CAT: Flowcytometrische analyse van het TCR-Vß - UZ Leuven

CAT:Flowcytometrische analyse van het TCR-Vβ repertoire

Apr. Annelies Brouwers6 december 2005

Klinisch/diagnostisch scenarioVraagstellingCritical appraisal

Analytische performantieDiagnostische performantieKlinische impactKostprijs: binnen en buiten labo

Studie GasthuisbergTo Do

Overzicht

Klinisch/diagnostisch scenariotoepassing = aantonen (opvolgen) van monoclonaliteitbij patiënten met een verdachte T-cel proliferatie

mature (= post-thymus) T-cel maligniteit

indeling cfr WHO classificatie= heterogene groep !

Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17: 2254-2317

Leukaemic / disseminated

T-cell prolymphocytic leukemia

T-cell large granular lymphocytic leukaemia

Aggressive NK cell leukemia

Adult T-cell leukemia

Cutaneous

Mycosis fungoides

Sézary syndrome

Primary cutaneous anaplastic

large cell lymphoma

Lymphomatoid papulosis

Other extranodal

Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type

Enteropathy-type T-cell lymphoma

Hepatosplenic T-cell lymphoma

Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma

Nodal

Angioimmunoblastic T-cell lymphoma

Peripheral T-cell lymphoma, unspecified

Anaplastic large cell lymphoma

Neoplasm of uncertain lineage/differentiation

Blastic NK cell lymphoma

WHO histological classification of mature T-cell and NK-cell neoplasms

Uit: Jaffe ES and Ralfkiaer E. Mature T-cell and NK-cell neoplasms. Pathology & Genetics. Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. WHO Classification of Tumours. IARCPress 2001

lymfoomcellen in perifeer bloed / beenmerg

=> T-PLL, T-LGL, AILD, T-NHL

diagnose = multidisciplinair

labo hematologie

aantonen monoclonaliteit = essentieel

principe: alle cellen uit 1 ontaarde cel

zelfde TCR genherschikking

expressie zelfde Vβ domein

meerderheid TCRαβ (2-15% TCRγδ)

herschikkingen specifieke sequentie (TCRD/G/B/A)

moleculaire diagnostiek

immuun fenotypering

herschikkingen binnen TCRB

> 98% TCR genherschikking aanwezig





Overzicht

Vraagstelling

Aanvraagpatroon?Correlatie resultaten moleculaire technieken? Voordelen? Meerwaarde?

? Flow van het Vβ repertoire behouden of niet ?

reagentiaprobleem, parallele analyse op CME, ….

Overzicht




Analytische performantie

Testprincipe= flowcytometrische analyse

21 MoAb tegen variabele domeinen van de TCRβ ketendetectie ± 70% humane TCR-Vβ repertoireFITC- of RPE fluorescente labelingpooling in 7 reactietubes telkens 10-15% reactiviteit+ CD3-PerCP => T-lymfocyten subpopulatie

directe versus indirecte detectieopvolging (indien mogelijk): specifieke Vβ MoAb + CD3-PerCP

Interpretatie TCR-V-beta mix analyses

1° stap 2° stap (eventuele 3° stap)

totaal % reactieveCD3+ T-cellen type distributiepatroon actie type distributiepatroon

>75% sterk verhoogde positiviteit met 1 mix

uitsplitsen van de mix positiviteit met 1 MoAb passend bij een onderliggend

monoclonaal T-cel proces

normale positiviteit met alle mixen (*) X X

polyclonaal reactiepatroon: een onderliggend

monoclonaal T-cel proces is weinig waarschijnlijk

sterk verhoogde positiviteit met 1 mix

uitsplitsen van de mix positiviteit met 1 MoAb

verdacht voor een onderliggend monoclonaal T-

cel proces

<50%sterk verlaagde

positiviteit met alle mixen

X X

verdacht voor een onderliggende T-cel

pathologie, die echter niet reageert met de gebruikte

MoAb

50-75%

interpretatie

Uit: Kwaliteitshandboek, SOP-090-Flowcytometrie

Preanalytische aspecten

Collectiemateriaal diagnose: PBopvolging / staging: PB, BM, LVEDTA / heparine

Staalstabiliteit idealiter binnen 48u (aspecifieke binding ↑)

Patiëntvariabelen andere pathologieën met “geskewed” repertoire- auto-immuunziekten- 1° immuundeficiënties- immuunreactie microbiologische / tumor antigenen

leeftijd (TCUS?)

Testaanvraag in sequentie met “routine” immuunfenotypering

Analytische aspecten

weinig gegevens !

detectielimiet ?

afhankelijk van grootte T-cel expansiepolyclonale achtergrondreactiviteit Vβ MoAb

T-cel expansie > 20% (of 40%) CD3+ cellen of > 2.0x10*9 cellen/L

combinatie met andere (aberrante) markers (tot 5%?)

TATmaximaal 72u (of 96u met inbegrip van routine immuunfenotypering)

Referentiewaardenvan den Beemd et al.

reactiviteit 21 Vβ MoAb in gezonde donorenneonataal navelstrengbloed tot PB > 70jCD3+ cellen (CD4 en CD8 subpopulaties)

variabele cut-off (2-3 SD, > 20%, # x ULN)

Vβ MoAbselectie (literatuur) of commerciële kit (IOTest® Beta Mark)

Moleculaire diagnostiek

Southern blotting PCR

gen TCRG, TCRB, TCRD TCRG, TCRB, TCRD

analytische sensitiviteit 5 – 10% ANCTCRD: 0.5-10% ANCTCRB: 1–10% ANC TCRG: 1-10% ANC

Genescanning: 0.5-5% ANCHeteroduplex: 1-10% ANC

arbeidsintensief ja (meerdere digesties, hybridisaties) minder

TAT 1-2 maanden 1 (-2) weken

staal veel, hoog kwalitatief DNA veel minder DNA (ook vriescoupes, klein biopt)

Southern blotting = gouden standaard ?TCR genherschikking => ∆ restrictiefragmentlengteoptimale keuze probes / restrictie-enzymes

PCR amplificatie van alle herschikte VDJ-segmentenonderscheid clonaal versus polyclonaal met aanvullende technieken (o.a. heteroduplex, GeneScan analyse)

Standaardisatie: BIOMED-2 multiplex PCR-protocol (TCRG/D/B)

op CME: diagnose (PCR TCRG + ev SB)

opvolging (PCR TCRG)

protocol cfr Theodorou (denaturing gradient gel electrophoresis)


Diagnostische performantie

beperkt aantal studies !kleine patiëntengroepen, heterogeen, zeldzamere pathologie

# pathologie PCR SB Vβ MoAb

TCRB TCRG TCRB

van den Beemd 2000 5 T-LGL, T-CLL 1(/1) 4(/4) 4 + 1

Langerak 2001 47 T-LGL, T-CLL, T-PLL, T-NHL, SS, T-AILD 42(/42) 47 31+16

Morice 2004 27 nl 4 0(/17) 1

9 reactief 2 2 0

29 CTCL, T-LGL, PTCL, T-PLL, TCLPD 26 13(/13) 26

Beck 2003 14 T-LGL 12(/12) 14

13 SS, T-PLL, T-NHL 12 13

16 reactief 9 2(/13)

Lima 2001 98 mono/poly/oligo LGL 58/11/29 58/11/29 71/23/4

Sensitiviteit (direct + indirecte detectie) 93-100%Specificiteit (voor maximale sensitiviteit) 80-88%

Moleculaire diagnostiek

studies BIOMED-2 multiplex PCR-protocolsensitiviteit

vals-negatieven = zeer beperkt (slechte primer annealing)specificiteit / vals-positieven ??? (pseudo-clonaliteit)

# PCR SB

TCRB TCRG TCRB+TCRG TCRB/G/D

van Dongen 2003 18 94% 89% 100% 100%

Sandberg 2005 150 87% 86% 100% 89%

Klinische impact

Diagnose: ≠ “klassieke” diagnostische test

andere argumenten voor een maligniteit?

maligniteit versus polyclonale/oligoclonale expansiemonoclonale, reactieve expansieocculte maligniteit

monoclonaliteit ≠ maligniteit, maar wel een noodzakelijk voorwaarde !

“diagnostische challenge”dwz zoveel mogelijk argumenten verzamelen

??

Behandeling/Follow-up:

juiste diagnosestelling maar dit impliceert niet rechtstreeks een behandeling

“verdachte” patiënt opvolgen met betrekking tot verdere evolutie

opvolging met flowcytometrie beperkt tot case-reportsinterpretatie? implicatie?

Prognose/Health outcome:

juiste diagnosestelling maar verder ????

! gebrek aan studies !

Kostprijs: binnen en buiten laboActuele kost:Diagnose: 312€ - 393€ (afhankelijk van hoeveel Vβ MoAb in mix)Opvolging: 43€

Nomenclatuur:RIZIVnummer 555730-555741 (1e antigen): B500 (13.99€)RIZIVnummer 556474-556485 (volgende antigenen met max.12):

B400 (11.20 € x 12 = 134.4 €)

Financiële impact elders: geen kosten-batenanalyses

CME: aparte nomenclatuur ongeveer 300€ voor alle moleculaire testen op een bepaald staal versus 40-80€/PCR




Overzicht

Studie Gasthuisberg

Flow Vβ repertoire januari 2001 – oktober 2005 (retrospectief):

131 analyses / 61 patiëntenCME (zelfde patiënten): 78 analyses / 26 patiëntenvergelijkbare data: 46 stalen / 26 patiënten

=> geen echte systematiek in de aanvraag

correlatie voor 43 stalen (3 extractieproblemen / 2 LV)diagnose (16 stalen) en opvolging (27 stalen / 16 patiënten)

Diagnose stalenpatiënt staal Immunfenotype Vbeta MoAb % ANC SB delta SB gamma SB beta PCR gamma Diagnose

1 DL85 bloed CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56neg 5.1 (48%) 27% - ?

2 PF39 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56neg 5.1 (80%) 34% g r r + T-LGL

3 LH68 bloed CD2/5/78//57neg/ab/16neg/56neg 5.1 (37%) 22% + T-LGL

4 ML30 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56 5.1 (90%) 60% g r r + T-LGL

5 AS94 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16/56 3 (55%) 15% g g g - T-LGL

6 DM47 beenmerg CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg 14 (34%) 26% g r r - T-LGL

7 HW48 beenmerg CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg 13.1/3 (86%) 62% r g r + T-PLL

8 JA29 beenmerg CD2/5/7/4/ab/16neg/56 1 (70%) 46% g r r + T-PLL

9 TM31 bloed CD2/5/7/4/8/57/ab/16neg/56 28% g g r + T-LGL

10 WM15 bloed CD2/5/7neg/8/57/ab/16neg/56neg 49% g r r + T-LGL

11 MJ30 beenmerg CD2/5/7/8/ab/16neg/56neg - g g g + asep. lymf.mening.

12 VHT24 beenmerg CD2/5/7/4/57neg/ab/16neg/56neg - g g g - AML

13 VMA37 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56 - - T-LGL

14 LE64 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16/56 36% + T-LGL

15 HN42 beenmerg CD2/5/7/4/57/ab/16neg/56neg - g g g - anaplastisch T-NHL

16 VDPJ39 bloed CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg - g g g - CLL

VG: sarcoïdose (IS)

klinisch verdacht, APO suggestief?, therapie met goede respons

? cfr Boeckx et al.

vals negatieve PCR en SB

vals negatieve PCR

vermoeden cerebraal lymfoom (parese); géén vermelding in verslag?

vals positieve PCR

n = 16 PCR + PCR -

Flow + 8 3

Flow - 1 4

n = 12 SB + SB -

Flow + 7 1

Flow - 0 4

Diagnostische stalen

Follow-up stalen (1)patiënt staal Vbeta MoAb % ANC SB delta SB gamma SB beta PCR gamma Diagnose

1 PF39 CSF 5.1 (32%) 27% extractie T-LGL

2 LH68 bloed 5.1 (43%) 22% + T-LGL

3 MA58 bloed 5.1 (79%) 39% + T-NHL

4 MA58 bloed 5.1 (77%) 37% g r g + T-NHL

5 MA58 beenmerg 5.1 (56%) 9% g g g - ?

6 VCA31 bloed 5.1 (49%) 8% + T-LGL

7 PF43 beenmerg 1 (26%) 12% ip ip ip - M.Kahler

8 PF43 beenmerg 1 (16%) 4% g g g M.Kahler

9 VRP42 bloed 8.1/8.2 (19%) 6% g r r + T-LGL

10 RR33 bloed 8.1/8.2 (30%) 15% + T-NHL

11 RR33 bloed 8.1/8.2 (30%) 8% - T-NHL

12 RR33 bloed 8.1/8.2 (45%) 25% - T-NHL

13 TS34 bloed 5.2/5.3 (64%) 38% g r r + T-LGL

14 AS94 beenmerg 3 (7%) <1% - T-LGL

15 AS94 beenmerg 3 (7%) <1% - T-LGL

vermoedelijk indolent T-NHL, PB PCR en SB+, uiteindelijk behandeld

vals positieve flowgeassocieerde T-LGL ?

vroegere en latere PB PCR en SB +

afwachtende houding

vals negatieve PCR

16 AS94 beenmerg 3 (12%) 7% - T-LGL

17 AS94 beenmerg 3 (65%) 38% + T-LGL

18 AS94 Beenmerg 3 (54%) 15% + T-LGL

19 AS94 Beenmerg 3 (75%) 40% + T-LGL

20 TE37 Beenmerg 5.1(14%) 6% - MGUS/CLL

21 DM47 CSF 14 (47%) 39% extractie T-LGL

22 DM47 beenmerg 14 (19%) 10% extractie T-LGL

23 DM47 beenmerg 14 (41%) 27% g r r - T-LGL

24 HW48 beenmerg 13.1/3 (39%) 1.5% + T-PLL

25 HW48 beenmerg 13.1/3 (91%) 87% + T-PLL

26 VNM43 bloed mix 4 (71%) 46% + T-LGL

27 FI43 beenmerg - + ?

28 JA29 beenmerg 1 (91%) 88% + T-PLL

29 VHT24 beenmerg - - AML

30 CJ39 beenmerg 17 (98%) 96% + T-NHL

Follow-up stalen (2)

geassocieerde T-LGL?

PB: PCR-, SB ip

?

vals negatieve PCRVG: mammaca eerder eerder PCR + op bloed en BM; behandeling gestopt wegens geen effect, nu opvolging

?

n = 16 PCR + PCR -

Flow + 8 3

Flow - 1 4

n = 12 SB + SB -

Flow + 7 1

Flow - 0 4

n = 26 PCR + PCR -

Flow + 15 6

Flow - 1 4

Diagnostische stalen

Follow-up stalen

n = 6 SB + SB -

Flow + 4 2

vals positieve PCR

?

⇒ goede diagnostische sensititviteit (hoge NPV)

⇒ meeste discordanties op beenmerg

Vraagstelling …….

Andere centra?UZ Gent, UZA, ….: enkel moleculaire diagnostiek

Erasmus MC Rotterdam: moleculaire diagnostiek én flowmomenteel nog in onderzoeksfase doel = sequentieel testen

flow negatief: stopflow positief: stopflow twijfelachtig: moleculaire diagnostiek

geen opvolging dmv flow

toegepast op onze data ……????

Samenvattend …….

VOORgoede diagnostische sensitiviteit => eerste screeningrelatief beperkte TAT (snel uitsluiten)diagnostische challengecomplementaire infogeen optimale moleculaire diagnostiek (enkel PCR TCRG)minder expertise nodigkwantificering mogelijk (opvolging onder therapie)

TEGENgroot aantal Vβ MoAbDNA versus eiwit niveauenkel Vβ (geen TCRγδ) indirecte detectie (70% repertoire)nog steeds moleculaire bevestiging nodig?hogere analytische gevoeligheid (quidopvolging?)ook op biopsie (klier, ander weefsel)betere terugbetaling?

To Do …….Overleg met hematologen over al dan niet afschaffen van

flowcytometrische analyse Vβ repertoire

Indien behoud, intern aandacht voor gebruik van perifeer bloed bij diagnose

Indien behoud, overleg omtrent rationalisering van de aanvraag met hematologen en CME

Indien behoud, alternatieve reagentia (IOTest® Beta Mark) evalueren (intern)

Documents

CAT: Flowcytometrische analyse van het TCR-Vß - UZ Leuven