Carences et toxicités Carences et toxicités métalliques chez les métalliques chez les végétaux supérieursvégétaux supérieurs

Caractérisation des réponses Caractérisation des réponses et adaptations physiologiques et adaptations physiologiques

et moléculaireset moléculaires

Antoine Gravot – Université Rennes 1

UMR 118 – Amélioration des Plantes et Biotechnologies Végétales

17 novembre 2010

Master 2 BioVIGPA

La pollution diffuse par La pollution diffuse par les éléments traces est les éléments traces est devenue un sujet de devenue un sujet de préoccupation pour les préoccupation pour les pouvoirs publics et les pouvoirs publics et les filières professionnelles filières professionnelles

Prasad 1995 J.Exp.Bot

Contamination des sols: transferts des sols vers les plantes 2007Anne Tremel-Schaub,Isabelle Feix

La communauté scientifique internationale La communauté scientifique internationale s’est largement investie depuis 15 ans sur s’est largement investie depuis 15 ans sur

des problématiques de relation des problématiques de relation organismes/polluants inorganiques et de organismes/polluants inorganiques et de

bioremédiationbioremédiationPlant AND metals >9000

La communauté scientifique internationale La communauté scientifique internationale s’est largement investie depuis 15 ans sur s’est largement investie depuis 15 ans sur

des problématiques de relation des problématiques de relation organismes/polluants inorganiques et de organismes/polluants inorganiques et de

bioremédiationbioremédiationPlant AND metal 1600

Les contraintes métalliques chez Les contraintes métalliques chez les végétaux supérieurs: un les végétaux supérieurs: un

thème plus large que la thème plus large que la phytoremédiation…phytoremédiation…

Le mot “métaux” évoque aujourd’hui essentiellement le champs lexical de la pollution:

•Métaux lourds

•Polluants métalliques

mais… il est permis d’élargir la discussion…

Aujourd’hui nous parlerons bien sûr des pollutions métalliques mais également de la carence ferrique et de la

toxicité de l’aluminium

planplan Eléments généraux de biologie métalliqueEléments généraux de biologie métallique Homéostasie du fer : indispensable, dangereux Homéostasie du fer : indispensable, dangereux

et pas très disponibleet pas très disponible La toxicité de l’aluminium, un enjeu majeur de La toxicité de l’aluminium, un enjeu majeur de

la croissance sur sols acidesla croissance sur sols acides De la ferveur biotec autour de la De la ferveur biotec autour de la

phytoextraction du cadmium à la phytoextraction du cadmium à la compréhension des mécanismes de compréhension des mécanismes de l’homéostasie du zincl’homéostasie du zinc

La tolérance au nickel : un modèle La tolérance au nickel : un modèle incontournable de biologie des milieux incontournable de biologie des milieux extrêmesextrêmes

M.L. Guerinot

L. Kochian

C. Cobbett, D.Salt

U. Kramer

Eléments généraux de biologie Eléments généraux de biologie des métauxdes métaux

Métaux: réseau métallique à l’état solide, tendance à céder des électrons

Métaux de transition : capacité à établir des coordinations avec N, O, C

Métalloïdes : caractéristiques intermédiaires avec les non-métaux

Eléments traces: de la croûte terrestre / des organismes < 100 ppm

Métaux lourds : éléments formant des précipités insolubles avec les sulfures OU densité OU 6g.ml-1/n°A>20…

Micropolluants métalliques: éléments traces métalliques toxiques

Eléments généraux de biologie Eléments généraux de biologie des métauxdes métaux

Eléments essentiels : la carence compromet le cycle de développement et de reproduction, on peut corriger la carence par fertilisation, la fonction biologique est connue

Eléments favorables : favorisent la croissance

Oligoéléments : éléments traces essentiels

Ordres de grandeur Ordres de grandeur A. thaliana - hydroponie

Valeurs référence (Epstein 1994) Racines Feuilles R/F

ppm ppm DW ppm DW ratio % MSmacroéléments N 5 000à 60 000 0.5 à 6%

Ca 1 000 à 60 000 8 026 36 432 0.2 0.1à 6 %K 8 000 à 80 000 54 620 29 612 1.8 0.8 à 8%S 1000 à 15 000 9 021 7 502 1.2 0.1à 1.5%

Mg 5 000 à 10 000 6 199 7 125 0.9 0.5 à 1%P 1 500 à 5 000 9 183 6 093 1.5 0.15 à 0.5 %

microéléments Cl 10 à 80 000Mn 10 à 600 3 848 336 11.4Fe 20 à 600 2 213 81 27.2Zn 10 à 250 504 72 7.0B 0.2 à 800 ND 39

Cu 2 à 50 40 9 4.5Mo 0.1 à 10Ni 0.05 à 5 68 6 12.4

non essentiels, souvent toxiques Al 0.5 à 500 213 17 12.5Cr 1.5 39.3 1.8 21.6Ag 4.9 0.4 12.7Cd 0.05 0.0 0.0

essentiels pour certaines plantes Na 10 à 80 000 1 304 570 2.3souvent bénéfiques Si 1 à 100 000

30-40% des protéines sont des 30-40% des protéines sont des métalloprotéinesmétalloprotéines

Eléments généraux de biologie Eléments généraux de biologie des métauxdes métaux

Métaux de transition et stress Métaux de transition et stress oxydatifoxydatif

Redox Haber Weiss ROS

Pas de cycle redox en conditions physiologiques…

Mais Cd/Hg/Ni provoquent la dépletion en glutathion + se substituent aux Cu ou au Fe

des métalloprotéines stress oxydatif indirect

Inégalité des stabilités des Inégalité des stabilités des complexes métalliques complexes métalliques série série

de Irving Williamsde Irving Williams Ca<Mn(II)<Fe(II)<Co(II)<Ni(II)<Cu(I)Ca<Mn(II)<Fe(II)<Co(II)<Ni(II)<Cu(I) Quelle que soit la nature du ligand (!)Quelle que soit la nature du ligand (!)

La prévention du chargement incorrect de métaux sur des métalloprotéines est le véritable enjeu il s’agit de maintenir des niveaux très faibles pour les métaux les plus compétitifs

•Transport membranaire/compartimentation

•Métallochaperones (à cuivre)

Transport membranaire: Transport membranaire: aspects éléctrochimiquesaspects éléctrochimiques

Des H+/ATPases acidifient la solution du sol, le Des H+/ATPases acidifient la solution du sol, le xylème, les vacuoles…xylème, les vacuoles…

Les cations diffusent spontanément vers le Les cations diffusent spontanément vers le cytoplasme cytoplasme l’exclusion cellulaire, la l’exclusion cellulaire, la séquestration vacuolaire et le chargement du séquestration vacuolaire et le chargement du xylème nécessitent un transport actifxylème nécessitent un transport actif

Equation de Nernst :Equation de Nernst :– Log (Ci/Co)=-z Log (Ci/Co)=-z E / 59 (à 25°C)E / 59 (à 25°C)– Ci concentration interneCi concentration interne– Co concentration externeCo concentration externe– z charge de l’élémentz charge de l’élément E potentiel membranaireE potentiel membranaire

Cf le chapitre du Hopkins (de boeck) sur l’assimilation des minéraux

--> Elements de reflexion sur la composition --> Elements de reflexion sur la composition de la solution nutritivede la solution nutritive

Solution Hoagland ppm racine theorique Valeurs référence feuillesRacines Feuilles

µMMasse molaire ppm dEnj-90mV -100 mV -110 mV ppm ppm FW ppm FW

macroéléments N (NO3-) 15000 14 210 6 4 3 Abs 5 000à 60 000Ca 5000 40 200 224 842 490 750 1 071 133 Ex 1 000 à 60 000 803 3643K 6000 39 234 7 846 11 591 17 125 Diff 8 000 à 80 000 5462 2961

S (SO4) 2000 32 64 0.06 0.03 0.01 Abs 1000 à 15 000 902 750Mg 2000 24 48 53 962 117 780 257 072 Ex 5 000 à 10 000 620 713P 1000 30 30 0.89 0.61 0.41 Abs 1 500 à 5 000 918 609

microéléments Cl 0.8 10 à 80 000Mn 10.7 55.0 0.59 659 1437 3137 10 à 600 385 34Fe 27.0 55.0 1.49 1669 3644 7953 20 à 600 221 8Zn 1.4 65.0 0.09 102 222 484 10 à 250 50 7B 32.3 10.8 0.35 0.010 0.007 0.005 0.2 à 800 4

Cu 0.4 63.5 0.03 0.9 1.3 1.9 2 à 50 4 1Mo 1.2 0.1 à 10Ni 0.1 59 0.01 6.6 14.5 31.6 0.05 à 5 7 1

non essentiels, souvent toxiques Al 0.01 27 0.00 10.2 32.8 105.8 0.5 à 500 21 2Cr 1.5 4 0Ag 0 0Cd 1 112 0.11 126 275 600 0.05 0 0

essentiels pour certaines plantes Na 54 23 1.24 41.6 61.5 90.9 10 à 80 000 130 57souvent bénéfiques Si 1 à 100 000

Eléments traces: Eléments traces: l’engorgement racinaire est la l’engorgement racinaire est la

règle générale règle générale A. thaliana - hydroponieValeurs référence

(Epstein 1994) Racines Feuilles R/Fppm ppm DW ppm DW ratio % MS

macroéléments N 5 000à 60 000 0.5 à 6%Ca 1 000 à 60 000 8 026 36 432 0.2 0.1à 6 %K 8 000 à 80 000 54 620 29 612 1.8 0.8 à 8%S 1000 à 15 000 9 021 7 502 1.2 0.1à 1.5%

Mg 5 000 à 10 000 6 199 7 125 0.9 0.5 à 1%P 1 500 à 5 000 9 183 6 093 1.5 0.15 à 0.5 %

microéléments Cl 10 à 80 000Mn 10 à 600 3 848 336 11.4Fe 20 à 600 2 213 81 27.2Zn 10 à 250 504 72 7.0B 0.2 à 800 ND 39

Cu 2 à 50 40 9 4.5Mo 0.1 à 10Ni 0.05 à 5 68 6 12.4

non essentiels, souvent toxiques Al 0.5 à 500 213 17 12.5Cr 1.5 39.3 1.8 21.6Ag 4.9 0.4 12.7Cd 0.05 0.0 0.0

essentiels pour certaines plantes Na 10 à 80 000 1 304 570 2.3souvent bénéfiques Si 1 à 100 000

Les racines sont souvent les premières victimes des intoxications métalliques

Homéostasie du ferHoméostasie du fer

Indispensable, dangereux et Indispensable, dangereux et pas très disponiblepas très disponible

Indispensable mais pas très Indispensable mais pas très disponibledisponible

Guérinot 1994 Plant Physiology

Régions calcaires = 1/3 de la surface

Acidification de la rhizosphère

Réduction du Fe(III) en Fe(II) plus soluble

Chélation

Modèle il y a 15 ansModèle il y a 15 ans

Stratégie IStratégie I

Lòpez-Bucio 2003 Current Opinion in Plant Biology, 6:280–287

Acidification de la rhizosphère

indicateur de pH coloré (Bromocresol pourpre)

Equipe de Marschner dans Plant Physiol. (1984) 76, 603-606

Architecture racinaire

Implication d’une réduction du Implication d’une réduction du FeFe3+ 3+ avant absorptionavant absorption

Expériences de Chaney et Brown Expériences de Chaney et Brown (1971, Plant Physiology)(1971, Plant Physiology)– Chélation spécifique du Fe2+ par le

BPDS supprime l’absorption de Fer – Chélation spécifique du Fe3+ par le

EDDHA n’a pas d’effet sur l’absorption de fer

Guérinot PNAS | May 1, 2007 | vol. 104 | no. 18 | 7311-7312

Clonage de IRT1Clonage de IRT1 Equipe ML GuérinotEquipe ML Guérinot

– Complémentation fonctionnelle du Complémentation fonctionnelle du mutant mutant fet3fet4 fet3fet4 à partir d’une banque à partir d’une banque de cDNAde cDNA 6 clones, tous identiques IRT1, non-6 clones, tous identiques IRT1, non-

homologues de FET3/FET4homologues de FET3/FET4

Eide et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 May 28;93(11):5624-8

Iron

Le mutant confirme la Le mutant confirme la fonction…fonction…

Clonage de FRO2 (Equipe ML Clonage de FRO2 (Equipe ML Guérinot)Guérinot)

Primers sur les zones Primers sur les zones conservées de conservées de gp91phox et FRE1 gp91phox et FRE1 fragment fragment criblage criblage d’une banque de cDNA d’une banque de cDNA FRO2 et FRO1 FRO2 et FRO1

Criblage de mutants Criblage de mutants déficients pour déficients pour l’activité ferric chelate l’activité ferric chelate reductase reductase clonage clonage positionnel de positionnel de frd1frd1

La surexpression de La surexpression de FRO1 complémente FRO1 complémente frd1frd1

Robinson NATURE | VOL 397 | 1999

Ajout à nouveau de Fer 100µM

Vert et al. Plant Physiology, June 2003, Vol. 132, pp. 796–804

L’homéostasie du Fer…et les L’homéostasie du Fer…et les conséquences indirectes sur le conséquences indirectes sur le

ionomeionomeIRT1

Baxter 2009 PNAS

Compétition Fe / Cd pour Compétition Fe / Cd pour IRT1IRT1

Design de sélectivité pour IRT1Design de sélectivité pour IRT1

Rodgers et al. PNAS 2000 97 (22) 12356–12360

Le design et l’expression chez le riz Le design et l’expression chez le riz d’une ferric reductase efficiente à pH d’une ferric reductase efficiente à pH élevé augmente la tolérance aux sols élevé augmente la tolérance aux sols

calcairescalcaires

Ishimaru PNAS 2009

Absorption du fer : stratégie Absorption du fer : stratégie IIII

Les graminées sont très tolérantes aux Les graminées sont très tolérantes aux carences en fercarences en fer redevable à la stratégie II : forte corrélation redevable à la stratégie II : forte corrélation

entre la quantité de sidérophores relargués et entre la quantité de sidérophores relargués et la tolérance aux carences en fer (Marschner la tolérance aux carences en fer (Marschner 1995)1995)

– Exeption : Le riz ne relargue pas beaucoup de Exeption : Le riz ne relargue pas beaucoup de sidérophores sidérophores sensible aux carences en fer sensible aux carences en fer

Guérinot Nature Biotechnology  19, 417 - 418 (2001)

Guérinot PNAS | May 1, 2007 | vol. 104 | no. 18 | 7311-7312

YS1YS1

Mutant YS1 décrit en 1929 par Beadle

1990 : déficience pour le transport de phytosidérophores

2001 : clonage du gène ZmYS1 à l’aide d’une banque de mutants de transposons

Confirmation fonctionnelle par Confirmation fonctionnelle par complémentation du mutant complémentation du mutant

fet3fet4fet3fet4

BPDS séquestration du

Fer libre

Conjugué Fer-phytosidéropho

re

YS1 s’exprime à la fois dans les YS1 s’exprime à la fois dans les feuilles et les racinesfeuilles et les racines

Roberts et al. (2004) Plant Physiology 135: 112–120

Immunoblot avec des anticorps anti-YS1

Et quand même…le mutant Et quand même…le mutant chloronerva chloronerva ??

Expériences de greffe (1960) substance mobile dont l’absence est responsable du phénotype

Identification du NA : 1974 Kristensen

Identification : la nicotianamine (1980 Phytochemistry)

Clonage positionnel (1999)

chloronervachloronerva

Expériences de greffe (1960) substance mobile dont l’absence est responsable du phénotype

Identification : la nicotianamine (1980 Phytochemistry)

Clonage positionnel (1999)

Modèle aujourd’hui SIModèle aujourd’hui SI

Palmer & Guerinot 2009

Modèle aujourd’hui SIIModèle aujourd’hui SII

Palmer & Guerinot 2009

La toxicité de La toxicité de l’aluminium, l’aluminium,

un enjeu majeur de la un enjeu majeur de la croissance sur sols acidescroissance sur sols acides

Contexte agricoleContexte agricole

Sols acides = 40 % terres arablesSols acides = 40 % terres arables Nombreux facteurs d’acidification des sols Nombreux facteurs d’acidification des sols

cultivéscultivés 2 problèmes majeurs : 2 problèmes majeurs :

– faible disponibilité en Pfaible disponibilité en P– Forte disponibilité en AlForte disponibilité en Al

Grande variabilité génotypiqueGrande variabilité génotypique– Forte corrélation entre les caractères de Forte corrélation entre les caractères de

tolérance aux sols acides / aluminiumtolérance aux sols acides / aluminium– Variétés tolérantes pour bcp de plantes Variétés tolérantes pour bcp de plantes

cultivéescultivées

Symptômes racinairesSymptômes racinaires Al3+ Al3+ gradient gradient

electrochimique très electrochimique très favorable à l’absorptionfavorable à l’absorption

Mécanismes de toxicité Mécanismes de toxicité mal connus mal connus – Action sur les pectinesAction sur les pectines

Rôle majeur des acides Rôle majeur des acides organiques dans la organiques dans la tolérancetolérance

Ma et al. 2001

Chélation Chélation intracellulaireintracellulaire

Barcelo 2002

Chélation extracellulaireChélation extracellulaire

2004 : Clonage d’2004 : Clonage d’ALMT1 ALMT1 codant un codant un canal malate racinaire activé par canal malate racinaire activé par

l’aluminiuml’aluminium

Cloné chez le blé, surexprimé chez l’orge

Delhaize 2004 PNAS