STAGE DE RECHERCHE « Tous chercheurs »Campus de Luminy – Avril 2010

« PRODUCTiON D’iNSULiNE PAR LE PANCREAS »

KévinStéphanePaulineMeddyEmilieRémy

Introduction

L'insuline permet de réguler la glycémie. Si on admet que les cellules ß des îlots de Langherans du pancréas produisent de l'insuline, dans quelles conditions cette insuline est-elle produite ? Quel signal permet aux cellules du pancréas de produire l'insuline ?

Afin de répondre à ces différentes questions, nous allons stimuler des cellules de pancréas et de rate avec du glucose à différentes concentrations pour ensuite détecter et doser l’éventuelle production d’insuline grâce au test E.L.I.S.A.

GlucoseInsuline

Stimulation des cellules à différents taux de glucose :

On a mis en culture des cellules ß du pancréas (INS 1) et des cellules de la rate (CH27).

Cellules INS 1 (x400) Cellules CH27 (x400)

0

20 1

10521

40

15

520

15 20 4010

20

0 1 151052

521040

1510 20 40

Stimulation des cellules à différents taux de glucose :

Cellules INS 1 Cellule CH27

Nous avons versé dans les puits contenant les cellules de pancréas et dans les puits contenant les cellules de rate des solutions de glucose à différentes concentrations (mmol/L). Après 30 minutes d’incubation à 37°C , on a prélevé les surnageants pour détecter et doser l’insuline si elle a été produite. Pour cela, nous pratiquerons la méthode E.L.I.S.A

Principe test E.L.I.S.A :

Le test E.L.I.S.A (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est un test immunologique destiné à détecter et doser l’insuline présente dans les surnageants issues des cellules stimulées par du glucose à différentes concentrations.

1ère étape: Fixation des anticorps anti-insuline dans les puits:

Anticorps anti-insuline fixé dans le fond du puit

Plaque E.L.I.S.A

2ème étape : Saturation On ajoute la solution de PBS/BSA, pour empêcher que l’insuline se fixe sur les parois au lieu de se fixer sur les anticorps.

3ème étape : Fixation de l’insuline sur les anticorps anti-insuline

On a ajouté l’insuline qui vient se fixer sur les anticorps anti-insuline.

4ème étape : Fixation de l’anticorps anti-insuline couplé à l’enzyme peroxydase.

On a ajouté le deuxième anticorps anti-insuline conjugué à la peroxydase.

5ème étape : Ajout du substrat de la peroxydase (TMB)

On a ajouté le substrat de la peroxydase. En se combinant avec l’enzyme, on voit apparaître une coloration bleue.

6ème étape : Lecture de l’absorbance

La réaction chimique donne une couleur bleue, donc nous lirons l’absorbance à la longueur d’ondes correspondante (620 nm).

Ensuite, on ajoute l’acide chlorhydrique (HCl) pour stopper la réaction enzymatique. La coloration change et vire au jaune. Nous lirons donc ensuite l’absorbance à la longueur d’ondes correspondante cette fois à la couleur jaune (450 nm).

Lecteur de plaques

NOTRE PROTOCOLE EXPERIMENTAL :

A: Ligne de la courbe d’étalonnage

B:Ligne de la courbe d’étalonnage

D:Ligne témoin négatif

E:Ligne de surnageant issue de cellules pancréatiques

Résultat du test E.L.I.S.A

+ HCl + HCl

On obtient un dégradé de couleurs : plus la concentration d’insuline est élevée et plus la couleur sera foncée.

A

B

D

E

E

A

B

D

La ligne D correspond aux surnageants issues des cellules CH27 stimulées par différentes concentrations de glucose. La ligne E correspond aux surnageants issues des cellules INS-1 stimulées par différentes concentrations de glucose.

Etablissement de la gamme étalon

Concentration glucose mmol/L

Conc

entr

atio

n d’

insu

line

ng/m

L

Concentration d’insuline produite en fonction du taux de glucose:

Conc

entr

atio

n d’

insu

line

ng/m

L

Concentration glucose mmol/L

Cas des cellules INS 1 Cas des cellules CH27 (témoin négatif)

CONCLUSION

D’après les résultats que nous avons obtenus, nous pouvons conclure que, seules les cellules ß du pancréas (INS 1) sont

capables de produire de l’insuline. De plus, la quantité d’insuline produite dépend de la concentration en glucose du milieu.

Enfin, on peut supposer que la production d’insuline par le pancréas ne nécessite pas l’intervention d’autres organes.

PERSPECTIVES

On peut se demander si d’autres sucres tels que le fructose, le saccharose ou l’amidon peuvent déclencher la production d’insuline.

Peut-on produire de l’insuline en synthèse ?

Est-il possible de produire de l’insuline avec d’autres cellules que celles du pancréas ?