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Cellules souches Cellules souches Neuroblastes Neuroblastes Précurseurs en Précurseurs en différenciation différenciation ZMC = zone marginale ciliaire ZMC ZMC Epithélium Epithélium pigmenté pigmenté Rétine neurale Rétine neurale Nerf Nerf optique optique Cristallin Cristallin Etude du transcriptome des cellules souches rétiniennes Candidats potentiels déjà disponibles Musashi: nrp1, xrp1: voir partie “RNA binding proteins” Cascade Hedgehog: voir poster Hedgehog, Amato et al. Crible par hybridation in situ chez tropicalis A B C D E F G H A B C D E F G H Chez les amphibiens, la rétine croît pendant toute la vie de l’animal par addition de nouvelles cellules de tous types au niveau de la zone marginale ciliaire. La ZMC est la région annulaire située aux extrémités de la rétine, composée de cellules souches, de rétinoblastes et de précurseurs neuraux en différenciation. La ZMC est non seulement accessible pour des analyses expérimentales pendant toute la vie de l’animal, mais a aussi l’avantage exceptionnel de présenter des cellules ordonnées spatialement selon le développement et la différenciation cellulaire. Jusqu’en 2000, les cellules souches de la rétine avaient été identifiées uniquement dans la ZMC des poissons et des amphibiens. Cependant, il a récemment été montré que l’épithélium pigmenté du corps ciliaire de la rétine des mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes. OBJECTIF Etant données les applications potentielles des cellules souches rétiniennes dans des interventions thérapeutiques de dystrophies rétiniennes, il est important de caractériser davantage ces cellules souches rétiniennes au niveau moléculaire. Notre projet constiste donc à: rechercher par hybridation in situ des gènes exprimés dans les cellules souches de la ZMC de la rétine de xénope étudier le rôle de ces gènes dans la maintenance et le potentiel de différenciation de ces cellules souches rétiniennes Intérêts du xénope: Approche in vivo Approche à grande échelle Banque de rétine et de cerveaux de bourgeons caudaux de Xenopus tropicalis Séquençage (Génoscope) de 30 000 clones Assemblage des séquences (N. Pollet; R. Thuret): 5- 6000 gènes Préparation des sondes et crible in situ Amplification par PCR des clones d’une plaque 96 puits Transcription des sondes DIG anti- sens Hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus tropicalis et coupes au vibratome des embryons présentant une expression dans l’œil Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés Détermination des cellules rétiniennes Les précurseurs rétiniens sont à l’origine de la rétine neurale et de l’épithélium pigmenté rétinien. La rétine neurale contient six types de neurones (cônes, bâtonnets, amacrine, bipolaire, horizontale et ganglionnaires) et un type de cellules gliales (Müller). XHes2 Groucho helix loop helix orange HC WRPW basique LES CONSTRUCTIONS HES2 XHes2- WRPW (dominant négatif) XHes2- WRPW-VP16 (antimorphe) domaine d’activation de VP16 WRPW VP16 Témoin XHes2 60 70 80 2 4 Cellules de Muller ganglionnaire amacrine bipolaire horizontale photorecepteur Müller Témoin 1244 cellules 11 rétines XHes2 939 cellule s 13 rétines % de cellules Types cellulaires: 0 20 40 60 80 * * * * * * * * * * * * * * * WRW VP16 Témoin 0 10 20 30 40 * * * * * * * * * * * * * * * * * ganglionnaire amacrine bipolaire horizontale photorecepteur Müller OBJECTIF Dans le but de mieux comprendre les cascades géniques impliquées dans le choix de la destinée de ces précurseurs rétiniens, nous avons étudié les rôles joués par les cascades de signalisation Hedgehog et Notch/Delta, ainsi que le rôle joué par des facteurs post-transcriptionnels. Amato, M.A., K. Koebernick, T. Pieler, W.A. Harris and and Perron, M. Hedgehog signaling controls the maintenance of stem cell/progenitor proliferation in Xenopus retina. Soumis. Amato, M.A., Boy, S., Arnault, E., A, Girard, M., Sharif, A., Dellapuppa, A. and Perron, M. (2005). Comparison of the expression patterns of five neural RNA binding proteins in the Xenopus retina. J Agnès, F. and Perron, M. (2004). RNA binding proteins and neural development: a matter of targets and complexes. NeuroReport . 15(17):2567-70. Amato M.A., Arnault E. and Perron M. (2004) . Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences. Int. J. Dev. Biol. "Eye development" special issue 48: 993-100. Boy S., Souopgui J., Amato M.A., Wegnez M., Pieler T. and Perron M. (2004) XSEB4R, a novel RNA-binding protein involved in retinal cell differentiation downstream of bHLH proneural genes. Developme Amato M.A., Boy S. and Perron M. (2004) Hedgehog signalling in vertebrate retinal development: a growing puzzle. Cell Mol Life Sci 61:899-910. Perron M, Boy S, Amato MA, Viczian A, Koebernick K, Pieler T, Harris WA. (2003). A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development 130:1565-77. Ohnuma S, Mann F, Boy S, Perron M, Harris WA. (2002). Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods 28:411-9. RNA binding proteins RRM 1 Xseb4R nrp-1 xrp1 elrB, C, D etr-1 Musashi Elav/Hu Bruno RRM 3 RRM 2 RRM 1 RRM 1 RRM 2 Post-mitotic cells Dividing cells GCL IINL OINL PRL xrp1 Xseb4R nrp1 etr-1 nrp1 elrB elrC elrD 1 2 3 4 Xseb4R nrp1 elrB elrC elrD etr-1 Xrp1 hermes etr-1 xrp1 etr-1 Xseb4R nrp1 elrC nrp1 RPE nrp1 0 10 20 30 40 50 % of retinal cells * * * * * * * * * * * * * * * Ganglion cells Amacrine cells Bipolar cells Horizontal cells Photoreceptor cells Müller cells control 1799 cells Xseb4R 1630 cells * * * * control Mo 925 cells Xseb4R Mo 476 cells % of retinal cells Ganglion cells Amacrine cells Bipolar cells Horizontal cells Photoreceptors cells Müller cells 0 10 20 30 40 Ntubulin expressio n Control Mo Xseb4R Mo + DEX - DEX INDUCED AT ST 10,5 - 11 Technique de lipofection in vivo DNA + GFP DNA + Dot ap Expression du gène Xhes2 très régionalisée, dans les vésicules optiques et otiques Expression du gène Xhes2 dans la zone marginale ciliaire de la rétine Cascade de signalisation Notch/Delta: Étude d’un nouveau gène de la famille hairy/enhancer of split, Xhes2 « RNA binding proteins » urexpression de Xhes2 favorise la gliogenèse L’inhibition de Xhes2 diminue la gliogenèse L’inhibition de Xhes2 affecte la distribution des différents types de neurones XHES2 GLIOGENESE NEUROGENESE SPECIFICATION NEURONALE elrB, C, D xrp1 Nrp-1 Xseb4R Etr-1 Xseb4R est le premier facteur post-transcriptionnel, positionné dans la cascade de neurogenèse, à avoir un rôle dans la détermination des neurones rétiniens Expression du gène Xseb4R dans la zone marginale ciliaire de la rétine Laboratoire Gènes, Développment et Neurogenèse, UMR CNRS 8080 Bât. 445 Université Paris XI, 91405 ORSAY PUBLICATIONS collaboration avec E. Bellefroid (Belgique); K. Koebernick; M. Solter; Jacob Souopgui et Tomas Pieler (Allemagne) collaboration avec Nicolas Pollet; Raphaël Thuret; Qods Ymlahi Ouazzani et André Mazabraud La surexpression de Xseb4R dans la rétine a un effet proneural, sa perte de fonction a l’effet opposé Xseb4R aurait aussi un rôle “proneural” au cours de la neurogenèse primaire La distribution des “RNA binding proteins” dans la rétine suggère que, comme les facteurs de transcription, ces régulateurs post-transcriptionnels jouent des rôles importants à toutes les étapes de la rétinogenèse et dans tous les neurones rétiniens. M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache et M. Perron

Cellules souches Neuroblastes Précurseurs en différenciation ZMC = zone marginale ciliaire ZMC Epithéliumpigmenté Rétine neurale Nerfoptique Cristallin

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Page 1: Cellules souches Neuroblastes Précurseurs en différenciation ZMC = zone marginale ciliaire ZMC Epithéliumpigmenté Rétine neurale Nerfoptique Cristallin

Cellules souchesCellules souches

NeuroblastesNeuroblastes

Précurseurs enPrécurseurs endifférenciationdifférenciation

ZMC = zone marginale ciliaire

ZMCZMC

EpithéliumEpithéliumpigmentépigmenté

Rétine neuraleRétine neurale

NerfNerfoptiqueoptique

CristallinCristallin

Etude du transcriptomedes cellules souches rétiniennes

Candidats potentiels déjà disponibles

Musashi: nrp1, xrp1: voir partie “RNA binding proteins”

Cascade Hedgehog: voir poster Hedgehog, Amato et al.

Crible par hybridation in situ chez tropicalis

A B

C D

E F

G H

A B

C D

E F

G H

Chez les amphibiens, la rétine croît pendant toute la vie de l’animal par addition de nouvelles cellules de tous types au niveau de la zone marginale ciliaire. La ZMC est la région annulaire située aux extrémités de la rétine, composée de cellules souches, de rétinoblastes et de précurseurs neuraux en différenciation. La ZMC est non seulement accessible pour des analyses expérimentales pendant toute la vie de l’animal, mais a aussi l’avantage exceptionnel de présenter des cellules ordonnées spatialement selon le développement et la différenciation cellulaire.

Jusqu’en 2000, les cellules souches de la rétine avaient été identifiées uniquement dans la ZMC des poissons et des amphibiens. Cependant, il a récemment été montré que l’épithélium pigmenté du corps ciliaire de la rétine des mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes.

OBJECTIF

Etant données les applications potentielles des cellules souches rétiniennes dans des interventions thérapeutiques de dystrophies rétiniennes, il est important de caractériser davantage ces cellules souches rétiniennes au niveau moléculaire.

Notre projet constiste donc à:

rechercher par hybridation in situ des gènes exprimés dans les cellules souches de la ZMC de la rétine de xénope

étudier le rôle de ces gènes dans la maintenance et le potentiel de différenciation de ces cellules souches rétiniennes

Intérêts du xénope:

Approche in vivo

Approche à grande échelle

Banque de rétine et de cerveaux de bourgeons caudaux de Xenopus tropicalis Séquençage (Génoscope) de 30 000 clones Assemblage des séquences (N. Pollet; R. Thuret): 5-6000 gènes Préparation des sondes et crible in situ

Amplification par PCR des clones d’une plaque 96 puits

Transcription des sondes DIG anti-sens

Hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus tropicalis et coupes au vibratome des embryons présentant une expression dans l’œil

Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés

Détermination des cellules rétiniennes

Les précurseurs rétiniens sont à l’origine de la rétine neurale et de l’épithélium pigmenté rétinien. La rétine neurale contient six types de neurones (cônes, bâtonnets, amacrine, bipolaire, horizontale et ganglionnaires) et un type de cellules gliales (Müller).

XHes2 GrouchoGroucho

helix loop helix

orange HC

WRPW

basique

LES CONSTRUCTIONS HES2

XHes2-∆WRPW (dominant négatif)

XHes2-∆WRPW-VP16 (antimorphe) domaine d’activation de VP16

∆WRPW

VP16

Témoin

XHes2

60

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Cellules de Muller

gangl

ionnai

re

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Témoin1244

cellules11 rétines

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Types cellulaires:

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∆WRW

VP16

Témoin

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gangl

ionnai

re

amac

rine

bipol

aire

horizo

ntale

photor

ecep

teur

Mülle

r

OBJECTIF

Dans le but de mieux comprendre les cascades géniques impliquées dans le choix de la destinée de ces précurseurs rétiniens, nous avons étudié les rôles joués par les cascades de signalisation Hedgehog et Notch/Delta, ainsi que le rôle joué par des facteurs post-transcriptionnels.

Amato, M.A., K. Koebernick, T. Pieler, W.A. Harris and and Perron, M. Hedgehog signaling controls the maintenance of stem cell/progenitor proliferation in Xenopus retina. Soumis. Amato, M.A., Boy, S., Arnault, E., A, Girard, M., Sharif, A., Dellapuppa, A. and Perron, M. (2005). Comparison of the expression patterns of five neural RNA binding proteins in the Xenopus retina. J. Comp. Neurol. 481(4):331-9. Agnès, F. and Perron, M. (2004). RNA binding proteins and neural development: a matter of targets and complexes. NeuroReport . 15(17):2567-70. Amato M.A., Arnault E. and Perron M. (2004) . Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences. Int. J. Dev. Biol. "Eye development" special issue 48: 993-100. Boy S., Souopgui J., Amato M.A., Wegnez M., Pieler T. and Perron M. (2004) XSEB4R, a novel RNA-binding protein involved in retinal cell differentiation downstream of bHLH proneural genes. Development 131: 851-62. Amato M.A., Boy S. and Perron M. (2004) Hedgehog signalling in vertebrate retinal development: a growing puzzle. Cell Mol Life Sci 61:899-910. Perron M, Boy S, Amato MA, Viczian A, Koebernick K, Pieler T, Harris WA. (2003). A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development 130:1565-77. Ohnuma S, Mann F, Boy S, Perron M, Harris WA. (2002). Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods 28:411-9.

RNA binding proteins

RRM 1

Xseb4R

nrp-1xrp1

elrB, C, D

etr-1

Musashi

Elav/Hu

BrunoRRM 3RRM 2RRM 1

RRM 1 RRM 2

Post-mitotic cellsDividing cells

GCL

IINL

OINL

PRL

xrp1

Xseb4R

nrp1

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12

3

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Xseb4R

nrp1

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Xseb4R

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control Mo 925 cells

Xseb4R Mo 476 cells

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f re

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Ganglioncells

Amacrinecells

Bipolarcells

Horizontalcells

Photoreceptorscells

Müllercells

0

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Ntubulin expression

Control Mo Xseb4R Mo + DEX

- DEX

INDUCED AT ST 10,5 - 11

Technique de lipofection in vivo

DNA+

GFP DNA

+

Dotap

Expression du gène Xhes2 très régionalisée, dans les vésicules optiques et otiques

Expression du gène Xhes2 dans la zone marginale ciliaire de la rétine

Cascade de signalisation Notch/Delta:Étude d’un nouveau gène de la famille hairy/enhancer of split, Xhes2

« RNA binding proteins »

La surexpression de Xhes2 favorise la gliogenèseL’inhibition de Xhes2 diminue la gliogenèse

L’inhibition de Xhes2 affecte la distribution des différents types de neurones

XHES2

GLIOGENESE NEUROGENESE

SPECIFICATION NEURONALE

elrB, C, D xrp1 Nrp-1 Xseb4R Etr-1

Xseb4R est le premier facteur post-transcriptionnel, positionné dans la cascade de neurogenèse, à avoir un rôle dans la détermination des neurones rétiniens

Expression du gène Xseb4R dans la zone marginale ciliaire de la rétine

Laboratoire Gènes, Développment et Neurogenèse, UMR CNRS 8080Bât. 445 Université Paris XI, 91405 ORSAY

PUBLICATIONS

collaboration avec E. Bellefroid (Belgique); K. Koebernick; M. Solter; Jacob Souopgui et Tomas Pieler (Allemagne)

collaboration avec Nicolas Pollet; Raphaël Thuret; Qods Ymlahi Ouazzani et André Mazabraud

La surexpression de Xseb4R dans la rétine a un effet proneural, sa perte de fonction a l’effet opposé

Xseb4R aurait aussi un rôle “proneural” au cours de la neurogenèse primaire

La distribution des “RNA binding proteins” dans la rétine suggère que, comme les facteurs de transcription, ces régulateurs post-transcriptionnels jouent des rôles importants à toutes les étapes de la rétinogenèse et dans tous les neurones rétiniens.

M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache et M. Perron