CENTRE INTERNATIONAL D ETUDES SUPERIEURES ?· DOCTEUR DU CENTRE INTERNATIONAL D’ETUDES SUPERIEURES…

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    04-Jun-2018

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  • THESE

    Pour obtenir le grade de

    DOCTEUR DU CENTRE INTERNATIONAL DETUDES SUPERIEURES EN SCIENCES AGRONOMIQUES

    ECOLE DOCTORALE: SCIENCES DES PROCEDES SCIENCES DES ALIMENTSDiscipline : Biochimie et biologie molculaire

    Prsente et soutenue publiquement par

    Fida KHATER

    le 12 Juillet 2011

    IDENTIFICATION ET VALIDATION FONCTIONNELLE

    DE NOUVEAUX GENES POTENTIELLEMENT IMPLIQUES DANS LA

    BIOSYNTHESE DES COMPOSES PHENOLIQUES

    JURY

    Isabelle Debeaujon Charge de recherche INRA, Versailles Rapporteur

    Christian Chervin Professeur, ENSAT, Toulouse Rapporteur

    Eric Dubreucq Professeur, Montpellier SupAgro Examinateur

    Laurence Lesage-Meessen Charge de recherche, INRA Marseille Examinateur

    Nancy Terrier Charge de recherche INRA, Montpellier Examinateur

    Vronique Cheynier Directeur de Recherche, INRA Montpellier Directeur de thse

    CENTRE INTERNATIONAL DETUDES SUPERIEURES EN SCIENCES AGRONOMIQUES - MONTPELLIER SUPAGRO

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    ABSTRACT

    Grape proanthocyanidins (PA) play a major role in organoleptic properties of wine, being involved in astringency and color stability. They are accumulated in skin and seeds during early stages of berry development. Numerous structural genes involved in PA biosynthesis have been identified in various plant species including grapevine but some steps are still not documented.

    A previous transcriptomic study led to identify new genes putatively involved in the PA pathway in grape. These included genes coding for 3 glucosyltransferases and 2 glucose acyl transferases. The objective of this work is to clarify the function of these genes in the phenylpropanoid pathway.

    The three glucosyltransferases called VvgGT1, VvgGT2, VvgGT3 displayed high sequence similarities between them and with other plant glucosyltransferases catalyzing the formation of glucose esters. The transcripts are expressed in the early stages of grape berry development, mainly in skins and seeds and also in the pulp for VvgGT2. The properties of these 3 enzymes were studied in vitro after production of recombinant proteins. The three of them are able to catalyse the synthesis of glucose ester with hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acids as substrates and with similar kinetic properties.

    Two glucose-acyltransferases called VvGAT1 and VvGAT2 were isolated. They displayed high sequence similarity with other glucose dependent acyltransferases belonging to the Serine carboxypeptidase like family. The transcripts are expressed in the early stages of grape berry development mainly in skins and seeds for VvGAT1 and in pulp and seeds for VvGAT2. Heterologous expression of the proteins in different hosts was unsuccessful. The confocal microscopy data performed on grapevine transgenic hairy-roots suggest that VvGAT1 fused to GFP are localized in cytosolic vesicles.

    The successive involvement of these enzymes in the galloylation of PA and in the synthesis of hydroxycinnamic esters is discussed.

    RESUME

    Les proanthocyanidines (PA) du raisin jouent un rle majeur dans les proprits organoleptiques du vin, notamment dans lastringence et la stabilit de la couleur. Elles sont accumules principalement dans la pellicule et les ppins pendant les premiers stades du dveloppement de la baie. La biosynthse des PA commence tre bien dcrite chez les plantes, dont la vigne. Cependant certaines tapes restent lucider.

    Une tude de transcriptomique avait permis didentifier de nouveaux gnes potentiellement impliqus dans la biosynthse des PA. Parmi ces gnes figuraient 3 glucosyltransfrases et 2 glucose- acyltransfrases.

    Les trois glucosyltransfrases, VvgGT1, VvgGT2 et VvgGT3, prsentent de fortes homologies entres elles et avec dautres glucosyltransfrases capables de catalyser la formation de glucose ester. Les transcrits sont exprims durant les premiers stades de dveloppement de la baie principalement dans les ppins et la pellicule mais aussi dans la pulpe pour VvgGT2. Les proprits de ces 3 enzymes ont t tudies in vitro aprs production de protines recombinantes. Les 3 VvgGTs sont capables de catalyser la synthse desters de glucose partir dacides hydroxybenzoiques et hydroxycinnamiques.

    Deux acyltransfrases VvGAT1 et VvGAT2 ont t isoles. Elles prsentent de fortes similarits avec des acyltransfrases glucose-ester dpendantes de type serine carboxypeptidase like. Les transcrits sont exprims surtout avant la vraison, dans les ppins et la pellicule pour VvGAT1 et dans la pulpe et les ppins pour la VvGAT2. Lexpression htrologue dans diffrents htes na pas permis de dtecter dactivit enzymatique. Les analyses en microscopie confocale sur des hairy-roots de vignes transgniques suggrent que VvGAT1 fusionne une GFP est localise dans des vsicules cytoplasmiques.

    Limplication successive des VvgGTs et des VvGATs dans la galloylation des PA et dans la synthse desters dacides hydroxcinnamiques est discute.

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    REMERCIEMENTS

    Cest une habitude saine de remercier au dbut dun mmoire de thse tous ceux qui

    ont contribu de prs ou de loin rendre possible ce travail. Mme si dans mon cas, cette liste

    pourrait sembler plus longue que dans les coutumes, cest avec mon enthousiasme le plus vif

    et le plus sincre que je voudrais rendre mrite tous ceux qui leur manire mont aid

    mener bien cette thse.

    Jexprime tout dabord ma gratitude Vronique Cheynier, pour avoir accept dtre

    ma directrice de thse au sein de lquipe polyphnol interactions. Merci pour tes

    encouragements et tes prcieux et judicieux conseils scientifiques. Merci aussi pour la

    confiance que tu mas apporte et dont javais besoin pour continuer parcourir cette

    aventure de rve et de dfi.

    Je remercie tout particulirement, Nancy Terrier, mon encadrante de thse pour avoir

    accept de me diriger patiemment aprs la disparition de David. Merci Nancy pour ton soutien

    constant pendant toute la dure de la thse et durant la rdaction. Merci pour mavoir transmis

    ton dynamisme et tes comptences professionnelles et scientifiques et de mavoir donn cette

    envie dexplorer le domaine de la biologie molculaire. Merci pour ta disponibilit, ta

    prsence et ton encadrement.

    Je tiens remercier Mme Debeaujon et Mr Chervin pour avoir accept la charge dtre

    Rapporteurs de ma thse et merci Mme Laurence Lesage- Meesen et Mr Eric Dubreucq

    davoir accept dexaminer ces travaux.

    Jadresse mes scinceres remerciements pour Christian Jay-Allemand et Eric Dubreuq

    pour avoir accept dtre membres de mon comit de pilotage de thse. Merci pour vos

    conseils et les remarques pertinentes. Je ne peux oublier Bruno Blondin pour son soutien et

    ses encouragements qui mont beaucoup aide.

    Je remercie Sandrine Vialet pour ses conseils et son suivi. Mes sincres remerciements

    sadressent Jean Luc Guiraud pour son aide et sa disponibilit pour les analyses. Je remercie

    aussi Thrse Marlin davoir pris le relais pour mes dernires exprimentations sans oublier

    Clotilde Verries et Agns Ageorges pour les discussions trs enrichissantes que nous avons

    eues plusieurs reprises. Je ne me contente pas de vous remercier pour votre aide

    professionnelle, jaimerai rajouter mes remerciements pour tous les bons moments que jai

    passs avec vous. Martine, un remerciement spcial pour toi, pour ta gentillesse et la paix que

    tu apportais la petite quipe des Gaulois.

    Jadresse mes sincres remerciements Emmanuelle Meudec pour son aide

    scientifique et technique et sa patience lors de mes nombreuses sollicitations pour les analyses

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    en HPLC-masse. Jadresse aussi un remerciement particulier Louise Sidhoum pour son

    assistance durant les premires experimentations de ma thse.

    Je dois tout de mme un remerciement Nicolas Sommerer et Arnaud Verbera pour

    leur aide en analyse HPLC et masse.

    Je remercie Franois- Xavier Sauvage qui ma toujours accueillie avec beaucoup de

    gentillesse et aide dans les exprimentations sur les protines et les gels dlectrophorse.

    Je noublie surement pas Patrick Chemardin qui tait l pour veiller sur ltat dme

    des fermenteurs. Merci beaucoup Patrick pour ta disponibilit et ta gentillesse. Merci Vro,

    Cathy pour leurs conseils et les discussions intressantes lors de mes expriences la Halle.

    Je tiens galement remercier Michel Rossignol et Sonia Hem et la plateforme du

    Laboratoire de Protomique Fonctionnelle- INRA pour leur assistance dans le squenage

    protique.

    Un grand merci lensemble de lquipe des polyphnols et interaction qui ma

    encourage et ma soutenue durant la dure de cette thse. Mes remerciements sadressent

    aussi aux thsards et aux stagiaires que jai rencontrs lUMR SPO.

    Une pense particulire Virginie Galeote, ma collocatrice de bureau. Je te remercie

    vivi pour tes encouragements et les nombreuses discussions de colocataires qui mont souvent

    remonte le moral.

    Je ne peux finir ces remerciements sans faire hommage David : Souvent on rencontre

    des personnes qui nous apportent quelque chose de merveilleux, une certaine conscience pour

    nous permettre de vivre diffremment et agrablement. A mon petit monde, et cest ce qui est

    le plus extraordinaire, David Fournand a su transmettre son caractre combatif, son

    enthousiasme, son envie daller de lavant et sa joie de vivre. Ce ntait malheureusement que

    pour 8 mois De longues conversations passionnantes tant scientifiques, professionnelle que

    quotidiennes mont encourage. Jai beaucoup apprci l'attention que tu mas porte tout en

    respectant ta carrire professionnelle et tes engagements. Tes encouragements, ton soutien, ta

    bienveillance, je dirai mme tes dispositions fraternelles et affables envers moi mont

    rconforte et ont renforc ma volont de franchir une tape et de faire un nouveau pas. A

    grands renforts, jai poursuivi ma thse et aujourdhui mon tour, je te rends hommage, je te

    ddie cette thse David, tu resteras une formidable personne que je noublierai jamais

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    SOMMAIRE

    LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................ 11

    LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................... 13

    LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................................................... 14

    INTRODUCTION GENERALE ........................................................................................................ 17

    1. HISTORIQUE................................................................................................................................. 18 2. IMPORTANCE ECONOMIQUE ........................................................................................................ 18

    CHAPITRE 1: BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................... 20

    1. PRESENTATION ET CLASSIFICATION DE LA VIGNE ....................................................................... 21 2. LA BAIE DE RAISIN ....................................................................................................................... 21

    2.1. Morphologie ........................................................................................................................... 21

    2.2. Dveloppement ....................................................................................................................... 22

    3. LES COMPOSES PHENOLIQUES DU RAISIN .................................................................................... 25 3.1. Les acides phnoliques ........................................................................................................... 25

    3.2. Les stilbnes ........................................................................................................................... 28

    3.3. Les flavonodes .................................................................................................................... 29

    3.3.1. Les flavonols ............................................................................................................. 30 3.3.2. Les Anthocyanes ....................................................................................................... 31 3.3.3. Les flavan 3-ols ......................................................................................................... 33

    3.3.3.1. Cintique daccumulation, localisation et compartimentation des flavanols dans la baie ............................................................................................................................ 35

    3.3.4. Rle des flavonodes ................................................................................................. 36 3.3.4.1. Pour la plante ............................................................................................................ 36 3.3.4.2. Pour la sant humaine et lindustrie .......................................................................... 37

    4. BIOSYNTHESE DES FLAVONODES ............................................................................................... 38 4.1. Les enzymes de la voie : Description des gnes structuraux et expression durant le

    dveloppement chez le raisin ............................................................................................... 38

    4.1.1. Les enzymes de la partie amont de la voie ...................................................................... 39 4.1.2. Les enzymes de la partie aval de la voie ......................................................................... 42

    4.2. Polymrisation des flavan-3-ols ............................................................................................. 44

    4.3. Transport et stockage des flavonodes ................................................................................ 46

    4.3.1. Limplication de protines de transport .............................................................. 48 4.3.1.1. Les glutathion S-transfrases .................................................................................... 48 4.3.1.2. Les transporteurs de type ABC (ATP-Binding Cassette) et ATPases ....................... 48 4.3.1.3. Les transporteurs de type MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion) ...... 50 4.3.1.4. Transporteur de types BTT ....................................................................................... 51

    4.3.2. Le modle vsiculaire ............................................................................................... 52 4.4. Rgulation de la voie de biosynthse. .................................................................................. 53

    5. PROBLEMATIQUE ......................................................................................................................... 56

    CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES ............................................................................... 57

    1. MATERIEL BIOLOGIQUE ............................................................................................................... 58...

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