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BREVET DE TECHNICIEN SUPRIEUR BIOANALYSES ET CONTRLES

Epreuve E3 - Unit U31

Biochimie et technologies d'analyse

B.T.S. BIOANALYSES ET CONTROLES

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Biochimie et technologies d'analyse

BIOANALYSES EN PANIFICATION

Le pain reprsente une part importante de l'apport glucidique dans la plupart des pays europens. La composition de la farine et la panification font l'objet d'analyses et de contrles de faon obtenir un pain de qualit. La panification correspond l'ensemble des processus mcaniques (ptrissage), thermiques (cuisson et refroidissement), biochimiques et microbiologiques (notamment hydrolyse de l'amidon, fermentations) mis en jeu.D'autre part, l'urgence des problmes sanitaires lis l'alimentation conduit l'industrie pharmaceutique mettre au point des mdicaments visant rguler l'absorption des glucides, en particulier pour les diabtiques.

1 - Analyse de la farine. (26 points)L'laboration des farines occupe aujourd'hui une place importante dans l'industrie cralire. Le choix d'une farine repose sur des analyses quantitatives et qualitatives de sa composition.

1.1- Dtermination du taux de cendres. (3 points)La classification des farines repose sur leur taux de cendres (document 1a). Le protocole de dtermination de ce taux est prsent dans le document 1b.

1.1.1- A quoi correspondent les cendres ?1.1.2- Sachant que m0 = 3,150 g et m! = 0,014 g, dterminer le taux de cendre de la farine analyse. Cette farine est-elle utilisable pour la fabrication de pains ordinaires ?

Donne : Humidit de la farine H = 15,5 % (m/m).

1.2- Dtermination de la teneur en protines. (5,5 points)La teneur en protines des farines est value par dosage de l'azote total par la mthode de Kjeldahl. Le protocole est rsum dans le document 2. 1.2.1- Calculer la masse approximative de farine peser.

Effectuer le calcul en fixant une masse d'azote prsente dans la prise d'essai rpondant aux exigences du protocole.

1.2.2- crire les quations des ractions mises en jeu.tablir la formule littrale donnant la masse mN d'azote en grammes contenu dans m grammes de farine en fonction de VD et Vi.

1.2.4- En dduire la formule littrale donnant la teneur en protines de la farine analyse en g pour 100 g de matire sche en fonction de m(g), V0 (mL), V-\ (mL) et H (humidit, % m/m).

Donnes : MN = 14 g.mol'1Le taux de protines de la farine analyse est d'environ 10 % (en masse de l'extrait sec).

Humidit de la farine H = 15,5 % (m/m). La teneur en azote des protines de la farine est de 17,5 % (m/m).

1.3 - Analyse des protines de la farine . (17,5 points)La mthode de rfrence permettant de sparer les protines de la farine aprs extraction est l'lectrophorse bidimensionnelle en gel polyacrylamide. Elle combine une isolectrofocalisation et une lectrophorse en prsence de sodium dodcyl sulfate, SDS (document 3).

Un lectrophorgramme est prsent dans le document 4. 1.3.1- Isolectrofocalisation (IEF).

1.3.1.1- Indiquer la proprit physico-chimique des ampholites ainsi que leur rle.

1.3.1.2- Quel est le critre de sparation des protines par cette mthode ? Expliquer brivement le principe.

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Coefficient : 31.3.2- lectrophorse en gel de polvacrvlamide en prsence de SDS (SDS PAGE).

La composition du tampon d'quilibration prparant le gel d'IEF la sparation en SDS PAGE est dcrite dans le document 3. Le dithiothritol peut tre remplac par le mercaptothanol.

1.3.2.1- Indiquer le rle de l'ure et du dithiothritol en prcisant leur mode d'action respectif.

1.3.2.2- Quels sont les rles du SDS dans cette tape de l'exprience ? Justifier en indiquant tes proprits physico-chimiques de la molcule et son mode d'action.Prciser le critre de sparation des protines lors de cette seconde migration.

1.3.2.3 - Identifier tes lectrodes 1 et 2 (document 4). Justifier.1.3.2.4- La composition de plusieurs gels de polyacrylamide (1 4) est

dcrite dans le document 3. Prciser les rles respectifs de l'acrylamide et du bis-acrylamide.

1.3.2.5- Un premier essai avec le gel 3 indique une migration verticale insuffisante des protines. Quel(s) autre(s) gel(s) doit-on tester pour amliorer la sparation ? Justifier.

1.3.3- Analyse des rsultats. Trois groupes de protines A, B, C, ont t identifis comme correspondant des sous-units de la glutnine (document 4).Une glutnine fonctionnelle est constitue d'un assemblage de sous-units de haut poids molculaire (HMW glutenins subunits ou HMW-GS) et de sous-units de faible poids molculaire (LMW glutenins subunits ou LMW-GS).

1.3.3.1- Identifier le groupe des HMW-GS. Justifier.1.3.3.2- Caractriser les deux autres groupes partir de leur

situation sur l'lectrophorgramme.

1.3.4- Structure d'une LMW-GS. Le document 5 reprsente une partie d'une LMW glutenin subunit .

1.3.4.1- Quel motif structura! secondaire parat sur cette molcule ? Indiquer les liaisons qui le stabilisent et les groupements impliqus.

Avec les gliadines, les glutnines forment dans la pte pain un rseau visco-lasttque appel gluten.Lors du ptrissage de la farine, on ajoute parfois des agents rducteurs afin de diminuer l'lasticit de la pte.

1.3.4.2- Interprter cette dmarche en indiquant la cible de ces agents rducteurs.

2 - Dgradation de l'amidon et fermentation panaire. (34 points)2.1- Structure de l'amidon et de ses produits d'hvdrolvse. (4,5 points)

L'amidon est form de 2 constituants : l'amylose (5 30 %) et l'amylopectine (70 95 %). L'amylose est un polymre non ramifi de rsidus de D-glucose unis par des liaisons (1 -> 4). L'amylopectine correspond de l'amylose ramifie. Les ramifications correspondent des rsidus d'isomaltose : -D glucopyranosyl (1 -> 6) D-glucopyrannose.

2.1.1- crire la structure dveloppe de l'amylopectine en reprsentant un branchement.Lors de la panification l'amidon est dgrad en prsence d'amylases ou diastases : -amylases et -amylases.Les -amylases catalysent l'hydrolyse au hasard des liaisons (1 -> 4).Les -amylases catalysent l'hydrolyse des chanes d'amidon partir de leur extrmit non rductrice et librent du -maltose : -D-glucopyranosyl (1 -> 4) -D-glucopyrannose.

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2.1.2- crire la raction catalyse par les (3-amylases (formules chimiques exiges).2.1.3- L'hydrolyse de l'amidon peut tre quantifie par mesure du pouvoir rducteur. Interprter

cette observation.2.2- Dosage de l'a-amylase d'une farine. (6 points)

2.2.1- Analyse du protocole (document 6). 2.2.1.1- Quel est le principe de la mthode de dosage propose ? 2.2.1.2- Quel est le rle du Trizma Base ? 2.2.1.3- Indiquer avec prcision la prparation du blanc a-amylase .

2.2.2- Rsultats. 2.2.2.1- Sachant que l'absorbance mesure 410 nm est de 0,748, calculer la

concentration d'activit catalytique. du surnageant (U.mL-1).2.2.2.2- Sachant que le volume de surnageant obtenu aprs extraction est de 4,9

mL, calculer l'activit -amylasique de la farine analyse en U.g-1 de farine.

Donnes : Une unit d' -amylase (U) provoque la libration d'une micromole de nitro-4-phnol par minute dans les conditions de l'exprience.Absorbance linique molaire du 4-nitrophnol dans les conditions de lecture

= 17,8.103mol-1.L.cm-1.2.3- Caractrisation d'un inhibiteur des -amvlases. (7,5 points)

L'acarbose est un inhibiteur de l' -amylase conu en vue d'une rgulation de l'absorption intestinale du glucose.Afin de prciser l'influence de l'acarbose sur l' -amylase, une srie d'tudes cintiques a t ralise. Pour faciliter les mesures, on a utilis le substrat synthtique rDP18 (document 7).

2.3.1 - Dtermination du type d'inhibition (document 7a).2.3.1.1- Comment voluent les paramtres cintiques KM et Vmax de l'enzyme en

prsence d'inhibiteur ? A quel type d'inhibition assiste-t-on ?2.3.1.2- Sur quelle(s) forme{s) de l'enzyme l'inhibiteur se fixe-t-il? Proposer un

schma montrant ce type d'inhibition.

2.3.2 - Dtermination de la constante d'inhibition Ki (document 7b).La reprsentation secondaire des ordonnes l'origine (1 / Vmax apparents ou 1 / Vmax app.) en fonction des concentrations en inhibiteur est une droite,

2.3.2.1- tablir la relation entre 1 / Vmax app et [I].Donne : On appelle Fi le facteur d'inhibition. C'est le facteur par lequel 1 / Vmax est multipli pour obtenir 1 / Vmax app.

2.3.2.2- Dterminer graphiquement la valeur approximative de la constante d'inhibition Ki de l' -amylase par l'acarbose. Justifier.

2.4 - La fermentation panaire. (16 points)La levure Sacc/raromyces cerevisiae fermente d'abord les glucides libres de la farine (glucose et saccharose) pendant que la p-amylase libre notamment du maltose, lut mme substrat pour la fermentation alcoolique.

2.4.1 - La fermentation alcoolique.2.4.1.1- Complter le document 8.

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2.4.1.2- Donner le nom et la formule semi-dveloppe des composs A, B et C.Identifier les composs D, E et F.Quel est le compos produit lors de la fermentation alcoolique l'origine de la leve de la pte pain ?

2.4.1.3- crire la raction bilan du catabolisme du glucose par fermentation alcoolique.

La variation d'enthalpie libre standard (G0') de la raction de fermentation alcoolique partir du glucose est de - 166 kj.mol1.

2.4.1.4- Calculer le rendement nergtique de la fermentation du glucose en thanol.

Donne : Variation d'enthalpie libre standard d'hydrolyse de l'ATP G0' = - 30,2 kJ.mol-1.

2.4.2- Oxydation arobie du glucose.La production industrielle de Saccharomyces cerevisise se fait en atmosphre arobie.

2.4.2.1- A l'aide du document 9, tablir le bilan molculaire de l'oxydation arobie du glucose.

2.4.2.2- Faire le bilan nergtique de l'oxydation arobie du glucose.2.4.2.3- Comparer le bilan avec celui de la fermentation alcoolique.

Conclure sur l'intrt de produire Sacc/raromyces cerevisiae en conditions arobies.

DOCUMENT 1 :

DOCUMENT 1a : CLASSIFICATION DES FARINES PAR TYPES

Les grands types de farine sont dfinis en fonction du taux de cendres contenu dans 100 g de matire sche. Le taux d'extraction mesure la quantit de farine obtenue partir du bl (kg de farine pour 100 kg de bl).

Types Taux de cendres {% massique)*Taux moyen d'extraction Utilisation

45 Moins de 0,50 67 Ptisserie

55 de 0,50 0,60 ~ 75 Pain ordinaire

65 de 0,62 0,75 78 Pains spciaux

80 de 0,75 0,90 80-85 Pains spciaux

110 de 1,00 1,20 85-90 Pain bis

150 plus de 1 ,40 90-98 Pain complet

par rapport la matire sche.

DOCUMENT 1b : PROTOCOLE DE DTERMINATION DU TAUX DE CENDRES

(d'aprs la norme AFNOR v03-720)

Dfinition du taux de cendres : Rsidu obtenu aprs incinration 900C dans les conditions ci-dessous et exprim en % en masse par rapport la matire sche.

Protocole :

1) Dans une nacelle incinration pralablement chauffe 900C, refroidie en dessiccateur et tare, peser 10 mg prs une masse m0 de 2 6 g de l'chantillon selon le taux de cendres prsum.

2) Effectuer l'incinration dans le four 900C 25C.3) Quand l'incinration est termine, retirer la nacelle du four. Aprs refroidissement au

dessiccateur, peser le rsidu d'incinration. Soit m1 la masse pese.

DOCUMENT 2:

DOSAGE DE L'AZOTE TOTAL DE LA FARINE PAR LA MTHODE DE KJELDAHL

(d'aprs la norme AFNOR V03-750)

Protocole :

Prise d'essaiPeser 0,001 g prs une masse m (g) de farine choisie en fonction de la teneur prsum en azote, de faon que la prise d'essai contienne entre 0,005 et 0,02 g d'azote.

MinralisationDans le matras de Kjeldahl contenant la prise d'essai, introduire :> 10 mL d'acide sulfurique concentr ;> une pointe de spatule de catalyseur ;Chauffer jusqu' dcoloration puis transvaser quantitativement le contenu du matras dans un ballon distiller.

Distillation et dosageEn prsence de phnolphtaline, ajouter de la lessive de soude jusqu'au virage de l'indicateur.Distiller et recueillir le distillt dans 20 mL d'acide borique contenant un indicateur de fin de raction.Doser par une solution d'acide sulfurique titre 0,05 mol.L"1 . Soit V, le volume (mL) d'acide sulfurique vers.

Essai blancEffectuer un essai blanc dans les mmes conditions, Soit V0 le volume {mL) d'acide sulfurique vers.

DOCUMENT 3 : EXTRACTION ET SPARATION DES PROTINES DE LA FARINE PAR ELECTROPHORSE EN 2 DIMENSIONS

tape 1 : Extraction des protines de la farine1)Peser 50 mg de farine dans un tube centrifuger de 1,5 ml.2)Ajouter 1 ml_ de tampon d'extraction au borate de sodium.3)Incuber 37C sous agitation pendant au moins 2 heures.4)Centrifuger temprature ambiante pendant 15 minutes.5)Transfrer le surnageant dans un nouveau tube. Cette solution peut tre utilise directement pour une analyse des protines totales de la farine.

tape 2 : Isolectrofocaiisation (IEF. premire dimension) Composition du gel d'IEF> 9,7 mL d'eau distille ;> 2,0 mL de solution acylamide/bisacrylamide ;> 300 (il de solution d'ampholytes pH 3,5 - 9 ;> 50 Lde persulfate d'ammonium (APS) 1 % ;> 20 L de TEMED.

Migration> Dure : 3 heures> Puissance constante : 5 watts> Temprature ambianteUne bande du gel est dcoupe pour effectuer l'lectrophorse en gel de polyacrylamide en prsence de SDS.

tape 3 : Electrophorse (PAGE) en prsence de SDS (seconde dimension)1) quilibration du gel d'IEF pour l'lectrophorse en prsence de SDSLa bande du gel d'IEF est place dans le tampon d'quilibration sous agitation lente pendant 10 minutes.

Composition du tampon d'quilibration :> Ure 6 mol.L-1 ;> Tris pH 8,8 0,375 mol.L-1 ;> SDS 2 % ;> Glycrol 20 % ;> Dithiothritol (DTT) 2 % .

2) Prparation du gel de polyacrylamideTampon de migration (utilis pour la prparation des gels et pour la migration)> 18,17 g Tris-base;> 2 mL SDS 20 % ;> Ajuster le pH 8,8 avec du MC112 mol.L-1> Complter le volume 100mL

DOCUMENT 3 (SUITE):

Composition du gel de polyacrylamideLes gels sont prpars partir d'une solution mre d'acrylamide 30% / bis-acrylamide 0,8% afin de limiter les manipulations de ces produits neurotoxiques.

Gel 1 Gel 2 Gel 3 Gel 4

H2O 8,5 mL 7,3 mL 6,2 mL 5 mL

Acrylamide 30% / Bis-Acrylamide 0,8%

2,5 mL 3,7 mL 4,8 mL 6 mL

Tampon de migration 3,8 mL 3,8 mL 3,8 mL 3,8 mL

Persulfate dammonium 10% 224 L 224 L 224 L 224 L

TEMED 10 l 10 L 10 L 10 L

3) Migration

Tampon de migration : voir 2) : praparation du gelDure : 1hPuissance : 50 WattsEtape 4 : RvlationColorationLe gel est color dans un mlange mthanol/acide actique/eau (40 :10 :50) 0,1 % de bleu de Coomassie Brillant R-250.DcolorationLe gel est lav l'acide actique 15 % pour liminer le colorant non li.

DOCUMENT 4 : RSULTAT DE L'ELECTROPHORGRAMME

DOCUMENT 5 :STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE D'UNE SOUS-UNIT LGRE

D'UNE GLUTENINE (LMW-GS)

(d'aprs S. Masci et coll., Plant Physiol., 1981; 118 (4), 1147-1158.)

C = Cystine

DOCUMENT 6 : DTERMINATION DE L'ACTIVIT -AMYLASIQUE D'UNE FARINE

Principe SubstratLe substrat synthtique utilis est le nitro-4-phnyl a-D maltoheptaoside 4,6 O-thylidne.Ractions mises en jeu

Protocole opratoire Extraction de l'a-amylase de la farine :> Peser prcisment m = 500 mg de farine dans un tube centrifuger.> Ajouter 5 mL de tampon d'extraction.> Extraire pendant 2 h temprature ambiante en agitant priodiquement. Centrifuger 3000 tours/min durant 10 min. Rcuprer le surnageant. Mesurer son volume (Vs).

Dosage de l'-amylase :> Prlever Q,2 ml de mlange substrat + a-glucosidase + glucoamylase dans un tube essai. > Princuber ce tube ainsi que le surnageant 40C environ 2 min.> Dans le tube contenant le mlange substrat + a-glucosidase+ glucoamylase , ajouter E = 0,2 mL du surnageant incub.> Incuber 40C pendant exactement 10 min.> Ajouter 3 mL de Trizma Base. Agiter vigoureusement.> Diluer la solution au 1/10 avant le passage au spectrophotomtre. Lire l'absorbance 410 nm contre un blanc -amylase .

DOCUMENT 7:

DOCUMENT 7a : INHIBITION DE L'ACTIVIT AMYLASIQUE PAR L'ACARBOSE

DOCUMENT 7b:

DOCUMENT 9 :

TAPES DE L'OXYDATION AROBIE DU GLUCOSE PAR SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1)Glycolyse

2) Dcarboxylation oxydative du pyruvate

3) Cycle de Krebs

Actyl-CoA + GDP + Pi+ FAD + 3 NAD+ 2 CO2 + CoASH + GTP + FADH2 + 3 NADH,H+

4) Roxydation des coenzymes rduits via la chane respiratoire mitochondriale

Rapport P/O pour l'oxydation du NADH = 3 Rapport P/O pour l'oxydation du FADH2 = 2