Caractérisation électrique de structures Si/SiO2 nues et greffées de

N° d'ordre : 96 ISAL 0113 Année 96

THESE Présentée devant

L' INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR FORMATION DOCTORALE : Dispositifs de l'Electronique Intégrée

ECOLE DOCTORALE : Electronique, Electrotechnique, Automatique

par

Catharina SCHYBERG Ingénieur

CARACTERISATION ELECTRIQUE de STRUCTURES Si/SiO2 NUES et GREFFEES DE MOLECULES ORGANIQUES et BIOLOGIQUES

EN VUE DE L'ELABORATION D'UN IMMUNOCAPTEUR

Soutenue le 12 décembre 1996 devant la Commision d'Examen

Jury MM P. PINARD Président

C. GABRIELLI

C. MARTELET

B. MANDRAND

A. JOUAN

D. BARBIER

Mmes M. KOUDELKA-HEP

C. PLOSSU

NOVEMBRE 1995 1 / 2 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : J. ROCHAT Professeurs : S. AUDISIO PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE J.C. BABOUX GEMPPM* J. BAHUAUD MECANIQUE DES SOLIDES B. BALLAND PHYSIQUE DE LA MATIERE D. BARBIER PHYSIQUE DE LA MATIERE G. BAYADA EQUIPE MOD. MATH. CALC. SC. C. BERGER (Melle) CETHIL/EQ. PHYSIQUE INDUST M. BETEMPS AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE J.M. BLANCHARD CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE ET ENVIRONNEMENT C. BOISSON VIBRATIONS ACOUSTIQUES M. BOIVIN MECANIQUE DES SOLIDES H. BOTTA EQUIPE DEVELOPPEMENT URBAIN G. BOULAYE L.I.S.I. J. BRAU CETHIL/EQ. EQUIPEMENT DE L'HABITAT M. BRUNET MECANIQUE DES SOLIDES J.C. BUREAU THERMOCHIMIE MINERALE J.P. CHANTE COMPOSANTS DE PUISSANCE ET APPLICATIONS B. CHOCAT METHODES B. CLAUDEL CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE ET ENVIRONNEMENT M. COUSIN BETONS ET STRUCTURES L. CRONENBERGER CHIMIE BIOLOGIQUE M. DIOT THERMOCHIMIE MINERALE A. DOUTHEAU CHIMIE ORGANIQUE J.C. DUPUY PHYSIQUE DE LA MATIERE H. EMPTOZ MOD. SYST. ET REC. DES FORMES C. ESNOUF GEMPPM* G. FANTOZZI GEMPPM* J. FAUCHON C.A.S.M. J. FAVREL L.I.S.P.I. G. FERRARIS-BESSO MECANIQUE DES STRUCTURES Y. FETIVEAU GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE L. FLAMAND MECANIQUE DES CONTACTS P. FLEISCHMANN GEMPPM* A. FLORY L.I.S.I. R. FOUGERES GEMPPM* L. FRECON D.E.L.I.A. R. GAUTHIER PHYSIQUE DE LA MATIERE M. GERY CETHIL/EQ. EQUIPEMENT DE L’HAB. G. GIMENEZ TRAITEMENT DU SIGNAL ET ULTRASONS P. GOBIN GEMPPM* P. GONNARD GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE R. GOUTTE TRAITEMENT DU SIGNAL ET ULTRASONS G. GRANGE GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE G. GUENIN GEMPPM* G. GUILLOT PHYSIQUE DE LA MATIERE A. GUINET L.I.S.P.I. C. GUITTARD D.E.L.I.A. J.L. GUYADER VIBRATIONS-ACOUSTIQUE J.P. GUYOMAR GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE J.M. JOLION L.I.S.P.I J. JOUBERT GENIE MECANIQUE J.F. JULLIEN BETONS ET STRUCTURES A. JUTARD AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE R. KASTNER GEOTECHNIQUE H. KLEIMANN GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE J. KOULOUMDJIAN L.I.S.I. M. LAGARDE CHIMIE BIOLOGIQUE M. LALANNE MECANIQUE DES STRUCTURES A. LALLEMAND CETHIL/EQ. ENERGETIQUE ET AUTOMATIQUE M. LALLEMAND (Mme) CETHIL/EQ. ENERGETIQUE ET AUTOMATIQUE

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NOVEMBRE 1995 2 / 2

P. LAREAL GEOTECHNIQUE A. LAUGIER PHYSIQUE DE LA MATIERE Ch. LAUGIER PHYSIOLOGIE ET PHARMACODYNAMIE P. LEJEUNE G.M.M.O. C. LESUEUR VIBRATIONS-ACOUSTIQUE A. LUBRECHT MECANIQUE DES CONTACTS Y. MARTINEZ L.I.S.P.I. H. MAZILLE PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE P. MERLE GEMPPM* J. MERLIN GEMPPM* J.P. MILLET PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE M. MIRAMOND METHODES N. MONGEREAU GEOTECHNIQUE R. MOREL MECANIQUE DES FLUIDES P. NARDON BIOLOGIE APPLIQUEE A. NAVARRO CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE ET ENVIRON. M. OTTERBEIN CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE ET ENVIRON. J.P. PASCAULT MATERIAUX MACROMOLECULAIRES J. PERA MATERIAUX MINERAUX G. PERACHON THERMOCHIMIE MINERALE M. PERDRIX TRAITEMENT DU SIGNAL ET ULTRASONS J. PEREZ GEMPPM* P. PHAM L.M.M. P. PINARD PHYSIQUE DE LA MATIERE J.M. PINON L.I.S.I. D. PLAY C.A.S.M. J. POUSIN EQUIPE MOD. MATH. ET CALCUL SCIEN. P. PREVOT L.I.S.P.I. R. PROST TRAITEMENT DU SIGNAL ET ULTRASONS M. REYNAUD CETHIL/EQUIPE GMC. J.M. REYNOUARD BETONS ET STRUCTURES J. ROBERT-BAUDOUY (Mme) G.M.M.O. A. ROCHE L.M.M. D. ROUBY GEMPPM* P. RUBEL L.I.S.I. J.F. SACADURA CETHIL/EQ. GMC H. SAUTEREAU MATERIAUX MACROMOLECULAIRES S. SCAVARDA AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE D. THOMASSET AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE M. TROCCAZ GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE R. UNTERREINER TRAITEMENT DU SIGNAL ET ULTRASONS J. VERON CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE ET ENVIRON. A. VINCENT GEMPPM* G. VIGIER GEMPPM* P. VUILLERMOZ PHYSIQUE DE LA MATIERE Directeurs de recherche C.N.R.S. : Y. BERTHIER MECANIQUE DES CONTACTS P. CLAUDY THERMOCHIMIE MINERALE M. MURAT GEMPPM* A. NOUAILHAT PHYSIQUE DE LA MATIERE M.A. MANDRAND (Mme) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES Directeurs de recherche I.N.R.A. : G. BONNOT BIOLOGIE S. GRENIER BIOLOGIE Y. MENEZO BIOLOGIE Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : A.F. PRIGENT (Mme) CHIMIE BIOLOGIQUE N. SARDA (Mme) CHIMIE BIOLOGIQUE

* GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX

5

ECOLES DOCTORALES MAI 1996

• Ecole Doctorale Matériaux de Lyon - INSA - ECL - UCBL - U. Chambéry - ENS

Responsable : Pr. A. HOAREAU

Formations doctorales : - Génie des matériaux (Pr. G. GUENIN) - Sciences des matériaux (Pr. BARRAT - Matériaux macromoléculaires et composites (Pr. SEAUTEREAU)

_____________________________

• Ecole Doctorale des Sciences pour l'ingénieur de Lyon : Mécanique, Energétique, Génie Civil, Acoustique (MEGA) ECL - INSA - UCBL Responsable : Pr. J. BATAILLE

Formations doctorales : - Acoustique (Pr. GUYANDER) - Génie civil : Sols, Matériaux, Structures physique du bâtiment (Pr. P. LAREAL) - Mécanique (Pr. BATAILLE) - Thermique et Energétique (Pr. LANCE)

_____________________________

• Ecole Doctorale des Sciences pour l'ingénieur de Lyon : Electronique, Electrotechnique, Automatique (EEA) - INSA - ECL - UCBL - U. Chambéry - U. St Etienne

Responsable : Pr. P. GIMENEZ

Formations doctorales : - Acoustique (Pr. GUYANDER) - Automatique industrielle (Pr. BOLON) - Dispositifs de l'électronique intégrée (Pr. PINARD) - Génie biologique et médical (Pr. COLLOMBEL) - Génie Electrique (Pr. AURIOL) - Signal, image, parole (Pr. LACOUME)

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INSA de Lyon Département des Etudes Doctorales Octobre 1995

LISTE DES DEA ou FORMATIONS DOCTORALES

FORMATIONS DOCTORALES RESPONSABLES INSA ADRESSES INSA

Acoustique GUYANDER Jean-Louis Bât 303 Tél 80 80

Analyse et modélisation de systèmes biologiques

NARDON Paul Bât 406 Tél 80 86

Automatique industrielle SCAVARDA Serge Bât 303 Tél 83 41

Biochimie LAGARDE Michel Bât 406 Tél 82 40

Chimie inorganique GONNARD Paul Bât 504 Tél 81 58

Conception en bâtiment et techniques urbaines

MIRAMOND Marcel Bât 304 Tél 85 56

DEA Informatique de Lyon KOULOUMIDJIAN Jacques Bât 501 Tél 80 99

Dispositifs de l'électronique intégrée PINARD Pierre Bât 502 Tél 82 47

Génie biologique et médical MAGNIN Isabelle Bât 502 Tél 85 63

Génie civil : sols, matériaux, structures, physique du bâtiment

LAREAL Pierre Bât 304 Tél 82 16

Génie électrique CHANTE Jean-Pierre Bât 304 Tél 82 16

Matériaux polymères et composites SAUTEREAU Henri Bât 403 Tél 81 78

Mécanique DALMAZ Gérard Bât 113 Tél 83 03

MIicrostructure et comportement mécanique et macroscopique des matériaux - génie des

matériaux

GUENIN Gérard Bât 502 Tél 82 45

Productique : organisation et conduite de systèmes de production

FAVREL Joël Bât 502 Tél 83 63

Sciences des matériaux et des surfaces LAUGIER André Bât 502 Tél 82 33

Sciences et techniques du déchet NAVARRO Alain Bât 404 Tél 84 30

Signal, Image, Parole GIMENEZ Gérard Bât 502 Tél 83 32

Thermique et énergétique LALLEMAND Monique Bât 404 Tél 81 54

Les responsables soulignés sont égalementresponsables généraux

Avant-propos

Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Physique de la Matière de l'INSA de Lyon, avec la collaboration du Laboratoire de Physico-Chimie des Interfaces de l'Ecole Centrale de Lyon, de l'unité mixte CNRS/Bio-Mérieux de l'Ecole Normale Supérieure de Lyon, et du Centre de Recherche du Service de Santé des Armées de Grenoble.

Toutes les personnes de ces différents laboratoires, qui m'ont aidé d'une manière ou d'une autre, ou qui ont contribué à rendre ces années agréables, trouvent ici l'expression de mes sincères remerciements.

Je tiens particulièrement à remercier les personnes suivantes :

Monsieur P. PINARD, pour m'avoir accuellie au laboratoire, pour l'intérêt qu'il a porté à ce travail et pour la confiance dont il m'a témoignée pendant ces années.

Madame C. PLOSSU, pour m'avoir encadrée et conseillée durant ce travail.

Monsieur D. BARBIER, pour l'intérêt qu'il a porté à ce travail.

Monsieur C. MARTELET, pour m'avoir guidée dans le domaine de la chimie, et pour avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteur.

Madame N. JAFFREZIC-RENAULT, pour ses nombreux conseils dans le domaine de la chimie.

Monsieur B. MANDRAND, pour l'intérêt qu'il a porté à ce travail et pour l'aide importante qu'il a fournie, avec son équipe, dans le domaine de l'immunologie.

Monsieur A. JOUAN, pour ses conseils et son soutien pratique dans le domaine de l'immunologie, ainsi que pour avoir accepté d'être membre du jury.

Monsieur C. GABRIELLI, pour avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteur.

Madame M. KOUDELKA-HEP, pour avoir accepté d'examiner ce travail et de faire partie du jury.

Les organismes suivants sont également remerciés :

L'UNION EUROPEENNE, pour avoir financé ce travail à travers une bourse individuelle de recherche du programme "Biomédicine et Santé".

L'entreprise BIO-MERIEUX et le CRSSA de Grenoble, pour avoir fourni les espèces immunologiques.

Table des matières Avant-propos .....................................................................................................7

Introduction.......................................................................................................13

CHAPITRE 1 : Le transducteur Si/SiO2.............................................................17

Introduction ...................................................................................................................18

1. La structure MOS : rappels [8], [9] .....................................................................18

1.1. La structure MOS idéale............................................................................................... 19

1.2. La structure MOS réelle ................................................................................................ 19

1.2.1. Charges dans l'oxyde et à l'interface oxyde/semiconducteur..........................................19 1.2.2. Diagramme des bandes d'énergie ...................................................................................20

1.3. Caractérisation électrique d'une structure MOS..................................................... 21

1.4. Capacité d'une structure MOS................................................................................... 21

1.3.1. Capacité d'une structure MOS idéale .............................................................................22 1.3.2. Capacité d'une structure MOS réelle ..............................................................................23

2. Le contact électrolytique et la structure EOS .................................................23

2.1. Comparaison électrolyte/métal................................................................................. 24

2.2. Interface électrode/électrolyte : la double couche électrique ....................................................................................................................... 24

2.2.1. Modèles classiques .........................................................................................................24 2.2.2. Modèle des liaisons par sites ..........................................................................................25

2.3. Polarisation d'une structure EOS ................................................................................. 26

3. Modélisation électrique......................................................................................28

3.1. Modèles électriques équivalents d'une structure Si/SiO2....................................... 28

3.2. Modèles électriques équivalents d'une structure EOS............................................ 28

4. La structure Si/SiO2 comme transducteur .......................................................30

4.1. Exploitation de la variation de la tension de bandes plates................................. 31

4.1.1. Un capteur de gaz : le MOSFET à grille palladium .......................................................31 4.1.2. L'ISFET : capteur chimique d'espèces ioniques .............................................................31 4.1.3. L'ENFET : capteur de molécules biologiques ................................................................32

4.2. Exploitation de la variation de la capacité.............................................................. 32

Table des matières

10

CHAPITRE 2 : Etude expérimentale de structures EOS................................35

Introduction .................................................................................................................. 36

1. Les structures Si/SiO2........................................................................................... 37

2. Techniques de caractérisation électrique et montages expérimentaux..................................................................................................... 37

2.1. La cellule électrochimique .......................................................................................... 37

2.2. Mesures d'impédances ................................................................................................ 38

2.2.1. Montages potentiostatiques............................................................................................ 38 2.2.2. Montage à deux électrodes............................................................................................. 40 2.2.3. Exploitation des mesures d'impédance........................................................................... 40 2.2.4. Correction des données expérimentales ......................................................................... 41

2.3. Mesures de courant ...................................................................................................... 44

2.3.1. La mesure QSM ............................................................................................................. 44 2.3.2. Mesure du courant de fuite ............................................................................................ 45

2.4. Récapitulatif des différentes techniques de mesure .............................................. 45

3. Validation de l'utilisation d'un montage à deux électrodes pour les mesures d'impédance ........................................................................ 47

3.1. Utilisation d'une pseudo-électrode de référence dans le montage potentiostatique.......................................................................................... 47

3.2. Montage à deux électrodes / montage potentiostatique.................................... 48

4. Reproductibilité des mesures électriques ....................................................... 49

4.1. Mesures QSM.................................................................................................................. 49

4.2. Mesures d'impédance.................................................................................................. 50

4.2.1. Importance du nettoyage des échantillons ..................................................................... 50 4.2.2. Importance du régime de polarisation............................................................................ 51

5. Modélisation électrique ..................................................................................... 52

5.1. Capacité équivalente.................................................................................................. 52

5.2. Modélisation électrique : première approche......................................................... 53

5.3. Détermination de la résistance de l'électrolyte....................................................... 54

5.3.1. Cas du montage potentiostatique ................................................................................... 54 5.3.2. Cas du montage à deux électrodes ................................................................................. 55

5.4. Résistance équivalente................................................................................................ 55

5.5. Modèle électrique des structures EOS....................................................................... 57

Table des matières

11

5.6. Courant de fuite............................................................................................................ 58

Conclusion.....................................................................................................................59

CHAPITRE 3 : Caractérisation de structures Si/SiO2 greffées de silanes et de polysiloxanes.................................................................61

Introduction ...................................................................................................................62

1. Les silanes et les polysiloxanes et leur greffage sur l'oxyde...........................63

1.1. Les silanes et les polysiloxanes .................................................................................... 63

1.1.1. Les silanes ......................................................................................................................63 1.1.2. Les polysiloxanes ...........................................................................................................63

1.2. Surface de l'oxyde ........................................................................................................ 64

1.3. Hydratation de l'oxyde................................................................................................. 64

1.4. Greffage des silanes sur l'oxyde ................................................................................. 65

1.5. Greffage des polysiloxanes sur l'oxyde...................................................................... 66

2. Influence du traitement sulfochromique sur les caractéristiques électriques des structures Si/SiO2 ........................................67

3. Utilisation d'une sonde mercure pour la caractérisation électrique de silanes et de polysiloxanes ........................................................68

3.1. Prise de contact sur un polymère .............................................................................. 69

3.2. Prise de contact sur une monocouche d'aminosilanes longue chaîne............................................................................................................................. 69

3.3. Conclusions .................................................................................................................... 71

4. Caractérisation des couches d'aminosilanes longue chaîne....................................................................................................................71

4.1. Instabilités ....................................................................................................................... 72

4.2. Modélisation électrique ............................................................................................... 72

4.3. Inhomogénéités ............................................................................................................ 73

4.4. Vieillissement .................................................................................................................. 74

4.5. Conclusion ..................................................................................................................... 75

5. Caractérisation de couches de cyanosilanes courte chaîne....................................................................................................................75

Table des matières

12

5.1. Nécessité d'un nettoyage des échantillons greffés ................................................ 76

5.2. Epaisseur de couche greffée...................................................................................... 77

5.3. Simulation de l'impédance d'une couche de cyanosilanes ................................. 78

5.4. Conclusions .................................................................................................................... 79

6. Caractérisation de couches de cyanopolysiloxanes ................................... 79

Conclusion .................................................................................................................... 81

CHAPITRE 4 : Immunodétection.....................................................................83

Introduction ................................................................................................... 84

1. Les anticorps et leur couplage sur le transducteur fonctionnalisé ...................................................................................................... 85

1.1. Les anticorps .................................................................................................................. 85

1.2. Liaison anticorps - transducteur fonctionnalisé........................................................ 86

1.3. Couplage des anticorps sur le transducteur ............................................................ 88

1.3.1. Couplage de l'anti-alfa-fœtoprotéine.............................................................................. 88 1.3.2. Couplage de l'anti-Dengue-2.......................................................................................... 88 1.3.3. Saturation des sites cyano .............................................................................................. 88

1.4. Comportement électrique des immunocapteurs ................................. 89

2. Les antigènes et leur détection ........................................................................ 90

2.1. La liaison anticorps-antigène ...................................................................................... 90

2.2. Une technique de détection classique : le test ELISA............................................. 91

2.3. Détection des antigènes par mesures d'impédance électrique ....................................................................................................................... 92

2.3.1. Résultats ...................................................................................................................... 92 2.3.2. Discussion ...................................................................................................................... 94

Conclusion .................................................................................................................96

Conclusion............................................................................................ ............97

Annexe : Rappels sur les systèmes électrochimiques classiques .............. 101

Références bibliographiques ............................................................ 103

Introduction

La technologie micro-électronique silicium a connu un essor considérable depuis la réalisation du premier circuit intégré au début des années soixante. Les circuits sont de plus en plus complexes et performants, et une production de masse à bas prix a permis à la micro-électronique de pénétrer progressivement les secteurs grand public tels l'automobile, l'électroménager et les jouets par exemple.

Cette réussite technologique est à l'origine des efforts considérables déployés depuis quelques années dans le domaine des microtechnologies, en vue de réaliser des microsystèmes. Ce sont des dispositifs dont la fabrication utilise autant que possible les matériaux et les procédés de la micro-électronique, et qui intègrent capteurs, traitement du signal, actionneurs et alimentation. Le but est évidemment de tirer profit de tous les avantages de la technologie silicium, notamment la production de masse à bas coût ainsi que la petite taille des dispositifs. L'élaboration de tels microsystèmes est cependant très complexe, et pendant de nombreuses années la recherche a concerné essentiellement de "simples" microcapteurs [1].

La recherche dans le domaine des microcapteurs est très diversifiée : les travaux concernent aussi bien la mise au point de microcapteurs physiques que chimiques ou biologiques [2], [3]. Les capteurs physiques sont à priori les plus faciles à réaliser, puisqu'ils ne font que convertir une grandeur physique telle l'accélération, la température ou la pression en un signal électrique. Un capteur chimique ou biologique par contre doit détecter de manière sélective une espèce chimique donnée, telle des ions H+ ou Na+, ou bien une espèce biologique donnée, telle une enzyme spécifique, dans un milieu souvent très complexe. Ensuite il doit traduire cette reconnaissance en un signal électrique.

Le développement des microcapteurs physiques est actuellement le plus avancé. Les photodiodes, CDD et capteurs de température ont été parmi les premiers microcapteurs commercialisés, car ils peuvent être réalisés entièrement avec la technologie classique du silicium. La commercialisation de capteurs nécessitant des étapes technologiques supplémentaires par rapport à la technologie classique du silicium est récente. Deux gros succès sont les accéléromètres et les capteurs de pression : 10 millions d'accéléromètres pour airbags par an vendus par la société norvégienne SensoNor et 35 millions de capteurs de pression par an par la société américaine Motorola pour applications dans les domaines médical et automobile, ce qui est prometteur. La commercialisation de capteurs chimiques et biologiques est moins avancée. Il faut cependant souligner que dans leur cas, à la nécessité de développer de nouvelles technologies s'additionnent des problèmes tels la sélectivité, la durée de vie ou la dérive due à l'impossibilité d'encapsuler la partie sensible du capteur, retardant ainsi leur arrivée sur le marché. Leur marché potentiel est cependant très vaste : l'analyse biomédicale, l'agroalimentaire et l'environnement par exemple sont des domaines très demandeurs, ce qui explique les efforts fournis.

Le travail présenté s'inscrit dans un projet qui vise à la réalisation d'un microcapteur biologique pour la détection et le dosage d'antigènes, de grande importance dans le domaine du diagnostic médical. Les techniques actuellement utilisées sont sélectives et sensibles puisqu'elles permettent la détection d'antigènes dans un milieu complexe tel le sérum humain, jusqu'à des concentrations de l'ordre du ng/ml. Cependant, dans le cas par exemple du test

Introduction

14

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) qui est la technique la plus couramment utilisée, le dosage des antigènes est lent et indirect : il nécessite plusieurs étapes successives et se fait grâce à des marqueurs enzymatiques coûteux. Cette technique est inadaptée à la demande croissante du diagnostic biomédical. L'objectif de ce travail est de contribuer à l'élaboration d'un immunocapteur peu coûteux et peu encombrant, qui permette une détection directe, rapide et facile des antigènes, et de conception telle qu'il puisse être aisément intégré dans un multicapteur.

Le micro-immunocapteur étudié est basé sur une détection par mesures électrochimiques. Il est constitué d'une structure Si/SiO2 greffée d'anticorps. Ceux-ci permettent la reconnaissance sélective des antigènes, la structure Si/SiO2 servant de transducteur. Plusieurs raisons ont motivé ce choix de transducteur. La fonctionnalisation de la silice, grâce à des polymères ou des silanes, est bien maîtrisée, permettant une fixation stable des anticorps. Le caractère bloquant de la structure Si/SiO2 limite les courants faradiques pouvant dégrader la membrane biologique du capteur, ainsi que les courants circulant dans les milieux biologiques. De plus, la structure Si/SiO2 permet aussi bien la détection d'une variation de charge que d'impédance électrique.

De nombreuses autres configurations d'immunocapteurs que celle présentée dans ce travail sont également étudiées [4], les capteurs se différenciant aussi bien par la nature du transducteur utilisé que par le mode de détection des immuno-espèces. A part les méthodes électrochimiques, basées sur une mesure de courant, de potentiel ou d'impédance, on distingue les méthodes optiques et piezo-électriques. Alors que les premières exploitent la variation de l'indice optique de la membrane biologique du capteur, après fixation des antigènes, les secondes exploitent la variation de masse. Jusqu'à présent ce sont les méthodes optiques qui ont été les plus concluantes, puisqu'elles ont permis de mettre au point le premier appareil commercialisé pour la détection directe de la réaction anticorps-antigène: le BIAcore de Pharmacia. Cet appareil présente cependant une sensibilité insuffisante (~1µg/ml) pour pouvoir être utilisé dans le domaine du diagnostic biomédical; il sert uniquement d'outil de recherche. De plus, les méthodes optiques présentent un inconvénient majeur : leur encombrement. Les travaux fournis afin d'élaborer des microcapteurs électrochimiques sont ainsi justifiés.

L'élaboration d'un micro-immunocapteur demande beaucoup d'efforts, non seulement sur le plan expérimental, mais surtout à cause du caractère pluridisciplinaire du travail. La collaboration de spécialistes de domaines très variés est nécessaire : des chimistes, des biochimistes et des biologistes pour la mise au point du greffage d'anticorps sur le transducteur, des électriciens et électrochimistes pour la détermination des conditions de mesures optimales, ainsi que des personnes spécialisées dans le traitement du signal et des électroniciens pour la conception d'un microcapteur industrialisable.

L'étude présentée ici s'inscrit dans la continuité des travaux menés antérieurement par le Laboratoire de Physico-Chimie des Interfaces à l'Ecole Centrale de Lyon, en collaboration avec l'Unité mixte CNRS/Bio-Mérieux à l'Ecole Normale Supérieure de Lyon. Ces travaux ont montré la faisabilité du capteur, c'est-à-dire que la reconnaissance des antigènes par les anticorps peut être détectée par mesure d'impédance électrique [5]; cependant des problèmes importants de reproductibilité ont empêché d'aboutir à la validation d'un capteur [6]. De nouvelles méthodes de fixation des anticorps sur le transducteur ont alors été développées, alors que les techniques de caractérisation électrique mises en œuvre pour la détection des antigènes

Introduction

15

restaient fortement limitées [7]. En réalité, seule la mesure de l'impédance en fonction de la tension à fréquence fixe, en général 10 ou 50 kHz était exploitée. Cette approche ne s'étant pas montrée très fructueuse quand à la détection reproductible et fiable des antigènes, le développement des techniques de caractérisation électrique s'est alors imposé.

La participation depuis quelques années du Laboratoire de Physique de la Matière à l'élaboration de l'immunocapteur se justifie ainsi par la nécessité d'une caractérisation électrique plus poussée du capteur. Le laboratoire possède en effet une longue expérience dans le domaine de la caractérisation électrique, notamment de composants micro-électroniques MOS (Métal-Oxyde-Semiconducteur) classiques.

La mise au point d'un immunocapteur fiable nécessite une maîtrise parfaite des propriétés électriques du capteur, en l'occurence celles du transducteur Si/SiO2 et de la membrane biologique. Ainsi, notre principal objectif a été de développer les techniques de caractérisation électrique, adaptées à l'étude d'un immunocapteur, après chaque étape de son élaboration.

Les propriétés du transducteur Si/SiO2 conditionnent fortement le comportement électrique du futur capteur. En conséquence, une partie importante de notre travail a été consacrée à son étude. Dans le premier chapitre seront faits les rappels théoriques nécessaires sur la structure Si/SiO2, qui seront suivis dans le chapitre 2 par une étude expérimentale détaillée. Le but de celle-ci n'est pas d'effectuer une analyse poussée des défauts des composants, mais de déterminer la réponse électrique du dispositif dans des conditions de mesure diverses en milieu liquide. Il s'agit entre autres de déterminer les conditions nécessaires à des mesures reproductibles, en identifiant tous les paramètres "parasites" pouvant modifier la réponse du dispositif mais ne provenant pas de la structure Si/SiO2 elle-même.

Le chapitre 3 est consacré au transducteur fonctionnalisé. Les méthodes de greffage utilisées sont présentées, et une caractérisation électrique poussée des couches de molécules greffées a été réalisée, ce qui a permis de définir celles qui sont suffisamment stables électriquement pour pouvoir servir à l'élaboration du capteur. Le couplage des anticorps à ces structures, ainsi que les essais de détection des antigènes correspondants, font l'objet du quatrième et dernier chapitre.

CHAPITRE 1 Le transducteur Si/SiO2

Chapitre 1 : Le transducteur Si/SiO2

18

Introduction

Dans ce chapitre nous faisons quelques rappels sur le comportement électrique de la structure Si/SiO2, transducteur de l'immunocapteur.

Lorsque les structures Si/SiO2 sont métallisées, elles forment des capacités MOS (Métal-Oxyde-Semiconducteur), composants de base des circuits intégrés de la micro-électronique. Le transducteur de l'immunocapteur est lui constitué d'une structure Si/SiO2 non métallisée. Le contact de grille est alors assuré par un électrolyte et une électrode de référence. On obtient ainsi une structure EOS (Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur).

Seule la nature du contact de grille différenciant les structures MOS et EOS, leurs comportements électriques sont très similaires. Le dioxyde de silicium étant un excellent isolant, ces structures sont principalement capacitives.

La nature du contact de grille n'est cependant pas sans importance. En effet, électriquement un électrolyte n'est pas complètement équivalent à un métal. La dimension des espèces chargées, par exemple, est beaucoup plus grande au sein d'un électrolyte que dans un métal. Il en résulte qu'une structure EOS est le siège de phénomènes plus complexes au niveau de la grille, comme nous le verrons dans ce chapitre.

La réponse électrique d'une capacité MOS est entièrement conditionnée par la structure Si/SiO2. Seule la tension de bandes plates dépend du métal de grille. Les principales caractéristiques d'une structure MOS sont, en conséquence, également valables pour une structure EOS. Pour cette raison, nous commençons ce chapitre par quelques brefs rappels concernant la structure MOS. Nous nous limiterons au cas d'un semiconducteur dopé P, tel étant le type de nos échantillons.

Seront exposés ensuite, les phénomènes engendrés lorsque le contact métallique de la structure MOS est remplacé par un contact électrolytique, ainsi que les conséquences au niveau de la modélisation électrique de la structure.

Finalement, nous décrirons quelques exemples de capteurs utilisant la structure Si/SiO2 comme transducteur, et nous verrons plus précisément le principe de l'immunocapteur sur lequel nous avons travaillé.

1. La structure MOS : rappels [8], [9]

Métal

Si

SiO2

figure 1 : La structure Métal-Oxyde-

Semiconducteur

La figure 1 représente une structure Métal-Oxyde-Semiconducteur (MOS). Elle est constituée d'un substrat silicium, dopé P ou N, sur lequel on fait croître un oxyde thermique qui est ensuite recouvert d'un métal. Par convention on polarise le métal de grille par rapport au semiconducteur.


1.1. La structure MOS idéale

Deux propriétés caractérisent une structure MOS idéale : il n'y a pas de charges présentes dans l'oxyde et à l'interface oxyde/silicium, et les travaux de sortie du métal et du silicium sont égaux. En conséquence, les bandes d'énergie sont plates à l'équilibre (en l'absence de polarisation appliquée) (figure ).

Métal Oxyde Silicium

Φmχ Φs

niveaudu vide

EcEi

EV

EF

Eg/2

figure 2 : Diagramme des bandes d'énergie d'une structure

MOS idéale à l'équilibre

Φm : Travail de sortie du métal

Φs : Travail de sortie du silicium

Χ : Affinité électronique du silicium

Ec : Minimum de la bande de conduction du

silicium

Ev : Maximum de la bande de valence du silicium

EF : Niveau de Fermi dans le silicium (type P)

Eg : Bande interdite du silicium

Ei : Niveau de Fermi intrinsèque

1.2. La structure MOS réelle

Dans une structure MOS réelle, différents types de charges, schématisés sur la figure 3, sont présents dans l'oxyde et à l'interface oxyde-silicium, et les travaux de sortie du métal et du silicium ne sont pas égaux.

1.2.1. Charges dans l'oxyde et à l'interface oxyde/semiconducteur

On distingue les charges dans l'oxyde des états d'interface. L'état de charge des états d'interface évolue avec la polarisation de la structure, alors que la valeur des charges dans l'oxyde reste constante.

La charge fixe dans l'oxyde, Qf, est généralement positive et située jusqu'à 30Å de l'interface Si/SiO2. Elle est due au procédé d'oxydation et ne peut être neutralisée. La charge mobile, Qm, est surtout constituée d'ions alcalins tels Na+ et K+, ou de métaux lourds. Ce sont des impuretés extrinsèques introduites lors du procédé de fabrication de la couche d'oxyde. Ces charges peuvent se déplacer sous l'action d'un champ électrique, même à température ambiante. La charge piégée dans l'oxyde, Qot, peut être positive ou négative et est due à un piégage d'électrons ou de trous dans toute la couche de l'oxyde. Elle peut être neutralisée par un recuit basse température.

Les états d'interface, Qit, sont des pièges chargés localisés dans la zone de transition entre l'oxyde et le silicium. On distingue les états de Tamm qui sont dus à la rupture de la périodicité du réseau cristallin et les états de Shockley qui sont dus à des défauts cristallins tels les liaisons pendantes. Physiquement les états d'interface sont capables d'échanger des porteurs avec le semiconducteur. Sur le plan dynamique, on distingue les états lents des états rapides. Les états lents sont situés à environ 20Å de l'interface dans l'oxyde et leur temps de réponse à un

19


changement de polarisation est assez long (1mn à 1heure), alors que les états rapides sont situés juste à l'interface et ont une vitesse d'émission et de capture de l'ordre de 1µs.

Métal

SiO

SiO

Charge mobile

Qf

Na

X X X X X+ + + + + + +

K+++ + +- - - 2

x

Si

Charge fixe dans l'oxyde

Charge piégée dans l'oxydeQ

ot

Qm

Pièges chargés à l'interface

Qit

figure 3 : Charges dans l'oxyde et à l'interface oxyde-silicium d'une structure MOS réelle

1.2.2. Diagramme des bandes d'énergie

La figure 4 représente le diagramme des bandes d'énergie d'une structure MOS réelle. A l'équilibre les niveaux de Fermi du métal et du silicium sont alignés. La courbure des bandes exprime une différence de potentiel entre le métal et le silicium. Celle-ci est due à la différence de leurs travaux de sortie et aux charges présentes dans la structure. Cette tension interne peut être neutralisée en appliquant une tension, Vfb, appelée tension de bandes plates, et donnée par la relation:

q : Charge élémentaire de l'électron

( )1fb m s

ox

QVq C

= Φ − Φ −



Q = Qot + Qf + Qm + Qit : charge totale dans l'oxyde

Cox : Capacité de l'oxyde

Métal Oxyde Silicium

Φm

χ Φs

niveaudu vide

EcEi

EV

EF

Ψsq

figure 4 : Diagramme des bandes d'énergie d'une

structure MOS réelle à l'équilibre



Ψs : Potentiel de surface du silicium

Χ : Affinité électronique du silicium

Ec : Minimum de la bande de conduction du

silicium

Ev : Maximum de la bande de valence du silicium

EF : Niveau de Fermi dans le silicium

Ei : Niveau de Fermi intrinsèque


Lorsque la structure est polarisée, les niveaux de Fermi du métal et du silicium sont décalés et la courbure des bandes d'énergie à la surface du semiconducteur change. Celle-ci est

20


quantifiée par le potentiel de surface, Ψs, défini comme la différence de potentiel entre le niveau de Fermi intrinsèque dans le volume et à la surface du semiconducteur.

1.3. Caractérisation électrique d'une structure MOS

L'exploitation de la capacité, C, en fonction de la tension appliquée, V, est la technique électrique la plus utilisée pour la caractérisation de structures MOS. A partir d'une caractéristique C(V) on peut déterminer l'épaisseur de l'oxyde, le dopage du substrat et la tension de bandes plates de la structure. Grâce à différentes méthodes capacitives comparatives, on peut également évaluer la qualité de l'interface oxyde/silicium et la densité d'états d'interface : la méthode de Terman consiste à comparer une caractéristique C(V) expérimentale avec la caractéristique théorique, et la méthode de Gray-Brown consiste à comparer des caractéristiques C(V) expérimentales obtenues à différentes températures.

La mesure de capacité n'est cependant pas la seule exploitée : la densité d'états d'interface peut également être déterminée à partir de mesures de conductance, et les mesures de courant permettent d'évaluer la qualité de l'oxyde.

Cependant, la capacité reste la caractéristique mesurable la plus importante d'une structure MOS. Ainsi nous rappelons ci-dessous ses principales propriétés.

1.4. Capacité d'une structure MOS

Lorsque la structure MOS est soumise à une polarisation, une quantité égale de charges mais de signe opposé apparaît de part et d'autre de l'oxyde, aux interfaces métal/oxyde et silicium/oxyde, et une chute de potentiel est observée à travers la structure. Alors que les charges dans le métal sont superficielles, une zone de charge d'espace s'étend dans le volume du semiconducteur. En conséquence, la chute de potentiel se répartit entre l'oxyde et une partie du semiconducteur. Electriquement ceux-ci peuvent, dans une première approche, être considérés comme deux capacités en série. La capacité totale de la structure est donnée par la relation:

1 1C CMOS ox s

= +1

C

CMOS : capacité de la structure MOS

Cox : capacité de l'oxyde (1)

Cs : capacité du silicium

Si les charges présentes dans l'oxyde (Qf, Qm, Qit) sont réparties uniformément, le champ électrique est uniforme et la chute de potentiel linéaire. La capacité de l'oxyde est donnée par la relation:


C Sdox

r=ε ε0 ε0 : Permittivité diélectrique du vide

εr : Permittivité diélectrique relative de l'oxyde

S : Aire de la grille métallique

d : Epaisseur de l'oxyde

21


La capacité du semiconducteur se calcule à partir de l'expression suivante:

Cs : Capacité du silicium C dQ

dsss

= −Ψ

Qs : Charge d'espace dans le silicium

Ψs : Potentiel de surface

La charge d'espace, Qs, et donc la capacité du silicium, Cs, varient en fonction de la polarisation de la grille. En conséquence, la capacité totale de la structure MOS dépend de la tension appliquée.

1.3.1. Capacité d'une structure MOS idéale

On distingue trois régimes de charge d'espace dans le semiconducteur en fonction de la tension continue V appliquée (figure 5).

basse fréquence

Capacité

0

accumulation

haute fréquence

Tensioninversion

désertion figure 5 : Caractéristique C(V) d'une structure

MOS idéale (silicium dopé P)

1. Accumulation (V<0) : Il y a accumulation d'électrons à l'interface métal/oxyde et de trous à l'interface silicium/oxyde. Une petite variation du potentiel appliqué entraîne une forte variation de la concentration de trous en surface : la capacité du silicium est très grande et peut être négligée par rapport à la capacité de l'oxyde, d'où CMOS = Cox.

2. Désertion (V>0) : Les électrons sont drainés de l'interface métal/oxyde, et les trous quittent l'interface silicium/oxyde créant une zone désertée sans porteurs mobiles. La charge positive à l'interface métal/oxyde est entièrement compensée par les atomes accepteurs ionisés, ce qui explique l'étendue de la région de charge d'espace dans le semiconducteur. La région désertée se comporte comme un diélectrique en série avec l'oxyde et la capacité de la structure est donnée par la relation (1). La capacité Cs du silicium diminue et une diminution de CMOS est observée.

3. Inversion (V>>0) : La capacité de la structure atteint un minimum lorsque la couche d'inversion commence à s'établir à la surface du semiconducteur. Des électrons générés thermiquement dans la zone désertée sont accélérés vers l'interface où ils s'accumulent. La largeur de la zone de désertion atteint un maximum : une augmentation de la tension continue induit uniquement une augmentation de la quantité d'électrons à l'interface. Dans ce régime la capacité de la structure dépend de la fréquence du signal sinusoïdal appliqué pour la mesure de la capacité. A haute fréquence, la génération et l'accumulation d'électrons à l'interface oxyde/silicium n'arrivent pas à suivre le signal alternatif superposé à la tension continue. La modulation de la charge imposée par le signal alternatif s'effectue alors au niveau de la zone désertée qui agit toujours comme un diélectrique en série avec l'oxyde. Etant donné que son épaisseur n'augmente plus, CMOS reste constant lorsque V augmente. A très basse fréquence (généralement en dessous de 100 Hz) la génération thermique de paires électron-trou arrive à suivre le signal alternatif. La modulation s'effectue alors au niveau de la couche d'inversion, masquant la zone de désertion. Comme dans le cas

22


23

de l'accumulation, la capacité du silicium est très grande et peut être négligée par rapport à la capacité de l'oxyde dans un modèle série : CMOS = Cox.

1.3.2. Capacité d'une structure MOS réelle

Les charges dans l'oxyde et les états d'interface, présents dans une structure MOS réelle, modifient sa caractéristique Capacité-Tension C(V).

• La charge fixe dans l'oxyde, Qf, induit une translation de la caractéristique C(V) parallèlement à l'axe des tensions, vers des tensions plus positives ou négatives, selon la nature de la charge. Dans le cas d'une charge positive, la translation se fait vers les potentiels négatifs.

• La charge mobile dans l'oxyde, Qm, induit une translation variable en fonction de la polarisation, ainsi que l'apparition d'un hystérésis, dû à l'inertie des charges, lors d'un balayage aller-retour en tension (figure 6). La largeur de l'hystérésis dépend de la vitesse de balayage de la tension, et pour un semiconduteur de type P il est de sens horaire quelle que soit la nature de la charge.

• Les états d'interface, Qit, induisent une déformation de la caractéristique (figure 7). Les états d'interface lents sont également sources d'hystérésis, à cause de leur constante de temps élevée. Pour un semiconducteur de type P, l'hystérésis induit par les états d'interface est de sens antihoraire.


C

V0

Cox

Qm > 0 C

V0

Cox

Qm< 0

C

V0

Cox

figure 6 : Influence de la charge mobile dans l'oxyde sur la caractéristique C(V)

d'une structure MOS. figure 7 : Influence des états

d'interface sur la caractéristique C(V) d'une structure MOS.

2. Le contact électrolytique et la structure EOS

La figure 8 représente une structure Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur (EOS). Le métal de grille d'une structure MOS est remplacé par un électrolyte et une électrode de référence. La structure EOS forme avec l'électrode de référence un système électrochimique. Un bref rappel sur les systèmes électrochimiques classiques se trouve en annexe (p. 111).

Les caractéristiques présentées dans le paragraphe précédent restent valables pour une structure EOS, avec cependant quelques modifications, notamment au niveau des diagrammes de bandes d'énergie et de la définition de la tension de bandes plates. Les principaux changements engendrés lorsque le contact de grille métallique de la structure MOS est remplacé par un électrolyte, sont exposés dans ce paragraphe. Nous commencerons cependant par quelques brefs rappels sur les systèmes électrochimiques classiques.

Si

SiO2

électrolyte

électrode de référence

figure 8 :La structure Electrolyte-Oxyde-

Semiconducteur

2.1. Comparaison électrolyte/métal

La nature du contact de grille différenciant les structures MOS et EOS, il est intéressant de comparer l'électrolyte et le métal.

Un électrolyte présente deux différences majeures par rapport à un métal : sa résistivité et la dimension des porteurs. Dans une solution molaire, la concentration en ions est de l'ordre de 1021cm-3, ce qui est 100 à 1000 fois inférieur à la concentration de porteurs libres dans le métal. De plus, les ions en solution sont en général solvatés, c'est-à-dire entourés de molécules d'eau, et présentent donc un certain encombrement par rapport aux électrons d'un métal.

Les conséquences sont doubles, lorsqu'un contact métallique est remplacé par un contact électrolytique. La résistance du contact augmente, et il apparaît une zone de chute de potentiel au niveau du contact, due à la dimension non négligeable des porteurs, et appelée double couche électrique.

24


25

2.2. Interface électrode/électrolyte : la double couche électrique

La double couche électrique résulte de la tension interfaciale qui apparait lorsqu'une électrode solide est mise en contact avec un électrolyte conducteur. La surface de l'électrode se charge, ce qui est compensé par une charge de signe opposé dans l'électrolyte près de l'électrode.

2.2.1. Modèles classiques

Les modèles classiques de la double couche électrique ont été développés principalement à partir d'études de l'interface mercure/solution. Plusieurs modèles ont été proposés [10]. La manière d'envisager la répartition de la charge dans l'électrolyte les différencie.

Le modèle de Stern est le plus complet (figure 9). Il considère deux zones de charge dans l'électrolyte : la couche interne, également appelée couche compacte, couche de Helmholtz ou couche de Stern, et la couche diffuse. Ce modèle tient compte de l'adsorption des molécules de solvant, et de quelques ions, sur la surface de l'électrode. Les ions électrolytiques solvatés qui doivent compenser la charge de l'électrode ne peuvent donc s'approcher qu'à une certaine distance de celle-ci. Ceux qui sont le plus proche définissent le plan externe de Helmholtz (OHP). La couche interne s'étend précisément de l'électrode jusqu'au plan externe de Helmholtz et fait quelques ångströms d'épaisseur. Elle est caractérisée par une très grande densité de charge par rapport au reste de l'élactrolyte, et une chute de potentiel importante et linéaire. La couche diffuse s'étend du plan extérieur de Helmholtz jusqu'au sein de la solution. Elle est constituée d'ions solvatés, de charge opposée à celle de l'électrode, et dont la concentration diminue lorsqu'on s'éloigne de celle-ci. La chute de potentiel dans la couche diffuse est beaucoup moins importante que dans la couche interne. L'épaisseur de la couche diffuse varie avec la concentration de l'électrolyte [11] : une augmentation de la concentration entraîne une compression de la couche. Pour des concentrations supérieures à 10-2M l'épaisseur est inférieure à 300Å .


+++++++

++

++

+-

-

-

-

-

-

électrode

OHP

molécule de solvant

ion spécifiquement adsorbé

- ion solvaté

électrolyte

coucheinterne

couche diffuse

OHPdistance

potentiel

électrode

+++++++

++

++

+

coucheinterne

couche diffuse

figure 9 : Vues schématiques de la double couche électrique et de la répartition du potentiel dans l'électrolyte, selon le

modèle de Stern.

L'expérience a montré que le modèle de Stern s'applique très bien à la plupart des interfaces chargées. Cependant, dans le cas d'interfaces oxyde/solution (oxyde au sens large) il présente quelques lacunes. Ces interfaces ont, en effet, des propriétés très différentes des interfaces métal/solution. La densité surfacique de charge est par exemple beaucoup plus grande pour la plupart des interfaces oxyde/solution, que pour des interfaces métal/solution. Différentes modifications ont été apportées au modèle de Stern afin d'essayer d'expliquer les phénomènes observés, mais aucune théorie parfaitement cohérente n'en a résulté [12].

D'autres modèles ont alors été proposés, parmi lesquels on distingue le modèle des liaisons par sites [13], que nous développons ici brièvement, appliqué au cas des structures Si/SiO2.

2.2.2. Modèle des liaisons par sites

C'est la structuration de la couche interne qui différencie le modèle des liaisons par sites des modèles classiques de la double couche électrique. Ce modèle tient compte du fait que la répartition de la charge surfacique d'un oxyde est différente de celle d'un métal .

En effet, la surface du dioxyde de silicium est formée de sites silanols et de ponts siloxanes (figure 10). Lorsqu'elle est mise en contact avec une solution aqueuse, les sites silanols réagissent avec les ions H+ et OH- présents dans la solution :

SiO2

Si Si Si Si

OH OH

OH

OHOH

Si Si

O

silanolisolé

silanolsvicinaux

silanolsgéminaux

pontsiloxane

figure 10 : Surface de l'oxyde

Si — OH Si — O- + H+

Si — OH + H+ Si — OH2+

Les sites O- et OH2+ créés sont responsables de la charge surfacique de l'oxyde. Celle-ci est donc discrète, contrairement au cas d'un métal où la charge est continue, et elle dépend de la concentration en ions H+ et OH- de la solution.

26


Le modèle des liaisons par sites envisage ensuite une interaction de ces sites chargés avec les ions électrolytiques. Dans le cas d'une solution aqueuse de chlorure de sodium, on a les réactions suivantes :

Si — O- + Na+ Si — O- — Na+

Si — OH2+ + Cl- Si — OH2+ — Cl-

Le modèle initial de Yates [13] a été plus amplement développé par Bousse et al. [14], qui proposent une répartition des cations et anions électrolytiques adsorbés aux sites chargés de l'oxyde, dans des plans à différentes distances de la surface de l'oxyde (figure 11). En conséquence, on observe trois zones de chutes de potentiel linéaires dans la couche interne.

OH

OH 2+

O-

OHOH2

+

OH2+

O-OH

Na+

SiO2

SiSiSiSiSiSiSiSi

OHP

couche interne couche diffuse

Cl-

OHP

ion solvaté

Na+

Cl-

Cl-

SiO2

couche interne couche diffuse figure 11 : Vue schématique de la couche interne et de la répartition du potentiel dans l'électrolyte selon le modèle

proposé par Bousse et al. [14].

La structuration de la couche diffuse, ainsi que la chute de potentiel associée, sont considérées de la même manière que dans le modèle de Stern.

2.3. Polarisation d'une structure EOS

siliciumoxydeélectrolyte

charges

-

+

Q

σo

σel s

figure 12 : Répartition de charges de part et d'autre de l'oxyde, dans une

structure EOS polarisée en régime d'accumulation.

Une structure EOS soumise à une polarisation se comporte de la même manière qu'une structure MOS : une quantité égale de charges mais de signe opposé apparaît de part et d'autre de l'oxyde. La figure 12 représente la répartition des charges, dans le cas d'une structure EOS polarisée en régime d'accumulation. Les charges éventuelles présentes à l'interface oxyde/silicium, ainsi que dans l'oxyde ont été omises. La charge dans le silicium, Qs, est contrebalancée par la charge de la double couche électrique, c'est-à-dire par la somme des charges de la surface de l'oxyde, σo, et des couches interne et diffuse de l'électrolyte, σel.

De la même manière qu'une structure MOS, une structure EOS présente trois régimes de charge d'espace dans le semiconducteur en fonction de la tension continue appliquée :

27


l'accumulation, la désertion et l'inversion. Cependant, les conventions de polarisation des électrochimistes sont en général appliquées aux structures EOS, c'est-à-dire que le substrat silicium est polarisé par rapport à la grille (électrode de référence). Les caractéristiques C(V) sont alors inversées par rapport à celles de structures MOS, le régime d'accumulation intervenant pour des tensions négatives dans le cas d'une structure MOS de type P, et positives dans le cas d'une structure EOS équivalente. Bien que notre étude porte sur des structures EOS, la convention de polarisation des électroniciens a été appliquée dans ce travail.

La figure 13 représente le diagramme des bandes d'énergie d'une structure EOS polarisée positivement par rapport à une électrode de référence (régime d'accumulation). L'électrode de référence est en contact électrostatique avec la structure EOS : leurs électrolytes sont séparés par une paroi poreuse, évitant le mélange des solutions, mais assurant un contact électrique. Ceci entraîne que leurs niveaux du vide sont alignés. La chute de potentiel dans la partie externe de la double couche électrique est négligée, et la partie interne est représentée par une unique chute de potentiel linéaire, même pour l'interface oxyde/électrolyte.

Electrolyte Oxyde Silicium

Φs

niveaudu vide

EcEi

EVEF

Electrode de référence

Métal Electrolyte

EF V

VH

figure 13 : Diagramme de bandes d'énergie d'une structure EOS en équilibre électrostatique avec une électrode de référence.

Polarisation négative du semiconducteur par rapport à l'électrode de référence.


Ec : Minimum de la bande de conduction

du silicium

Ev : Maximum de la bande de valence

du silicium

EF : Niveau de Fermi

Ei : Niveau de Fermi intrinsèque du

silicium


VH : Chute de potentiel dans la couche

interne (couche de Helmholtz)

V : Tension positive appliquée au silicium

Comme dans le cas d'une structure MOS, il existe une tension pour laquelle les bandes d'énergie dans le silicium sont plates. Elle est définie par [15] :

Vref : Potentiel de l'électrode de référence

VH : Chute de potentiel dans la couche interne

28


q : Charge élémentaire du silicium

V V Vq

QCfb ref H

s

ox

= − − −Φ

Q : Charge totale dans l'oxyde


Cette tension dépend du pH de la solution électrolytique, comme nous allons le voir par la suite.


29

3. Modélisation électrique

Un de nos objectifs est de réaliser une modélisation électrique de l'immunocapteur. Voilà pourquoi, après avoir résumé les principales caractéristiques des structures MOS et EOS, nous présentons quelques modèles électriques équivalents issus de la littérature.

3.1. Modèles électriques équivalents d'une structure Si/SiO2

Un schéma électrique complet d'une structure Si/SiO2 est donné dans la figure 14. Il sépare la contribution de l'oxyde et du silicium, et détaille la contribution des états d'interface.

C

C

C

R

R ox

it it

d

Zs figure 14 : Schéma équivalent détaillé

d'une structure MOS

R : Résistance due au volume du semiconducteur

Cit, Rit : Capacité et résistance dues aux états d'interface

Cd : Capacité associée à la zone de désertion du

semiconducteur


Zs : Impédance totale du silicium

Lorsque les comportements spécifiques du silicium et des états d'interface ne sont pas de première importance, ce qui est notre cas, un modèle électrique plus simple peut être envisagé (figure 15). La capacité, C, englobe celles de l'oxyde et du silicium. La conductance, G, est due aux états d'interface. Elle est nulle en régime d'accumulation et d'inversion.

R : Résistance due au volume du semiconducteur

C : Capacité globale de la structure MOS

G : Conductance globale de la structure MOS, due aux

états d'interface

C

G

R

figure 15 : Schéma équivalent simple d'une

structure MOS

3.2. Modèles électriques équivalents d'une structure EOS

A partir des modèles ci-dessus on peut élaborer des modèles électriques d'une structure EOS. Il est nécessaire d'ajouter les impédances de l'interface oxyde/électrolyte, de l'électrolyte et de l'électrode de référence. Parmi elles, l'impédance de l'interface oxyde/électrolyte est la plus complexe.

L'impédance de l'interface oxyde/électrolyte a été étudiée par Bousse et al. [16]. Deux contributions parallèles sont distinguées : celle de la charge surfacique de l'oxyde, et celle de la double couche électrique (figure 16).


CDL

Ca Zw

figure 16 : Impédance de l'interface oxyde/électrolyte, selon Bousse et al.

[16].

CDL : Capacité de la double couche électrique

Ca : Capacité associée à la charge surfacique de l'oxyde

Zw : Impédance de Warburg associée à la variation de

charge de la surface de l'oxyde avec le signal alternatif

appliqué

Une capacité, Ca, est associée à la charge surfacique de l'oxyde, créée par la réaction

des ions OH- et H+ avec l'oxyde. Cette charge surfacique est modulée lors de l'application d'un signal alternatif à la structure. A cette modulation est associée une impédance de Warburg, Zw, composée d'un terme capacitif, Cw, et d'un terme résistif, Rw. Elle représente une résistance au transfert de masse, c'est-à-dire à la diffusion des ions OH- et H+ entre l'oxyde et la solution, lors de la modulation de la charge surfacique.

La répartition de la charge dans la double couche électrique est supposée conforme au modèle de Stern. Les auteurs négligent l'adsorption spécifique d'ions électrolytiques aux sites O- et OH2+ dans la couche interne. La double couche électrique a alors un comportement purement capacitif. On lui associe la capacité CDL.

Il n'est cependant pas toujours nécessaire de tenir compte de l'impédance de l'interface oxyde/électrolyte. Diot et al. proposent un modèle électrique d'une structure EOS, dans lequel l'impédance de l'interface oxyde/électrolyte est négligée [17]. En effet, les ordres de grandeur de Ca et CDL sont de 140µF/cm2 et 20µF/cm2 respectivement [13], ce qui est négligeable en série avec Cox, même pour des oxydes minces. De son côté, Zw dépend de la fréquence de mesure, et n'est significative qu'à très basse fréquence.

Rref Wref

figure 17 :Schéma électrique équivalent d'une


L'impédance de l'électrode de référence est en général négligeable par rapport à celle d'une structure Si/SiO2. Une modélisation électrique a cependant été proposée par Erbach et al. [18] (figure 17). Wref représente une impédance complexe de Warburg.

Quand à l'électrolyte, celui-ci a en général un comportement purement résistif, et peut être modélisé par une résistance Rel.

Ainsi, plusieurs modèles électriques équivalents d'une structure EOS peuvent être envisagés selon que les contributions du silicium et de l'oxyde sont séparées, que la contribution des états d'interface est détaillée, et que les impédances de l'interface oxyde/électrolyte et de l'électrode de référence sont prises en compte. Les figure 18 et figure 19 représentent respectivement un schéma électrique équivalent très détaillé et très simplifié, d'une structure EOS.

30


Cox

CDL

Ca Zw

Rel Rref

Cd

Cit

Rit

R

Wref

oxyde interface électrolyte électrodesilicium

oxyde/silicium de référence

figure 18 : Schéma équivalent très détaillé d'une structure EOS

C

G

R

Rel

Si/SiO 2 électrolyte

figure 19 : Schéma équivalent très simplifié d'une structure EOS

Dans le prochain chapitre, qui constitue une étude expérimentale de structures EOS, nous

réaliserons une modélisation électrique à partir de nos résultats expérimentaux. Nous déterminerons ainsi de quels paramètres il sera nécessaire de tenir compte, dans notre cas, et quels paramètres pourront être négligés.

4. La structure Si/SiO2 comme transducteur

Pour terminer ce chapitre sont présentés succintement quelques exemples de capteurs utilisant une structure Si/SiO2 comme transducteur, ainsi que le principe de l'immunocapteur sur lequel nous avons travaillé.

Le rôle d'un capteur est de détecter un phénomène, et de le traduire en un signal électrique. Le transducteur est la partie du capteur qui convertit le phénomène en un signal électrique. Certains capteurs sont de simples transducteurs. C'est le cas de nombreux capteurs physiques, qui ne font que convertir une grandeur physique, telle la température ou la masse, en un signal électrique. D'autres capteurs sont plus complexes. Les biocapteurs, par exemple, qui permettent la détection et le dosage de molécules biologiques, nécessitent l'association d'une membrane sensible au transducteur. La membrane sensible interagit de manière sélective avec la molécule biologique à détecter. Cette interaction est ensuite détectée par le transducteur qui le traduit en un signal électrique. Les natures de la membrane sensible et du transducteur peuvent être très variées [19], [20] comme l'indique la figure 20.

transducteur

substanceà détecter

membrane sensible

MacromoléculeMembrane lipidiqueCellules entièresTissu organique

OptiqueThermiquePiezoélectriqueElectrochimique

signal électrique

capteur

figure 20: Principe d'un biocapteur

La structure Si/SiO2 a des propriétés telles qu'elle se prête bien à une utilisation comme transducteur pour des capteurs chimiques ou biologiques. La structure Si/SiO2 est soit utilisée telle quelle, soit sous la configuration plus complexe d'un transistor à effet de champ. Comme nous l'avons vu dans les paragraphes précédents, les deux principaux paramètres d'une

31


structure Si/SiO2 sont la capacité et la tension de bandes plates. C'est la variation de ces paramètres qu'exploitent les capteurs à transducteur Si/SiO2.

4.1. Exploitation de la variation de la tension de bandes plates

La tension de bandes plates d'une structure Si/SiO2 est sensible à la présence d'espèces chargées au niveau de la grille. Cependant elle est rarement directement exploitée. On préfère exploiter la modification de la tension de seuil d'un transistor à effet de champ, induite par la modification de la tension de bandes plates de la structure MOS centrale.

La figure 21 représente un transistor à effet de champ en technologie MOS classique. Son principe de fonctionnement est le suivant. La source et le substrat étant mis à la masse, une tension positive est appliquée sur la grille. Au dessus d'une tension seuil, une zone d'inversion de type n apparaît à la surface du substrat et constitue le canal. Cette tension dépend directement de la tension de bandes plates de la structure MOS formée par la grille, l'oxyde de grille et le silicium. Si le drain est polarisé par rapport à la source, un courant s'établit entre la source et la drain et le transistor devient passant.

Silicium

SiO2n

p

+ n

source

+

grille

drain

oxyde de grille

canal

figure 21 : Le transistor classique à effet de champ

La modification de la tension de seuil d'un transistor, due à la présence d'espèces chargées au niveau de la grille, est utilisée pour la détection d'espèces gazeuses, chimiques et biochimiques.

4.1.1. Un capteur de gaz : le MOSFET à grille palladium

Il a été montré que la tension de bandes plates de capacités MOS [21], et la tension de seuil de transistors MOSFET (Metal-Oxide-Field-Effect-Transistor) [22], tous les deux avec une grille métallique en palladium, dépendent de la teneur en hydrogène de l'atmosphère environnante. L'explication serait que l'hydrogène gazeux s'adsorbe et se dissout à la surface de la grille palladium, et que les atomes d'hydrogène diffusent ensuite jusqu'à interface Pd/SiO2 où ils forment une couche de dipoles, modifiant ainsi le travail de sortie de la grille. D'autres gaz, qui en se dissociant produisent de l'hydrogène, peuvent également être détectés par ce dispositif.

4.1.2. L'ISFET : capteur chimique d'espèces ioniques

L'ISFET (Ion-Sensitive-Field-Effect-Transistor) permet la détection d'ions dans une solution [23]. C'est Bergveld qui le premier a montré qu'un transistor à effet de champ classique, sur lequel le métal de grille est remplacé par un électrolyte et une électrode de référence, est sensible à la concentration en ions H+ de la solution électrolytique. Comme nous l'avons vu précédemment, la charge surfacique d'un oxyde en contact avec une solution est créée à partir de réactions avec les ions H+ et OH- de la solution. Cette charge surfacique dépend de la concentration en ions H+ et OH- de la solution, c'est-à-dire du pH. Par conséquent, la chute de

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potentiel dans la solution, la tension de bandes plates de la structure, et la tension de seuil du transistor, dépendent du pH.

Par la suite, il s'est avéré que des capteurs à pH, réalisés à partir de structures Si/SiO2, présentent une très mauvaise stabilité, due au dioxyde de silicium. Celui-ci a alors été remplacé par d'autres diélectriques, tels Si3N4, Ta2O5 ou Al2O3.

La surface du diélectrique peut être rendue sensible à d'autres ions que les ions H+, permettant de réaliser des capteurs pour d'autres espèces chimiques ionisées.

4.1.3. L'ENFET : capteur de molécules biologiques

L'ENFET (Enzyme-Field-Effect-Transistor) constitue une extension de l'ISFET, et permet de détecter des molécules biologiques, de manière indirecte [20]. En effet, des enzymes catalysant la molécule biologique à détecter sont immobilisées sur la grille d'un ISFET. Celui-ci détecte ensuite des espèces ioniques simples produites par la réaction enzymatique. La pénicilline, l'urée et le glucose constituent quelques exemples de molécules qui peuvent ainsi être dosées.

4.2. Exploitation de la variation de la capacité

La capacité d'une structure Si/SiO2 peut être sensible à la fixation de molécules neutres à la surface de l'oxyde, si celles-ci forment une couche suffisamment épaisse et au moins partiellement diélectrique.

A priori ce pourrait être le cas de molécules biologiques, car elles sont de taille importante. Aussi, la faisabilité d'immunocapteurs capacitifs, pour la détection d'espèces immunologiques, a été étudiée par plusieurs auteurs [24], [25], [26]. La structure Si/SiO2 n'est pas le seul transducteur envisageable pour un tel capteur : des immunocapteurs capacitifs à transducteur Si/SiO2/Si3N4 [27], Ta/Ta2O5 [28] et TiO2 [29] ont été signalés.

Un immunocapteur capacitif est constitué d'une structure capacitive sur laquelle sont fixés des anticorps, nécessaires à la reconnaissance sélective des antigènes à doser. Un anticorps interagit, en effet, de manière spécifique avec un seul type d'antigènes, comme nous le verrons dans le chapitre 4. Les anticorps peuvent être fixés par simple adsorption, mais la stabilité d'une telle couche est très mauvaise. Elle peut être augmentée par la fonctionnalisation du transducteur, c'est-à-dire par le greffage de molécules organiques servant d'intermédiaire entre l'oxyde et les anticorps. Ces molécules organiques forment avec les anticorps la membrane sensible du capteur. La figure 22 représente une vue schématique d'un immunocapteur à transducteur Si/SiO2.

Si

SiO2

électrolyte


membrane sensiblecontenant des anticorps

antigènes à détecter

capteur transducteur

figure 22 :Vue schématique de l'immunocapteur

33


En réalité on distingue deux modes de fonctionnement d'un immunocapteur capacitif, qui découlent de deux modes différents de fixation des anticorps sur le transducteur. Soit le transducteur est fonctionnalisé grâce à une monocouche de molécules, sur laquelle est ensuite fixée une monocouche d'anticorps, soit il est fonctionnalisé par le dépôt d'une membrane polymérique dans laquelle sont ensuite inclus des anticorps (figure 23). Dans le premier cas, une éventuelle variation de la capacité de la structure après réaction avec les antigènes serait due à une augmentation de l'épaisseur du diélectrique du capteur; dans le deuxième cas il s'agirait d'une modification de la constante diélectrique de la membrane sensible.

SiSiO2


monocouche

monocouche

VARIATION DE CAPACITE

membranesensible

Si


VARIATION DE CAPACITE

membranesensible membrane polymérique

contenant des anticorps

d'anticorps

de moléculesSiO2

FONCTIONNALISATION PAR MONOCOUCHE FONCTIONNALISATION GRACE A UN POLYMERE

due à l'augmentation de l'épaisseurdu diélectrique de la strutcure

due à la modification de la constantediélectrique de la membrane sensible

figure 23 : Modes de fixation des anticorps sur le transducteur et de fonctionnement de l'immunocapteur capacitif

Le travail effectué au Laboratoire de Physico-Chimie des Interfaces, de l'Ecole Centrale de Lyon, en collaboration avec l'Unité Mixte CNRS/Bio-Mérieux, de l'Ecole Normale Supérieure de Lyon, concernant l'élaboration d'un immunocapteur capacitif, est particulièrement intéressant, puisque notre étude constitue une suite directe à celle menée par ces deux laboratoires.

Initialement, c'est le premier mode de fonctionnement du capteur qui a été exploité : chaque couche de molécules ajoutée sur l'oxyde était considérée comme diélectrique. La fixation d'une couche d'antigènes sur le capteur, réagissant avec les anticorps immobilisés, augmenterait donc l'épaisseur du diélectrique du capteur, ce qui entraînerait une baisse de sa capacité en régime d'accumulation.

La faisabilité de l'immunocapteur capacitif a ainsi pu être montrée : le dosage de l'alfa-fœtoprotéine, avec une sensibilité de 20ng/ml, a été réalisé grâce à des mesures de capacité en fonction de la tension [5]. Cependant, les problèmes de reproductibilité ont été importants lorsqu'on a ensuite voulu réaliser un capteur identique pour la détection d'un autre antigène, l'entérotoxine B [6]. Ces problèmes provenaient de la nature de la membrane sensible. Les anticorps étaient, en effet, incorporés dans une couche de glutaraldéhyde, produit très réactif et instable.

34


35

De nombreuses autres techniques d'immobilisation d'anticorps sur la structure Si/SiO2 ont alors été testées, avec succès quand à l'aptitude du capteur à ensuite fixer des antigènes (évaluée par test ELISA), mais sans grand succès quand à la détection des antigènes par mesure de capacité [7].

D'autres auteurs ont également rencontré des difficultés dans l'élaboration d'immunocapteurs capacitifs. Cela se traduit soit par une absence totale de signal, comme l'a signalé Berney [26], soit par un signal mais beaucoup plus faible qu'attendu, comme l'a signalé Klein [27].

Les antigènes semblent donc difficilement engendrer un effet capacitif reproductible, que ce soit directement, ou par modification de la constante diélectrique d'une membrane polymérique dans laquelle ils pénètrent. L'importance d'une caractérisation électrique plus poussée a aussi été montrée par Maupas [4], avec des résultats encourageants, obtenus par l'exploitation de l'impédance totale du capteur, et non plus seulement de la partie capacitive, et en fonction de la fréquence de mesure. Le capteur étudié était destiné à détecter l'alfa-fœtoprotéine, et les anticorps étaient greffés sur le transducteur grâce à une membrane polymérique. Des modifications réversibles des propriétés électriques de la membrane sensible du capteur, après incubation d'antigènes, ont ainsi pu être mises en évidence, grâce à une modélisation électrique. Les variations de l'impédance globale du capteur après incubation d'antigène étaient cependant très faibles. Il faut dire que dans le cas d'un transducteur Si/SiO2 Maupas n'a exploré qu'un très petit domaine de fréquences, de 20 à 80kHz, ce qui n'est pas forcément le domaine optimal de détection des antigènes, et ce qui justifie d'autant plus la suite des travaux.

Chapitre 2 : Etude expérimentale de structures EOS

38

CHAPITRE 2 Etude expérimentale de structures EOS


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Introduction

Plusieurs raisons ont motivé cette première étude expérimentale, consacrée au transducteur Si/SiO2.

L'objectif premier étant de développer des techniques de caractérisation électrique adaptées à l'étude d'un immunocapteur, il était logique de mettre au point ces techniques sur de simples structures Si/SiO2, dont nous connaissons le comportement électrique théorique, avant des les appliquer au capteur entier, dont la réponse électrique est plus incertaine, à cause de la membrane sensible.

Deux nouvelles techniques de caractérisation électrique ont été introduites par rapport aux mesures d'impédance, le plus souvent utilisées : la mesure du courant de fuite, permettant de contrôler la qualité diélectrique de l'oxyde, et la mesure QSM (Quasi Static Measurement), équivalente à une mesure de capacité à très basse fréquence, pour la détermination précise de l'épaisseur du diélectrique.

Par ailleurs nous avons poursuivi le travail effectué par Maupas [4], en développant davantage les mesures d'impédance. Aux mesures de capacité en fonction de la tension à fréquence fixe, nous avons ajouté des mesures d'impédance en fonction de la fréquence à tension fixe, sur un domaine de fréquences très vaste : de 10mHz à 100kHz, et à différents régimes de polarisation.

En appliquant ces techniques expérimentales aux structures Si/SiO2, nous avons pu déterminer les conditions nécessaires à des mesures reproductibles et significatives. Ce point est fondamental car, si l'on veut réaliser un immunocapteur fiable, il faut être sûr qu'une éventuelle modification de la mesure de l'impédance du capteur est bien spécifique de la réaction anticorps-antigène et n'est pas due à une fluctuation de l'impédance de la structure sous-jacente.

Cette étude expérimentale de structures EOS est d'autant plus importante que, jusqu'à présent, les variations d'impédance du capteur mises en évidence lors de la fixation d'antigènes ont été plutôt faibles, par rapport à l'impédance totale du transducteur Si/SiO2 [4]. Cette étude permettra donc, par la suite, de mieux distinguer les signaux significatifs.

Ce chapitre commence par une présentation des structures Si/SiO2 utilisées, ainsi que des montages expérimentaux ayant servi à leur caractérisation électrique, et par la suite à celle de l'immunocapteur. Certaines mesures d'impédance ont été réalisées avec un montage à deux électrodes, alors qu'un montage à trois électrodes est généralement utilisé pour les structures EOS. L'utilisation du montage à deux électrodes a été validée par une étude expérimentale. Différentes analyses systématiques ont permis de déterminer les conditions nécessaires à des mesures reproductibles sur le transducteur Si/SiO2, et d'élaborer un modèle électrique des structures EOS sont exposées ensuite.


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1. Les structures Si/SiO2

Les structures Si/SiO2 utilisées proviennent de la société Microsens de Neuchâtel en Suisse. Elles nous ont été fournies sous la forme de plaquettes de trois pouces comportant 21 structures identiques prédécoupées, de dimensions 1.3 x 1.3 cm2. Les échantillons sont constitués d'un substrat silicium monocristallin d'orientation <100>, de type P, métallisé or en face arrière, et recouvert d'un oxyde thermique: un oxyde mince de grille, circulaire, d'épaisseur environ 75Å et de diamètre 3mm, est entouré d'un oxyde de champ d'épaisseur 0.5 à 1µm (figure 24).

Si

1.3 cm

contact or

oxyde de champ

oxyde de grille = 3 mm

figure 24 :Vue schématique d'une structure

Si/SiO2

Cette configuration permet d'obtenir une surface bien définie pour les mesures d'impédances électrochimiques. En effet, la surface de contact entre l'électrolyte et l'échantillon est définie par un joint torique, et fait dans le cas de notre cellule de mesure environ 30mm2. Cependant, elle peut être sujette à de petites fluctuations. Grâce au motif de l'oxyde mince, ces fluctuations se produisent au niveau de l'oxyde de champ, dont la capacité est négligeable par rapport à celle de l'oxyde de grille, à cause de son épaisseur importante. En effet, pour une surface totale de mesure de 30mm2, un oxyde de grille de 75Å et un oxyde de champ de 1µm, la capacité est de 33nF, dont seuls 0.8nF sont dus à l'oxyde de champ.

La différence d'épaisseur entre l'oxyde de grille et l'oxyde de champ a été vérifiée grâce à un profilomètre mécanique, pour chaque lot d'échantillons reçu, afin de nous assurer que la capacité de l'oxyde de champ est réellement négligeable par rapport à celle de l'oxyde de grille.

2. Techniques de caractérisation électrique et montages expérimentaux

2.1. La cellule électrochimique

Toutes les mesures ont été réalisées avec la cellule électrochimique de la figure 25, conçue par Bio-Mérieux. Cette cellule permet l'utilisation de trois électrodes, souvent nécessaire dans le domaine électrochimique, pour le contrôle précis du potentiel de l'électrode à étudier.

L'électrode à étudier est en général dénommée "électrode de travail". Dans notre cas, c'est la structure Si/SiO2. Un joint torique permet d'assurer l'étanchéité entre la cellule en pyrex, d'une part, et l'électrode de travail et la contre-électrode en platine, d'autre part. Une connexion rigide en aluminium maintient ces électrodes en place, et assure le contact électrique.

Une électrode au calomel saturé a été utilisée comme électrode de référence, et du PBS (Phosphate Buffered Saline) a servi d'électrolyte, pour l'ensemble des mesures. C'est une solution aqueuse, utilisée de manière courante comme tampon, lors de la manipulation de molécules


biologiques. Sa composition est la suivante : tampon phosphate à 0.01M, KCl à 0.0027M et NaCl à 0.137M; son pH est de 7.4.

Electrode de référence (ER)

Cellule en pyrex

Connection électrique

Electrode de travail (ET)

Joint torique

Bloc de plexiglass

Contre-électrode (CE)

Electrolyte

figure 25 : Vue schématique de la cellule électrochimique

Lors de la caractérisation électrique des structures Si/SiO2, les électrodes de la cellule électrochimique sont reliées à différents appareils, selon la mesure effectuée. Toutes les acquisitions expérimentales sont entièrement pilotées par un micro-ordinateur, dans lequel les résultats sont ensuite stockés, pour une exploitation ultérieure.

2.2. Mesures d'impédances

L'objectif des mesures d'impédances électrochimiques réalisées dans ce travail est de déterminer l'impédance de l'immunocapteur après chaque étape dans son élaboration, ainsi que de déterminer les conditions expérimentales optimales pour la détection des antigènes. Deux types de montages ont été utilisés : un montage potentiostatique à trois électrodes, et un montage à deux électrodes.

Quel que soit le type de montage, l'appareillage de mesure ne peut distinguer la contribution de l'électrode de travail de celle des autres éléments du système électrochimique, en particulier de celle de l'électrolyte, de la contre-électrode et de l'électrode de référence. Les données déterminées expérimentalement correspondent toujours à celles du système électrochimique dans son intégralité. Afin de remonter aux caractéristiques de l'électrode de travail, il sera donc nécessaire de déterminer l'influence des autres éléments. Nous verrons toutefois par la suite que dans le cas de structures Si/SiO2, l'électrode de travail possède une très grande impédance, dominant la réponse électrique du système.

2.2.1. Montages potentiostatiques

Un montage à trois électrodes est le plus généralement utilisé pour effectuer des mesures d'impédances électrochimiques, car il permet de contrôler le potentiel de l'électrode de travail par rapport à une électrode de référence de potentiel fixe. Un tel montage comprend un potentiostat et un amplificateur à détection synchrone ou un analyseur de réponse de transfert.

Le principe du montage expérimental est donné sur figure 26. Le potentiostat comporte un amplificateur régulateur de tension qui, à tout instant, ajuste son signal de sortie, appliqué à

41


la contre-électrode (CE), de telle sorte que la différence de potentiel v entre l'électrode de référence (ER) et l'électrode de travail (ET) soit égale à la tension d'entrée e du circuit, même si les impédances au sein de la cellule électrochimique fluctuent au cours du temps.

La détermination de l'impédance Z du circuit se fait grâce à la mesure de la différence de potentiel v entre l'électrode de travail et l'électrode de référence, et à celle du courant i circulant dans la cellule. On a alors Z = v/i.

La tension v est mesurée via un électromètre de très grande impédance d'entrée, et le courant i est obtenu grâce à un convertisseur courant/tension connecté à une résistance de mesure Rm. La tension ui délivrée par le convertisseur est proportionnelle à i.

Les tensions v et ui sont ensuite envoyées sur les deux voies d'une détection synchrone qui mesure leurs composantes en phase et en quadrature par rapport à un signal de référence, ce qui permet de remonter à l'impédance du circuit [30].

_

+

CEER

ETZ

R+

_

e

e

m

Amplificateur régulateurde tension

Electromètre

Convertisseurcourant/tension

vers la détectionsynchrone

vers la détectionsynchrone

v

u i

cellule électrochimique_

+

i

i

R

R

voie 2voie 1

vv = e

Mesure de la tensionaux bornes de Z

Mesure du courant

figure 26 : Schéma de principe d'un montage potentiostatique

Deux montages potentiostatiques distincts ont été utilisés dans ce travail.

Le premier comprend un potentiostat, conçu au Laboratoire de Physico-Chimie des Interfaces de l'Ecole Centrale de Lyon, et une détection synchrone Stanford Research Systems SRS10. Le logiciel développé sur ce système permet de réaliser des mesures d'impédances en fonction de la tension à fréquence fixe, dans le domaine 100Hz à 100kHz.

Le second montage, que nous avons utilisé beaucoup plus amplement, comporte un analyseur d'impédances électrochimiques EG&G Instruments M6310, intégrant en un seul appareil un potentiostat et une détection synchrone. Le logiciel de commande permet d'effectuer des mesures d'impédances en fonction de la fréquence sur un domaine très large, de 50µHz à 100kHz, pour des polarisations continues allant jusqu'à 8V.

42


2.2.2. Montage à deux électrodes

N'ayant pas pu utiliser de manière continue durant ce travail les montages potentiostatiques, nous avons également effectué des mesures d'impédances à l'aide d'un montage à deux électrodes, dans lequel l'électrode de travail et la contre-électrode sont reliées à un analyseur d'impédances HP4192A, utilisé de manière courante pour la caractérisation de circuits électroniques et de composants semiconducteurs. Il permet la mesure de l'impédance en fonction de la fréquence entre 10Hz et 10MHz, à tension fixe, et vice-versa. Dans ce montage, le potentiel de l'électrode de travail n'est donc pas contrôlé par rapport à celui d'une électrode de référence.

Le principe de mesure de l'analyseur d'impédance HP est le même que celui d'une détection synchrone, à savoir qu'il détecte les composantes en phase et en quadrature de la différence de potentiel v entre l'électrode de travail et la contre-électrode, et du courant i traversant la cellule, par rapport à un signal de référence. Nous n'irons donc pas plus loin dans la description du fonctionnement de cet appareillage, ceci ne présentant pas d'intérêt particulier pour la compréhension des mesures réalisées dans ce travail.

Une étude comparative des mesures d'impédance effectuées avec les deux types de montages a été réalisée. Les résultats, exposés dans la suite du chapitre, ont permis de valider l'utilisation du montage à deux électrodes dans le cas particulier de nos structures d'étude. Cependant, le domaine de fréquences exploitable (de 10Hz à 10MHz) est beaucoup plus limité du côté des basses fréquences que celui de l'analyseur d'impédance EG&G Instruments, avec lequel nous avons réalisé des mesures jusqu'à 10mHz.

2.2.3. Exploitation des mesures d'impédance

L'impédance mesurée Zm peut être exploitée sous différentes configurations:

• module et phase Zm = Z.e-jϕ Z : module ϕ : phase

• parties réelle et imaginaire Zm = Re(Zm)+j.Im(Zm) avec Re(Zm) = Z.cosϕ Im(Zm) = Z.sinϕ

• résistance et capacité équivalentes dans le cas d'un circuit purement résistif et capacitif (figure 27)

Zm eq

Impédance mesuréeéquivalentes

R Ceq

Résistance et capacité

figure 27 : Relation entre l'impédance mesurée

et la résistance et la capacité équivalentes

Z R jCm eq

eq= −

⋅ω

avec Req = Re(Zm) et CZeq

m= −

⋅1

ω Im( )

Dans ce travail, les configurations module et phase, ainsi que résistance et capacité équivalentes, ont été utilisées. Cette dernière a été préférée à la configuration parties réelle et imaginaire car l'impédance globale du système étudié se modélise très grossièrement par une

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capacité, celle de la structure Si/SiO2, en série avec une résistance, celle de l'électrolyte, du silicium, des connexions et des câbles; elle est donc plus explicite.

2.2.4. Correction des données expérimentales

Dans un appareillage tel que l'analyseur d'impédances électrochimiques de EG&G Instruments, les limites de l'électronique de mesure peuvent dans certains cas entraîner des erreurs de mesure importantes. Les sources d'erreurs se situent à plusieurs niveaux et sont décrites dans une note technique fournie par EG&G Instruments [31].

a) Impédance d'entrée Ze de l'électromètre

La différence de potentiel v entre l'électrode de travail (ET) et l'électrode de référence (ER) est mesurée grâce à un électromètre dont l'impédance d'entrée Ze doit être très supérieure à l'impédance Z que l'on veut mesurer (figure 28).

ER

ETZe

_

+ i

v Z

figure 28 : L'électromètre et son

impédance d'entrée Ze

Etant donné que les structures Si/SiO2 présentent de par leur caractère isolant une très grande impédance, nous avons vérifié que l'impédance d'entrée Ze de l'électromètre n'introduisait pas d'erreurs sur la mesure de Z.

Nous avons déterminé Ze en effectuant une mesure d'impédance à vide, c'est-à-dire sans qu'aucun échantillon ne soit connecté à l'appareil; le courant i passe alors dans Ze, et par la mesure de v et i, on détermine Ze.

Le graphe 1 montre les variations du module de l'impédance d'entrée Ze avec la fréquence de mesure. Un schéma électrique équivalent de Ze, constitué d'une résistance d'entrée Re de 30GΩ en parallèle avec une capacité d'entrée Ce de 19pF (figure 29), modélise parfaitement les variations expérimentales.

Sur le même graphe, nous avons reporté les variations du module de l'impédance d'une structure EOS. Il apparait que sur toute la gamme de fréquences exploitée par la suite, le module de l'impédance d'entrée de l'appareil est environ 1000 fois supérieure à celle d'une structure Si/SiO2. Son influence sur les mesures peut donc être négligée.

44


10-2 10-1 100 101 102 103 104 105101102103104105106107108109

10101011

Ze - mesurée Ze - simulée structure EOS

IZI (

Ω)

f (Hz)

graphe 1: Impédance d'entrée de l'analyseur EG&G, par rapport à celle mesurée pour une structure EOS.

L'impédance d'entrée simulée correspond à celle du circuit ci-contre.

C = 19 pF

R = 30 GΩ

e

e

figure 29 Impédance d'entrée de l'analyseur EG&G

45


b) Impédance d'entrée du convertisseur courant/tension

R+

_

mu i

i

Cparasite

figure 30 : Présence de capacités

parasites au niveau du convertisseur courant/tension d'un

montage potentiostatique

Une autre source d'erreurs provient de la présence d'une capacité parasite Cparasite, à l'entrée du convertisseur courant/tension, en parallèle avec la résistance de mesure Rm (figure 30). Les valeurs de Rm et de Cparasite dépendent toutes les deux du calibre de mesure choisi.

EG&G Instruments fournit, avec le logiciel de commande de l'analyseur d'impédance, un fichier de calibration standard,qui comporte la valeur de Cparasite pour chaque calibre de mesure, et qui permet de calculer à partir des données expérimentales brutes, des valeurs corrigées des capacités parasites.

C = 33nF R = 180 Ω

Rf = 20GΩ

figure 31 Circuit-test. Rf représente la résistance de fuite du condensateur, évaluée expérimentalement à 20GΩ.

L'importance de la correction a été mise en évidence en réalisant des mesures sur le circuit électrique simple de la figure 31, le logiciel de commande permettant l'accès aussi bien aux courbes expérimentales brutes, que corrigées. Ce circuit, comprenant un condensateur et une résistance en série, permet de nous placer dans des conditions expérimentales très similaires à celles engendrées par nos structures EOS, tout en maîtrisant parfaitement l'impédance du circuit de test (pas d'électrolyte, d'électrode de référence ou de contre électrode). Par la suite, ce circuit est appelé "circuit-test".

Alors que les mesures brutes du module de l'impédance et de la capacité équivalente sont parfaitement conformes à la théorie, les mesures de la phase de l'impédance, et surtout de la résistance équivalente, nécessitent impérativement une correction. Elles dévient en effet fortement des courbes théoriques, comme le montrent les graphe 2 et graphe 3.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

courbe brute calibration standard calibration améliorée courbe théoriquePh

ase(

Z) (d

egré

s)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

R eq ( Ω

)

f (Hz)

graphe 2 et graphe 3 : Phase de l'impédance et résistance équivalente en fonction de la fréquence du circuit-test. Courbe théorique, mesure brute et effet de différentes calibrations.

Même si la calibration standard permet de rapprocher courbes expérimentales et théoriques, l'écart reste encore grand, surtout au niveau de la résistance équivalente, ce qui

46


s'explique par le fait que les paramètres du fichier de calibration standard ne correspondent pas parfaitement à chaque appareil de mesure d'un même modèle.

La détermination spécifique des capacités parasites en fonction du calibre de notre appareil de mesure s'est alors imposée. Elle a été effectuée selon les instructions de la note technique 201 de EG&G Instruments [31], grâce à des mesures sur des résistances. La valeur d'une seule capacité parasite sur dix a due être légèrement modifiée dans le fichier de calibration, de 330pF à 390pF. La courbe de la phase de l'impédance (graphe 2), corrigée par cette calibration améliorée, s'est alors montrée parfaitement cohérente avec la courbe théorique, autour de 10Hz, alors qu'un léger écart subsiste autour de 0.1Hz, que nous n'avons pas réussi à éliminer. Par contre, la résistance équivalente est encore loin de la caractéristique théorique (graphe 3). De plus, la résistance équivalente du circuit-test, déterminée avec un autre montage expérimental (potentiostat modèle 283 et détection synchrone modèle 1025 de EG&G Instruments) n'a pas du tout la même allure, comme l'indique le graphe 4.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105101

102

103

104

105

106

107

108

109

Appareil de mesure 1 Appareil de mesure 2

R eq ( Ω

)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105101

102

103

104

105

106

107

108

109

Re(Z) Im(Z)( Ω

)

f (Hz)

graphe 4 : Résistance équivalente du circuit-test, déterminée avec deux appareils différents

graphe 5 : Parties réelle et imaginaire théoriques du circuit-test

Il est probable qu'aux problèmes de calibration, s'additionnent des problèmes de mesure, causés par la nature même de l'impédance des échantillons. Comme l'indique le graphe 5, la partie imaginaire de l'impédance du circuit-test est toujours largement supérieure à la partie réelle, ce qui est également valable pour une structure EOS. Autour de 10Hz, la partie imaginaire atteint jusqu'à 5000 fois la partie réelle. De telles inégalités peuvent poser problème, au niveau de la détection synchrone, pour la détermination précise de la partie réelle.

En raison des importantes erreurs de mesure, la résistance équivalente sera par la suite exploitée de manière très prudente.

c) Réponse en fréquence

Un mauvais accord entre les réponses en fréquence de l'électromètre et du convertisseur courant/tension de l'analyseur d'impédance de EG&G Instruments induit des erreurs de mesure à haute fréquence. Le fichier de calibration standard doit en principe permettre de corriger ces erreurs, mais nous avons observé que ceci n'est pas toujours le cas.

47


102 1030

10

20

30

104 105

courbe brute calibration standard calibration

Ceq

(nF)

f (H

améliorée

z)

graphe 6 : Influence de la calibration de l'appareil de mesure sur la capacité équivalente, à haute

fréquence.

En effet, le graphe 6 montre les variations de la capacité équivalente d'une structure EOS en fonction de la fréquence, déduite de la mesure de la partie imaginaire de l'impédance. On observe que cette capacité augmente à haute fréquence, au dessus de 10kHz, ce qui est difficilement explicable, et que le fichier de calibration ne modifie d'aucune manière les données expérimentales brutes. Encore une fois, les paramètres du fichier de calibration ne correspondent pas parfaitement à notre appareil de mesure.

La détermination expérimentale des paramètres correspondant précisément à l'appareil utilisé a été réalisée en suivant les instructions de la note technique 201 de EG&G Instruments [31]. Après application du fichier de calibration amélioré aux mesures brutes, une légère chute de la capacité équivalente est alors observée à haute fréquence (graphe 6).

Cependant, la détermination expérimentale du paramètre de correction devant figurer dans le fichier de calibration est délicate, et les instructions fournies très incomplètes. Nous avons donc un doute sur l'exactitude du paramètre déterminé, et préférons ignorer par la suite la chute de la capacité équivalente à haute fréquence, dans une modélisation électrique.

2.3. Mesures de courant

Deux types de mesures de courant ont été introduits : la mesure QSM et la mesure du courant de fuite. Dans les deux cas, un picoampèremètre HP4140, est relié à l'électrode de travail et à la contre-électrode de la cellule électrochimique.

2.3.1. La mesure QSM

La mesure QSM (Quasi Static Measurement) permet, par une mesure de courant, d'accéder à une caractéristique C(V), équivalente à la caractéristique C(V) basse fréquence de la structure Si/SiO2.

Cette mesure est utilisée de manière courante pour les composants MOS classiques. En effet, les mesures d'impédance à basse fréquence, avec les appareils généralement utilisés dans le domaine de la micro-électronique, sont souvent très bruitées. Cependant, la caractéristique C(V) basse fréquence est très importante, car elle permet de calculer avec précision l'épaisseur de l'isolant de la structure, en s'affranchissant de l'influence de la résistance série due au substrat, aux connexions et aux câbles. Le problème est donc résolu grâce à la méthode QSM, qui par l'application d'une rampe de tension à la structure capacitive, et à la mesure du courant de déplacement, permet de remonter à la caractéristique C(V) basse fréquence, comme le montre la relation suivante :

48


dq : Variation de la charge aux bornes de la structure capacitive

C dqdV

dqdtdVdt

id= = =α

dV : Variation de la tension aux bornes de la structure capacitive

id : Courant de déplacement engendré par la rampe de tension

α : Vitesse de la rampe de tension appliquée à la structure

Cette technique de mesure a déjà été appliquée à des structures EOS par d'autres auteurs [17].

2.3.2. Mesure du courant de fuite

La mesure du courant de fuite, en fonction de la tension appliquée, est intéressante pour contrôler la qualité de l'oxyde. Pour un oxyde de bonne qualité, le courant de fuite est très faible, puisque le dioxyde de silicium est un isolant et présente une résistivité très grande. Cependant, si l'oxyde se dégrade, le courant de fuite augmente.

La mesure du courant de fuite nécessite l'application de paliers de tension à la cellule électrochimique. En effet, chaque fois que la polarisation aux bornes de la structure Si/SiO2 est modifiée, un courant de déplacement est engendré dans le circuit. Or, le courant de fuite est le courant qui subsiste après que le courant de déplacement se soit annulé. A chaque polarisation, il est donc nécessaire d'attendre la disparition du courant de déplacement avant d'effectuer la mesure.

2.4. Récapitulatif des différentes techniques de mesure

La figure 32 présente un schéma récapitulatif des montages expérimentaux utilisés.

49


Analyseur d'impédanceEG&G M6310

Analyseur d'impédanceHP4192A

Pico-ampèremètreHP4140

câble

ERCEET

CEET

CEET

ER

ETCE

MESURES

COURANT

Micro-ordinateurCellule

Détection synchroneSRS10

PotentiostatLPCI

ERCEET

- la fréquence

- la tension

- la fréquence

IMPEDANCE

- la tension

en fonction de :

(montage potentiostatique)

(montage potentiostatique)

(montage à deux électrodes)

IEEE

électrochimique

figure 32 : Schéma récapitulatif des montages expérimentaux utilisés

La figure 33 donne pour chaque technique de caractérisation électrique mise en œuvre, la nature de la tension appliquée à la cellule électrochimique, ainsi que l'objectif de la mesure dans cette étude.

Tension

temps

MESURES D'IMPEDANCE

Tension

temps

Tension

temps

Tension

tempsf1 f2 f3

en fonction de la tensionà fréquence fixe

en fonction de la fréquenceà tension fixe

MESURE DE COURANT

mesure QSM mesure du courant de fuite

Modélisation électriqueDétection des antigènes

Détection des antigènes Contrôle de la qualité de l'oxyde

TECHNIQUES EXPERIMENTALES

TENSION APPLIQUEE A LA CELLULE ELECTROCHIMIQUE

OBJECTIF

figure 33 : Récapitulation des techniques expérimentales utilisées et de leurs objectifs

L'objectif des mesures de courant de fuite est uniquement de contrôler la qualité diélectrique initiale des structures Si/SiO2, et de vérifier qu'aucune dégradation n'a lieu lors de l'élaboration de l'immunocapteur. Des mesures de courant de fuite ont été réalisées sur toutes les structures Si/SiO2 nues, ainsi qu'après chaque étape dans l'élaboration du capteur.

50


51

Les mesures QSM et les mesures d'impédance ont été exploitées dans l'objectif de mettre en évidence la réaction des antigènes avec l'immunocapteur.

Les mesures QSM et les mesures d'impédance en fonction de la tension permettent toutes les deux de mettre en évidence les deux phénomènes suivants : une éventuelle modification de l'épaisseur du diélectrique du capteur par la fixation d'antigènes, ce qui se traduirait par une baisse de la capacité équivalente en régime d'accumulation, ainsi qu'une éventuelle variation de charge au niveau de la grille du capteur engendrée par les antigènes, ce qui se traduirait par une variation de la tension de bandes plates de la structure. Entre les deux types de mesures, nous avons préféré les mesures QSM, qui ont été le plus amplement exploitées.

Les mesures d'impédance en fonction de la fréquence constituent la plus importante des différentes techniques de caractérisation électrique mises en œuvre. Ces mesures, réalisées sur un très large domaine de fréquence, et à différentes polarisations, sont destinées à déterminer dans quels domaines de fréquences et de tensions la réaction des antigènes avec l'immunocapteur produit le signal électrique le plus important. De plus, ces mesures permettent de réaliser une modélisation électrique du capteur, et de déterminer ainsi les caractéristiques électriques de la membrane sensible.

3. Validation de l'utilisation d'un montage à deux électrodes pour les mesures d'impédance

L'utilisation d'un montage potentiostatique, à trois électrodes, permet le contrôle du potentiel de l'électrode de travail par rapport à une référence fixe. Elle est surtout préconisée dans deux cas : si la cellule électrochimique est le siège d'oxydo-réductions, ou si la résistance de l'électrolyte est élevée.

Dans le premier cas, les potentiels de l'électrode de travail et de la contre-électrode évoluent en fonction du temps (équation de Nernst). Un montage à deux électrodes permettra alors uniquement de contrôler la différence de potentiel entre les deux électrodes, et non le potentiel de chaque électrode, en général plus intéressant.

Dans le deuxième cas, la chute de potentiel dans l'électrolyte peut devenir importante par rapport à la tension appliquée à la cellule électrochimique. Un montage potentiostatique est alors préférable, car il permet de diminuer l'influence de l'électrolyte sur les mesures. En effet, dans un montage potentiostatique, l'électrode de travail est polarisée par rapport à l'électrode de référence, alors que dans un montage à deux électrodes, elle est polarisée par rapport à la contre-électrode. Comme l'électrode de référence est généralement placée plus près de l'électrode de travail que la contre-électrode, la chute de potentiel au niveau de l'électrolyte est moindre dans le cas d'un montage potentiostatique.

A priori, un montage potentiostatique n'est pas impératif pour des mesures d'impédances électrochimiques sur des structures Si/SiO2. En effet, les oxydo-réductions devraient être négligeables, puisque la structure Si/SiO2 est électriquement bloquante vis-à-vis d'un courant


continu, et, son impédance étant très importante, le courant dans la cellule est faible et la chute de potentiel dans l'électrolyte devrait également être négligeable.

Nous avons cependant voulu vérifier expérimentalement la validité de l'utilisation du montage à deux électrodes.

3.1. Utilisation d'une pseudo-électrode de référence dans le montage potentiostatique

Dans un premier temps, l'électrode de référence au calomel saturé a été remplacée par une pseudo-électrode de référence en platine, dans le montage potentiostatique. Des mesures d'impédance en fonction de la tension, à différentes fréquences entre 1kHz et 100kHz, ont ainsi été réalisées.

Alors qu'une véritable électrode de référence est séparée de l'électrolyte de la cellule électrochimique par une membrane poreuse, ce qui lui permet de garder un potentiel constant, le platine de la pseudo-électrode de référence utilisée plonge dans cet électrolyte. L'utilisation d'une pseudo-électrode de référence dans un montage potentiostatique est donc un pas vers un montage à deux électrodes.

Comme le montrent les graphe 7 et graphe 8, représentant respectivement la résistance et la capacité équivalentes mesurées à 10kHz, la seule modification engendrée est une translation d'environ 0.2V des caractéristiques, c'est-à-dire une modification de la tension de bandes plates de la structure EOS.

-2 -1 0 1 2102

103

104

Electrodes de référence véritable (ECS) pseudo (platine)

R eq( Ω

)

Tension (V)

-2 -1 0 1 20

10

20

30

Ceq

(nF)

Tension (V)

graphe 7 et graphe 8 : Résistance et capacité équivalentes mesurées avec un montage potentiostatique à f=10kHz. Modification engendrée lorsqu'une pseudo-électrode de référence en platine remplace la véritable électrode de

référence.

Cette variation de la tension de bandes plates doit être en théorie égale à la différence de potentiel, ou à la différence des travaux de sortie, des deux électrodes de référence. Le travail de sortie de la SCE est connu : il est proche de 4.75eV. L'électrode en platine n'étant pas une véritable électrode de référence, son potentiel et son travail de sortie ne sont pas constants. Nous avons donc déterminé expérimentalement la différence de potentiel entre l'électrode de platine et la SCE, polongés dans du PBS. Elle vaut environ 0.2V, ce qui correspond parfaitement à la valeure de la variation de la tension de bandes plates observée.

52


Le potentiel de l'électrode de platine est supérieur à celui de la SCE, ce qui engendre une tension de bandes plates supérieure. Les caractéristiques électriques devraient alors être décalées vers des tensions positives lorsque l'électrode au calomel saturée est remplacée par l'électrode en platine, ce qui correspond tout à fait à ce que nous observons.

3.2. Montage à deux électrodes / montage potentiostatique

Dans un deuxième temps, des mesures d'impédance en fonction de la tension ont été réalisées avec le montage deux électrodes sur les mêmes structures Si/SiO2, également dans la gamme de fréquences de 1 à 100kHz.

La seule différence notable par rapport aux caractéristiques obtenues avec le montage potentiostatique (électrode de référence en platine) se situe au niveau de la résistance équivalente, en régime d'accumulation, comme l'indiquent les graphe 9 et graphe 10, qui correspondent aux courbes expérimentales obtenues à 10kHz. En régime d'accumulation, la résistance du silicium est faible. Comme nous le verrons par la suite, la résistance équivalente dans ce régime, correspond principalement à la résistance de l'électrolyte. La différence entre les courbes expérimentales expriment donc simplement l'augmentation de la contribution de l'électrolyte à l'impédance mesurée, lorsque le montage potentiostatique est remplacé par un montage à deux électrodes.

-2 -1 0 1 2102

103

104

Montages: potentiostatique à deux électrodes

R eq( Ω

)

Tension (V)

-2 -1 0 1 20

10

20

30

Ceq

(nF)

Tension (V)

graphe 9 et graphe 10 :Résistance et capacité équivalentes mesurées avec un montage potentiostatique (électrode de référence en platine) et un montage à deux électrodes, à f=10kHz.

Dans les gammes de fréquences et de polarisations étudiées ici, il est donc tout à fait possible de faire des mesures d'impédances sur des structures Si/SiO2 avec un montage à deux électrodes. Ceci nous permet non seulement d'utiliser sans scrupules le montage à deux électrodes, mais il constitue également un résultat très intéressant, en vue de la réalisation d'un immunucapteur intégré, car la miniaturisation de l'électrode de référence est souvent délicate.

4. Reproductibilité des mesures électriques

De nouvelles techniques de caractérisation électrique ont été introduites, pour augmenter les chances d'aboutir à un immunocapteur fiable. Cependant, il ne suffit pas de multiplier les techniques de caractérisation électrique. Il ne sert à rien d'essayer d'exploiter un

53


paramètre, tel la tension de bandes plates, si celui-ci n'est pas reproductible d'une mesure à l'autre, sur le capteur seul. De même, il ne sert à rien d'essayer de détecter des antigènes dans un régime de polarisation donné, si les mesures sur le capteur seul dans ce régime de polarisation manquent de reproductibilité.

Aussi, la réalisation d'un capteur fiable nécessite une étude de la reproductibilité des techniques de caractérisation électrique mises en œuvre, à commencer par une étude de la reproductibilité des mesures sur le transducteur seul. Dans ce but, la reproductibilité des mesures QSM et des mesures d'impédance en fonction de la fréquence a été testée sur cinq structures Si/SiO2, pendant une période de 5 mois.

4.1. Mesures QSM

Les mesures QSM se sont avérées parfaitement reproductibles, quand à la valeur de la capacité en régimes d'accumulation et d'inversion, sur la totalité de la période (graphe 11). Les variations maximales sont inférieures à 2% et correspondent à des incertitudes sur l'épaisseur de l'oxyde inférieures à 1Å. De plus, la capacité en régimes d'accumulation et d'inversion semble insensible à l'état de la surface de l'oxyde : que l'échantillon soit nettoyé ou non, nous obtenons le même résultat, ce qui n'est pas le cas des mesures d'impédance, comme nous le verrons par la suite.

-2 -1 0 1 20

10

20

30

(a) (b) (c)

Ceq

(nF)

Tension (V)

-2 -1 0 1 20

10

20

30

Dérive

Ceq

(nF)

Tension (V)

graphe 11 : Reproductibilité des caractéristiques QSM. (a) Premières mesures (b) Mesure après un mois (c) Mesure après 5 mois

graphe 12 : Dérive de la caractéristique QSM lors du contact avec l'électrolyte de 30mn

Une mauvaise reproductibilité de la tension de bandes plates a par contre été notée d'une mesure à l'autre : pour un même échantillon, des translations aléatoires de la caractéristique C(V) allant jusqu'à 150mV ont été observées, et dont nous n'avons pas réussi à nous affranchir. Elles sont probablement liées à la charge surfacique de l'oxyde, différente d'une mesure à l'autre, même avec une procédure identique de nettoyage de l'échantillon avant chaque mesure.

Une dérive systématique de la tension de bandes plates vers des tensions positives a également été observée pour l'ensemble des échantillons, lorsqu'ils sont laissés en contact avec l'électrolyte (plusieurs mesures consécutives sans enlever l'échantillon de la cellule électrochimique) (graphe 12). En 30 minutes, la dérive maximale observée est de 80mV. Elle

54


pourrait correspondre à la création d'une charge surfacique négative sur l'oxyde, en contact avec la solution aqueuse.

En conséquence, seule la variation de capacité en régime d'accumulation a été exploitée, la variation de la tension de bandes plates étant trop aléatoire.

4.2. Mesures d'impédance

4.2.1. Importance du nettoyage des échantillons

Contrairement aux mesures QSM, les mesures d'impédance se sont montrées très sensibles à l'état de la surface de l'oxyde. S'il y a présence de poussières visibles à l'œil nu, la reproductibilité des mesures est très mauvaise, comme le montrent les graphe 13 et graphe 14, qui correspondent aux courbes expérimentales en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation. En éliminant ces poussières, l'amélioration est nette.

Plusieurs méthodes de nettoyage de l'oxyde ont été testées, parmi lesquelles nous avons retenu le nettoyage à l'acétone, avec un coton-tige. Il donne les surfaces d'oxydes les plus propres au microscope optique, et ne dégrade d'aucune manière les caractéristiques électriques des structures Si/SiO2.

102 103 104 105102

103

104

sans nettoyage avec nettoyage

R eq ( Ω

)

f (Hz)

102 103 104 1050

10

20

30

Ceq

(nF)

f (Hz)

graphe 13 et graphe 14 : Résistance et capacité équivalentes en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation, sans et avec nettoyage de la surface de l'oxyde.

Le graphe 14 permet de faire une remarque quant aux mesures de capacité en fonction de la tension, dont la reproductibilité n'a pas été étudiée séparément. Il indique que si l'échantillon n'est pas nettoyé, la capacité équivalente en régime d'accumulation, mesurée à une fréquence donnée, risque d'être erronée. Si l'on considère qu'elle correspond à la capacité de la structure Si/SiO2, et qu'une épaisseur d'oxyde en est déduite, celle-ci risque d'être fausse. Pour l'échantillon du graphe 14, dans le pire des cas, la capacité équivalente de la structure non nettoyée, à une fréquence de 10kHz, correspond à une épaisseur d'oxyde de 89Å. L'erreur est ici pratiquement de 15%, car la capacité équivalente à la même fréquence, après avoir nettoyé l'oxyde, correspond à une épaisseur de 78Å.

Le nettoyage systématique de la surface de l'oxyde est donc primordial avant chaque mesure d'impédance, que celle-ci se fasse en fonction de la fréquence ou de la tension.

55


4.2.2. Importance du régime de polarisation

Malgré les précautions prises quant au nettoyage de l'oxyde, les mesures d'impédances en fonction de la fréquence, sans polarisation extérieure appliquée (régime de désertion), se sont montrées d'une très mauvaise reproductibilité. Ceci est lié au déplacement aléatoire de la tension de bandes plates, mis en évidence par les mesures QSM.

Les mesures en régime d'inversion ne se sont pas non plus montrées reproductibles d'un jour à l'autre, à cause de l'extrême sensibilité de la couche d'inversion dans le silicium, aux conditions d'éclairement.

En réalité, seules les mesures d'impédance en régime d'accumulation, se sont montrées assez reproductibles pour pouvoir par la suite être exploitées pour la détection d'un signal lors de l'interaction des antigènes avec l'immunocapteur. Nous nous sommes donc concentrés sur ce type de mesure.

5. Modélisation électrique

Dans le but d'élaborer un modèle électrique fiable des structures EOS, nous avons dans un premier temps déterminé la contribution des différents éléments du circuit électrochimique à l'impédance mesurée, ainsi que les mesures réellement significatives.

5.1. Capacité équivalente

La capacité des structures EOS en régime d'accumulation, déterminée par mesure QSM, donne une épaisseur d'oxyde qui correspond parfaitement à celle donnée dans les spécifications du fabriquant. De plus, en fonction de la fréquence (10mHz<f<100kHz), la capacité équivalente en régime d'accumulation est quasi-constante (graphe 15), et égale à celle déterminée par mesure QSM (graphe 16). En conséquence, toutes les capacités sauf une, celle de l'oxyde, sont négligeables dans ce domaine de fréquences.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

10

20

30

Ceq

(nF)

f (Hz)

-2 -1 0 1 20

10

20

30

Ceq

(nF)

Tension (V)

graphe 15 et graphe 16 : Capacité équivalente en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation, et caractéristique QSM, pour une même structure EOS.

En réalité, le graphe 15 montre que la capacité équivalente en régime d'accumulation n'est pas parfaitement constante en fonction de la fréquence. Une très légère diminution est

56


souvent observée à moyennes fréquences (entre 100Hz et 10kHz), s'accentuant à haute fréquence (entre 10 et 100kHz).

Nous avons vu précédemment que la présence d'impuretés à la surface de l'oxyde entraîne une chute importante de la capacité équivalente à moyennes et hautes fréquences (graphe 14 p. 55). Il est probable que la légère diminution à moyennes fréquences, parfois observée pour les structures nettoyées, est due à des impuretés résiduelles sur l'oxyde, invisibles au microscope optique. On peut imaginer que de telles impuretés forment une couche à la surface de l'oxyde, conductrice à basse fréquence, mais présentant un caractère capacitif à moyennes et hautes fréquences, dont l'importance dépend de la densité des impuretés. L'ampleur de la chute de la capacité équivalente, en fonction de la fréquence, traduirait alors la propreté de la surface de l'oxyde. Il est à noter qu'aucun modèle électrique simple, constitué de composants idéaux de valeur constante en fonction de la fréquence, ne peut modéliser cette chute progressive de la capacité équivalente. Son importance relative étant très faible, nous choisissons donc de l'ignorer dans notre modélisation électrique.

Quand à la chute plus importante de la capacité équivalente, à haute fréquence, ce phénomène a déjà été observé par Maupas [4]. Afin de l'expliquer, il propose un modèle électrique prenant en compte la capacité de la double couche électrique et la résistance de transfert de charges, à l'interface oxyde/électrolyte. Dans ce travail nous n'adoptons pas cette explication, car nous avons pu constater précédemment que des erreurs de mesures, causées par un mauvais accord entre la réponse en fréquence de l'électromètre et du convertisseur courant/tension de l'analyseur EG&G, sont présentes à ce niveau (graphe 6, p. 48). Nous préférons ignorer cette chute de capacité également, dans notre modélisation électrique.

Il est toutefois à noter que, même si la courbe expérimentale est légèrement erronée à haute fréquence, elle est parfaitement reproductible, pour une structure EOS donnée. Toute modification après fonctionnalisation de la structure, fixation des anticorps, ou réaction du capteur avec les antigènes sera interprétée comme significative.

5.2. Modélisation électrique : première approche

Un premier modèle électrique des structures EOS en régime d'accumulation a été déduit des mesures du module et de la phase de l'impédance, en fonction de la fréquence. Ce modèle est très simple, uniquement constitué d'une capacité et d'une résistance en série (figure 34). Les expressions analytiques du module et de la phase de l'impédance correspondante en fonction de la fréquence f sont indiquées ci-dessous:

C R

série

figure 34 : Premier modèle électrique

des structures EOS

( )( )

2série 2

1IZI= R2 f Cπ

+⋅ ⋅ ⋅

série

1Phase(Z) atan2 f C Rπ

⎛ ⎞= ⎜ ⎟⋅ ⋅ ⋅ ⋅⎝ ⎠

Comme le montrent les graphe 17 et graphe 18, ce modèle simule parfaitement la réponse électrique des structures EOS. La capacité déterminée correspond tout à fait à celle

57


de l'oxyde, et la résistance série devrait correspondre à la somme des résistances de l'électrolyte, du substrat silicium, de l'électrode de référence, des connexions et des câbles.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109

ModélisationRsérie = 180ΩC = 32.5nF

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

courbes expérimentales modélisation

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 17 et graphe 18 : Module et phase de l'impédance d'une structure EOS en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation. Première modélisation électrique.

Ces graphes permettent également d'évaluer la reproductibilité des mesures, puisque les courbes expérimentales de six acquisitions différentes y sont représentées. Au niveau de la phase de l'impédance, pour des fréquences supérieures à 10kHz, de faibles écarts sont observés. Cependant, au niveau de la modélisation électrique, elles correspondent à des variations de la résistance inférieures à 10Ω. Etant donné que plusieurs éléments contribuent à cette résistance, une telle variation n'est pas surprenante.

5.3. Détermination de la résistance de l'électrolyte

5.3.1. Cas du montage potentiostatique

Il est probable que la principale contribution à la résistance du modèle électrique ci-dessus provienne de l'électrolyte. Afin de le déterminer expérimentalement, des mesures d'impédance ont été réalisées en modifiant la concentration du PBS, ainsi qu'en remplaçant le PBS par de l'eau distillée. La concentration du PBS a été modifiée, soit en diluant la solution avec de l'eau distillée, soit en dissolvant plusieurs pastilles de PBS dans le volume d'eau destiné à une pastille.

Les graphe 19 et graphe 20 illustrent la modification engendrée au niveau du module et de la phase de l'impédance d'une structure EOS, en régime d'accumulation, lorsque la concentration ionique de l'électrolyte est modifiée.

58


10-2 10-1 100 101 102 103 104 105101

102

103

104

105

106

107

108

109

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

eau distillée C/CPBS = 0.5 PBS C/CPBS = 1.5 C/CPBS = 2 C/CPBS = 3Ph

ase(

Z) (d

egré

s)

f (Hz)

graphe 19 et graphe 20 : Influence de la concentration ionique de l'électrolyte sur la réponse électrique de la structure EOS, en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation.

En se basant sur le même modèle électrique simple que précédemment (figure 34), la résistance série totale a pu être déterminée, pour chaque concentration ionique de l'électrolyte. Les valeurs sont reportées dans le tableau 1.

Célectrolyte/CPBS 1 0.5 1.5 2 3

Rsérie (Ω) 180 390 125 100 77

Rsérie/Rsérie -1PBS - 0.5 1.4 1.8 2.3

tableau 1 : Influence de la concentration ionique de l'électrolyte sur la résistance série mesurée

L'on constate que le rapport des résistances série est très proche du rapport des concentrations électrolytiques, quand ces dernières sont faibles. La résistance de l'électrolyte domine alors complètement la résistance série de la structure EOS. Ceci n'est plus vrai pour des concentrations ioniques plus élevées.

A partir des valeurs du tableau 1, la résistance du PBS, dans le cas du montage potentiostatique, est évaluée à environ 160Ω, et les 20Ω restants seraient dûs à l'électrode de référence, au substrat silicium, aux connexions et aux câbles. Il faut noter que ces valeurs varient légèrement, selon les échantillons.

5.3.2. Cas du montage à deux électrodes

Grâce à une modélisation électrique obtenue à partir des courbes expérimentales des graphe 21 et graphe 22, la résistance série pour une même structure EOS a été évaluée à 180Ω, dans le cas du montage potentiostatique, et à 330Ω dans le cas du montage à deux électrodes.

Dans le cas du montage potentiostatique, l'électrode de référence est placée à mi-chemin entre l'électrode de travail et la contre-électrode. L'utilisation d'un montage à deux électrodes devrait donc doubler la résistance de l'électrolyte. En se basant sur les valeurs déterminées ci-dessus, la résistance série totale dans le cas d'un montage à deux électrodes serait de (2x160 + 20)Ω, c'est-à-dire 340Ω, ce qui est très proche de la valeur déterminée expérimentalement.

59


10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

ModélisationC = 33nFRsérie 3 électrodes = 180Ω

Rsérie 2 électrodes = 330Ω

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Montages: potentiostatique à deux électrodes Modélisation

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 21 et graphe 22 : Module et phase de l'impédance d'une structure EOS, en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation, déterminée avec deux montages expérimentaux différents : le montage potentiostatique et le

montage à deux électrodes.

Ces courbes constituent une preuve expérimentale que l'utilisation d'un montage à deux électrodes, au lieu d'un montage potentiostatique, pour la mesure de l'impédance d'une structure EOS, n'engendre qu'une seule modification, en régime d'accumulation : l'augmentation de la contribution de la résistance de l'électrolyte. Par rapport au montage potentiostatique, ce montage n'a alors qu'un seul inconvénient : le domaine restreint de fréquences délivrées par le pont d'impédances HP4192A.

5.4. Résistance équivalente

Le modèle électrique jusqu'à présent élaboré pour les structures EOS est très simple : uniquement constitué d'une capacité et d'une résistance en série (figure 34). Il s'applique parfaitement au module et à la phase de l'impédance, ainsi qu'à la capacité équivalente, en régime d'accumulation, dans le domaine de fréquences étudié (10mHz à 100kHz).

Cependant, ce modèle ne permet pas du tout d'expliquer le comportement de la résistance équivalente, dans ce domaine de fréquences. Le modèle implique, en effet, une résistance équivalente constante, sur toute la gamme de fréquences, ce qui n'est pas observé expérimentalement. Pour des fréquences supérieures à 100Hz, la résistance équivalente est bien constante et égale à environ 200Ω. Cette valeur correspond parfaitement à la résistance série de la structure EOS, due à l'électrolyte, au substrat silicium, aux connexions et câbles, déterminée précédemment. En dessous de 100Hz, la résistance équivalente augmente fortement, pour atteindre environ 1MΩ à 0.1Hz.

Cette augmentation pourrait être expliquée par la résistance non infinie du dioxyde de silicium. En effet, à température ambiante, sa résistivité est supérieure à 1016Ω.cm [32], ce qui correspond pour nos échantillons à une résistance supérieure à 100GΩ. Il a été déterminé par simulation qu'une telle résistance, en parallèle avec la capacité de l'oxyde dans un modèle électrique (figure 35), est suffisamment importante pour ne pas modifier le module ou la phase de l'impédance, ainsi que la capacité équivalente, dans le domaine de fréquences jusqu'à présent étudié (10mHz<f<100kHz). Par contre elle

C

R

R

ox

série

figure 35 : Modèle électrique pouvant

expliquer l'augmentation de la résistance équivalente des structures EOS à basse

fréquence

60


entraîne bien une augmentation de la résistance équivalente à basse fréquence. Cependant, tout comme dans le cas des mesures sur le circuit-test (figure 31, p. 46), la courbe théorique d'un tel modèle ajuste très mal les points expérimentaux.

Les résistances équivalentes d'une structure EOS et du circuit-test (figure 31, p. 46) ont été comparées et les caractéristiques sont très similaires, comme le montre le graphe 23. Ceci permet d'affirmer que l'augmentation à basse fréquence, dans le cas de la structure EOS, est bien causée par une résistance, en parallèle avec la capacité de l'oxyde. En effet, il ne peut pas s'agir d'une impédance de Warburg, ce qui aurait été une autre explication possible, puisque dans le cas du circuit-test il n'y a aucune présence d'électrolyte.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

Circuit-test Structure EOS

R eq ( Ω

)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

R eq ( Ω

)

f (Hz)

graphe 23 : Comparaison de la résistance équivalente d'une structure EOS et du circuit-test

graphe 24 : Mauvaise reproductibilité de la résistance équivalente d'une structure EOS à basses fréquences. Six

acquisitions consécutives sont représentées.

Contrairement au cas de la capacité équivalente, qui est peut-être légèrement erronée à haute fréquence, mais parfaitement reproductible, la résistance équivalente est non seulement sujette à des erreurs de mesure, mais elle est de plus très bruitée et manque de reproductibilité à basses fréquences, comme le montre le graphe 24. Elle ne sera donc pas exploitée par la suite, dans l'objectif de détecter les antigènes.

5.5. Modèle électrique des structures EOS

La figure 36 représente le modèle électrique auquel nous avons abouti. Ce modèle très simple explique parfaitement le comportement des structures EOS, en régime d'accumulation, pour des fréquences comprises entre 10mHz et 100kHz. Si l'on exploite uniquement le module et la phase de l'impédance, il n'est pas nécessaire de tenir compte de la résistance de l'oxyde.


Rox : Résistance de l'oxyde

Rs : Résistance série due à l'électrolyte, à l'électrode

de référence, au substrat silicium, aux connexions

et aux câbles

C

R

R

ox

s

ox

figure 36 : Schéma électrique équivalent

des structures EOS en régime d'accumulation, déterminé

expérimentalement.

61


Ce modèle électrique semble à première vue identique au modèle électrique théorique

très simple d'une structure EOS, présenté dans le chapitre 1 (figure 19, p. 31). Cependant, la conductance de l'oxyde, G, représentée dans la figure 19, est associée aux états d'interface et ne correspond pas à l'inverse de la résistance de l'oxyde, Rox, représentée ci-dessus. La conductance due aux états d'interface étant nulle en régime d'accumulation, elle n'a pas besoin d'être prise en compte dans notre modèle. De son côté, le modèle de la figure 19 ne tient pas compte de la résistance de l'oxyde, car il dérive d'un modèle électrique équivalent d'une structure MOS, rarement caractérisée à des fréquences assez basses (f<100Hz) pour que la résistance de l'oxyde ait une influence sur sa réponse électrique.

La capacité de l'oxyde Cox est déterminée avec une incertitude inférieure à 1%, soit à partir de la caractéristique QSM, soit à partir de la courbe de la capacité équivalente en fonction de la fréquence. La résistance série Rsérie est déterminée à partir des courbes du module et de la phase de l'impédance en fonction de la fréquence, avec une incertitude inférieure à 2%. La courbe de la phase de l'impédance en fonction de la fréquence permet également de déterminer la valeur minimale de la résistance de l'oxyde Rox. En effet, c'est cette caractéristique qui est la plus sensible à la résistance de l'oxyde, dans le domaine de fréquences étudié.

Les graphe 25 et graphe 26 illustrent la modélisation électrique d'une structure EOS, grâce au schéma équivalent de la figure 36. Dans cet exemple précis, la valeur de la capacité de l'oxyde a été déterminée à 30.7nF, à la fois par mesure QSM et par la mesure de la capacité équivalente en fonction de la fréquence. La résistance de l'oxyde est supérieure à 100GΩ, et la valeur de la résistance série a été évaluée à 180Ω.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109

ModélisationCox = 30.7nFRox > 100GΩ

Rsérie = 180Ω

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 25 et graphe 26 :Modélisation électrique d'une structure EOS à l'aide du schéma électrique équivalent de la figure 36.

5.6. Courant de fuite

Les mesures du courant de fuite ont jusqu'à présent été ignorées dans ce chapitre. Or, elles sont en réalité un complément indispensable, pour réaliser des mesures d'impédance correctes. Alors qu'on attribue en général un courant de fuite élevé à un oxyde de mauvaise qualité, il peut également être dû à à une cellule électrochimique mal nettoyée. Quelle que

62


soit son origine, un courant de fuite élevé n'empêche pas en général les mesures d'impédance. Par contre, les courbes expérimentales sont modifiées, voir faussées dans le cas de courants de fuite au niveau de la cellule électrochimique.

Les graphe 27 et graphe 28 illustrent l'influence de courants de fuite au niveau de la cellule électrochimique, sur le module et la phase de l'impédance d'une même structure EOS. Ainsi, l'ajustement du modèle électrique de la figure 36 aux points expérimentaux, dans le cas de courants de fuite importants, conduit à la conclusion que la résistance de l'oxyde est d'environ 2MΩ, soit environ 105 fois inférieure à la valeur obtenue après avoir nettoyé la cellule à l'éthanol.

10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

Courants de fuite faibles importants

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 27 et graphe 28 : Influence de courants de fuite importants au niveau de la cellule électrochimique (dus à un mauvais nettoyage), sur le module et la phase de l'impédance d'une même structure EOS, en régime d'accumulation.

Le graphe 29 représente les caractéristiques du courant de fuite en fonction de la tension pour dix structures EOS, parmi lesquelles quatre ont des oxydes de mauvaise qualité. Le courant de fuite, pour un oxyde de bonne qualité, est ici de l'ordre de 1pA/mm2, en régime d'accumulation. Le graphe 30 permet d'affirmer que ceci est bien l'ordre de grandeur de la fuite à travers un oxyde de bonne qualité. En effet, une première mesure, avec l'électrode de travail et la contre-électrode montées sur la cellule électrochimique, mais sans électrolyte faisant contact entre les deux, a permis d'évaluer les fuites par la cellule électrochimique à environ 10fA/mm2, dans ce cas précis. Une deuxième mesure, après ajout de l'électrolyte, a conduit à un courant de fuite de précisément 1pA/mm2.

63


-2 -1 010-1510-1410-1310-1210-1110-1010-910-810-710-610-5

Oxydes mauvaise qualité bonne qualité

I fuite

(A/m

m2 )

Tension (V)

-2 -1 010-1510-1410-1310-1210-1110-1010-910-810-710-610-5

Mesure sur une structure EOS sans électrolyte avec électrolyte

I fuite

(A/m

m2 )

Tension (V)

graphe 29 : Courant de fuite en fonction de la tension pour 10 structures EOS. Quatre structures ont des oxydes de mauvaise qualité. Polarisation négative de la grille.

graphe 30 : Courants de fuite par la cellule électrochimique (mesure sans électrolyte), et par la

structure Si/SiO2 (mesure avec électrolyte).

Conclusion

Dans l'objectif d'aboutir à un immunocapteur fiable, de nouvelles techniques de caractérisation électrique ont été introduites, et appliquées aux structures Si/SiO2. Ceci a permis de définir les conditions dans lesquelles les mesures sur le transducteur Si/SiO2 sont reproductibles, ce qui est très important dans l'objectif, par la suite, de distinguer les signaux significatifs lors de l'interaction des anticorps avec le capteur.

Parmi les techniques initialement prévues pour la détection des antigènes, certaines ont du être abandonnées. Ainsi, la tension de bandes plates des structures EOS s'est montrée sujette à des variations aléatoires, dont nous n'avons pas réussi à nous affranchir, et ne pourra pas être exploitée. D'autres techniques seront uniquement exploitées dans certaines conditions, ce qui est le cas des mesures d'impédance en fonction de la fréquence. Elles se sont, en effet, montrées reproductibles uniquement dans un seul régime de polarisation : en accumulation.

Dans d'autres cas, l'origine des problèmes de reproductibilité a pu être décelée et éliminée. Ainsi, les mesures d'impédance se sont montrées extrêmement sensibles à la propreté de la surface de l'oxyde. La présence de poussières à la surface de l'oxyde induit notamment une chute importante et aléatoire de la capacité équivalente des structures EOS en régime d'accumulation, à moyennes et hautes fréquences. Un nettoyage systématique des échantillons, à l'acétone, élimine quasiment complètement ce phénomène. Une très légère diminution de la capacité équivalente, parfaitement reproductible, peut persister, et nous avons émis l'hypothèse qu'elle est liée à des impuretés sur la surface de l'oxyde, non visibles à l'œil nu.

De cette étude découle également un modèle électrique des structures EOS en régime d'accumulation. Il est très simple : l'oxyde est modélisé par une capacité et une résistance en parallèle, le tout en série avec une résistance. Il a été déterminé expérimentalement que cette dernière résistance est principalement due à l'électrolyte, mais l'électrode de référence, le substrat silicium, les connexions et les câbles y contribuent également.

64


65

Ce modèle électrique très simple ajuste parfaitement le module et la phase de l'impédance des structures EOS, ainsi que la capacité équivalente, en régime d'accumulation, dans tout le domaine de fréquences étudié (10mHz à 100kHz). En réalité, si seules ces trois configurations sont exploitées, il n'est pas nécessaire de tenir compte de la résistance de l'oxyde. Elle a été rajoutée au modèle, afin de prendre en compte l'augmentation de la résistance équivalente des structures EOS, à basse fréquence.

Cette résistance équivalente sera, cependant, par la suite exploitée de manière extrêmement prudente, car nous avons pu constater que les erreurs de mesure à son niveau sont très grandes. Aux erreurs de mesures dues aux limites de l'électronique de l'appareillage de mesure, s'ajoutent très probablement des erreurs dues au déséquilibre entre les parties réelle et imaginaire de l'impédance des structures EOS, ce qui pourrait aussi expliquer les courbes expérimentales très bruitées et leur manque de reproductibilité.

Finalement, cette étude a également montré qu'il est tout à fait possible de réaliser des mesures d'impédance sur des structures EOS avec un montage à deux électrodes. La seule modification engendrée par l'utilisation d'un montage à deux électrodes, dans lequel le potentiel de l'électrode de travail n'est pas contrôlé par rapport à une référence fixe, consiste en l'augmentation de la contribution de la résistance de l'électrolyte à la partie réelle de l'impédance.

Dans le chapitre suivant, ces techniques de caractérisation électrique seront appliquées à des structures Si/SiO2 fonctionnalisées de silanes et de polysiloxanes.

Chapitre 3 : Caractérisation de structures Si/SiO2 greffées de silanes et de polysiloxanes

68

CHAPITRE 3 Caractérisation de structures Si/SiO2 greffées de

silanes et de polysiloxanes


69

Introduction

La fonctionnalisation du transducteur Si/SiO2 constitue la première étape dans l'élaboration de l'immunocapteur. Il s'agit du greffage sur l'oxyde de la couche de molécules organiques, qui servira par la suite d'intermédiaire entre l'oxyde et les anticorps, et qui formera, avec les anticorps, la membrane sensible du capteur. L'objectif de cette fonctionnalisation est de permettre une bonne stabilité de la fixation des anticorps sur le transducteur. Le produit utilisé doit posséder des groupements terminaux capables d'interagir avec des groupements sur les anticorps.

Les deux modes de fonctionnalisation présentés pour l'immunocapteur capacitif dans le chapitre 1 (p. 34) ont été utilisés dans ce travail. Ainsi, certaines structures Si/SiO2 ont été fonctionnalisées grâce à une monocouche structurée de molécules, dont l'épaisseur est de l'ordre du nanomètre, et d'autres ont été fonctionnalisées grâce à une membrane polymérique, couche non structurée et beaucoup plus épaisse, en général de l'ordre du micromètre.

La caractérisation électrique des structures Si/SiO2 fonctionnalisées constitue l'objet de ce chapitre. Elle est importante pour deux raisons. Tout d'abord, elle permet de vérifier que les propriétés électriques des structures Si/SiO2 ne sont pas détériorées par le greffage. Son principal objectif est cependant d'aboutir à une modélisation électrique des différentes couches de molécules greffées, et de vérifier que l'impédance de ces couches est bien reproductible et constante dans le temps.

Les structures Si/SiO2 ont été fonctionnalisées grâce à des silanes et des polysiloxanes. Les silanes peuvent être fixés en monocouche sur un substrat, alors que les polysiloxanes sont des polymères. Le chapitre commence par une présentation des méthodes de greffage utilisées pour leur fixation sur l'oxyde.

Le lavage sulfochromique des oxydes constitue la première étape dans leur fonctionnalisation. Une étude, exposée ensuite, a été réalisée afin de déterminer l'influence de ce lavage sur les caractéristiques électriques des structures Si/SiO2. Ceci est nécessaire afin de pouvoir attribuer toute modification de l'impédance des structures après greffage, à la couche de molécules greffée.

La caractérisation électrique des structures Si/SiO2 greffées de silanes ou polysiloxanes a été réalisée de manière classique, avec une cellule électrochimique. Nous avons également testé l'utilisation d'une sonde mercure pour prendre contact sur des couches de molécules organiques. Le motif en était le suivant : en s'affranchissant de l'électrolyte la modélisation électrique des couches de molécules greffées devait être à priori plus aisée.

A cette étude sur l'utilisation de la sonde mercure, suivront finalement les résultats de la caractérisation et de la modélisation électrique des différentes couches de molécules greffées : aminosilanes longue chaîne, cyanosilanes courte chaîne, et cyanopolysiloxanes.

Nous noterons que le greffage de molécules organiques sur un substrat a de nombreuses applications autres que dans le domaine des capteurs. La chimie des surfaces, la lubrification, ainsi que la micro-électronique et l'opto-électronique sont également des domaines d'application potentielle [33]. En micro-électronique, l'idée est d'utiliser des couches de


70

molécules organiques comme isolant de grille de composants MIS et FET, surtout pour des composants III-V tels InP sur lesquels on ne peut pas faire croître d'oxyde de qualité suffisante [34], mais également pour des composants silicium, afin d'obtenir des épaisseurs d'isolant faibles (<5nm) [35], [36]. Cette étude électrique de structures Si/SiO2 greffées de monocouches de silanes ou de polysiloxanes présente donc un intérêt plus large que l'application immunocapteur.

1. Les silanes et les polysiloxanes et leur greffage sur l'oxyde

1.1. Les silanes et les polysiloxanes

1.1.1. Les silanes

Les silanes sont des molécules constituées d'un atome de silicium entouré de quatre groupements chimiques. La formule générale d'un silane est donnée dans la figure 37. Lors de la fixation des silanes sur l'oxyde, le groupement partant P est éliminé et le silane se lie de manière covalente au substrat.

Si RP

X

X1

2

figure 37 : Formule générale d'un silane

R : chaîne alkyl P : groupement partant X1, X2 : groupements de nature variable

Les groupements X1 et X2 peuvent être de même nature que le groupement partant et sont dans ce cas également capables de réagir avec la surface de l'oxyde. On parle alors de silanes di- ou tri-fonctionnels. Cependant du fait de leur forte réactivité (2 ou 3 sites réactifs) l'utilisation de silanes di- ou tri-fonctionnels favorisent une polymérisation des couches.

1.1.2. Les polysiloxanes

Les polysiloxanes sont des polymères, c'est-à-dire des macromolécules possèdant une unité de base (mère) répétée un grand nombre de fois. Dans le cas des polysiloxanes, l'unité qui se répète contient des liaisons siloxanes (figure 38). Différents groupements chimiques (souvent organiques) peuvent se lier aux atomes de silicium, donnant ainsi différents types de polysiloxanes.

Si O Si O Si O... ...

figure 38 : Unité de base d'un polysiloxane : une suite de liaisons siloxanes


71

1.2. Surface de l'oxyde

Comme nous l'avons vu dans le chapitre 1 (p. 26), la surface de l'oxyde est constituée de sites silanols (Si-OH) et de ponts siloxanes (Si-O-Si) résultant de la condensation de deux sites silanols. Les sites silanols sont responsables de l'adsorption d'eau à la surface de la silice (figure 39) et de la réactivité de la silice vis-à-vis des silanes et des polysiloxanes. Dans le cas de l'eau, des liaisons hydrogènes se créent entre la molécule d'eau et deux sites silanols voisins. Ces liaisons sont fragiles et l'eau physisorbée peut être éliminée par chauffage. Cependant si la température excède 170°C, il y a condensation des sites silanols et formation de ponts siloxanes qui sont beaucoup moins réactifs. Ceci est important car nous utilisons de la silice thermique, formée à haute température. Le taux de sites silanols en surface est donc faible, et une réhydratation de la surface est nécessaire avant greffage pour obtenir des densités de silanes suffisamment importantes et une bonne adhérence des polysiloxanes.

SiO2

Si

OH

Si

OH

HO

H

figure 39 : Adsorption d'eau à

la surface de l'oxyde

1.3. Hydratation de l'oxyde

La réhydratation de l'oxyde peut se faire en nettoyant la surface avec divers solvants organiques, puis en plongeant l'échantillon dans de l'eau pure pendant environ une heure [30]. Une autre méthode consiste à immerger les échantillons quelques minutes dans une solution sulfochromique. Celle-ci permet à la fois le nettoyage de l'oxyde et la création de sites silanols.

Plusieurs études ont été consacrées au traitement des oxydes à la solution sulfochromique. Sa supériorité par rapport à un nettoyage dans des solvants organiques a été montrée par XPS. Aucune contamination par les espèces en solution n'a été mise en évidence, et la surface des oxydes, examinée au MEB, est homogène [37]. La création de sites silanols a été vérifiée en examinant la réponse au pH de structures plongées dans une solution sulfochromique [38], et leur taux a été déterminé par une méthode chimique, basée sur la mesure de CH4 produit par la réaction de CH3Li avec les sites silanols [39]. Les auteurs rapportent qu'un traitement sulfochromique de 3mn génère deux fois plus de sites silanols qu'une immersion dans de l'eau pendant 1h (5.57µmol/m2 contre 2.88µmol/m2) et presque autant qu'une immersion pendant 48h (6.42µmol/m2).

Nous notons que la création des sites silanols après un traitement sulfochromique de 3mn peut également être contrôlée à l'œil nu, en rinçant les échantillons à l'eau : en effet, d'après ce qui précède, les sites silanols sont responsables de l'adsorption d'eau sur la surface de l'oxyde. Un oxyde thermique est hydrophobe et ne retient pas l'eau du tout (très peu de sites silanols), alors qu'un oxyde traité à la solution sulfochromique est très hydrophile et retient l'eau.

Le traitement sulfochromique semble être la méthode la plus efficace pour réhydrater la surface de l'oxyde ainsi qu'un excellent moyen pour la nettoyer. En conséquence nous avons choisi cette méthode pour le nettoyage et la réhydratation de nos oxydes thermiques.


72

1.4. Greffage des silanes sur l'oxyde

Les silanes se lient de manière covalente à l'oxyde, comme l'indique la figure 40. Dans les conditions idéales, on peut ainsi obtenir des monocouches de silanes greffés sur la silice. La liaison siloxane formée est très stable ce qui donne une bonne durée de vie au greffage.

OH

+

Si

R

P

X1 2

O

Si

R

X1

Si SiO2

Si

+

PH

Si SiO2

Si

X

2X

figure 40 :Réaction d'un silane avec un site silanol à la surface de l'oxyde, résultant dans la fixation covalente du silane sur l'oxyde.

Les silanes sur silice ont été amplement étudiés. Les plus étudiés semblent être les trichlorosilanes (caractérisation électrique, ellipsométrie, spectroscopie IR, diffraction aux rayons X et mouillabilité) [40], [41], [42], [43]. Cependant, les trichlorosilanes sont trifonctionnels, et polymérisent facilement. Nous avons pour cette raison préféré utiliser des silanes monofonctionnels un peu moins étudiés.

La densité de molécules fixées dépend de la nature du groupement partant et de la longueur de la chaîne alkyl. Une récapitulation des valeurs fournies par la littérature se trouve dans la référence [44]. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le groupement partant du silane est de nature diméthylamino.

La structuration de la couche greffée dépend également de la longueur de la chaîne alkyl : 18 carbones seraient nécessaires afin d'obtenir une bonne structuration [45].

Il existe différentes techniques de greffage de silanes sur l'oxyde : en milieu aqueux, en phase organique, en phase gazeuse ou par imprégnation [7]. Nous avons utilisé une méthode de greffage en phase gazeuse [46], et celui-ci a été réalisé au Laboratoire de Physico-Chimie des Interfaces à l'Ecole Centrale de Lyon. Le mode opératoire est ici décrit brièvement.

Après nettoyage et hydratation des structures Si/SiO2 par traitement sulfochromique, l'eau physisorbée sur les sites silanols doit être éliminée afin d'éviter l'hydrolyse des silanes. Les échantillons sont placés dans des tubes en verre, qui sont montés sur une rampe à vide (figure 41). Une pompe associée à un piège à azote liquide permet l'obtention d'un vide d'environ 0.015Torr. Les tubes en verre sont plongés dans un bain d'huile chauffé à 140°C pendant 2 heures. Cette température permet d'éliminer l'eau physisorbée sans que les sites silanols ne se condensent en ponts siloxanes. Ensuite les tubes en verre sont mis sous atmosphère d'azote, et un surplus de silane sous forme liquide est injecté à l'aide d'une seringue dans chacun des tubes à travers un septum. Le vide est de nouveau fait et les tubes sont scellés. Ils sont ensuite placés


73

dans une étuve, pendant une durée et à une température qui dépendent de la nature du silane : 3 jours à 140°C pour les aminosilanes longue chaîne et 2 jours à 60°C pour les cyanosilanes courte chaîne que nous avons greffés. Les tubes sont ensuites cassés et l'excès de silanes n'ayant pas réagi est éliminé par deux lavages successifs : au THF sous ultrasons pendant 10mn, suivi d'un lavage à l'eau distillée sous ultrasons pendant 10mn pour les échantillons greffés d'aminosilanes longue chaîne, et par un lavage au THF sous ultrasons suivi d'un lavage au xylène chaud pour les échantillons greffés de cyanosilanes courte chaîne. Tous les échantillons sont finalement séchés sous flux d'azote.

pompe

circuit à azote

bain d'huile

thermomètre

rampe à vide piège à

tubes en verre

structure Si/SiO2

injection du silane

rampe à vide

VUE DE PROFIL

azote

figure 41 : Schéma du montage expérimental utilisé lors du greffage de silanes sur les structures Si/SiO2

1.5. Greffage des polysiloxanes sur l'oxyde

Le greffage des polysiloxanes sur les structures Si/SiO2 a également été réalisé au Laboratoire de Physico-Chimie des Interfaces, à l'Ecole Centrale de Lyon.

Tout comme pour le greffage des silanes, il existe différentes techniques de greffage des polysiloxanes sur un oxyde. La plus simple consiste à diluer le polymère dans un solvant, et à déposer la solution sur l'oxyde à l'aide d'une tournette.

Pour la fonctionnalisation de nos structures Si/SiO2, la technique SOL-GEL a été utilisée. Elle permet, par hydrolyse et polycondensation de monomères de départ, de créer des polymères nouveaux. Les composés polymérisent et passent d'un état SOL, plus ou moins visqueux, à un état GEL.

Le dépôt du polymère sur l'oxyde a été réalisé par la méthode du tirage, ou dip-coating. La structure Si/SiO2, ayant préalablement subi un traitement sulfochromique de 5mn afin d'augmenter l'adhérence du polymère, est ensuite montée sur une plaquette en verre. Celle-ci est trempée dans la solution polymérique, grâce à un dispositif piloté par ordinateur, permettant de faire varier la vitesse de tirage, ainsi que le temps d'immersion. Ces deux paramètres influencent l'épaisseur de la couche greffée.


74

2. Influence du traitement sulfochromique sur les caractéristiques électriques des structures Si/SiO2

Le traitement sulfochromique est la première étape dans le protocole de greffage des silanes et des polysiloxanes sur l'oxyde. Il est pour cette raison important de déterminer clairement son influence sur les caractéristiques électriques des structures Si/SiO2, afin de pouvoir attribuer toute modification d'impédance après greffage à la couche de molécules fixée. Ceci est d'autant plus important qu'une étude couplée en ellipsométrie et en mesures de capacité électrique a montré que l'oxyde diminuerait de 6Å en moyenne, lorsque les structures Si/SiO2 sont plongées pendant 3mn dans une solution sulfochromique (5ml d'eau + 2g de bichromate de potassium + 100 ml d'acide sulfurique) [37]. De plus il faut s'assurer que la solution ne dégrade pas l'oxyde par une éventuelle contamination par les ions K+ présents en grande quantité.

Nous avons examiné l'influence du traitement sulfochromique sur six échantillons : trois ont été immergés pendant 3mn, par référence à l'étude citée ci-dessus, et les trois autres pendant 10mn, conformément au protocole de greffage des silanes. Les échantillons ont été caractérisés avant et après traitement par des mesures QSM, des mesures de capacité en fonction de la tension, à fréquence fixe, et des mesures d'impédance en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation. Pour les mesures avant traitement sulfochromique les échantillons étaient nettoyés à l'acétone. Le caractère hydrophile des échantillons après le bain sulfochromique a été vérifié.

Aucune modification significative de la capacité de l'oxyde en régime d'accumulation, et donc de son épaisseur, n'a pu être mise en évidence, ni après 3mn de bain sulfochromique, ni après 10mn. Le graphe 31 représente la caractéristique QSM d'une structure Si/SiO2 avant et après immersion 10mn dans la solution. Les variations maximales de capacité correspondent à des variations d'épaisseur d'oxyde de 1Å, limite de reproductibilité de la méthode de mesure, comme nous l'avons vu dans le chapitre 2.

-2 -1 0 1 20

10

20

30

Avant Après

Ceq

(nF)

Tension (V)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

10

20

30

Avant Après

Ceq

(nF)

f (Hz)

graphe 31 : Caractéristique QSM d'une structure Si/SiO2 avant et après traitement à la solution sulfochromique

graphe 32 : Capacité équivalente en fonction de la fréquence en régime d'accumulation d'une structure Si/SiO2

avant et après un traitement sulfochromique de 10mn.


75

Cependant une différence a été notée au niveau de la capacité équivalente de la structure en régime d'accumulation, pour les moyennes et hautes fréquences (graphe 32). Que ce soit avant ou après lavage, la capacité chute légèrement pour des fréquences supérieures à 1kHz, mais cette chute est plus faible après lavage. Dans le chapitre 2, nous avons émis l'hypothèse que l'importance de la chute est liée à la propreté de la surface de l'oxyde. Une chute de capacité plus faible après traitement sulfochromique pourrait donc être interprétée comme une surface d'oxyde plus propre qu'avant (lavage acétone). Ceci est en accord avec les résultats de l'étude XPS citée précédemment [37], montrant la supériorité d'un lavage sulfochromique par rapport au lavage dans des solvants organiques classiques.

Ce phénomène pourrait partiellement expliquer que F. Gardies ait conclu qu'un traitement sulfochromique de 3mn diminue l'épaisseur des oxydes de 6Å. En effet, les mesures de capacité étaient réalisées en fonction de la tension à moyenne/haute fréquence (la fréquence exacte n'est pas mentionnée). Dans notre cas, nous observons par exemple à f=63kHz des augmentations de la capacité après lavage sulfochromique qui correspondraient à des modifications de l'épaisseur de l'oxyde allant jusqu'à 3Å. Sans le nettoyage préalable à l'acétone, l'écart entre les deux courbes serait plus grand encore.

Aucune autre modification de l'impédance en fonction de la fréquence en régime d'accumulation n'a pu être mise en évidence après traitement sulfochromique.

Finalement, les caractéristiques Capacité-Tension obtenues avec un balayage en tension aller-retour ne présentent aucun hystérésis après traitement sulfochromique. Il n'y aurait donc pas contamination ionique de l'oxyde par la solution.

Nous pouvons donc conclure que le traitement sulfochromique ne dégrade pas l'oxyde et ne modifie pas son épaisseur. La seule modification des caractéristiques électriques de la structure Si/SiO2 qu'il induit est une augmentation de la capacité équivalente de la structure en régime d'accumulation à moyennes et hautes fréquences, pouvant s'expliquer par son action nettoyante.

3. Utilisation d'une sonde mercure pour la caractérisation électrique de silanes et de polysiloxanes

Une sonde mercure permet de réaliser un contact ohmique sur un échantillon sans métallisation préalable. Elle s'utilise essentiellement sur des structures de type semiconducteur/isolant ou des diodes Schottky [47], [48]. Pour la caractérisation de nos structures Si/SiO2/molécules organiques elle présente plusieurs avantages mis à part sa simplicité d'utilisation. En effet, une métallisation classique nécessite en général une mise sous vide de l'échantillon, pouvant éventuellement endommager les couches organiques. De plus l'utilisation de la sonde mercure permet de récupérer l'échantillon intact après la caractérisation et de continuer l'empilement des couches organiques formant la membrane sensible du capteur.

Quelques exemples d'utilisation d'une sonde mercure pour prendre contact sur des couches de molécules organiques ont été trouvés dans la littérature [49], [50]. Nous avons cependant voulu procéder à une validation de son utilisation aussi bien sur des monocouches de silanes que sur des polymères. Nous n'oublions cependant pas que l'immunocapteur devra impérativement être basé sur la mesure d'impédances électrochimiques, les espèces


76

immunologiques se dénaturant hors d'une solution physiologique. Les mesures effectuées avec un contact métallique serviront uniquement à apporter des informations supplémentaires facilitant l'élaboration d'un modèle électrique du capteur.

Nous avons utilisé une sonde mercure modèle 811 de Materials Development Corporation.

3.1. Prise de contact sur un polymère

Afin de tester l'utilisation de la sonde mercure pour prendre contact sur des polymères, nous avons tenté d'effectuer des mesures d'impédance sur des structures or/polymère déposé. Les substrats en or ont été choisis par référence à une étude antérieure [51]. Ils ont été obtenus à partir de substrats silicium de type p et d'un dépôt d'or sur chaque face par évaporation thermique. Le polymère utilisé était le polycyanopropylméthyl-siloxane, qui peut fixer des anticorps grâce à ses groupements cyano. Il est dilué dans du toluène (1% de polymère en poids) avant d'être déposé sur les échantillons à l'aide d'une tournette.

Dans un premier temps le polymère a été déposé directement sur les substrats or. Les essais de mesures d'impédance ont montré que le polymère utilisé ne constitue pas du tout une structure bloquante. En effet, le mercure pénètre instantanément la couche et attaque l'or de la face avant de l'échantillon : au bout de quelques secondes il ne reste plus d'or. Une très mauvaise adhérence de l'or sur le silicium nous a cependant amené à renouveler l'expérience, en améliorant le procédé de préparation des échantillons.

Dans un deuxième temps, l'adhérence de l'or sur le silicium a été améliorée grâce à un recuit de 40mn à 250°C après dépôt, et l'adhérence du polymère sur le substrat or a été améliorée par un greffage préalable de thiols longue chaine. Celui-ci s'effectue en immergeant les échantillons pendant 24 heures dans une solution de 15µl de thiols (CH3-(CH2)15-SH) dans 50ml d'éthanol. Les thiols s'adsorbent spontanément sur l'or : on obtient ainsi une monocouche auto-assemblée, de forte densité et de bonne structuration [52], [53]. En pesant les échantillons avant et après dépôt du polymère, l'épaisseur du polymère a pu être évaluée entre 1.5 et 2.8µm. Ces échantillons se sont montrés plus bloquants lors de la mesure d'impédance avec la sonde mercure : la moitié est restée complètement intacte même après une polarisation de 15mn. Les mesures d'impédance se sont cependant avérées difficiles à cause d'une très grande instabilité, probablement due à des charges présentes dans le polymère.

La sonde mercure n'est donc pas adaptée pour prendre un contact électrique sur des polymères. Cependant, la nette amélioration apportée par le greffage de thiols indique qu'elle peut éventuellement être utilisée pour prendre contact sur des couches de molécules plus structurées et plus denses qu'un polymère.

3.2. Prise de contact sur une monocouche d'aminosilanes longue chaîne

Les chaines aliphatiques de différentes longueurs fixées de manière covalente à une structure Si/SiO2 ont été amplement étudiées [37]. Pour cette raison nous avons choisi un aminosilane monofonctionnel à longue chaine alkyl afin de tester l'utilisation de la sonde


77

mercure : l'octadécyldiméthyl(diméthylamino)silane (figure 42), commercialisé par Chemie Vetikon. Des molécules de même structure, mais possédant un groupement cyano en bout de chaine à la place du groupement méthyl, peuvent fixer des anticorps. Il a été montré par chromatographie que les couches sont denses, et d'après une étude couplée en ellipsométrie et en mesures de capacité avec une cellule électrochimique, il semblerait qu'on obtienne des monocouches isolantes de molécules [38].

CH3

CH3

N Si

CH3

CH3

CH2 CH2 CH2.... CH3

17 fois

groupement partantlors du greffage

figure 42 : Octadécyl diméthyl (diméthylamino) silane

Nous avons essayé de confirmer ce résultat par mesure de capacité avec la sonde mercure. En effet, la fixation d'une monocouche isolante de molécules sur l'oxyde augmente l'épaisseur du diélectrique et diminue en conséquence la capacité de la structure en régime d'accumulation. Grâce à leur longue chaine aliphatique de 18 carbones, la constante diélectrique relative de cette monocouche est très proche de 2. Il est donc possible de déduire l'épaisseur de la couche greffée à partir de la mesure de capacité de la structure en régime d'accumulation avant et après greffage, et de la comparer à la longueur théorique de la chaine aliphatique qui est de 23Å.

ε0 : permittivité diélectrique du vide

d SC Csilane r

TOTALE oxyde

= ⋅ −⎛

⎝⎜

⎞

⎠⎟ε ε0

1 1

εr : permittivité diélectrique relative des silanes

S : surface de mesure

CTOTALE : capacité en accumulation après greffage

Coxyde : capacité en accumulation avant greffage

Trois lots de structures Si/SiO2/silanes ont été préparés par la méthode décrite précédemment, donnant au total une douzaine d'échantillons. Des mesures de capacité en fonction de la tension à une fréquence de 10kHz ont été effectuées en phase liquide et en phase sèche, c'est-à-dire avec la cellule électrochimique et la sonde mercure, sur des structures Si/SiO2 nues ainsi que sur les structures Si/SiO2/silanes.

Pour les structures Si/SiO2 nues, ces mesures se sont montrées parfaitement cohérentes, et l'épaisseur d'oxyde déterminée correspond aux spécifications du fabriquant. Cependant après greffage, la capacité de la structure mesurée avec la sonde mercure s'est avérée en moyenne deux fois plus élevée qu'avec la cellule électrochimique (graphe 33). L'épaisseur de la couche de silane déduite de la mesure avec la sonde mercure est donc en moyenne deux fois inférieure à celle déduite de la mesure avec la cellule électrochimique : 9Å contre 20Å qui correspondent bien à la longueur de la chaine aliphatique.


78

Nous proposons deux explications : soit une compression de la couche de silanes par la goutte mercure, qui exerce une pression sur l'échantillon afin d'assurer une surface constante et reproductible, soit une diminution de la surface de mesure effective de la sonde mercure à cause de la modification de l'état de surface de l'échantillon après greffage des silanes. La surface de mesure de la sonde mercure est en effet très petite : 0.496mm2. La capacité mesurée est donc très sensible à une variation de cette surface : une diminution de la surface entraîne une augmentation de la capacité. Dans notre cas un diamètre effectif de la goutte de mercure de 560µm au lieu des 795µm théoriques suffit pour expliquer la capacité plus importante mesurée avec la sonde mercure qu'avec la cellule électrochimique.

-3 -2 -10.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 1 2 3

Cellule Si/SiO2 Si/SiO2/silane

Sonde mercure Si/SiO2 Si/SiO2/silane

nsion (V)

Ceq

( µF/

cm2 )

Te

graphe 33 : Modification de la caractéristique C-V d'une structure Si/SiO2 à la suite d'un greffage covalent de

silanes C18. Mesures effectuées avec une cellule électrochimique et une sonde mercure à f = 10kHz.

Une cohérence des résultats est toutefois à noter : les deux méthodes de mesure indiquent le même échantillon comme ayant la couche de silanes la plus épaisse, et ainsi de suite. Cette cohérence confirme que le greffage de silanes à longue chaine aliphatique sur une structure Si/SiO2 entraîne une baisse de capacité globale de la structure. La couche de silanes présente clairement un caractère diélectrique.

3.3. Conclusions

Cette étude a montré qu'il est possible d'utiliser une sonde mercure pour prendre un contact électrique sur des couches de molécules organiques, à condition que celles-ci soient bien structurées et bloquantes, mais il semblerait cependant qu'un contact électrolytique soit plus approprié. L'utilisation de la sonde mercure sera restreinte à des mesures sur des couches de molécules structurées pour lesquelles la surface de mesure ou une éventuelle compression sont de moindre importance.

4. Caractérisation des couches d'aminosilanes longue chaîne

Des molécules identiques aux aminosilanes utilisées pour les essais avec la sonde mercure, mais possédant un groupement cyano en bout de la chaîne carbonée à la place du groupement méthyl, peuvent être utilisées pour le couplage des immunoespèces, comme mentionné précédemment. Cela nous a incité à caractériser plus amplement nos couches d'aminosilanes et d'en élaborer un modèle électrique.


79

4.1. Instabilités

Les caractéristiques capacité-tension des structures Si/SiO2/silanes obtenues avec la sonde mercure à une fréquence de 10kHz et un balayage en tension aller-retour, présentent une hystérésis importante (graphe 34). La valeur moyenne de l'hystérésis calculée sur 10 échantillons est de 0.19 ± 0.05 V. Le sens horaire de l'hystérésis indique la présence d'une charge ionique mobile dans l'isolant, c'est-à-dire soit dans l'oxyde, soit dans la couche de silanes. Aucune présence de charge ionique mobile n'est notée dans les structures Si/SiO2 non greffées.

-3 -2 -1 0 1 2 30.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

f=10kHz

Si/SiO2/silanes

Ceq

( µF/

cm2 )

Tension (V)

-3 -2 -1 0 1 2 30.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

f=10kHz

Si/SiO2/silanes après élimination des silanes

Ceq

( µF/

cm2 )

Tension (V)

graphe 34 : Mise en évidence de la présence d'une charge ionique mobile dans l'isolant d'une structure Si/SiO2/silanes.

graphe 35 :L'élimination des silanes entraîne l'élimination de l'hystérésis.

Plusieurs hypothèses ont été émises quand à l'origine de ces charges présentes dans les structures greffées. Il a déjà été montré qu'il n'y a aucune contamination des oxydes par des ions K+ présents en grande quantité dans la solution sulfochromique servant à nettoyer la surface de l'oxyde et à créer les sites silanols nécessaires au greffage covalent des silanes. Une hypothèse est alors la contamination des couches de silanes par des ions Na+ et K+ présents dans l'électrolyte, car les mesures d'impédance avec la sonde mercure étaient toujours précédées par des mesures avec la cellule électrochimique. Cependant cette hypothèse a été infirmée en inversant l'ordre des mesures. Il semblerait donc que les charges soient présentes dans la couche de silanes. Afin de vérifier qu'une éventuelle contamination des oxydes n'a pas eu lieu lors de l'étape d'imprégnation du greffage, la couche de silanes a été enlevée. Ceci a éliminé l'hystérésis des caractéristiques capacité-tension, localisant de manière certaine les charges dans la couche de silanes (graphe 35).

4.2. Modélisation électrique

Nous avons noté une cohérence des résultats des mesures de capacité avec la sonde mercure et la cellule électrochimique, ce qui nous a permis de confirmer le caractère diélectrique de ces couches. Cependant, nous venons de mettre en évidence la présence de charges dans la couche : celle-ci ne peut donc pas être considérée comme purement diélectrique. Lors de l'élaboration d'un modèle électrique équivalent il faudra tenir compte de la résistance non infinie de la couche.

Grâce à des mesures d'impédance en fonction de la fréquence en régime d'accumulation, un modèle électrique a pu être élaboré. La couche d'aminosilanes est


80

représentée par une capacité et une résistance en parallèle, mises en série avec l'impédance de la structure Si/SiO2 et la résistance due à l'électrolyte (figure 43). Ce modèle simple s'est avéré ajuster très correctement les courbes expérimentales (graphe 36 et graphe 37), obtenues par un moyennage sur trois échantillons.

R

C

R

série

ox

ox

C

R

silanes

silanes

Si/SiO /électrolyte2

Si/SiO /aminosilanes/électrolyte2

figure 43 : Modèle électrique d'une structure

Si/SiO2/aminosilane longue chaîne/électrolyte.

Rsérie : résistance série due principalement à

l'électrolyte


Rox : Résistance de l'oxyde

Csilanes : Capacité de la couche d'aminosilanes

Rsilanes : Résistance de la couche d'aminosilanes

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109ModélisationRsérie = 186Ω

Cox = 26.5nFRox > 100GΩ

Csilane = 55nFRsilane = 3GΩ

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Si/SiO2 Si/SiO2/aminosilanes Modélisation

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 36 et graphe 37 : Module et phase de l'impédance en fonction de la fréquence, en régime d'accumulation, avant et après greffage d'aminosilanes longue chaine. Courbes expérimentales et modélisation électrique.

Les caractéristiques électriques moyennes d'une couche d'aminosilanes sont les suivantes: Csilane = 55nF et Rsilane = 3GΩ, pour une surface de mesure de 7mm2. En calculant l'épaisseur de la couche d'aminosilanes correspondant à une capacité de 55nF, nous obtenons 23Å, ce qui correspond parfaitement à la longueur de la chaîne aliphatique : la valeur de la capacité est donc plausible. Electriquement nous avons l'équivalent d'une monocouche de silanes greffée de constante diélectrique εr = 2. A partir de l'épaisseur et la résistance de la couche organique, sa résistivité est évaluée à environ 1015Ω.cm, ce qui n'est que 10 fois inférieur à celle du SiO2.

4.3. Inhomogénéités

La couche n'est cependant pas complètement homogène. Comme le montre le graphe 38, obtenu grâce à un profilomètre AFM de Optilab, il existe des amas importants par endroit, correspondant à environ 4 monocouches de silanes.


81

graphe 38 : Inhomogénéités de la couche d'aminosilanes longue

chaîne greffée sur une structure Si/SiO2. Image obtenue par profilomètre AFM.

En réalité, même à plus petite échelle il y a probablement des inhomogénéités. Il a en effet été montré sur du gel de silice, grâce au greffage de silanes fluorescents, que les sites silanols sont répartis de manière inhomogène sur la silice, avec des zones de haute et basse densités [54].

Cependant ces inhomogénéités ne semblent pas assez importantes pour qu'il soit nécessaire d'en tenir compte dans la modélisation électrique, en tout cas pas pour une surface de mesure de l'ordre du mm2.

4.4. Vieillissement

Nous notons l'excellente durée de vie du comportement diélectrique des couches de silanes : la valeur de Csilane est quasiment inchangée 16 mois après greffage, les échantillons ayant été conservés à l'air.

De plus, la présence de la couche de silanes minimise la dégradation de la structure Si/SiO2 sous-jacente. Les courbes Capacité-Tension basse fréquence, obtenus par mesure QSM 16 mois après greffage, montrent une augmentation de la capacité minimale dans le cas des structures Si/SiO2 non greffées, ce qui est significatif d'une génération d'états d'interface, due certainement à une diffusion d'espèces contaminantes. Ce phénomène n'est pas observé pour les structures Si/SiO2/aminosilanes, la couche d'aminosilanes servant alors de couche de passivation (graphe 39).

-2 -10

10

20

30

0 1 2

Si/SiO2 Si/Si

Ceq

(nF)

Te

O2/aminosilanes

nsion (V)

graphe 39 : Caractéristiques QSM de structures Si/SiO2 non greffées et greffées d'aminosilanes longue chaîne, 16 mois

après greffage (conservation à l'air).


82

4.5. Conclusion

Par des mesures de capacité électrique à la fois avec une sonde mercure et une cellule électrochimique, nous avons pu confirmer qu'une couche d'octadécyldiméthyl(diméthylamino)- silanes présente un caractère diélectrique, malgré une présence importante de charges mobiles. Dans la modélisation électrique, nous avons cependant tenu compte de sa résistance non infinie, ce qui nous a permis de montrer que la résistivité d'une telle couche de molécules n'est que 10 fois inférieure à celle du dioxyde de silicium.

Electriquement la couche est bien équivalente à une monocouche de silanes, même si des inhomogénéités ont pu être mises en évidence. Notre surface de mesure est cependant relativement grande (7mm2), et il est probable que pour des surfaces beaucoup plus faibles, ces inhomogénéités interviendrait sur la réponse électrique des structures.

Les couches d'aminosilanes ne se sont pas notablement dégradées après une conservation à l'air de 16 mois. Elles semblent même jouer un rôle de passivation vis à vis de l'interface dans la structure Si/SiO2 sous-jacente.

5. Caractérisation de couches de cyanosilanes courte chaîne

Les aminosilanes étudiés ci-dessus, possédant un groupement méthyl en bout de la chaîne alkyl, ne peuvent interagir avec des anticorps que par des liaisons hydrophobes, qui ne sont pas d'une très grande stabilité. A l'inverse, comme nous le verrons plus en détail dans le chapitre suivant, des silanes dont la chaîne alkyl se termine par un groupement cyano peuvent fixer des anticorps grâce à une interaction électrostatique forte. On pourrait alors imaginer d'utiliser des molécules identiques aux aminosilanes étudiés, compte tenu de leurs bonnes caractéristiques électriques, mais possédant un groupement cyano en bout de chaîne à la place du groupement méthyl. Cependant, contrairement aux aminosilanes, de tels cyanosilanes ne sont pas commercialisés. De plus, leur synthèse est extrêmement longue et pénible. Pour cette raison, nous avons décidé de nous intéresser à des cyanosilanes à courte chaîne alkyl, existant dans le commerce, même si l'utilisation de silanes courte chaîne donne des couches de molécules moins structurées.

Cl Si

CH3

CH3

CH2 CH2 N

CCH2

figure 44 : γ-cyano propyl diméthyl

chlorosilane

Nous avons choisi un cyanosilane mono-fonctionel : le γ-cyanopropyldiméthylclorosilane (figure 44), commercialisé par ABCR Karlsruhe. L'atome de chlore constitue le groupement partant éliminé lors du greffage covalent du silane à l'oxyde.

Nous ne connaissons pas la constante diélectrique de cette molécule, mais nous

connaissons celle du γ-cyanopropyldiméthyl(diméthylamino)-silane, qui est de 24.8 [37]. Cette molécule se différencie de la nôtre uniquement par la nature du groupement partant. Pour cette raison nous estimons la constante diélectrique de nos cyanosilanes à 25. A cause de la petite taille de la molécule et de la constante diélectrique élevée par rapport à celle de l'oxyde, une monocouche de ces cyanosilanes ne devrait pas modifier notablement l'impédance des structures Si/SiO2.


83

Les structures Si/SiO2 ont été nettoyées, hydratées et greffées en phase gazeuse, comme décrit précédemment. Au total une vingtaine d'échantillons a été caractérisée par mesure du courant de fuite, mesures QSM et mesures d'impédance en fonction de la fréquence en régime d'accumulation avant et après greffage. Aucune augmentation du courant de fuite n'a été notée après greffage.

5.1. Nécessité d'un nettoyage des échantillons greffés

Les cyanosilanes sont des molécules très polaires. Après greffage, la surface des échantillons a une forte tendance à adsorber des poussières visibles à l'œil nu, beaucoup plus qu'après le greffage d'aminosilanes. Ce problème a déjà été remarqué lors d'une étude d'AFM [55].

Nous avons vu dans le cas de structures Si/SiO2 non greffées que la présence de poussières sur la surface de l'oxyde influe sur les caractéristiques électriques. Il est donc impératif de nettoyer les échantillons greffés avant chaque série de mesures afin de pouvoir attribuer toute modification des caractéristiques électriques à la couche de cyanosilanes.

L'étude AFM indique qu'un nettoyage en touchant la surface donne un meilleur résultat que de simples rinçages, sans pour autant modifier les propriétés adhésives de la couche de molécules. Ce dernier résultat est important pour une fixation ultérieure d'anticorps. Nous avons donc choisi de nettoyer nos échantillons greffés avec un coton-tige inbibé d'acétone, de la même manière que nous nettoyons les échantillons non greffés.

Tout comme dans le cas des structures Si/SiO2 nues, une différence est notée entre les caractéristiques des échantillons greffés de cyanosilanes, nettoyés ou non. C'est également au niveau de la capacité équivalente de la structure que cette différence est la plus nette (graphe 40).

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

10

20

30

Si/SiO2Si/SiO2/cyanosilanes:

Non nettoyé Nettoyé

Ceq

(nF)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

5

10

15

20

25

30

35

Si/SiO2Si/SiO2/cyanosilanes:

Mesure n°1 Mesures n°2 Mesures n°3 Mesures n°4

Ceq

(nF)

f (Hz)

graphe 40 : Capacité équivalente d'une structure Si/SiO2/cyanosilanes non nettoyée (poussières visibles à

l'œil nu) et après nettoyage.

graphe 41 : Manque de reproductibilité de la capacité équivalente d'une structure Si/SiO2/cyanosilanes à

moyennes et hautes fréquences. Après nettoyage il persiste une légère différence par rapport aux structures non greffées,

pour des fréquences supérieures à 100Hz (graphe 40). En réalité, un manque de reproductibilité de cette caractéristique à moyennes et hautes fréquences a été noté (graphe 41). Il a pu être lié au nettoyage : des mesures consécutives sans toucher à la surface des échantillons se sont montrées parfaitement reproductibles.


84

Une première hypothèse était que le nettoyage détériore la couche de molécules. Cependant une détérioration devrait signifier une baisse de la densité de molécules greffées. Après chaque nettoyage la capacité équivalente devrait donc augmenter et s'approcher de plus en plus de celle d'une structure non greffée, ce qui n'est pas observé. Elle oscille au contraire de manière aléatoire entre la capacité de la structure non greffée et une capacité minimale.

Une deuxième hypothèse est alors que le nettoyage au coton-tige réoriente les molécules greffées et/ou répartit différemment des impuretés adsorbées invisibles à l'œil nu. L'étude AFM [55] a en effet montré que les molécules greffées possèdent une certaine liberté de mouvement, et que les échantillons greffés sont recouverts d'une couche d'impuretés. D'après l'auteur, il est probable qu'il s'agisse de molécules de cyanosilanes hydratées. Celles-ci possèdent deux fonctions polaires (cyano et hydroxyles) et s'adsorbent facilement aux cyanosilanes fixés sur la surface, et également entre eux. Cette hypothèse est cohérente avec les résultats déjà présentés sur les structures non greffées, qui ont montré que la chute de la capacité équivalente à moyennes et hautes fréquences est liée à la présence d'impuretés à la surface de l'oxyde.

5.2. Epaisseur de couche greffée

La présence de poussières sur les échantillons pourrait expliquer que F. Gardies affirme que le greffage de cyanosilanes courte chaîne alkyl (également 3 carbones) conduise à une couche diélectrique dont l'épaisseur est évaluée par mesure de capacité à une vingtaine de fois l'épaisseur théorique d'une monocouche [37]. Les mesures ont été réalisées à moyenne ou haute fréquence, mais la fréquence exacte n'est pas mentionnée. En prenant l'exemple de notre échantillon du graphe 40, la différence de capacité équivalente à 10kHz entre la structure nue et la structure greffée mais non nettoyée correspondrait effectivement à une vingtaine de monocouches de cyanosilanes.

Comme nous avons vu dans le cas de structures Si/SiO2 non greffées que les mesures QSM semblent beaucoup plus insensibles que les mesures de capacité à la présence de poussières ou autres impuretés à la surface de l'échantillon, nous avons essayé d'utiliser cette méthode pour évaluer l'épaisseur de la couche greffée de cyanosilanes.graphe 40Les variations en régime d'accumulation induites par le greffage des cyanosilanes et mesurées par QSM sont très faibles : de l'ordre de 1%. De telles variations ont déjà été observées pour une même structure Si/SiO2 non greffée, lors de plusieurs mesures consécutives. Elles correspondraient à une incertitude inférieure à 0.5Å sur l'épaisseur de l'oxyde.

Cependant nous avons remarqué que dans le cas de structures Si/SiO2 non greffés, les variations de capacité sont aussi bien à la hausse qu'à la baisse. En effet, sur 28 échantillons, exactement 50% avaient une capacité en régime d'accumulation plus grande lors de la deuxième mesure QSM. Ceci n'est pas le cas après un greffage de cyanosilanes. Sur 19 échantillons greffés et testés ensuite en mesure QSM, la valeur de la capacité en régime d'accumulation avait baissé pour 16 d'entre eux et est restée inchangée pour les trois restants. Une deuxième mesure QSM sur 11 de ces échantillons confirme que même si les variations sont faibles, le greffage de cyanosilanes induit bien une baisse de la capacité de la structure. Cette légère baisse est visualisée sur le graphe 42 qui correspond aux valeurs moyennes des 19 échantillons testés électriquement.


85

-2 -1 0 1 20

10

20

30

Si/SiO2 Si/SiO2/cyanosilanes

Ceq

(nF)

Tension (V)

-1.8 -1.6 -1.4 -1.2 -1.00

1

2

3

4

5

Csil

anes

(µF)

Tension (V)

graphe 42 : Caractéristiques QSM de structures Si/SiO2 avant et après greffage de cyanosilanes

graphe 43 : Capacité moyenne des couches de cyanosilanes

La capacité de la couche greffée est de 3.5µF en moyenne sur les 19 échantillons, comme l'indique le graphe 43 dérivé des courbes du graphe 42 en régime d'accumulation en se basant sur un simple modèle série, dans lequel les résistances de l'oxyde et des cyanosilanes sont négligées :

1 1

2 2C C Csilanes Si SiO silanes Si SiO= −

/ / /

1

La valeur de cette capacité équivaut à une épaisseur de cyanosilanes de 5Å, ce qui correspond parfaitement à la taille de la molécule (quatre atomes de carbone forment théoriquement une chaîne de longueur 4Å). Cependant les inégalités entre échantillons sont importantes, l'écart type étant de 3Å.

5.3. Simulation de l'impédance d'une couche de cyanosilanes

Si les échantillons greffés sont nettoyés il n'y a pas de différence notable au niveau du module et de la phase de l'impédance en fonction de la fréquence (10mHz < f < 100kHz) par rapport aux structures non greffées, conformément à ce que nous espérions (graphe 44 et graphe 45).

Une simulation a été réalisée afin de vérifier qu'une couche de cyanosilanes de capacité 3µF n'influe effectivement pas sur le module et la phase de l'impédance dans ce domaine de fréquences. Le même modèle électrique que pour les aminosilanes longue chaîne a été utilisé (figure 43 p. 80). Il s'est avéré qu'une couche de cyanosilanes de capacité 3µF n'influe d'aucune manière sur l'impédance initiale de la structure Si/SiO2, dans le domaine de fréquences étudié, indépendamment de la valeur de la conductance Rsilanes. En réalité, pour qu'une influence soit notée il faut que la fréquence de mesure soit inférieure au µHz et la résistance de la couche de silanes supérieure à 10GΩ.


86

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109IZ

I (Ω

)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Si/SiO2 Si/SiO2/cyanosilanesPh

ase(

Z) (d

egré

s)

f (Hz)

graphe 44 et graphe 45 : Module et phase de l'impédance en fonction de la fréquence en régime d'accumulation avant et après greffage de cyanosilanes courte chaîne.

5.4. Conclusions

Les mesures QSM ont montré que le greffage de γ-cyanopropyldiméthylclorosilanes sur des structures Si/SiO2 donne en moyenne une monocouche diélectrique de molécules, malgré des disparités entre échantillons.

En prenant les précautions nécessaires (nettoyage des échantillons greffés avant chaque série de mesures électriques), nous constatons que le greffage n'induit aucune modification notable du module ou de la phase de l'impédance en régime d'accumulation en fonction de la fréquence (10mHz < f < 100kHz) par rapport aux structures non greffées. Ceci est en accord avec la présence sur l'oxyde d'une monocouche de cyanosilanes, dont l'épaisseur est faible et la constante diélectrique élevée.

Le nettoyage ne semble cependant pas éliminer toutes les impuretés adsorbées aux silanes fortement polaires, et qui pourraient être à l'origine des problèmes de reproductibilité observés au niveau de la capacité équivalente des structures à moyennes et hautes fréquences, en accord avec ce qui a déjà été observé pour les structures non greffées.

6. Caractérisation de couches de cyanopolysiloxanes

La fonctionnalisation des structures Si/SiO2 par un polymère permet de fixer des quantités plus grandes d'anticorps sur le transducteur, que lorsqu'il est fonctionnalisé par une monocouche de molécules. Un polymère possède, en effet, de par son épaisseur importante, beaucoup plus de groupements susceptibles d'interagir avec les anticorps, qu'une monocouche de molécules, et une étude FTIR a montré que les anticorps peuvent diffuser en tout cas dans une partie du polymère [56]. Ainsi, il devrait être plus aisé de montrer la faisabilité de l'immunocapteur, si celui-ci est fonctionnalisé grâce à un polymère. Les résultats les plus encourageants jusqu'à présent, ont aussi été obtenus pour des structures fonctionnalisées grâce à un polymère [57].

Le polymère ici utilisé a été obtenu par le procédé SOL-GEL décrit précédemment (p. 73), à partir des deux monomères suivants : le 2-cyanoéthyltrietoxysilane et le tetraetoxysilane (figure


87

45), comercialisés par ABCR. Tout comme les cyanosilanes courte chaîne, caractérisés ci-dessus, ce polymère pourra fixer des anticorps grâce à ses groupements cyano.

Une première solution, contenant 1 mole de chaque monomère, ainsi que 8 moles d'éthanol, a d'abord été préparée. Une deuxième solution, contenant également 8 moles d'éthanol, ainsi que 3 moles d'eau et 0.1 moles d'acide chlorhydrique, a ensuite été ajoutée à la première, petit à petit. L'ensemble a été mis sous agitation durant 4h. Les monomères sont ainsi hydrolysés, réaction accélérée par la présence de l'acide chlorhydrique, puis se condensent en un polysiloxane. La vitesse de tirage lors du dépôt sur les oxydes était de 1.6mm/s, et le temps d'immersion était de 5mn. Les structures ainsi obtenues ont été conservées à l'air.

Si O C2H 5

O

C2H 5

O

C2H 5

CH 2CH 2CN Si

O

O

CH2

O C 3HCH2

CH3

CH2

CH3

OCH2CH3

(a) (b)

figure 45 : Monomères de départ pour la synthèse du polymère cyano (a) le 2-cyano éthyl trietoxy silane, (b) le tetra etoxy silane

L'impédance des structures Si/SiO2/polysiloxane diffère fortement de celles des structures non greffées, comme l'indiquent les graphe 46 et graphe 47. Ils montrent également que le comportement électrique des structures greffées peut être approximé par le même modèle électrique simple utilisé pour les aminosilanes longue chaîne (figure 43 p. 80), dans lequel la couche greffée est représentée par une capacité et une résistance en série.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109

Si/SiO2 Si/SiO2/polysiloxane modélisation

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

ModélisationRsérie = 210Ω

Cox = 33.5nFRox > 100GΩ

Csiloxane = 2nFRsiloxane = 200kΩ

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 46 et graphe 47 : Modification de l'impédance d'une structure Si/SiO2 en régime d'accumulation, engendrée par le greffage du polysiloxane sur l'oxyde. Mesure en régime d'accumulation.

Cependant, l'impédance des couches de polysiloxanes ne s'est pas montrée reproductible, ni d'un échantillon à l'autre, ni pour un même échantillon. Une dérive est observée, comme le montrent les graphe 48 et graphe 49, qui a pu être reliée, grâce à la modélisation électrique, à une augmentation de la résistance de la couche de polysiloxane


88

avec le temps. Dans ce cas précis, la résistance de la couche de polysiloxane était évaluée à 200kΩ, lors de la première mesure, et à 2MΩ, 18 jours plus tard. Un recuit des structures greffées, pendant 12h à 100°C, a été tenté afin de stabiliser les couches, mais sans succès.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Mesure 1. Jour J Mesure 2. Jour J+13 Mesure 3. Jour J+18

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 48 et graphe 49 : Dérive des caractéristiques électriques des structures Si/SiO2/polysiloxane en fonction du temps.

L'augmentation de la résistance de la couche de polysiloxane pourrait s'expliquer par des réactions de condensation au sein de la couche. Deux hypothèses sont envisageables. On peut imaginer que les réactions de condensation des monomères, incomplètes lors du dépôt sur l'oxyde, continuent une fois le greffage réalisé. On peut également imaginer que le polysiloxane s'hydrate lors de la caractérisation électrique, dont la durée est d'environ une heure, et durant laquelle le polysiloxane est en contact avec le PBS. Cette hydratation peut entraîner une hydrolyse des liaisons restées intactes lors de la synthèse du polymère, qui sera suivie de réactions de condensation. La caractérisation électrique fait ainsi redémarrer les réactions de condensation au sein de la couche, augmentant chaque fois sa résistance.

Avant de pouvoir servir à la fonctionnalisation du transducteur, les couches de polysiloxane devront faire l'objet d'une étude détaillée, visant à optimiser la préparation du polymère et son dépôt sur l'oxyde, en comparant divers traitements des structures après greffage, afin d'aboutir à des couches électriquement stables.

Conclusion

Cette étude de structures Si/SiO2 greffées de silanes et de polysiloxanes a tout d'abord permis de déterminer quelles couches de molécules organiques sont suffisamment stables électriquement pour servir à l'élaboration de l'immunocapteur. Les monocouches de silanes se sont montrées très stables, contrairement au polysiloxane utilisé.

Cette différence pourrait être expliquée partiellement par la différence structurale entre une monocouche de silanes et une couche de polysiloxane. La première est dense et structurée, contrairement à la deuxième, qui peut beaucoup plus facilement subir des modifications au cours du temps. Aussi, le procédé SOL-GEL n'est pas forcément le mieux adapté pour l'obtention d'un polysiloxane stable. Cependant, par rapport aux polymères commerciaux, il présente l'avantage de pouvoir réaliser "sur mesure" un polysiloxane spécialement adapté à l'application immunocapteur, en modérant le nombre de groupements pouvant servir au couplage des anticorps.


89

Dans cette étude, la différence structurale entre une monocouche de silanes et une couche de polysiloxane a pu être mise en évidence à plusieurs reprises. La densité de la couche de silanes permet l'utilisation de la sonde mercure pour la prise de contact de grille, alors qu'elle n'est pas utilisable dans le cas du polysiloxane, couche beaucoup trop poreuse. Cette différence structurale se traduit par des résistivités très différentes entre les couches de silanes et polysiloxanes. Ainsi, la résistivité des aminosilanes longue chaîne est évaluée à environ 1015Ω.cm, ce qui est plus de 105 fois celle du polysiloxane.

La résistance de la couche d'aminosilanes longue chaîne est tellement élevée qu'elle n'influe quasiment pas sur le module et la phase de l'impédance totale des structures, dans le domaine de fréquences étudié (10mHz<f<100kHz), ce qui n'est pas le cas des polysiloxanes. En effet, moins la couche de molécules est structurée et dense, moins elle se comporte comme un diélectrique parfait, et plus la résistance de la couche devient importante pour expliquer son comportement électrique. On comprend alors l'importance de s'intéresser à l'impédance totale du capteur, et non seulement à la partie capacitive, dans l'objectif immunocapteur. En effet, les anticorps et les antigènes ne pourront, de par leur configuration, former des couches denses et structurées.

Chapitre 4 : Immunodétection

92

CHAPITRE 4 Immunodétection


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Introduction

Le couplage des anticorps sur le transducteur fonctionnalisé constitue la dernière étape dans l'élaboration de l'immunocapteur. Ce sont les anticorps qui vont permettre au capteur la reconnaissance sélective des antigènes à détecter.

Les anticorps font partie du système immunitaire, dont le rôle est de nous défendre contre des organismes infectieux et leurs produits toxiques. Dans cet objectif, des cellules spécifiques et des anticorps circulent constamment dans le corps. Dès qu'elles localisent des virus, des cellules ou des macromolécules étrangères, intervient un ensemble de phénomènes visant à éliminer ces derniers.

Les anticorps participent à la neutralisation et l'élimination des substances étrangères en se liant avec elles. Alors que la production d'anticorps dans le corps se fait même en l'absence de toute substance étrangère, elle est stimulée par la réaction des anticorps avec une substance étrangère. Toute substance qui peut se lier à un anticorps, et qui est capable de stimuler une production d'anticorps, est appelée antigène. Ainsi, les virus et les bactéries constituent des exemples d'antigènes.

La réaction anticorps-antigène est spécifique, c'est-à-dire qu'un anticorps ne peut réagir qu'avec un seul type d'antigène. Toutes les techniques de dosage d'antigènes se basent sur cette spécificité, que ce soit les méthodes classiques ou les immunocapteurs.

La détection de deux antigènes différents a été tentée dans notre travail : l'alfa-fœtoprotéine et le virus Dengue-2. L'alfa-fœtoprotéine est présent dans le sang de tout être humain adulte, mais à des concentrations inférieures à 10ng/ml. Cependant, dans le cas d'un cancer du foie, ainsi que chez la femme enceinte, cette concentration augmente. Le virus Dengue-2 provoque une fièvre hémorragique, tuant chaque année quelques dizaines de milliers de personnes dans le monde.

Des anticorps correspondant à ces deux antigènes ont ainsi été couplés aux transducteurs fonctionnalisés. Parmi les couches de molécules caractérisées dans le chapitre précédent, seules les monocouches de silanes se sont montrées assez stables électriquement pour pouvoir être utilisées dans l'élaboration du capteur. Parmi elles, seules les cyanosilanes courte chaîne permettent une bonne fixation des anticorps sur le transducteur. En effet, les groupements terminaux des aminosilanes longue chaîne étant de nature méthyl, ces molécules ne peuvent interagir avec des anticorps que par des liaisons hydrophobes, dont la stabilité n'est pas très grande.

Deux immunocapteurs, se différenciant uniquement par la nature des anticorps fixés, ont donc été élaborés. L'intérêt réside dans la différence de taille très importante entre les antigènes correspondants, l'alfa-fœtoprotéine et le virus Dengue-2.

Dans un premier temps sera étudié le couplage des anticorps sur le tranducteur fonctionnalisé, et dans un deuxième temps la détection des antigènes.


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1. Les anticorps et leur couplage sur le transducteur fonctionnalisé

1.1. Les anticorps

Les anticorps, également appelés immunoglobulines (Ig), sont des glycoprotéines. Chez l'homme on distingue 5 classes d'anticorps. Environ 75% des anticorps appartiennent à la classe "IgG", largement majoritaire. Les deux anticorps utilisés dans ce travail, l'anti-alfa-fœtoprotéine et l'anti-Dengue-2, appartiennent à cette classe.

La figure 46 représente un anticorps IgG. Il est constitué de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques, liées entre elles par des ponts disulfure. Une chaîne légère s'associe avec une chaîne lourde pour former un site de reconnaissance antigénique. Ainsi l'IgG possède deux sites de reconnaissance antigénique identiques.

Régions constantesRégions variablesPonts disulfure

Sites de reconnaissanceantigénique

Résidu glucidique

NH2

COOHHOOC

H N2

Chaînes légères

Chaîne lourde

environ 150 A

environ 50 A

figure 46 : Vue schématique d'un anticorps IgG

Il a été constaté que chaque chaîne polypeptidique est constituée d'une région constante, identique pour tous les anticorps d'une même classe, et d'une région variable. Ce sont précisément les régions variables d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde qui s'associent pour former un site de reconnaissance antigénique. Ainsi, au sein d'une même classe d'anticorps, il existe une multitude d'anticorps différenciés par leurs sites antigéniques, et capables de reconnaître des antigènes très divers. Leur grande flexibilité permet aux anticorps d'interagir avec les antigènes de configurations très différentes (figure 47).


anticorps anticorps

antigènes

figure 47 : Flexibilité d'un anticorps IgG

La taille d'un anticorps est d'environ 150Å de hauteur, et 50Å de largeur. Il est donc beaucoup plus grand que les chaînes silanes caractérisés dans le chapitre précédent, mais sa taille est de loin inférieure à l'épaisseur moyenne d'une couche de polysiloxane, qui est en général de l'ordre du micromètre.

Certains antigènes sont de la taille des anticorps. Ceci est le cas de l'alfa-fœtoprotéine qui est une glycoprotéine, comme les anticorps. Le virus Dengue-2 par contre est beaucoup plus grand : son diamètre est d'environ 100nm.

En réalité, l'anticorps ne reconnait et n'interagit qu'avec une petite partie de l'antigène, appelée épitope. Différents anticorps peuvent ainsi reconnaître différents endroits d'un même antigène : on parle alors d'anticorps polyclonaux. Les anticorps monoclonaux, de leur côté, sont parfaitement identiques et reconnaissent tous le même endroit de l'antigène.

1.2. Liaison anticorps - transducteur fonctionnalisé

L'anticorps possède différents groupements chimiques capables d'interagir avec un transducteur fonctionnalisé : des groupements amines et carboxyles aux extrémités des longues chaînes peptidiques, ainsi que des résidus glucidiques le long de ces mêmes chaînes.

Il a été montré que ce sont les groupements hydroxyles, présents au niveau des groupements carboxyles et des résidus glucidiques, qui permettent la fixation des anticorps sur un transducteur fonctionnalisé par des cyanosilanes [37]. La liaison résiste à des lavages acides forts (pH=2.8). Aucune liaison covalente n'a cependant pu être mise en évidence par spectrométrie Infra-Rouge. Il s'agirait d'interactions électrostatiques fortes.

Afin de simuler l'interaction entre les groupements hydroxyles des anticorps et les groupements cyano du transducteur fonctionnalisé, un greffage de molécules d'alcool a été réalisé sur des structures Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne. Une molécule d'alcool est constituée d'une chaîne carbonée, de longueur variable selon la nature de l'alcool, et d'un groupement hydroxyle en bout de chaîne. Ainsi, cette molécule permet de simuler l'anticorps, par son groupement terminal hydroxyle, alors qu'elle présente une forte similitude structurale avec un silane. Si la couche de molécules d'alcool ainsi fixée est suffisamment dense, elle devrait engendrer une modification de la capacité basse fréquence des structures, tout comme dans le cas des couches de silanes étudiées. Par référence aux aminosilanes longue

95


chaîne caractérisées dans le chapitre précédent, un alcool à 18 carbones a été choisi : l'octadécanol (figure 48).

CH3 CH2 CH2 CH2 CH2........ OH

17 fois

figure 48 : L'octadécanol

Les structures Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne ont été immergées durant deux heures dans une solution d'octadécanol à 99%. Des structures Si/SiO2 non greffées ont également été immergées, afin de servir de témoin. L'octadécanol étant solide à température ambiante, l'immersion a été réalisée dans une étuve à 80°C. Après immersion les échantillons ont été rincés à l'acétone chaud afin d'éliminer l'excès d'alcool n'ayant pas réagi avec les cyanosilanes.

Une très grande affinité entre la solution d'alcool et les oxydes greffés de cyanosilanes a été notée, contrairement au cas des oxydes nus : les oxydes fonctionnalisés cyano retiennent la solution d'alcool, de la même manière que les oxydes traités à la solution sulfochromique retiennent l'eau.

Alors qu'aucune modification des caractéristiques électriques des oxydes nus n'a été notée, une baisse de la capacité basse fréquence en régime d'accumulation des oxydes déjà greffés de cyanosilanes a été mise en évidence par mesure QSM (graphe 50). Si l'on suppose, par analogie avec les aminosilanes longue chaîne, que la constante diélectrique de la couche d'octadécanol est égale à 2, la baisse de capacité correspond à une épaisseur de couche de 20Å, en moyenne sur trois échantillons, ce qui est cohérent avec la longueur de la chaîne carbonée de l'alcool, qui est de 23Å.

-2 -10

10

20

30

0 1 2

Avant Après

Ceq

(nF)

Tension (V)

graphe 50 : Modification de la caractéristique QSM d'une structure Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne, par le

greffage d'octadécanol.

Les problèmes de reproductibilité ont cependant été importants. La difficulté consiste à mettre au point un rinçage qui permette d'éliminer l'excès d'alcool n'ayant pas réagi avec les groupements cyano, mais sans que cet excès d'alcool ne se solidifie, et sans que le solvant n'enlève la couche d'alcool électrostatiquement fixée à la structure Si/SiO2. Des rinçages à l'eau pure, à l'éthanol, ainsi qu'à l'hexane ont aussi été tentés, mais sans améliorer la reproductibilité.

Toutefois, l'aptitude du transducteur, fonctionnalisé grâce aux cyanosilanes courte chaîne, à fixer des molécules possédant des groupements hydroxyles a été vérifiée.

96


97

1.3. Couplage des anticorps sur le transducteur

1.3.1. Couplage de l'anti-alfa-fœtoprotéine

Une solution initiale d'anti-alfa-fœtoprotéines monoclonaux de concentration 4.7mg/ml, fournie par Bio-Mérieux, a été diluée au dixième dans un tampon carbonate (pH=9.5), puis 10µl de cette solution ont été déposés sur chaque oxyde de grille fonctionnalisé. Les échantillons ont ainsi été laissés 12h, dans un environnement humide, à température ambiante. Ils ont ensuite été rincés au PBS-Tween.

1.3.2. Couplage de l'anti-Dengue-2

Une solution purifiée d'anti-Dengue-2, de concentration 0.8mg/ml, a été fournie par le Centre de Recherche du Service de Santé des Armées, de Grenoble. Elle a été diluée 10 fois dans du PBS, avant que 10µl ne soient déposés sur chaque oxyde de grille. De même que pour l'incubation de l'anti-alfa-fœtoprotéine, les échantillons ont été laissés 12h, dans un environnement humide, à température ambiante, puis ils ont été rincés au PBS-Tween.

Les concentrations plus faibles d'anticorps que dans le cas de l'anti-alfa-fœtoprotéine sont justifiées par la taille beaucoup plus grande de l'antigène correspondant.

1.3.3. Saturation des sites cyano

La plupart des antigènes possèdent également des groupements hydroxyles, capables d'interagir avec les groupements cyano du transducteur fonctionnalisé. C'est le cas de l'alfa-fœtoprotéine, puisque c'est une glycoprotéine tout comme son anticorps, et c'est probablement aussi le cas du virus Dengue-2. Afin d'éviter que les antigènes ne puissent se fixer directement sur le transducteur lors de l'immunodétection, une saturation des groupements cyano n'ayant pas réagi avec un anticorps est nécessaire.

Les structures greffées d'anticorps ont ainsi été incubées durant trois heures, à température ambiante, dans une solution de BSA (sérum-albumine bovine) dans du PBS, à 10% poids volume. Cette concentration a été choisie, parce qu'elle correspond à la concentration de la solution d'anti-Dengue-2. Elle a aussi été utilisée pour les structures greffées d'anti-alfa-fœtoprotéine, bien que la concentration de la solution d'anti-alfa-fœtoprotéine soit un peu plus élevée.

Les immunocapteurs ainsi obtenus (figure 49) ont ensuite été caractérisés électriquement.


SiSiO2

cyanosilanescourte chaîne

anticorps

molécule de BSA

~ 150A

~ 70A~ 4A

~ 0.5mm

Si

oxyde

de champ

Au

1.3 cm

oxyde de grille3 mm

~ 0.5 mm

figure 49 : Vue schématique de l'immunocapteur

1.4. Comportement électrique des immunocapteurs

Le couplage des anticorps aux structures Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne n'a engendré aucune modification notable quand à l'impédance de ces structures, comme le montrent les graphe 51 et graphe 52 qui correspondent au cas de l'anti-alfa-fœtoprotéine. La très légère différence notée au niveau de la phase, à haute fréquence, n'est pas significative, car de telles variations avaient déjà été observées pour une même structure Si/SiO2 non greffée (graphe 18 p. 58). La présence d'anti-alfa-fœtoprotéine sur le transducteur fonctionnalisé a été vérifiée grâce à un test ELISA, dont le principe est décrit ultérieurement (p. 100).

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109

Couplage des anticorps: Avant Après

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 51 et graphe 52 : Le couplage de l'anti-alfa-fœtoprotéine aux structures Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne n'engendre aucune modification de leur impédance en régime d'accumulation. Ces courbes expérimentales

correspondent aux moyennes sur quatre échantillons.

Initialement, une très forte augmentation du courant de fuite des immunocapteurs avait été observée, atteignant en régime d'accumulation jusqu'à 104 fois celle d'une structure Si/SiO2 de bonne qualité. Cependant, nous avons pu constater que ce courant de fuite ne traduisait pas une dégradation de la qualité diélectrique de l'oxyde, mais était due à une fuite par les bords des échantillons, causée par les molécules de BSA. En effet, alors que le couplage anticorps a été réalisé uniquement au niveau de l'oxyde de grille, la saturation des groupements cyano par le BSA a été réalisée sur toute la surface des échantillons, qui sont ensuite conservés dans du PBS. Avant la caractérisation électrique, ils sont séchés à l'air libre quelques instants, afin d'éviter justement des fuites par les bords. Or, il s'est avéré que les échantillons ne séchaient jamais parfaitement, probablement à cause de la présence des

98


99

protéines, retenant l'eau, et causant l'augmentation du courant de fuite. En essuyant le bord des échantillons, les courants de fuite ont été ramenés à celui d'un oxyde de bonne qualité.

On constate ici encore une fois l'importance des mesures de courant. En effet, malgré les courants de fuite élevés, les mesures d'impédance sur l'immunocapteur auraient été possibles, mais les caractéristiques auraient été faussées, conduisant à des conclusions erronées quand l'influence du couplage anticorps sur le transducteur fonctionnalisé.

La configuration des anticorps est probablement à l'origine du fait que leur couplage sur le transducteur n'engendre aucune modification d'impédance. Cette configuration en forme de Y empêche la formation de couches denses. Ceci, en combinaison avec le caractère hydrophile des protéines constaté ci-dessus, entraîne une pénétration massive d'eau dans la couche de molécules. Il a été montré, dans le cas de l'albumine bovine, que si l'absorbtion d'eau par cette molécule est supérieure à 10% de son poids, sa constante diélectrique augmente très fortement [37]. Ainsi, pour une absorption d'eau de 15%, la constante diélectrique est déjà supérieure à 200. La capacité électrique d'une telle couche de protéines, en estimant l'épaisseur à 150Å, est alors plus de 25 fois supérieure à celle du transducteur fonctionnalisé, et devient négligeable dans un modèle série. De son côté, de par la présence importante d'eau, la résistance de la couche diminue et s'approche de celle de l'électrolyte.

Etant donné que la présence de la couche de cyanosilanes courte chaîne n'a pas non plus d'influence notable sur l'impédance des structures EOS nues, mis à part une très légère diminution de la capacité basse fréquence en régime d'accumulation, le comportement électrique des immunocapteurs ainsi élaborés devient équivalent à celui des structures EOS nues. Le modèle électrique équivalent des immunocapteurs se résume ainsi au modèle électrique équivalent de la structure EOS (figure 36 p. 61), dans le domaine de fréquences 10mHz à 100kHz.

2. Les antigènes et leur détection

2.1. La liaison anticorps-antigène

Toutes les techniques de détection et de dosage d'antigènes se basent sur l'interaction anticorps-antigène. Plusieurs types de forces sont impliqués dans cette interaction : des forces Van der Waals, des forces électrostatiques, des liaisons hydrogène et des liaisons hydrophobes. Il ne s'agit donc pas d'une liaison covalente.

Les forces Van der Waals sont dues au mouvement des électrons dans les molécules, et sont inversement proportionnelles à la distance entre deux atomes à la puissance 6. Elles sont donc très faibles, mais peuvent devenir efficaces dans le cas d'une complémentarité étroite entre l'antigène et l'anticorps.

Les liaisons électrostatiques et les liaisons hydrogène sont les plus fortes. Alors que les liaisons électrostatiques mettent en jeu des groupements ioniques de charge opposée, les liaisons hydrogène mettent en jeu des atomes électropositifs et électronégatifs, tels l'hydrogène et l'oxygène par exemple.

Les liaisons hydrophobes constituent des interactions entre des groupements non polaires.


Toutes ces liaisons contribuent à une bonne stabilité de l'interaction anticorps-antigène, bien que l'énergie de liaison de chacune d'elle soit faible par rapport à celle d'une liaison covalente.

Il est à noter que l'interaction est d'autant plus forte que la complémentarité entre l'anticorps et l'antigène est élevée. Dans le cas d'une mauvaise complémentarité, les forces stériques de répulsion entre les deux macromolécules deviennent importantes, et celles-ci sont séparées. C'est ainsi que la spécificité de l'interaction anticorps-antigène est assurée.

2.2. Une technique de détection classique : le test ELISA

Il existe de nombreuses techniques classiques de dosage d'antigènes, parmi lesquelles celles utilisant un marqueur sont les plus couramment exploitées. Des anticorps marqués par un groupement fluorescent, une molécule radio-active ou une enzyme, permettent le dosage des antigènes. Le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), utilisé dans ce travail pour le contrôle de la fixation des anticorps sur le transducteur et de l'interaction des antigènes avec l'immunocapteur, est une technique de dosage utilisant un marqueur enzymatique. Son principe est brièvement décrit ci-dessous.

La première étape consiste en l'incubation des anticorps marqués. Différents modes opératoires sont possibles : modes direct, indirect ou sandwich.

Dans le mode direct, les antigènes sont fixés sur un support (par simple adsorption), puis les anticorps correspondant, marqués d'une enzyme, sont incubés (figure 50).

M

Mantigène

support anticorpsmarqué

figure 50 : Mode opératoire direct

Dans le mode indirect, on commence également par fixer les antigènes sur un support. Ensuite sont incubés les anticorps correspondant, mais non marqués. On procède ensuite à une deuxième incubation d'anticorps, cette fois-ci marqués, mais dont l'antigène associé constitue le premier anticorps incubé (figure 51).

100


antigène

support anticorps

anticorps

M

marqué

M

figure 51 : Mode opératoire indirect

Dans le mode sandwich, des anticorps correspondant à l'antigène que l'on veut doser sont fixés sur le support. On procède ensuite à l'incubation des antigènes, puis à l'incubation d'autres anticorps, différents des premiers, mais qui peuvent interagir avec un autre épitope de l'antigène, et qui sont marqués.

antigènesupport

anticorps

anticorps

M

marqué

M

figure 52 : Mode opératoire sandwich

Indépendamment du mode opératoire d'incubation des anticorps marqués, on procède ensuite à un rinçage, afin d'éliminer tous les anticorps marqués n'ayant pas réagi avec un antigène correspondant. Ensuite, une solution appelée "substrat" est ajoutée, dont la couleur est modifiée par la présence des enzymes. La densité optique du substrat, proportionnelle à la concentration en enzymes, et donc à la concentration en antigènes, est finalement déterminée grâce à un spectromètre.

Les méthodes de dosage utilisant des marqueurs fluorescents ou radio-actifs se déroulent selon le même processus, se différenciant uniquement dans l'étape finale par la technique employée quand au "comptage" des anticorps marqués.

Malgré l'excellente sélectivité et sensibilité (de l'ordre du ng/ml) de ces techniques, on constate ici que leur mise en œuvre est complexe. L'on comprend mieux alors l'intérêt pour l'analyse biomédicale, d'un immunocapteur permettant la détection rapide et directe des antigènes.

101


2.3. Détection des antigènes par mesures d'impédance électrique

2.3.1. Résultats

Pour tester l'aptitude des immunocapteurs élaborés à détecter l'alfa-fœtoprotéine et le virus Dengue-2, deux solutions de PBS-Tween, contenant repectivement de l'alfa-fœtoprotéine à une concentration de 1µg/ml et du virus Dengue-2 à une concentration de 60µg/ml, ont été préparées. 10µl de chaque solution ont ensuite été déposés sur l'oxyde de grille des capteurs correspondants, laissés 12h dans un environnement humide à température ambiante, puis rincés au PBS-Tween.

Le virus Dengue-2 était fourni par le Centre de Recherche du Service de Santé des Armées (CRSSA), à Grenoble, tout comme son anticorps correspondant. Il provenait d'une culture sur des cellules Vero de rein de singe, et avait été désactivé par le formaldéhyde. L'alfa-fœtoprotéine utilisée est commercialisée par Behring.

Malgré les concentrations élevées d'antigène incubées, aucune modification significative des caractéristiques électriques des immunocapteurs n'a été notée, que ce soit au niveau de l'impédance ou de la capacité équivalente en fonction de la fréquence en régime d'accumulation ou au niveau de la caractéristique QSM, comme le montre les graphe 53, graphe 54, graphe 55 et graphe 56, qui correspondent au capteur de virus Dengue-2.

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105102

103

104

105

106

107

108

109

Capteur sans antigènes avec antigènes

IZI (

Ω)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

20

40

60

80

100

Phas

e(Z)

(deg

rés)

f (Hz)

graphe 53 et graphe 54 : L'incubation de virus Dengue-2 n'engendre aucune modification notable de l'impédance de l'immunocapteur en régime d'accumulation

102


-2 -1 0 1 20

10

20

30C

eq (n

F)

Tension (V)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 1050

10

20

30

40

Capteur sans antigènes avec antigènes

Ceq

(nF)

f (Hz)

graphe 55 et graphe 56 :L'incubation de virus Dengue-2 n'engendre aucune modification nptable ni de la caractéristique QSM ni de la capacité équivalente de l'immunocapteur

La présence du virus sur les capteurs Dengue-2 a été montrée grâce à un test ELISA réalisé au CRSSA, dont le résultat est exposé dans le graphe 57. Il exprime le rapport des densités optiques entre chaque capteur et une référence, qui correspond à des structures Si/SiO2 greffées de cyanosilanes courte chaînes auxquelles uniquement du BSA a été couplé. La présence d'antigènes est considérée comme certaine lorsque ce rapport est supérieur à 2.

10

1

2

3

4

capteurno 4

capteurno 3

rcapteurno 1

capteuno 2

Rap

por

tca

pte

ur/r

éfér

ence

graphe 57 :Résultat du test ELISA pour les capteurs de virus Dengue-2. Rapport entre les densités optiques de chaque

capteur et de la référence.

103


104

2.3.2. Discussion

Les capteurs élaborés ne permettent donc pas la détection des antigènes par mesure d'impédance. Une inhomogénéité de la couche d'anticorps pourrait en être la cause, comme l'a montré Klein [27]. Il a étudié la faisabilité d'un immunocapteur capacitif pour la détection de l'activateur plasminogène de type urokinase. Le transducteur Si/Si3N4 était fonctionnalisé grâce une couche de silanes sur laquelle était greffée une couche de glutaraldéhyde permettant le couplage des anticorps correspondants. Une baisse de la capacité du capteur après injections successives d'antigènes dans la cellule de mesure a pu être mise en évidence, mais elle était beaucoup plus faible qu'attendu. Grâce à des simulations Klein a pu montrer qu'une mauvaise homogénéité de la couche d'anticorps entraîne des effets d'écran électrostatique, diminuant fortement la réponse du capteur.

Dans notre cas, un tel effet d'écran n'est probablement pas la seule cause de l'absence de signal. Déjà la couche de protéines formée par les anticorps et le BSA n'avait pas modifiée l'impédance du transducteur fonctionnalisé. Alors que ces molécules couvrent certainement toute la surface du transducteur, leur configuration et leur caractère hydrophile ne permettent pas la formation d'une couche dont l'impédance est significative par rapport à celle de la structure Si/SiO2. La configuration des antigènes ne permet certainement pas non plus la formation d'une couche complètement homogène. L'électrolyte de mesure pénétrera alors instantanément la double couche formée par les complexes immuns, leur impédance devenant négligeable par rapport à celle du transducteur.

Ainsi, une structure Si/SiO2 fonctionnalisée par monocouche (monocouche de silanes puis monocouche d'anticorps) ne forme peut-être pas un capteur approprié pour la détection d'antigènes par mesure d'impédance, ce qui confirmerait les travaux de Maupas. Il n'avait cependant étudié qu'un très faible domaine de fréquences (1 à 100kHz) [57], et la fréquence maximale à laquelle un complexe anticorps immobilisé - antigène peut répondre à une excitation électrique a été estimée par Gebbert à 6kHz [28], ce qui justifie nos travaux.

Deux solutions sont alors à envisager : l'utilisation d'autres modes de greffage des anticorps sur le transducteur, ou le choix d'un transducteur dont l'impédance est moindre que celle de la structure Si/SiO2.

Autres techniques de greffage

Si des complexes anticorps-antigènes présents à la surface d'un transducteur Si/SiO2 fonctionnalisé par monocouche ne peuvent être détectés par mesure d'impédance, une fonctionnalisation du transducteur par un polymère dans lequel sont inclus des anticorps pourraient permettre de meilleurs résultats, comme l'indique les travaux de Maupas [57]. Il a mis en évidence une modification réversible, spécifique et reproductible des caractéristiques électriques d'une membrane de cyanopolysiloxane contenant des anti-alfa-fœtoprotéines, et greffée sur une structure Si/SiO2, après incubation des antigènes correspondants. A cause de la grande instabilité électrique des cyanopolysiloxanes testés dans ce travail (chapitre 3), nous n'avons pu confirmer ce résultat. La mise au point de polysiloxanes stables est donc de première importance.

Un autre mode de fixation des anticorps sur le transducteur, intermédiaire entre la monocouche et la membrane polymérique, a été étudié par plusieurs auteurs dans l'objectif


105

d'élaborer des immunocapteurs capacitifs, notamment lorsque l'immobilisation des anticorps par monocouche s'est avérée infructueuse. Il s'agit d'élaborer une monocouche d'anticorps, au moins partiellement diélectrique. Ainsi, Gardies a mis au point une technique permettant d'obtenir des couches bloquantes d'anticorps, grâce à l'addition de glutaraldéhyde dans la solution servant à leur couplage sur le transducteur [37]. Le glutaraldéhyde sert ainsi d'agent de réticulation entre les anticorps, empêchant une infiltration trop massive de l'électrolyte, et permettant une détection de la couche de biomolécules par mesure de capacité électrique. Gebbert et al. ont utilisé un mode opératoire similaire en se servant d'une solution d'anticorps et de carbodiimide pour le couplage des immunoespèces sur le transducteur Ta/TaO2 silanisé [28]. Une autre technique a été développée par Billard [6] : l'incorporation des immunoespèces dans une couche de Langmuir-Blodgett. Cependant, parmi ces trois exemples, seul le capteur de Gebbert a permis la détection de l'antigène (un antigène de mouton) de manière reproductible et sélective, par mesure de capacité. Des résultats plus encourageants pourraient éventuellement découler d'une caractérisation électrique plus complète.

Cependant l'on ne peut s'empêcher de faire le parallèle entre ces capteurs, présentant une monocouche diélectrique d'anticorps, et ceux que nous avons élaboré et caractérisé. En effet, dans notre cas, la présence de la couche de protéines constituée d'anticorps et de BSA sur la structure diélectrique sous-jacente, n'avait pu être détectée par mesure d'impédance. Il parait alors peu probable que la présence d'antigènes sur la surface d'un capteur dont la membrane sensible est diélectrique puisse engendrer une modification significative de son impédance. En effet, une monocouche diélectrique d'anticorps n'empêchera pas l'infiltration de l'électrolyte dans la couche d'antigènes, rendant ainsi leur impédance négligeable par rapport à celle du capteur. L'utilisation d'une membrane polymérique pour le couplage des anticorps sur le transducteur, dont les propriétés électriques sont modifiées par la présence des antigènes, nous semble pour cette raison une meilleure approche, dans un premier temps.

Autre transducteur

Si des complexes anticorps-antigènes présents à la surface d'un transducteur Si/SiO2 fonctionnalisé par monocouche ne peuvent être détectés par mesure d'impédance, cela est probablement lié à la grande impédance du capteur lui-même. En effet, la sensibilité du capteur est limitée par son impédance intrinsèque. Des structures à oxyde très mince (70Å) avaient pourtant été choisies, car elles permettent une meilleure sensibilité. En comparant avec les travaux de Bataillard [5], l'on comprend mieux l'importance de ce paramètre. Il avait étudié un immunocapteur capacitif à transducteur Si/SiO2 pour le dosage et la détection de l'alfa-fœtoprotéine. L'épaisseur de l'oxyde était de 70nm, soit 10 fois supérieure à la nôtre. Une diminution de 3% de la capacité électrique du capteur était enregistrée après incubation d'antigènes à une concentration de 1µg/ml. Avec un oxyde de 70Å d'épaisseur, une diminution de 35% aurait été enregistrée, lui permettant de détecter des concentrations beaucoup plus faibles.

Dans notre cas, la sensibilité du capteur ne peut cependant plus être augmentée par une diminution de l'épaisseur de l'oxyde, sans que ses caractéristiques électriques se dégradent. La solution qui se présente est alors d'échanger la structure Si/SiO2 contre un transducteur métallique, dont l'impédance est beaucoup plus faible. Ainsi, Maupas a réussi à détecter l'alfa-fœtoprotéine à une concentration de 500ng/ml, grâce à un capteur quasiment identique aux nôtres, seule la structure Si/SiO2 étant remplacée par une électrode en platine [4]. Plusieurs autres travaux ont été signalés concernant l'élaboration d'immunocapteurs impédimétriques à


106

transducteur métallique, en général or [58] ou platine [59]. Ces capteurs pourraient également être réalisés en technologie micro-électronique, permettant une intégration aisée dans un multicapteur.

Il faut cependant être conscient des inconvénients de l'utilisation d'un transducteur métallique. Elle engendre entre autres des phénomènes électrochimiques complexes, compliquant nettement la réponse électrique du capteur. De plus, la membrane biologique du capteur risque d'être rapidement dégradée si une polarisation est nécessaire pour la détection des antigènes, à cause du passage de courants d'intensité non négligeable.

Conclusion

La faisabilité d'un immunocapteur basé sur une structure Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne/anticorps immobilisés, et permettant la détection des antigènes correspondants par mesure d'impédances, a été étudiée. Deux types de capteurs, destinés à détecter deux antigènes de tailles différentes, l'alfa-fœtoprotéine et le virus Dengue-2, ont été élaborés et caractérisés, puis leur aptitude à détecter les antigènes a été testée.

La fixation des anticorps sur le transducteur fonctionnalisé n'a engendré aucune modification significative de l'impédance de la structure dans le domaine de fréquences étudié (10mHz < f < 100kHz), probablement à cause du caractère très hydrophile des protéines. La capacité électrique de la couche d'anticorps devient ainsi très grande et négligeable par rapport à celle du transducteur fonctionnalisé, tandis que sa résistance électrique devient très proche de celle de l'électrolyte, à cause de l'infiltration massive d'eau. Le modèle électrique équivalent des capteurs dans le domaine de fréquences étudié, se résume ainsi à celui de la structure EOS.

La présence d'anticorps sur le transducteur fonctionnalisé ne fait cependant pas de doute. Une étude préalable a permis de confirmer qu'une structure Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne est capable de fixer des molécules présentant des groupements hydroxyles, ce qui est le cas des anticorps. Dans le cas du capteur d'alfa-fœtoprotéine, la présence des anticorps a également été vérifiée par test ELISA.

Ces capteurs n'ont cependant pas permis la détection des antigènes correspondants, que ce soit dans le cas de l'alfa-fœtoprotéine, antigène de petite taille, ou dans le cas du virus Dengue-2, antigène de plus grande taille. A cause du caractère hydrophile des molécules biologiques, et de la grande impédance des structures Si/SiO2, sa fonctionnalisation par monocouche ne semble pas appropriée dans l'objectif d'élaborer un immunocapteur basé sur des mesures d'impédance. La mise au point de polysiloxanes électriquement stables devient alors de première importance.

Conclusion

Le premier objectif de ce travail était de développer des techniques de caractérisation électrique, permettant d'étudier la faisabilité d'un capteur à transducteur Si/SiO2 pour la détection d'antigènes par mesures d'impédance électrique. Ces techniques ont été mises au point sur des structures Si/SiO2 nues, dont le comportement électrique théorique est connu. Les conditions expérimentales nécessaires à des mesures reproductibles et significatives ont pu être définies. L'importance du nettoyage de la surface de l'oxyde a été mise en évidence, ainsi que la nécessité de prendre en compte les erreurs dues aux limitations électroniques des appareillages de mesure d'impédance.

Les techniques de mesures de courant statique et quasistatique mises en œuvre se sont montrées très complémentaires des mesures d'impédance, en particulier pour juger de la bonne qualité du transducteur Si/SiO2 et de la cellule électrochimique. Les mesures d'impédance en fonction de la fréquence se sont avérées reproductibles uniquement en régime d'accumulation dans le silicium. Dans les régimes de désertion et d'inversion, des variations aléatoires trop importantes de la réponse électrique des structures ont notamment empêché l'exploitation de la modification de la tension de bandes plates, représentative d'une éventuelle variation de charge au sein des différentes couches greffées, et lors de la réaction anticorps-antigène.

A partir de mesures expérimentales d'impédance sur un très large domaine de fréquences (10mHz<f<100kHz), nous avons élaboré un modèle électrique des structures EOS polarisées en régime d'accumulation. Nous avons montré que leur réponse électrique est dominée par celle de la couche de SiO2, modélisée par une capacité en parallèle avec une résistance très élevée, rendant compte de sa très faible conductivité intrinsèque. Il est cependant nécessaire de prendre en compte une résistance série dont la valeur a été déterminée expérimentalement. Cette résistance est due principalement à l'électrolyte, mais l'électrode de référence, le substrat silicium et les connexions et les câbles y contribuent également. Ce modèle électrique équivalent simule parfaitement les variations du module et de la phase de l'impédance globale du système électrochimique sur toute la gamme de fréquences étudiée.

* * * * * * * * *

Le deuxième objectif de ce travail était d'appliquer ces techniques de caractérisation électrique à quelques capteurs, après chaque étape dans leur élaboration, c'est-à-dire après fonctionnalisation du transducteur, puis après couplage des anticorps, avant de procéder à des essais de détection d'antigènes.

L'étude des structures Si/SiO2 fonctionnalisées a tout d'abord permis de déterminer quelles couches de molécules organiques sont suffisamment stables électriquement pour servir à l'élaboration de l'immunocapteur. Les monocouches d'aminosilanes (C18) et de cyanosilanes (C4) se sont montrées très stables, contrairement au polysiloxane utilisé, élaboré par la technique SOL-GEL. Une hydrolyse insuffisante des monomères de départ lors de l'élaboration du polymère pourrait en être la cause. Un polymère est également beaucoup moins structuré

Conclusion

108

et dense qu'une monocouche de silanes, comme nous avons pu le constater lors des essais d'utilisation de la sonde mercure pour la prise de contact de grille, et peut beaucoup plus facilement subir des modifications structurales au cours du temps.

La caractérisation électrique des transducteurs fonctionnalisés nous a permis de constater que moins une couche de molécules est structurée et dense, moins elle se comporte comme un diélectrique parfait, et plus il devient important de tenir compte de sa résistance pour expliquer son comportement électrique. Ainsi, les aminosilanes longue chaîne forment des couches dont la résistivité a été évaluée à 1015Ω.cm, c'est-à-dire seulement 10 fois inférieure à celle du dioxyde de silicium. Bien que la présence de charges mobiles ait pû être mise en évidence, la résistance de ces couches est tellement élevée qu'elle peut être négligée dans le domaine de fréquences étudié, ce qui n'est pas le cas pour les polysiloxanes, dont la résistivité est environ 105 fois inférieure à celle des aminosilanes longue chaîne. Pour une fonctionnalisation de l'immunocapteur par monocouche, on comprend alors l'importance de s'intéresser à l'impédance totale du capteur, et pas seulement à la partie capacitive; en effet, les anticorps et les antigènes ne peuvent, de par leur configuration, former des couches denses et structurées et se comporter comme un diélectrique de très forte résistivité, modélisable par une simple capacité.

Parmi les couches de molécules étudiées permettant une bonne fixation des anticorps sur le transducteur, seuls les cyanosilanes courte chaîne se sont montrés stables électriquement. Deux types de capteurs, se différenciant uniquement par la nature des anticorps fixés, mais destinés à détecter deux antigènes de taille différentes, l'alfa-fœtoprotéine et le virus Dengue-2, ont donc été élaborés et caractérisés. Leur aptitude à détecter les antigènes a ensuite été testée.

Le couplage des anticorps au transducteur fonctionnalisé n'a engendré aucune modification significative de l'impédance de la structure dans le domaine de fréquences étudié (10mHz<f<100kHz), probablement à cause du caractère très hydrophile des protéines. La capacité électrique de la couche d'anticorps devient ainsi très grande et négligeable par rapport à celle du transducteur fonctionnalisé, tandis que sa résistance électrique devient très proche de celle de l'électrolyte, à cause de l'infiltration massive d'eau. Le modèle électrique équivalent des capteurs dans le domaine de fréquences étudié, se résume ainsi à celui de la structure EOS, la couche de cyanosilanes courte chaîne n'ayant pas non plus d'influence notable sur l'impédance de la structure Si/SiO2.

Ces capteurs n'ont cependant pas permis la détection des antigènes correspondants, que ce soit dans le cas de l'alfa-fœtoprotéine, ou dans le cas du virus Dengue-2. La présence d'anticorps sur le transducteur fonctionnalisé n'est cependant pas remise en cause. Une étude préalable a permis de confirmer qu'une structure Si/SiO2/cyanosilanes courte chaîne est capable de fixer des molécules présentant des groupements hydroxyles, ce qui est le cas des anticorps. De plus, des tests ELISA ont permis de vérifier la présence des anticorps sur le transducteur fonctionnalisé dans le cas du capteur d'alfa-fœtoprotéine, et la présence des antigènes sur le capteur de virus Dengue-2, après incubation.

* * * * * * * * *

Conclusion

109

Cette caractérisation électrique complète a permis de clairement identifier les difficultés associées à l'élaboration d'un capteur à transducteur Si/SiO2 pour la détection d'antigènes par mesures d'impédance électrique. Deux difficultés ont été rencontrées.

La première est liée à la mesure. En effet, l'impédance expérimentale de structures de type EOS (Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur) s'est avérée sensible à de nombreux paramètres. Leur capacité équivalente à moyennes et hautes fréquences s'est par exemple montrée particulièrement sensible à la présence d'impuretés à la surface du diélectrique, tandis que l'impédance basse fréquence est complètement modifiée par la présence de courants parasites. De grandes précautions sont donc nécessaires afin de distinguer les signaux réellement significatifs lors de la fixation d'antigènes sur le capteur.

La seconde et principale difficulté dans l'élaboration du capteur est liée à sa fonctionnalisation. Il existe une multitude de produits et de techniques utilisables, parmi lesquels il faut choisir ceux qui permettent l'obtention de capteurs à la fois électriquement stables et qui permettent la détection des antigènes. Nos travaux illustrent parfaitement ce problème. La fonctionnalisation du transducteur par des monocouches de silanes a donné lieu à des capteurs d'une excellente stabilité électrique, mais qui n'ont cependant pas permis la détection des antigènes. D'un autre côté, la fonctionnalisation du transducteur grâce à un polysiloxane a donné lieu à des structures d'une telle instabilité électrique, qu'elles ne peuvent en aucun cas servir à l'élaboration d'un capteur, alors qu'un tel mode de fonctionnalisation permettrait peut-être plus facilement la détection des antigènes.

C'est donc vers la mise au point de polymères électriquement stables que la recherche pourrait s'orienter. De par le caractère hydrophile des immunoespèces et la grande impédance du transducteur Si/SiO2, une fonctionnalisation par mococouche ne semble en effet pas appropriée à l'élaboration d'un capteur pour la détection d'antigènes par mesures de variations d'impédance. Il faut cependant noter que ce mode de fonctionnalisation pourrait être approprié si l'on s'oriente vers d'autres techniques électriques que la mesure d'impédance, comme par exemple la détection d'un courant transitoire en temps réel, pendant la réaction anticorps-antigène.

Annexe

Annexe : Rappels sur les systèmes électrochimiques classiques

112

Rappels sur les systèmes électrochimiques classiques

A. Définitions

Une électrode électrochimique est formée d'un conducteur électronique (métal, semiconducteur) en contact avec une solution électrolytique. Cependant le terme "électrode" est souvent utilisé pour désigner uniquement le conducteur électronique, et dans ce travail il est utilisé principalement dans ce sens.

Un système électrochimique est constitué de deux électrodes électrochimiques. Les deux électrodes peuvent avoir le même électrolyte ou avoir des électrolytes séparés par une membrane poreuse, évitant le mélange des solutions mais assurant un contact électrique.

B. Phénomènes dans un système électrochimique

Le transport de charges dans un électrolyte s'effectue grâce au mouvement d'ions, tandis que dans un conducteur électronique il est assuré par le mouvement des électrons. Lorsqu'un courant passe dans un système électrochimique il y a transfert d'électrons entre le conducteur électronique et les espèces en solution (oxydation ou réduction) (figure 53). Des couples redox différents sont mis en jeu aux deux électrodes.

Les trois principaux phénomènes se produisant dans une cellule électrochimique classique sont [60] :

• Transfert de masse : transfert des molécules de la solution vers la surface de l'électrode. • Adsorption/désorption d'espèces aux électrodes. • Transfert de charges : transfert d'électrons entre les espèces en solution et l'électrode.


ox

red ox

red

Diffusion des espèces réduites

Diffusion des espèces oxydées

e-

OXYDATION REDUCTION

électrolyte

conducteurélectronique

ox

ox

ox

redred

red

redox

red ox=> + ne-

redox =>+ ne-

figure 53 : Transport de charges dans un système électrochimique

Un processus impliquant un transfert d'électrons est dit faradique. Le transfert de charges est donc un processus faradique, contrairement à l'adsorption d'espèces qui est dit non faradique.

C. L'électrolyte

On distingue des électrolytes comprenant un couple redox et les électrolytes indifférents, où seul est présent un élément du couple redox. Pour les électrolytes comprenant un couple redox on peut définir un niveau de Fermi [61]. De tels électrolytes sont nécessaires si les effets faradiques sont importants dans le système. Dans le cas contraire un électrolyte indifférent suffit pour assurer le contact électrique.

D. Potentiel d'une électrode

Le potentiel d'un conducteur électronique plongé dans une solution comprenant un couple redox est donné par l'équation de Nernst :

E0 : Potentiel standard du couple redox

E E RTnF

oxred

= + ⋅0 ln [ ][ ]

R : Constante des gaz parfaits

n : nombre d'électrons mis en jeu dans la réaction rédox

F : constante de Faraday

[ox], [red] : concentrations en espèces oxydantes et réductrices

En cas de modification de la concentration de la solution en espèces oxydantes et réductrices, le potentiel de l'électrode change. C'est le cas d'un système électrochimique dans lequel passe un courant. Pour connaître le potentiel d'une électrode, il est alors nécessaire de le mesurer par rapport à une électrode de référence.

113


114

E. Electrodes de référence

Comme toute électrode, une électrode de référence est constituée d'un conducteur métallique en contact avec une solution électrolytique. L'électrolyte contient nécessairement un couple redox, et les concentrations en espèces oxydées et réduites doivent être fixes. Le potentiel de l'électrode de référence reste alors constant, quelle que soit la solution dans laquelle elle est plongée, et il est donné par l'équation de Nernst. Une membrane poreuse assure un contact électrique entre l'électrode de référence et l'électrolyte de la cellule de mesure.

Il existe plusieurs électrodes de référence. Elles peuvent être classées selon le pouvoir réducteur (ou oxydant) des couples redox qu'elles mettent en jeu. L'électrode normale à hydrogène (ENH), qui met en jeu le couple H2/H+, a été choisie comme référence absolue. Sa mise en œuvre est cependant complexe et l'on préfère en général utiliser d'autres électrodes, telle l'électrode au calomel saturé (ECS) dont le potentiel est de 244.4mV/ENH à 25°C.

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FOLIO ADMINISTRATIF THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

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NOM : SCHYBERG DATE de SOUTENANCE (avec précision du nom de jeune fille, le cas échéant) 12 Décembre 1996 Prénom : Catharina TITRE : Caractérisation électrique de structures Si/SiO2 nues et greffées de molécules organiques et biologiques,

en vue de l'élaboration d'un immunocapteur.

NATURE : Doctorat Numéro d’ordre : 96 ISAL 0113 Formation doctorale : Dispositifs de l'Electronique Intégrée

Cote B.I.U. -Lyon: T50/210/19 /. et bis CLASSE :

RESUME : La faisabilité d'immunocapteurs, constitués de structures Si/SiO2 greffées d'une membrane biologique contenant des anticorps, et permettant la reconnaissance des antigènes correspondants par mesure d'impédance électrique, a été étudiée. La mise au point d'immunocapteurs fiables nécessite une maîtrise parfaite de leurs propriétés électriques, en l'occurrence celles du transducteur Si/SiO2 et de la membrane biologique. Ainsi, notre principal objectif a été de développer les techniques de caractérisation électrique, adaptées à l'étude des capteurs, après chaque étape de leur élaboration. Les propriétés du transducteur Si/SiO2 conditionnent fortement le comportement électrique des futurs capteurs. En conséquence, une partie importante de notre travail a été consacrée à l'étude expérimentale des structures EOS (Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur). Le but de celle-ci n'a pas été d'effectuer une analyse poussée des défauts des composants, mais de déterminer la réponse électrique du dispositif dans des conditions de mesure diverses. Les conditions nécessaires à des mesures reproductibles, ainsi que les paramètres "parasites" pouvant modifier la réponse du dispositif mais ne provenant pas de la structure Si/SiO2 elle-même, ont été déterminées, et un modèle électrique du transducteur a été élaboré. L'application des techniques de caractérisation électrique aux transducteurs fonctionnalisés a permis de définir quelles couches de molécules sont suffisamment stables électriquement pour pouvoir servir à l'élaboration de la membrane biologique. Trois couches différentes ont été testées : des monocouches d'aminosilanes (C18) et de cyanosilanes (C4), ainsi qu'un polysiloxane élaboré par la technique SOL-GEL. Un modèle électrique de chaque couche a été élaboré. Les monocouches de silanes ont montré d'excellentes qualités diélectriques, et une bonne stabilité dans le temps, contrairement au polysiloxane. Deux types d'anticorps différents ont ensuite été couplés aux transducteurs fonctionnalisés, l'anti-alfa-fœtoprotéine et l'anti-Dengue-2, donnant ainsi deux capteurs différents. Un modèle électrique des capteurs entiers a été dérivé, et la détection des antigènes correspondants a été tentée. MOTS-CLES : capteur mesure, antigène, anticoprs, silicium, fonctionnalisation, greffage, impédance électrique, modélisation

Laboratoire (s) de recherches : Laboratoire de Physique de la Matière , UMR C5511

Directeur de thèse : PLOSSU Carole

Président de jury : PINARD Pierre Composition du jury : GABRIELLI Claude KOUDELKA-HEP Milena BARBIER Daniel MARTELET Claude JOUAN Alain PLOSSU Carole MANDRAND Bernard

Documents

Caractérisation électrique de structures Si/SiO2 nues et greffées de