanmoins important ajustement de la conformation de la GP

d’enveloppe [21].

Bien que ces protéines gp140unc soient oligomériques et stable du fait de

l’élimination de l’interface entre gp120 et gp41, on peut se demander si elles miment

vraiment le complexe glycoprotéique d’enveloppe natif et si elles sont de bonnes

19

protéines pour l’élaboration d’un immunogène d’enveloppe susceptible d’induire

des AcN à large spectre.

20

Conclusions et perspectives

Deux types de modifications ont été développées afin de stabiliser le complexe

glycoprotéique d’enveloppe du VIH-1. D’une part, des ponts disulfure ont été

introduits entre les sous-unités gp120 et gp41 formant le complexe. Dans cette

stratégie, différents degrés de stabilisation ont été établis. D’autre part, ces sous-

unités ont été fusionnées par mutation dans le site de clivage. Ces GP recombinantes,

d’un point de vue antigénique et immunogénique, ont des propriétés intéressantes

puisqu’elles sont reconnues efficacement par des AcN (comme 2G12, b12, 2F5 et

4E10) et qu’elles sont capables d’induire ces AcN après administration dans des

modèles animaux. Néanmoins, cette induction n’est pas suffisante pour l’élaboration

d’un candidat vaccin anti-VIH. C’est pourquoi ces modifications stabilisantes sont

aujourd’hui combinées avec d’autres, afin d’exposer au mieux les épitopes des AcN

pour induire fortement ces Ac.

Les plus étudiées sont les délétions de boucles variables ou les déglycosylations de

certains sites de N-glycosylation. En effet, certaines boucles variables de la gp120 et

certains sucres masquent des épitopes qui peuvent avoir un rôle important pour la

neutralisation.

La délétion de boucles variable la plus étudiée est celle de la boucle variable V2

puisqu’elle peut augmenter l’immunogénicité de la GP d’enveloppe du VIH-1 [3, 29].

Concernant les mutations des sites de glycosylations, une étude récente a observé

que des macaques immunisés avec un immunogène d’enveloppe délété de cinq

glycanes montraient clairement une meilleur réponse humorale neutralisante que les

animaux immunisés avec la protéine sauvage [30].

Une autre étude a été réalisée sur une GP d’enveloppe mutée sur quatre sites de

glycosylation et délétée de la boucle V2. On constate que les AcN à large spectre 447-

52D, 2F5 et b12 se lient fortement à ces mutants [31]. On peut donc penser que les

boucles variables et les glycanes interagissent fortement, modifiant ainsi les

propriétés d’antigénicité.

Le complexe glycoprotéique d’enveloppe du VIH-1 offre tout un panel de mutations

possibles qui permettent d’augmenter son antigénicité mais surtout son

21

immunogénicité. Mais les plus prometteuses sont les mutations sur le manteau de

glycanes. Les recherches doivent donc être poursuivies afin de trouver quelle(s)

mutation(s) ou quelle(s) combinaison(s) de mutations seraient les plus appropriées

pour la conception d’un immunogène capable de neutraliser différents isolats du

VIH. Mon rapport technique aura justement pour objectifs d’étudier l’influence de

certaines mutations de sites de glycosylation dans un contexte gp140unc.

22

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