Chapitre : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE

1ère PARTIE : METHODES D'ETUDE DE LA MORPHOLOGIE DES CELLULES

La plupart des méthodes sont basées sur l'emploi des microscopes, la taille des cellules et de leurs constituants est en effet généralement trop petite pour qu'il soit possible de les observer à l'oeil nu.Il existe toute une gamme de microscopes.

1. Les microscopes

1.1. Les microscopes à lumière ou microscopes photoniques

Il existe divers types de microscopes à lumière :- les uns permettent l'observation directe de structures dont les dimensions sont de l'ordre de 0,2 µm ce sont les microscopes par transmission ;- les autres microscopes donnent des informations indirectes sur l'ultrastructure des cellules = microscope à lumière polarisée, microscope à fond noir et microscope à contraste de phase.- le microscope confocal à balayage

1.1.1. Microscopes par transmission

Le microscope le plus courant utilise la lumière visible (lumière blanche constituée de plusieurs longueurs d'onde) qui est transmise directement sur la prépa biologique.Ces microscopes sont équipés de système de lentilles qui condensent la lumière sur la préparation à observer.Les échantillons biologiques observés sont traversés par la lumière.

Tous les microscopes sont caractérisés par leur pouvoir séparateur = pouvoir de résolution c'est à dire la distance limite appréciable entre 2 points = aussi limite de résolution.Pour l'oeil humain, cette distance limite appréciable est de 100 à 200 µm.Un microscope photonique à transmission distingue des objets tout au plus distant de 0,2 µm.

Le pouvoir séparateur d'un microscope est donné par la formule d'Abbe :

ε = (0,61.λ) / (n.sin u) avec ε = distance limite appréciable = limite de résolutionλ = longueur d'onde de la lumière utilisée (400 nm = violet ---> 800 nm = rouge)

n = indice de réfraction du milieu transparentu = moitié de l'angle d'ouverture du cône lumineux entrant dans l'objectif0,61 = constante

Pouvoir séparateur élevé <-----> distance limite appréciable petiteD'après cette formule on voit que le pouvoir séparateur est d'autant plus grand c'est à dire la distance limite appréciable plus petite que la longueur d'onde des radiations utilisées est petite ou que u et n sont plus grands.

* à propos de la longueur d'onde utilisée :En général, une radiation possédant une longueur d'onde donnée ne peut être employée pour examiner des détails structuraux beaucoup plus petit que sa propre ??Ce principe impose donc une limite fondamentale au pouvoir séparateur du microscope photonique.La limite extrême de résolution d'un microscope photonique est donc fixée par la longueur d'onde de la lumière, qui varie d'environ 0,4 µm à 0,7 µm selon sa couleur.Concrètement, une bactérie ou une mitochondrie qui mesurent environ 0,5 µm de largeur sont les plus petits objets clairement observables au microscope photonique.Des détails plus fins sont masqués par des effets de diffraction optique.

* On peut jouer sur n et sur sin u :Cependant, cette précision peut être ramenée à 0,2 µm (200 nm) lors de l'utilisation d'un objectif à immersion.- On intercale entre l'objectif et la préparation à observer une goutte d'huile dont l'indice de réfraction est voisin de celui du verre : n augmente donc ε diminue.- De plus, il n'y a pas de perte de rayons entre la préparation et l'objectif, on augmente aussi l'angle du cône lumineux : sin u augmente donc ε diminue.

1.1.2. Les autres microscopes photoniques

L'observation d'échantillons biologiques en microscopie photonique par transmission nécessite des étapes de préparation (elles seront décrites en détail dans les prochains paragraphes). Elles ont pour but de rendre l'échantillon :- mince pour que la lumière puisse le traverser (confection de coupes) ;- et contrasté pour qu'il puisse absorber la lumière davantage que le milieu ambiant (coloration).Les traitements utilisés ne permettent pas de conserver vivantes les cellules.Ainsi, la possibilité d'une perte ou d'une altération de certains composants cellulaires durant ces étapes de préparation a toujours préoccupé les microscopistes.La façon la plus convaincante d'établir l'existence d'une structure dans les cellules vivantes est de les examiner au microscope quand elles sont vivantes. Cela est possible en utilisant d'autres microscopes.Toutefois l'observation des structures ne sera plus directe mais on obtiendra des informations indirectes sur l'existence de certaines structures.

* Le microscope à contraste de phase = microscope à interférence différentielle

Le microscope à contraste de phase est équipé d'un système optique, appelé plaques de phase qui permet d'exploiter les propriétés de diffraction des cellules.Ce système est situé dans la monture de l'objectif. Il permet de faire interférer dans la formation de l'image les rayons réfractés (=ont traversé la prépa en étant déviés cf. indice de réfraction de cellule différent de celui du milieu ambiant) et les rayons diffractés qui ont subit un retard de l'λ/2.Quand la lumière passe à travers une cellule vivante, si les structures sont peu épaisses l'onde n'est pas arrêtée (= absorbée) mais la phase de l'onde est modifiée, elle est retardée et changera donc de phase par rapport à la lumière ayant traversé une région voisine plus mince. Le système optique du microscope à contraste de phase recombine ces deux séries d'onde pour supprimer la lumière traversée en cette zone. Cela contraste la structure qui a créé le retard de phase. En effet, grâce à cette interférence, même si une structure a un indice de réfraction proche du milieu ambiant elle apparaîtra noire ou grise par rapport à ce milieu ambiant.

L'intérêt de ce microscope = Ce microscope amplifie de faibles différences d'indice de réfraction, il permet d'observer des cellules vivantes sans coloration donc sans qu'il y ait eu de formation d'artéfacts (= structure artificielle apparue suite aux traitements imposés aux cellules lors de leur préparation pour l'observation).

* Le microscope à fond noir

Un façon plus simple de voir les détails d'une cellule non colorée, que l'utilisation du microscope à contraste de phases, consiste à utiliser la lumière dispersée par les divers constituants cellulaires (= lumière diffractée).Un dispositif placé sous la platine du microscope permet d'éclairer la préparation biologique en lumière rasante.Les rayons incidents qui traversent la préparation ne pénètrent pas dans l'objectif, seuls pénètrent dans l'objectif les rayons diffractés.On peut ainsi observer les régions des cellules qui diffractent fortement la lumière. Elles apparaissent très brillantes sur un fond obscur donné par les régions très peu diffractantes. Il est donc possible de voir des structures de taille inférieure au pouvoir séparateur du microscope mais sans en discerner la forme ; on met juste en évidence leur existence ----> donne information indirecte sur les structures.

* Le microscope à lumière polarisée

La source lumineuse est constituée par un faisceau dont les vibrations sont situées toutes dans un même plan appelé plan de polarisation. En éclairant un échantillon avec de la lumière polarisée, il est possible de mettre en évidence les régions biréfringentes de la cellule.La biréfringence = propriété que possède une structure de dédoubler un rayon lumineux polarisé en deux nouveaux rayons, tous deux polarisés suivant des plans de vibration perpendiculaire et se propageant à la même vitesse. Ces deux rayons sont donc caractérisés par des indices de réfraction distincts ; la biréfringence représente exactement la différence entre les deux indices.La biréfringence est liée à la présence de structures ou de molécules asymétriques rangées régulièrement, mais que l'on ne peut pas distinguer avec un microscope à lumière par transmission puisque leur taille est bien inférieure à son pouvoir séparateur.

* Le microscope à rayons UV (= à fluorescence)

Le pouvoir séparateur de ce microscope est supérieur à celui du microscope photonique ordinaire (utilisant la lumière blanche) puisqu'il utilise, pour éclairer la préparation, les rayons UV caractérisés par une longueur d'onde plus faible.

UV usuels = 390 à 200 nmUV courts = 200 à 100 nm

La distance limite appréciable avec ce microscope peut descendre jusqu'à 0,06 µm (60 nm = 600A°m).Dans un microscope à fluorescence les lentilles sont en quartz (cf. le verre s'oppose au passage des UV). L'observation se fait sur un écran fluorescent où l'image obtenue peut être photographiée.

NB : Le microscope à fluorescence peut aussi exploiter la propriété de fluorescer de certaines préparations :Fluorescence = propriété d'émettre une lumière de fluorescence qui se caractérise par une longueur d'onde supérieure à la longueur d'onde de la lumière d'éclairement.- Fluorescence primaire : mise en évidence de constituants naturels ayant la propriété de

fluorescence. C'est surtout le cas pour des préparations botaniques et minéralogiques.- Fluorescence secondaire : c'est une fluorescence artificielle crée par imprégnation des éléments à observer par des fluorochromes qui ne se fixent que sélectivement sur certains constituants ou qui se fixent spécifiquement sur des constituants car ils ont été greffés sur des molécules d'anticorps dotées d'une spécificité de reconnaissance. Ces techniques sont illustrées par les tests immunologiques d'immunofluorescence que l'on étudiera plus tard.

* Le microscope confocal à balayage

- observation d'échantillons massifs- marquage = coloration par sondes fluorescentes- source lumineuse = rayon laser- éclairement en un point de la préparation = foyer d'excitation = point focal- déplacement du point focal d'éclairement à l'intérieur de l'échantillon- émission de fluorescence suite à l'éclairement au point observé- seule la fluorescence du point focal est recueillie = focalisation de la lumière d'émission dans le détecteur = foyer d'émission = point confocal (qui va avec le point focal)- balayage du faisceau lumineux dans le plan = analyse du plan- observation sur plusieurs plans focaux = analyse épaisseur- traitement informatique des images séquentielles- résultat = image en trois dimensions de l'échantillon.

1.2. Les microscopes électroniques

1.2.1. Généralités

* Principe :- L'échantillon à observer est bombardé par un flux d'électrons (ë). - Emploi d'ë en mouvement à la place de la lumière. Comme pour la lumière, (= flux de particules énergétiques = photons en mouvement), les ë se déplacent selon une onde = onde de matière (vue en physique). La longueur d'onde du flux d'ë dépend de la tension à laquelle sont soumis les ë.La longueur d'onde d'un ë diminue quand la vitesse de déplacement de l'ë augmente.- La source d'ë est un filament chauffé = cathode.- Le flux d'ë est dévié par des champs magnétiques qui le focalisent comme les lentilles de verre le font pour la lumière dans le microscope photonique.- L'image est perceptible grâce à un écran fluorescent.- Ces images peuvent être photographiées et sont souvent agrandies ensuite.

* Performances :La limite de résolution imposée par la longueur d'onde de la lumière visible peut être abaissée car les ë en mouvement créent une onde de longueur d'onde plus courte que celle de la lumière. La limite de résolution d'un microscope électronique sera donc plus petite et le pouvoir séparateur plus élevé que celui d'un microscope photonique.Dans un microscope électronique possédant une tension d'accélération de 100 000 volts, la longueur d'onde de l'ë est de 0,002 nm c'est à dire 200 000 fois plus petite que la plus petite longueur d'onde de la lumière (400 nm = 200 000 x 0,002).En théorie la résolution d'un tel microscope devrait être d'environ 0,002 nm. - Toutefois du fait que les aberrations des lentilles électroniques sont considérablement supérieures aux lentilles de verre, le pouvoir séparateur de la plupart des microscopes électroniques est bien moins élevé, la limite de résolution est donc nettement supérieure à la longueur d'onde de l'ë en déplacement (au mieux, elle serait de 0,1 nm).

- De plus, les altérations causées lors de la préparation de l'échantillon (coupes, obtention de contrastes) et les dégâts causés par l'irradiation limitent la résolution des objets biologiques à environ 2 nm. (20 Äm). C'est 100 fois mieux que la résolution du microscope photonique.(Rappel : avec l'objectif à immersion d'un microscope photonique par transmission on a ε = 0,2 µm = 200 nm).Lorsque les préparations sont observées sous des tensions très élevées, microscope haute tension, le pouvoir séparateur peut atteindre 5Äm.- Les grossissements obtenus sont très élevés 500 000 fois le diamètre pour 1000 fois en microscopie photonique.

* Inconvénients :- Les ë ne se propagent que dans le vide très poussé ce qui empêche toute observation sur le vivant ;- La pénétration des ë dans la matière est très faible, donc les coupes doivent être très minces (de l'ordre de 0,06 à 0,09 µm ~ 0,1 µm pour 2 à 5µm en microscopie photonique) ;

* Il existe deux types de microscope électronique.- Le microscope électronique par transmission ;- Le microscope électronique à balayage.

1.2.1 Le microscope électronique par transmission

L'objet à observer est placé sur le trajet du faisceau d'ë.Selon la densité locale du matériel, certains ë qui traversent l'échantillon sont déviés, ils ne figurent pas sur l'image. Les régions denses de l'échantillon se distinguent donc par des zones de flux électronique réduit c'est à dire zones + ou - sombres sur l'image.Les ë qui traversent l'échantillon sont, eux, focalisés pour former une image, soit sur un écran fluorescent, soit sur une plaque photo. Ce sont donc les ë qui traversent l'échantillon qui contribuent directement à la formation de l'image. On ne peut qu'observer des objets très minces, généralement on s'adresse à des coupes.

1.2.2. Le microscope électronique à balayage

Les échantillons sont bombardés par un faisceau d'ë, mais seuls sont utilisés pour la formation de l'image, les ë qui sont réémis par la surface de l'échantillon.A la différence du microscope électronique par transmission, il est donc possible d'étudier des échantillons massifs dont seule la surface est observée.Pratiquement, la surface de l'objet est balayée par un faisceau très fin d'ë, d'où le nom donné à l'instrument. Un récepteur recueille les ë réémis par la surface de l'objet et donne un signal qui, après amplification, module l'intensité d'un faisceau qui balaie un écran de télévision en synchronisme avec le balayage du faisceau d'ë. L'image obtenue sur l'écran de télévision donne avec une très grande profondeur de champ une vue tridimensionnelle de la surface de l'échantillon avec une résolution de l'ordre de 250A°m.

2. Les conditions d'observation aux microscopes

2.1. Méthodes d'études par microscopie à lumière

2.1.1. Les contraintes et les différentes étapes du traitement des échantillons

* Contraintes :

- Epaisseur : Dans l'observation par transmission, qui est la plus employée, les rayons lumineux qui contribuent à la formation de l'image traversent l'objet. Ainsi, l'observation exige que l'objet soit de faible épaisseur pour être traversé. De plus, il faut éviter les superpositions des structures pour que l'image ne soit pas trop confuse.Cette épaisseur ne doit pas dépasser 2 à 5 µm.-----> Comme nous l'avons vu, les dimensions des cellules sont plus grandes, il faut donc recourir aux méthodes de la microtomie = confection de coupes.

- Contrastes : L'observation par transmission au microscope photonique, ne fournit des renseignements que si certaines régions de l'objet absorbent la lumière plus que d'autres, c'est à dire si cet objet présente des contrastes.Généralement les constituants cellulaires ont très peu de contrastes les uns par rapport aux autres ; aussi est-on obligé d'employer certains artifices pour augmenter ceux-ci.----> Il est possible d'amplifier les très faibles différences de contrastes qui existent entre les différentes régions de la cellule en recourant à des montages optiques qui utilisent la nature ondulatoire de la lumière = cas du microscope à contraste de phase.----> On peut d'autre part, créer artificiellement des contrastes au niveau de certaines structures cellulaires en réalisant des colorations. On exploite alors des combinaisons entre certains constituants biochimiques cellulaires et des produits absorbant certaines longueur d'onde de la lumière = colorants. La coloration des préparations biologiques est très largement utilisée.

* Les différentes étapes du traitement :Des coupes de quelques microns d'épaisseur ne peuvent être réalisées que si la dureté de l'échantillon à couper est convenable.Les cellules ont une consistance visqueuse et sont beaucoup trop molles pour être coupées en tranches minces. Il faut donc les durcir artificiellement pour pouvoir les sectionner.Ceci est réalisable si l'on agit sur le constituant le plus abondant des cellules = l'eau. :----> Ou bien on remplace l'eau par un autre liquide pouvant être durci dans certaines conditions =

méthode d'inclusion ;----> Ou bien on fait passer l'eau de l'état liquide à l'état solide = technique de congélation.Mais ces méthodes, qui permettent de durcir les cellules altèrent considérablement l'organisation cellulaire. C'est pourquoi il est nécessaire de consolider au préalable les structures par un ensemble d'opérations appelées fixation.Lorsque la condition de "fine épaisseur" est remplie, il faut ensuite contraster artificiellement l'échantillon = c'est l'étape de coloration.Chronologiquement ces différentes étapes s'enchainent ainsi :

1) fixation = consolider2) inclusion = durcir3) microtomie = couper4) coloration = contraster

2.1.2. La fixationUne fixation est un traitement chimique ou physique effectué sur des cellules vivantes et permettant de pratiquer ultérieurement certaines manipulations avec un minimum de dommages pour les structures cellulaires. En général la fixation entraine la mort des cellules, ce qui indique que la cellule a subi des perturbations, dont il conviendra de connaitre la nature et l'importance pour juger de la valeur de la fixation.

* Fixation par traitement chimique :La fixation par traitement chimique est réalisée en plaçant les cellules dans liquides que l'on appelle fixateurs.On classe les fixateurs en deux groupes selon leur action sur les protéines :- fixateurs coagulants, comme l'éthanol (CH3CH2OH), l'acide acétique (CH3COOH) dilué, les solutions aqueuses d'acide picrique (trinitrophénol) ou de chlorure mercureux (HgCl2) ;- fixateurs non coagulants comme les solutions aqueuses de tétroxyde d'osmium OsO4, ou d'aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde, etc.). Les protéines étant, après l'eau, le constituant le plus abondant des cellules, ce dernier type de fixation est évidemment celui qui altère le moins les structures cellulaires.Il n'est pas difficile de concevoir que le mécanisme de la coagulation consolide les structures cellulaires.Par contre, on connait peu de choses sur le mécanisme d'action des fixateurs non coagulants. On pense qu'ils créent des ponts entre les molécules voisines. Ainsi le tétroxyde d'osmium peut réagir avec les doubles liaisons éthyléniques de molécules voisines selon le schéma suivant :

Schéma écrit au tableau pendant le cours

Les aldéhydes, comme la formaldéhyde ou la glutaraldéhyde, après avoir formé des composés d'addition avec les groupements -NH2 de molécules voisines, réalisent des ponts liant les molécules entre elles. Avec la formaldéhyde, par ex, le schéma de la réaction est le suivant :

Schéma écrit au tableau pendant le cours

Des ponts méthylénique entres chaines voisines peuvent également se créer au niveau de liaisons peptidiques :

Schéma écrit au tableau pendant le cours

Dans la pratique :On utilise des solutions aqueuses du fixateur (tétroxyde d'osmium à 1 ou 2 %, formaldéhyde ou glutaraldéhyde à 2 ou 5 %) tamponnées à un pH voisin de la neutralité. La durée de la fixation dépend de la taille de l'échantillon à fixer, de la vitesse de pénétration du fixateur dans les cellules, de la nature des cellules elles-mêmes. Pour des pièces cubiques de quelques millimètres de côté, le temps de fixation varie, selon le fixateur, de 30 minutes à plusieurs jours. Pour des cellules isolées, ces temps sont plus courts (de quelques minutes à une demi-heure).

* Fixation par traitement physique :Le traitement physique le plus couramment utilisé pour la fixation est la congélation. La pièce à fixer est refroidie rapidement, soit par immersion dans un liquide à basse température (azote liquide -196°C), soit par détente à son niveau de gaz carbonique comprimé (-60°C). La congélation doit être rapide pour que les cristaux de glace qui vont se former ne soient pas trop gros, sinon ils risqueraient de déchirer les structures cellulaires.

* Comparaison des performances :Les fixateurs coagulants conservent très mal les organites cytoplasmiques. Ils sont utilisés cependant en histologie lorsqu'il s'agit d'étudier des groupements cellulaires = tissus, sans chercher à mettre en évidence des détails de structure propre à chaque cellule.En cytologie, les fixateurs chimiques non coagulants donnent des résultats satisfaisants.

La meilleure technique reste cependant la congélation. En effet après congélation, certaines cellules, remises dans des conditions normales de température, reprennent leur activité, donnant ainsi la preuve que leurs structures n'ont pas été perturbées au point d'entrainer leur mort.

2.1.3. Durcissement de l'échantillon et obtention de coupes

* Durcissement par inclusion :Il est obtenu en remplaçant l'eau des cellules par de la paraffine chaude qui durcit en refroidissant.Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible, ces deux liquides n'étant pas miscibles. On doit en premier lieu substituer à l'eau des cellules fixées de l'éthanol, puis du toluène qui peut se mélanger à la paraffine liquide (chaude). Cette paraffine remplit dans les cellules les espaces préalablement occupés par l'eau. En refroidissant, la paraffine se solidifie et donne aux cellules une consistance qui permet de les débiter en coupes minces.

* Durcissement par congélation :Il peut être effectué en même temps que la fixation par la même technique, ou bien en congelant des cellules déjà fixées par un traitement chimique.

* Comparaison des performances :Le durcissement par inclusion entraine des modifications des structures puisqu'on remplace l'eau par des liquides polaires (éthanol et toluène) qui provoquent des extractions et en particulier la dissolution des lipides. Ce n'est pas le cas quand le durcissement est obtenu par congélation.

* Obtention de coupes :Les blocs de paraffine ou les blocs de glace contenant les cellules congelées, sont coupés en tranches à l'aide d'appareils appelés microtomes. Lorsqu'on travaille avec des échantillons congelés, le microtome est équipées d'une enceinte maintenue à -20°C.Dans les deux cas, inclusion à la paraffine ou congélation, la lame servant à trancher est un rasoir d'acier.Après inclusion à la paraffine, on peut réaliser des coupes de 2 à 5 µm, alors qu'après congélation, on peut obtenir au mieux des coupes de 5-10 µm.

2.1.4. Obtention de contrastes et observation

Une fois les coupes réalisées, on peut procéder à l'obtention de contrastes.Les contrastes peuvent être augmentés en utilisant le microscope à contraste de phase ou en pratiquant des colorations.* Il existe de nombreux colorants et on peut les regrouper, dans un 1er temps, en deux catégories : - les colorants vitaux : ne tuent pas la cellule ou pas immédiatement ; ils sont cependant +/- toxiques, parfois ils entrainent malgré tout la formation d'artéfacts. Ces colorants sont peu nombreux (ex rouge neutre) ;- les colorants incompatibles avec la vie : leur emploi nécessite une fixation préalable de la cellule pour consolider les structures cellulaires. Ils permettent toutefois une observation assez fine grâce à de meilleurs contrastes. La gamme de ce type de colorants = utilisables pour des cellules fixées, est très étendue.* Colorant = molécule qui a la propriété d'absorber certaines longueurs d'onde de la lumière et de conférer une couleur au composant qui l'a lié.Toutes les molécules de colorant portent :

l un groupement chromophore qui absorbe certaines longueurs d'onde et qui confère la couleur ;

l un groupement auxochrome qui permet la liaison à certains constituants cellulaires, les colorants peuvent donc avoir une affinité élective pour un type de constituants cellulaires.

On distingue les colorants acides = possèdent un groupement auxochrome anionique (ex : COO-) qui se fixe sur des constituants cellulaires dits alors acidophiles (= de nature basique); et les colorants basiques qui portent un groupement auxochrome cationique (ex : NH3+) qui se fixent sur des constituants cellulaires dits alors basophiles (= de nature acide).* La coloration peut être :- simple = utilisation d'un colorant unique pour contraster ;- combinée = utilise plusieurs colorants ;- progressive = on arrête la coloration au bout d'un temps précis, mis au point pour que la coloration soit optimale ;- régressive = on surcolore et on enlève ensuite l'excès de colorant au moyen d'un différenciateur = solvant du colorant utilisé.* Les étapes de la coloration :On procède en trempant successivement la lame de verre supportant la coupe dans des bains. 1) Les coupes sont collées sur des lames de verre à l'aide d'une solution protéique (albumine ou gélatine) : en chauffant la protéine coagule et fixe la coupe à la surface du verre.2) On enlève ensuite la substance d'inclusion : on substitue d'abord la paraffine par le toluène, puis le toluène par l'éthanol (on s'arrête là si le colorant utilisé est en solution alcoolique)et finalement l'alcool par de l'eau (si le colorant utilisé est en solution aqueuse).3) On procède à la coloration à l'aide du ou des colorants, avec une étape de rinçage entre chaque étape de coloration.4) On monte la préparation en la plaçant sous une lamelle, dans un milieu possédant un indice de réfraction convenable et on observe au microscope photonique.

2.1.5. Valeurs des observationsPour juger de la valeur des observations, il convient de se demander si les aspects observés sur les coupes existent réellement dans les cellules vivantes. En effet des remaniements peuvent se produire au cours des traitements de fixation et d'inclusion et donner naissance à des structures différentes de ce qu'elles étaient dans la cellule vivante. On désigne sous le nom d'artefacts ces structures créées artificiellement.Comment faire pour juger ? - Pour cellules se prêtant à l'observation sur le vivant (ex : cellules isolées ou monocouche de cellules) : on regarde si pas différences morphologiques entre ces cellules vivantes et ces mêmes cellules fixées. Si pas de différences = la technique de fixation est bonne.- Pour des cellules ne se prêtant pas à l'observation sur le vivant (cf. nécessité de faire coupe car appartiennent à des tissus), on est amené à faire des extrapolations en testant les fixateurs sur d'autres catégories cellulaires (cellules isolées ou en couche mince).- On peut aussi utiliser des techniques différentes pour préparer un échantillon, si elles produisent toutes la même image, il est vraisemblable que cette image représente une structure réelle et non un artéfact.

2.2. Méthodes d'études par microscopie électronique

2.2.1. Les contraintes et les différentes étapes du traitement des échantillons

* Contraintes :

- Dans un microscope électronique, les électrons se déplacent à l'intérieur d'une enceinte où règne un vide poussé, de l'ordre de 10-5 mm de mercure. Cette nécessité fait que seules peuvent être observées des substances non volatiles sous cette faible pression.- D'autre part, les spécimens sont soumis à un bombardement d'électrons, dont le premier effet est d'élever leur température. Il faut donc que les échantillons résistent à cet échauffement sous vide.- Le pouvoir de pénétration des électrons est très faible, or l'image est formée par les électrons qui traversent l'échantillon Donc, l'épaisseur des échantillons ne doit pas dépasser le dixième de micromètre pour profiter au mieux du pouvoir séparateur de l'appareil (il est de l'ordre de 5A°).-------> Les conditions d'observation imposées par le microscope rendent impossible l'observation de cellules vivantes.

* Préparation de l'objet :- Les cellules sont riches en composés volatils, en particulier l'eau. Il est donc nécessaire d'effectuer au préalable une déshydratation pour éviter les bouillonnements tumultueux au moment où l'on fait le vide dans l'appareil. - Comme on l'a vu à propos de l'observation au microscope photonique, cette déshydratation ne peut être effectuée sans dommage que si les cellules ont été fixées auparavant.- Par ailleurs, l'épaisseur des spécimens observés devant être de l'ordre du 1/10 du micron, seuls peuvent être examinés des objets de petite dimension ou des coupes faites dans des échantillons plus massifs.- Enfin l'observation des spécimens par transmission ne donne des renseignements que si certaines régions diffusent plus les électrons que d'autres et présentent donc des contrastes. On doit augmenter le contraste des objets biologiques en intégrant aux structures des éléments de numéro atomique élevé qui diffusent fortement les électrons. Cette opération est appelée improprement "coloration" par analogie avec la technique employée en microscopie à lumière.------> 1) fixation ; 2) déshydratation ; 3) durcissement ; 4) coupes ; 5) obtention de contrastes.

2.2.2. Observation d'objets de petite taille

* Observation en microscopie électronique par transmission :

- Il existe des matériaux biologiques dont la taille est compatible avec une observation directe par transmission : virus, macromolécules, flagelles bactériens, organites ...- Pour être introduits dans le microscope électronique, ces objets doivent être déposés sur une membrane support transparente aux électrons de 100 à 200 angströms (Äm) d'épaisseur environ (membrane de carbone ou d'un polyvinyle comme le formvar). Ce support est lui-même soutenu par une grille de cuivre de 3 mm de diamètre à maille fine (maille de 100 à 300 µm de côté). Le rôle de la grille recouverte de sa membrane support est comparable à celui des lames porte-objet en verre de la microscopie à lumière.- On dépose sur la membrane une gouttelette d'eau contenant en suspension les objets à étudier.- On déshydrate les objets à observer par dessiccation et ils se collent contre la membrane support.- En général, le contraste des objets étant faible, il est nécessaire d'utiliser certains artifices pour les rendre apparents. Deux techniques peuvent être utilisées :

→ Technique de l'ombrage = vaporisation sous vide des métaux avec une direction faisant un angle faible avec le plan de la préparation (= sous incidence rasante). Les vapeurs métalliques viennent se déposer sur la membrane-support et à la surface des objets, mais chaque objet forme un obstacle au dépôt métallique. On obtient ainsi un effet d'ombre sur la membrane-support. D'où le nom d'ombrage donné à cette technique.

→ Technique de coloration négative : on place les objets dans une solution aqueuse d'acide phosphotungstique et on dépose une gouttelette de cette suspension sur une grille recouverte d'une membrane-support. L'eau s'évaporant, il se fait autour des objets un dépôt d'acide phosphotungstique opaque aux électrons (le tungstène est un atome de numéro atomique élevé). Ce dépôt épouse étroitement les contours des objets et souligne ainsi avec une grande finesse tous les détails de sa surface. A l'observation, les objets apparaissent clairs sur un fond sombre. Cette méthode, qui revient à augmenter le contraste de l'entourage des objets et non celui des objets eux-mêmes, est appelée coloration négative. Elle est particulièrement employée pour l'étude de la morphologie des virus.

* Observation en microscopie électronique à balayage :

Les échantillons devant être placés sous vide pour l'observation, il est nécessaire dans le cas de spécimens biologiques riches en eau de les déshydrater. Mais auparavant il faut que les structures aient été consolidées par une fixation préalable.La déshydratation doit introduire le minimum de changements dans la configuration superficielle de l'objet.- Quand il s'agit de spécimens peu hydratés tels que les grains de pollen ou des cytosquelettes minéraux de microorganismes variés, il suffit d'opérer par dessiccation.- par contre, dans le cas de cellules très hydratées, comme des protozoaires ou des tissus, les échantillons sont congelés, puis la glace est sublimée sous vide.- Les échantillons biologiques déshydratés sont isolants. Il convient donc de rendre leur surface conductrice pour éviter qu'elle ne se charge lors de l'irradiation par le faisceau d'électrons qui la balaye. Ceci est obtenu en vaporisant sous vide une mince couche d'or ou de platine sur toute la surface de l'échantillon.

2.2.3. Observation de coupes minces

Les objets de petite taille qui peuvent être regardés directement au microscope électronique ne représentent qu'un domaine limité ; en effet les cellules sont trop épaisses pour que l'on puisse étudier leur ultrastructure au microscope électronique sans les sectionner au préalable.L'épaisseur des coupes ne doit pas dépasser 1/10 µm. Elles sont appelées coupes minces en comparaison des coupes réalisées pour l'observation en microscopie à lumière.La réalisation des coupes minces amène à effectuer un certain nombre d'opérations comparables, dans leur principe, à celles décrites en microscopie photonique : fixation, durcissement (inclusion ou congélation), microtomie et "coloration".

* Fixation :La fixation est faite par traitement chimique, soit par traitement physique.Fixation par traitements chimiques :Seuls sont utilisés des fixateurs non coagulants (tétroxyde d'osmium et aldéhydes). Ces fixateurs sont employés en solution aqueuse à un pH voisin de la neutralité. De plus, leur concentration, ainsi que celle du tampon sont calculées pour que la molarité du fixateur soit voisine de celle du milieu dans lequel elles vivent. Le plus souvent deux fixations successives sont effectuées : une fixation aldéhydique suivie d'une fixation post-osmique.

Fixation par traitement physique :Ce type de fixation est pratiqué par congélation. Pour éviter que la formation de cristaux de glace

à l'intérieur des cellules ne vienne bouleverser et déchirer les structures, on essaie de faire passer l'eau directement de l'état liquide à l'état solide amorphe, sans qu'il y ait formation de cristaux. Ceci peut être obtenu en congelant très rapidement les cellules, mais dans ce cas, seules les cellules isolées peuvent être convenablement congelées. Quand il s'agit d'échantillons plus massifs, la congélation est plus lente et la formation des cristaux peut alors être inhibée en traitant les cellules par une substance protectrice non toxique comme le glycérol (on utilise aussi, en cryoconservation des cellules, le diméthylsulfoxyde = DMSO). Avant d'être congelés les tissus sont placés dans une solution physiologique contenant du glycérol à 20 % qui pénètre dans les cellules, empêchant la cristallisation de l'eau. Pratiquement, après avoir incubé 30 min dans la solution de glycérol les petits fragments de tissus sont plongés dans du fréon liquide à - 140°C.

* Durcissement :On peut pratiquer soit le durcissement par inclusion, soit par congélation.Inclusion :Comme pour la microscopie à lumière, le durcissement des échantillons est obtenu en remplaçant l'eau des cellules par un liquide que l'on fait solidifier ultérieurement. Les milieux d'inclusion sont des matières plastiques très dures lorsqu'elles sont polymérisées et qui permettent de faire des coupes plus minces qu'avec la paraffine. Les plus employées sont des résines époxy : araldite ou épon. Ces résines n'étant pas hydrosolubles, on substitue à l'eau des cellules fixées de l'alcool éthylique dans lequel les résines sont miscibles. En présence d'un catalyseur, la résine durcit à chaud et on obtient ainsi des blocs d'une dureté suffisante pour réaliser des coupes de 500 à 1000 Äm d'épaisseur.Congélation :Le durcissement par congélation peut être aussi pratiqué soit sur des cellules préalablement fixées par des agents chimiques, soit sur des cellules vivantes congelées rapidement, la fixation et le durcissement étant alors réalisés simultanément.

* Confection de coupes :Les coupes sont faites à l'aide de microtomes perfectionnés = ultramicrotomes, sur lesquels sont adaptés des rasoirs de verre ou de diamant. Quand il s'agit de spécimens durcis par congélation, le bloc et le rasoir sont maintenus à base température.A mesure qu'elles sont débitées, les coupes viennent s'étaler à la surface d'un liquide (eau ou milieu liquide à basse température quand il s'agit de coupes faites à congélation). Les coupes sont ensuite recueillies sur des grilles de cuivre dont le rôle est comparable à celui de la lame porte-objet du microscope à lumière (voir planche).Les coupes minces ainsi réalisées ne doivent pas excéder 0,1 µm d'épaisseur

* Obtention de contrastes :Les objets biologiques présentent un faible contraste aux électrons, aussi est-on amené à augmenter celui-ci.Il n'est pas nécessaire d'enlever la résine d'inclusion pour "colorer" les coupes et pour les observer.L'augmentation des contrastes s'obtient par combinaison d'éléments de numéro atomique élevé avec certains constituants biochimiques des ultrastructures. Cette coloration est réalisée avant l'observation en plongeant pendant quelques minutes les grilles supportant les coupes dans des solutions de sels de plomb, de tungstène ou d'uranium. Quand les cellules ont été fixées au tétroxyde d'osmium, le fixateur agit également comme colorant, mais le contraste est habituellement renforcé par une coloration ultérieure des coupes.Comme dans le cas de la microscopie à lumière, il existe des méthodes de coloration qui permettent de contraster spécifiquement certains constituants biochimiques des cellules.

Les grilles supportant les coupes contrastées sont introduites dans le microscope. Seules peuvent être étudiées les régions des coupes situées entre les barreaux de la grille-support.

2.2.4. Observation de coupes épaisses

Les images obtenues en observant des coupes minces sont souvent difficiles à interpréter quand il s'agit de reconstituer l'architecture spatiale des organites ou les rapports des organites entre eux dans les cellules.* L'étude de coupes successives dites sériées permet de faire des reconstitutions tridimensionnelles, mais dans des conditions techniques longues et difficiles à réaliser.* L'observation de coupes épaisses est le moyen le plus naturel pour comprendre la disposition des structures dans l'espace. Aux tensions de 80 à 10 kV qui sont celles des microscopes électroniques commerciaux les plus courants, il est possible d'observer des coupes de 0,5 à 1 µm, qui peuvent être traversées par le faisceau d'électrons, mais la résolution est alors moins bonne pour des épaisseurs plus importantes en raison de la valeur élevée de l'aberration chromatique sous ces tensions. L'utilisation de microscopes électroniques à haute tension fonctionnant sous 1 à 3 millions de volts rend possible l'étude à l'échelle ultrastructurale des coupes épaisses de plusieurs micromètres compte tenu du grand pouvoir de pénétration des électrons à ces tensions et de la faible valeur de l'aberration chromatique.Comme dans le cas des microscopes fonctionnant sous 100 kV, les structures doivent être contrastées par des éléments de numéro atomique élevé, mais dans le cas des coupes épaisses, il convient d'utiliser des méthodes qui colorent sélectivement un nombre limité d'organites pour éviter les superpositions qui rendraient très difficile l'interprétation des images.

2.2.5. Valeur des observations

Il convient de se demander si les détails structuraux révélés lors de l'observation au microscope électronique existent réellement dans les cellules ou s'ils ne sont pas des artéfacts.L'observation des cellules vivantes n'est pas possible au microscope électronique, on doit recourir à d'autre méthodes pour juger de la valeur des diverses techniques de préparation.

→ Lorsqu'il s'agit de structures orientées ou périodiques qui peuvent être mises en évidence sur le vivant par microscopie en lumière polarisée ou par diffraction aux petits angles, on peut comparer les informations obtenues par ces méthodes à celle que donne l'observation de ces mêmes structures au microscope électronique.Diffraction des rayons X aux petits angles :Les rayons X, de même que la lumière, sont diffractés par la matière. Dans le cas des rayons X, les centres diffractants sont les atomes composant les molécules.Lorsque les centres diffractants sont équidistants les uns des autres, les rayons X diffractés font avec le faisceau incident un angle bien défini.La valeur de cet angle est inversement proportionnelle à la distance séparant les centres diffractants.Cette distance est appelée période et les structures renfermant des centres diffractants équidistants sont dites structures périodiques.- Lorsque la période est < 40 Äm : les angles que font les rayons diffractés avec le rayon incident sont grands (> 5°), on parle de diffraction aux grands angles. La diffraction aux grands angles permet de mesurer les distances entre atomes d'une même molécule et d'en reconstituer la structure tridimensionnelle.- Lorsque la période est comprise entre 40 Äm et 1000 Äm : les angles que font les rayons diffractés avec le rayon incident sont petits (< 5°), on parle de diffraction aux petits angles. La diffraction aux petits angles permet de mesurer la distance entre des molécules semblables rangées en structures périodiques. C'est la diffraction aux petits angles qui nous intéresse dans le cadre de l'étude des ultrastructures cellulaires (= arrangement de molécules).

Voir planche Pratiquement, on fait arriver un faisceau de rayons X sur un spécimen et les rayons diffractés viennent impressionner une plaque photo placée derrière celui-ci. Connaissant la distance entre le spécimen et la plaque photo ainsi que la direction du faisceau incident, il est possible de calculer les angles des rayons diffractés par rapport au faisceau incident. De ces mesures on déduit la période des centres diffractants.Grâce au grand pouvoir de pénétration des rayons X on peut étudier, par cette méthode des échantillons relativement épais et travailler sur des groupes de cellules importants (muscle alaire de mouche, muscle de la patte d'une grenouille).Un autre intérêt de cette méthode est de permettre d'effectuer ces mesures sur des échantillons vivants. Comme l'étude de la biréfringence avec la microscopie en lumière polarisée, l'étude de la diffraction des rayons X aux petits angles rend possible une comparaison entre ultrastructures à l'état vivant et les ultratructures après l'action des fixateurs.

→ Lorsqu'il s'agit de structures non orientées et non périodiques, la méthode du cryodécapage permet de faire ces contrôles.Cryodécapage :cryo =froid et décapage : on doit retrouver ces deux éléments dans la description de la technique.1) Le principe de cette méthode consiste à congeler rapidement une suspension de cellules ou un fragment de tissu, ce qui on le sait introduit très peu d'artéfacts puisque la congélation ne tue pas les cellules.2) Le spécimen congelé est alors introduit dans ue enceinte où l'on fait le vide et où il est fracturé par une lame métallique elle-même refroidie.La surface de la fracture suit préférentiellement les reliefs membranaires qui existent dans les cellules. La fracture se propage dans les zones les moins résistantes de la cellule = entre les deux feuillets des bicouches lipidiques des membranes.3) Les irrégularités superficielles de la fracture sont ensuite accentuées en sublimant la glace dans cette région, ce qui réalise un décapage à froid de la surface, d'où le nom donné à la méthode.4) On effectue alors un dépôt métallique sur la surface décapée en vaporisant, sous incidence rasante, du platine, ce qui consiste à faire un ombrage.5) Le dépôt métallique est ensuite consolidé par une vaporisation de carbone perpendiculairement à la surface décapée ombrée. On obtient ainsi une réplique ombrée de la surface de fracture.6) L'échantillon, qui pendant toutes ces opérations, a été maintenu à basse température (d'où le préfixe cryo = froid) est ensuite réchauffé et sorti de l'enceinte où il était sous vide. On dissout alors par l'acide sulfurique et l'eau de Javel, les débris cellulaires qui adhèrent à la réplique.7) La réplique ombrée est recueillie sur une grille de cuivre, et observée au microscope électronique.L'examen de la réplique démontre l'existence à l'intérieur des cellules d'ultrastructures présentes au moment de la congélation alors que n'ont pas été appliqués les différents traitements nécessaires à l'obtention de coupes.

2ème PARTIE :METHODES D'ETUDE DE LA COMPOSITION BIOCHIMIQUE DES

CELLULES

Ces méthodes permettent de connaitre la nature mais aussi la localisation des constituants biochimiques de la cellule.

Selon les recherches envisagées, les matériels cellulaires sont différents.

1. Les matériels cellulaires

1.1. Cellules entières ou coupes de cellulesVoir ce que sont les coupes cellulaires et les différentes étapes de leur confection dans la première partie du chapitre.

1.2. Broyats cellulaires = homogénats cellulaires* Pour obtenir un broyat cellulaire = homogénat cellulaire on peut partir, soit d'une suspension de cellules, soit de fragments de tissu.* Homogénat cellulaire = organites en suspension + débris cellulaires (fragments d'ultrastructures) + constituants biochimiques en solution.* Différentes techniques sont utilisables :Elles peuvent d'ailleurs se combiner pour une meilleure efficacité.- Mortier + abrasif :Cette méthode s'adresse à des fragments de tissus. Les morceaux de tissu sont très souvent congelés immédiatement par immersion dans de l'azote liquide (- 196°C) ou de la carboglace (CO2 liquide, - 80 °C) afin de les durcir.L'abrasif utilisé est souvent le sable de Fontainebleau de granulométrie régulière et très fine.- Mixeur :ex : le disperseur ultra-TurraxC'est un appareil muni de pales en rotation.- Le Potter-Elvehjem :Il est constitué d'un tube de verre et d'un piston en plastique tels que l'espace annulaire entre le piston et la paroi du tube ne soit que de quelques dixièmes de mm.Le piston tourne à 1000 ou 2000 tours/min et en même temps que le piston tourne, on fait aller et venir le tube verticalement.Les cellules qui passent entre le piston et la paroi du tube sont alors soumises à des forces de cisaillement qui amènent leur éclatement.- Le choc osmotique :On place les cellules dans un milieu hypotonique.Le milieu intracellulaire étant plus concentré qu'à l'extérieur, l'eau entre de façon massive à l'intérieur des cellules sous l'effet de l'osmose. Le volume cellulaire augmentant, la membrane plasmique n'y résiste pas et la cellule éclate.Lorsque les cellules sont délimitées par une paroi, celle-ci peut protéger les cellules de la lyse car la présence de la paroi (contre laquelle vient se plaquer la mb plasmique) crée une force de turgescence qui s'oppose à l'entrée de l'eau par osmose.Pour neutraliser l'intervention de la paroi, on la digère au préalable en plaçant les cellules dans une

solution isotonique tamponnée contenant des enzymes capables d'hydrolyser les constituants pariétaux :ex : cellulases et pectinases pour les cellules végétales :ex : lysozyme pour les cellules bactériennes ;ex : chitinase pour levures et moisissures.

- Vibrateur ultrasonique :Cet appareil émet des ultrasons dont on peut régler la fréquence et l'intensité en fonction du matériel cellulaire étudié. La membrane plasmique se rompt sous l'effet des vibrations engendrées par la propagation des ondes.Comme pour le choc osmotique, des cellules débarrassées de leur paroi seront fragilisées et donc plus facilement lysées avec ce type de technique.

* Conditions de manipulation :- On met l'échantillon biologique dans une solution tamponnée et isotonique ou légèrement hypertonique (sauf pour la technique du choc osmotique). De façon à ne pas altérer les structures cellulaires.- On travaille entre 0-4°C, afin d'empêcher tout fonctionnement enzymatique. En effet la compartimentation cellulaire n'est pas entièrement conservée cf. un certain nombre d'organites sont abîmés. Leur structure n'étant plus intacte, ils libèrent des enzymes capables de catalyser certaines dégradations indésirables (ex : activité hydrolases stockées dans les lysosomes).La préparation d'homogénats cellulaires est donc réalisée en chambre froide ou bien on place le récipient contenant l'échantillon biologique dans un bain de glace pilée.

1.3. Fractions cellulaires

Si l'on veut connaitre la composition biochimique des organites cellulaires, il faut les isoler les uns des autres. La purification d'organite passe par l'obtention de fractions cellulaires. On parle de techniques de fractionnement cellulaire = isolement d'organites cellulaires.Le fractionnement cellulaire est réalisé à partir d'un homogénat cellulaire (voir § ci-dessus)* Principe de la séparation des organites cellulaires :Le fractionnement cellulaire est basé sur la différence de densité des organites.On peut à partir d'un homogénat cellulaire laisser sédimenter les organites, et observer que leur vitesse de sédimentation est différente car leur densité diffère :

- les + denses sédimentent les premiers ;- les moins denses sédimentent par la suite.

La vitesse de sédimentation répond à l'équation suivante :V = Kr2(dp - dm)g c'est une vitesse V = dx/dt exprimée en m/s

V = vitesse de sédimentationK = facteur qui dépend de la viscosité du milieu dans lequel sont en suspension les organitesr = rayon de la particule considérée comme sphériquedp = densité de la particule d = (masse d'un vol. d'un corps x)/(masse du même vol. d'eau)dm = densité du milieug = accélération de la pesanteurKr2.(dp - dm) = coefficient de sédimentation dont l'unité est la seconde.Comme les valeurs des coefficients de sédimentation sont très petites, on les exprime plutôt en unités SVEDBERG (S) pour lesquelles 1 unité S = 10-13 seconde

La différence de densité des organites de la cellule est très faible, ce qui impliquerait une séparation

longue dans le temps. On utilise donc la centrifugation pour remplacer la pesanteur par une force centrifuge. L'accélération des particules sous l'effet de l'attraction terrestre, g, est remplacée par une accélération plus élevée notée, ?.L'équation donnant la vitesse de sédimentation devient : V = Kr2.(dp - dm).?

Dans une centrifugeuse on a ? = ?2r avec ? = vitesse angulaire exprimée en radian/seconde r = distance qui sépare la particule de l'axe de rotation

La vitesse d'une centrifugeuse est souvent exprimée en rpm = rotation par minute.Ainsi, ? = (rpm.2?/60)2.r on a converti rpm en radian/secondeL'accélération ? à laquelle on soumet les organites est généralement exprimée en multiples de g : (on dit, par exemple, centrifugation à x 1000 g) avec g = 9,81 m/s.D'où l'accélération ? exprimée en multiples de g devient :? = (rpm.2?/60)2.r/9,81? = (rpm)2.(2?/60)2.r/9,81? = (rpm)2.r.(2?/60)2/9,81? = (rpm)2.r.1,117.10-3 Le rayon qui sépare la particule de l'axe de rotation est généralement relevé en cm :? = (rpm)2.r/100.1,117.10-3 on a converti r mesuré en cm en m? = (rpm)2.r.11,17.10-6

? = 11,17.r.(rpm)2.10-6

? = 11,17.r.(rpm/1000)2

? = RCF = Relative Centrifuge Force = 11,17.r.(rpm/1000)2

avec r en cm, rpm = rotation par min,L’accélération ainsi calculée est exprimée en multiples de g

* L'ultracentrifugation différentielle :C'est à Albert CLAUDE que l'on doit cette technique.On l'appelle ultracentrifugation différentielle car basée sur la différence de vitesse de sédimentation des organites, elle-même reposant sur différence de densité des organites ; et ultra pour désigner que exploitation de faibles différences (comme pour ultrastructure) et utilisation d'accélérations importantes.On procède en deux temps : 1) fabrication d'un homogénat cellulaire

2) ultracentrifugation différentielle.

Les centrifugations sont réalisées en milieu refroidi et on doit donc disposer d'un équipement spécial = ultracentrifugeuse réfrigérée.Pratiquement la technique consiste à soumettre un homogénat de tissu à des centrifugations successives de plus en plus rapides. Les accélérations et les temps de centrifugation sont à adapter en fonction de la nature du matériel biologique étudié.

* L'ultracentrifugation sur gradient de densité :Cette technique permet de séparer en une seule fois des organites qui ont des vitesses de sédimentation très voisines (cf. très faibles différences de densité).On travaille dans un milieu présentant un gradient de densité, d'où le nom donné à la technique.

Principe : On a vu précédemment que la vitesse de sédimentation est fonction de la différence (dp - dm), or quand dp = dm Vsed = 0, l'organite s'immobilise ainsi dans la zone ou couche de gradient de densité qui correspond à sa propre densité.Les différents organites vont donc s'étager sur toute la hauteur du tube de centrifugation.La technique de centrifugation différentielle intervient rarement à partir d'un homogénat cellulaire, mais elle est plutôt pratiquée après l'ultracentrifugation différentielle à partir d'une fraction cellulaire donnée afin de la purifier.On travaille généralement sur un gradient de saccharose pour la purification d'organites (il existe une centrifugation sur gradient de chlorure de césium pour séparer des molécules d'acides nucléiques : différences de densités exploitées sont très finesConfection du gradient : Il est réalisé dans le tube à centrifuger avant le dépôt de la fraction cellulaire à analyser et la centrifugation (en centrifugation sur gradient de chlorure de césium le gradient de densité s'établit pendant la centrifugation). Le dispositif utilisé est le suivant :

Voir schéma donné pendant le cours

* Vérification de la pureté des fractions :- Cette vérification peut se faire par une observation au microscope électronique, mais cette technique n'est pas réalisable par tous les types de laboratoire amenés à effectuer du fractionnement cellulaire ;- on peut alors rechercher les activités enzymatiques connues pour être compartimentées spécifiquement à l'intérieur d'un organite donné : ex une enzyme mitochondriale détectée dans une fraction "noyau" est le signe de la présence de mitochondries, c'est à dire d'une contamination, donc d'une pureté imparfaite.

2. Les méthodes

2.1. Les méthodes d'analyse et de dosage biochimiquesElles sont appliquées soit à des homogénats, soit à des fractions cellulaires à partir desquels on obtiendra des extraits bruts = constituants biochimiques en solution.Elles consistent à rechercher la nature et la concentration des constituants biochimiques : glucides, lipides, protéines et acides nucléiques.Elles sont très nombreuses (voir TP Techno. d'Ana.) et concernent les techniques d'extraction, de purification, de caractérisation et de dosage.

2.2. Les méthodes cytochimiquesCes méthodes permettent de localiser les constituants biochimiques à l'intérieur des cellules.Ces méthodes s'adressent à des coupes.Différents exemples vont être donnés en illustration.* ex : localisation de polysaccharides : réaction à l'APS APS = Acide Périodique - réactif de SchiffC'est la méthode la plus employée pour localiser les polysaccharides dans la cellule.Elle se réalise sur des coupes tissulaires en deux temps :1) oxydation des polysaccharides par l'acide périodique IO4H. Il y a alors formation de fonctions aldéhydes à partir de certaines fonctions alcool (= groupement hydroxyle) des oses qui constituent

les polyholosides. La coupe est trempée dans un bain d'AP.2) mise en évidence des fonctions aldéhydes apparues par le réactif de Schiff. La coupe est immergée dans un bain de réactif de Schiff.On obtient une coloration rouge dans les régions cellulaires riches en polysaccharides. La coupe est ensuite observée au microscope photonique par transmission.3) Pour connaitre la nature des polysaccharides détectés dans les différentes régions de la préparation, on effectue au préalable une digestion enzymatique. La coupe est trempée dans une solution tamponnée d'une enzyme donnée (ex. la glycogénase). Puis on réalise la réaction APS. On compare la première lame et de la seconde, et on recherche les zones dans lesquelles la coloration rouge a disparu. On en déduit alors la localisation du polysaccharide recherché (ex glycogène).

* ex : localisation d'acides nucléiques : test de Brachet et réaction de FeulgenCette technique est employée pour localiser les acides nucléiques dans la cellule.Elle est toujours réalisée à partir de coupes.Ce test combine :

l une méthode de coloration au mélange [vert de méthyle + pyronine] : l vert de méthyle ----> ADN vertl pyronine ----> ARN rouge

l l'emploi d'enzymes capables d'hydrolyser de façon spécifique soit l'ADN soit l'ARN, càd DNase et RNase. Le traitement par les nucléases est nécessaire pour vérifier la spécificité de la coloration, car la coloration au vert de méthyle-pyronine n'est pas très spécifique.coupe A sert de témoin et n'est pas traitée par les nucléases ;coupe B est traitée par la DNase ;coupe C est traitée par la RNase.

Puis ces trois coupes sont colorées par le mélange vert de méthyle-pyronine et sont observées au microscope photonique par transmission.

l noyau contient ADN (chromatine) et ARN (nucléole bien visible, mais transcription partout aussi) ;

l cytoplasme contient ARN pas d'ADN (l'ADN mitochondrial et chloroplastique n'est pas visible à l'intérieur de ces organites car sont rarement observables en microscopie photonique).

* Localisation d'antigènes (Ag) et d'anticorps (Ac) : utilisation des "outils anticorps"Ce sont des méthodes très générales car à partir du moment où on a l'Ac on peut localiser n'importe quel Ag c'est à dire n'importe quelle molécule. Ces méthodes reposent donc sur la propriété de reconnaissance spécifique des anticorps.On travaille toujours à partir de coupes tissulaires.La méthode se déroule en deux temps :- 1) formation du complexe Ag-Ac = complexe immun : la coupe est trempée dans un bain contenant l'anticorps en solution ;- 2) révélation de la présence des complexes immuns : utilisation d'outils immunologiques marqués, par exemple anti-anticorps = anti-immunoglobuline = anti-Ig = antiglobuline marquée.Il existe différentes façons de marquer les "anticorps révélateurs" :- par des enzymes capables d'utiliser un substrat chromogène c.à.d. capable de donner un produit coloré détectable ----> observation en microscopie photonique par transmission ;- par des fluorochromes ----> observation au microscope à fluorescence ;- par des radioisotopes ----> autoradiographie (voir § plus tard) puis observation de la coupe et de la plaque photographique en parallèle au microscope photonique ou électronique.

3ème PARTIE :METHODES D'ETUDE DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES

Elles s'adressent à différents matériels cellulaires : fragments de tissus, coupes, homogénats ou fractions cellulaires.

1. Méthodes utilisant des molécules marquées par des radioisotopes = précurseurs radioactifs

1.1. PrincipeCes méthodes consistent à mettre une préparation biologique en contact avec une molécule radioactive donnée appelée souvent précurseur radioactif = phase d'absorption.Après une durée variable d'incubation, la molécule radioactive est incorporée c.à.d. intégrée dans le métabolisme cellulaire = phase d'incorporation.On dose ensuite, dans la préparation biologique, la molécule précurseur fournie ou les produits radioactifs qui en dérivent. Ces dosages sont effectués à partir de prélèvements échelonnés dans le temps, on réalise ainsi une étude cinétique du devenir du précurseur radioactif à l'intérieur des cellules.Les résultats obtenus renseignent donc sur les modalités d'utilisation de la substance fournie par les cellules. Cette démarche est largement utilisée pour l'étude du métabolisme cellulaire.

1.2. Les radioisotopes les plus utilisés

Ce sont le tritium 3H, le 14C et le 32P.Ils émettent un rayonnement ? : l'énergie de ce rayonnement est la plus faible pour le tritium et la plus élevée pour le 32P, pour ce dernier on dit aussi qu'il émet des ? durs, le 14C émet, lui, des ? mous.Ils se caractérisent par une demi-vie dont la valeur est importante à connaître lors des processus de décontamination.La manipulation des radioisotopes fait l'objet d'une règlementation très stricte régie par la loi : formation obligatoire du personnel pour obtention d'un agrément + locaux adéquats et procédures obligatoires pour la gestion du risque (locaux agrées) + gestion des déchets spécialisée.

Classement par ordre décroissant d'énergie du rayonnement ? (électrons) qu'ils émettent :isotope demi- vie 131I émet aussi un rayonnement ?32P 14 jours131I 8,1 jours35S 87 jours14C 5570 années45Ca 164 jours3H 12,3 annéesLa demi-vie est le temps nécessaire à la désintégration de 50 % des atomes d'un isotope.

Exemples de précurseurs radioactifs :- pour l'étude du métabolisme de l'ADN : thymidine tritiée ;- pour l'étude du métabolisme de l'ARN : uridine tritiée ;- pour l'étude du métabolisme des protéines : acides aminés tritiés ou marqués par le 14C ;- pour l'étude du métabolisme glucidique : glucose marqué au 14C.

1.3. Absorption des éléments radioactifs par les cellules

* Expérience in vivo :On introduit dans un organisme vivant le précurseur marqué :ex animal, le précurseur est incorporé dans la nourriture ou on l'injecte ;ex végétal, le précurseur est présent dans l'atmosphère ou en solution dans l'eau d'arrosage.On prélève ensuite des morceaux de tissu à des temps échelonnés (biopsie).

* Expérience in vitro :On prélève tout d'abord sur l'organisme le tissu contenant les cellules que l'on veut étudier, ou on s'adresse à des cellules cultivées in vitro (culture de cellules de mammifères et de plusieurs types cellulaires bien maitrisée à l'heure actuelle).On fait incuber des fragments du tissu découpés au préalable, ou les cellules cultivées in vitro, dans un milieu aqueux contenant le précurseur marqué.On effectue ensuite des prélèvements à des intervalles de temps réguliers.

* Temps de pulse - temps de chasse :Le marquage radioactif des cellules se déroule selon deux étapes :- temps de pulse = fourniture du précurseur radioactif à l'échantillon biologique pendant un temps très court ;- temps de chasse = fourniture pendant un temps relativement long du même précurseur mais non radioactif (précurseur "froid"). Ce temps suit le temps de chasse et dure tout le temps des prélèvements.- Intérêt = alimenter en continu une voie métabolique sans permettre au marquage radioactif de s'étendre à d'autres voies que celle que l'on veut cibler. Le précurseur radioactif n'étant présent que peu de temps il va être incorporé au sein de l'activité cellulaire prépondérante qui privilégie son utilisation.

1.4. Méthodes de détection de la radioactivité dans des préparations biologiques

Deux méthodes sont utilisables : l'autoradiographie et la scintillation liquide.

* L'autoradiographie

C'est une méthode qui permet de suivre le devenir de constituants biochimiques en termes de localisation tissulaire ou cellulaire. C'est une méthode qualitative : on détecte la présence et la localisation du composé radioactif.

Cette méthode s'adresse à des coupes tissulaires ou cellulaires destinées à la microscopie photonique ou électronique. Le tissu a préalablement incorporé le précurseur radioactif ; et l'on a réalisé des coupes selon les étapes déjà décrites.

- On recouvre la préparation biologique (coupe, chromatogramme ou électrophorégramme) par une émulsion photographique ou un film photographique qui contient du bromure d'argent BrAg. - L'énergie libérée par le rayonnement émis par les radioisotopes contenus dans la préparation biologique arrache un électron à un cristal BrAg et cet électron réduit un ion Ag+ du bromure d'argent BrAg en atome d’argent métallique Ag. On obtient ce que l'on appelle l'image latente (latente car pas encore visible en raison du petit nombre d’atome d’argent métallique formés). L'obtention de cette image latente est lente : 15 jours de contact avec un marquage par le 32P (cf. rayonnements ? durs) ou 3 à 5 semaines avec le 14C (cf. rayonnements ? mous).

- Cette image latente est ensuite transformée en image visible au cours de la révélation ou développement du film photographique qui se déroule en trois étapes :

- bain révélateur (agent réducteur qui opère en milieu basique) qui complète la transformation des ions Ag+ en argent métallique Ag de façon à ce que les grains d’argent métallique soient plus gros (le révélateur n’est actif que sur les cristaux de BrAg ayant été exposés à la lumière, là où a été initiée la réduction des Ag+ cf. propriété nouvelle de ces cristaux avec présence d’Ag métallique) ;- bain d’arrêt qui stoppe l’action du révélateur (acide acétique ou citrique qui agit par diminution du pH) ;- bain fixateur (ions thiosulfate) qui complexe les ions argent Ag+ des cristaux de BrAg restant, entraîne leur dissolution et donc l’élimination du BrAg en excès : le fond du film photographique devient transparent.

- On observe en parallèle la préparation biologique et le film photographique. Les grains d’argent forment des taches sombres qui correspondent aux régions de la préparation biologique hébergeant des molécules radioactives.Cette méthode est également utilisée pour mettre en évidence des constituants biochimiques radioactifs séparés par chromatographie ou électrophorèse.Le chromatogramme (souvent sur papier) ou le gel d'électrophorèse (agarose ou polyacrylamide) est mis en contact avec une plaque photo qui est impressionnée puis révélée.On identifie ainsi les constituants devenus radioactifs en repérant l'emplacement des taches de radioactivité de la plaque photo par rapport aux spots de migration caractéristique de chaque constituant identifié et séparé par chromatographie ou électrophorèse.

* Le compteur à scintillation liquideCette méthode de détection de la radioactivité peut être appliquée à des cellules entières, à des fragments de tissu, des homogénats, des fractions cellulaires ou des morceaux découpés de chromatogramme ou électrophorégramme. C'est une méthode quantitative : on peut faire le dosage de constituants grâce à leur radioactivité. Il s'agit de surcroît d'une méthode de dosage très sensible, bien plus que ne le permet un dosage spectrophotométrique par exemple.Dans le cas d'une étude à partir de fractions cellulaires on peut aussi localiser indirectement la radioactivité, donc les constituants au niveau des ultrastructures cellulaires et les doser.On utilise des substances scintillantes liquides comme le POPOP et le PPO qui sont capables d'émettre une scintillation très fugitive (= lumière) lorsque ces molécules sont traversée par une radiation ionisante comme l'est un rayonnement radioactif.- La préparation biologique est plongée = immergée dans un mélange scintillant contenu dans une petite fiole (pilulier) ;- La lumière émise est mesurée lorsque le pilulier passe, à l'intérieur du compteur, devant un photomultiplicateur électronique. Les photons émis lors de la traversée des rayonnements radioactifs sont alors transformés en impulsions électriques. L'intensité de la radioactivité détectée est exprimée en coup par minute = cpm.

* Remarque : le compteur Geiger Müller : = autre appareil de mesure de la radioactivité Il est constitué par un cylindre métallique fermé par une membrane extra-mince.A l'intérieur et dans une atmosphère de gaz rares (hélium, argon + alcool) se trouvent deux électrodes isolées et portées à une tension électrique de l'ordre de 1000 volts.Quand une radiation ? ou ? provenant des radioisotopes traverse la membrane, cette radiation produit une ionisation passagère du milieu gazeux, ce qui permet le passage du courant entre les

deux électrodes = impulsion électrique ou coup. L'intensité de radioactivité est exprimée en cpm.Le compteur Geiger Müller n'est pas utilisé pour mesurer la radioactivité présente dans des échantillons biologiques car les quantités utilisées sont très faibles et elles ne sont pas détectables avec précision avec ce type d'appareil bien moins sensible que le compteur à scintillation liquide.Par contre le compteur Geiger Müller peut trouver sa place dans un labo de biologie pour déceler d'éventuelles contaminations de paillasse.

2. Autres méthodes

2.1. La micromanipulation

A l'aide de micromanipulateurs placés sur la platine du microscope on peut réaliser de véritables opérations chirurgicales au niveau de la cellule dont on observe ensuite les conséquences.Exemples : Énucléation, microinjections, technique du "patch clamp" (étude de la propagation du signal électrique le long de la membrane du neurone et du fonctionnement des canaux ioniques membranaires), microrespiromètres, microélectrodes (mesure du pH cytosolique et vacuolaire) ....

2.2. La micropuncture à UV et rayon laser

Grâce à l'utilisation de faisceaux lumineux très petits (UV ou mieux laser) on peut effectuer des destructions limitées et en observer ensuite les conséquences.

2.3. La microcinématographie

C'est une méthode utilisée depuis longtemps. On adapte une caméra au microscope et on filme la vie d'une cellule. La caméra peut étendre ou comprimer le temps.On peut travailler en lumière visible mais aussi en UV et IR, ce qui permet de relever des phénomènes que l'?il humain ne peut déceler.

4ème PARTIE : LA CYTOFLUORIMETRIE DE FLUX

1. Les différents éléments d'un cytofluorimètre - Principe de fonctionnement

Voir schéma de principe du cytofluorimètre incluant la fonction de tri donné en cours

Cytofluorimétrie de flux = méthode d'ANALYSE et éventuellement de TRI de CELLULES généralement RENDUES FLUORESCENTES ou marquées sélectivement par des anticorps sur lesquels sont greffés des fluorochromes.Le tri n'est pas toujours l'activité prépondérante d'un service de cytofluorimétrie, l'activité prépondérante réside dans l'analyse.Lorsqu'on réalise le tri l'appareil est désigné sous l'appellation anglaise F.A.C.S. = Fluorescence Actived Cell Sorter (sorter = trieur en anglais).

* Chronologie des opérations réalisées dans cet appareil :• chaque cellule est séparée des autres à l'intérieur d'une microgoutte = individualisation ;• ces cellules individuelles circulent en une seule file dans un léger courant de liquide = flux

de microgouttes ;• les cellules (c.à.d. les microgouttes) sont traversées une à une à par un faisceau laser =

éclairement ;• on détecte la lumière dispersée et la lumière de fluorescence pour chacune des

microgouttes = détection ;• les infos recueillies sont analysées par un système informatique = analyse ;

• en fonction des caractéristiques retenues les cellules peuvent être ensuite triées = tri.

* Comment peut-on s'adresser à des cellules individuelles ?On s'adresse à une suspension cellulaire contenant des cellules préalablement rendues fluorescentes. Cette suspension "marquée" est introduite dans un vibrateur ultrasonique de distribution en même temps qu'un fluide d'entrainement. La suspension est mélangée au fluide d'entrainement (dilution des cellules).Sous l'effet des vibrations de la membrane du vibrateur, il se forme en sortie du vibrateur un flux de microgouttelettes. Ce fractionnement de la suspension diluée est conçu pour individualiser les cellules.En effet, chaque microgouttelettes doit contenir 0 ou 1 cellule.

* Analyse du contenu de chaque microgoutteLe flux de microgouttes passe devant un rayon laser de longueur d'onde choisie permettant de façon générale l'excitation du fluorochrome utilisé pour le marquage préalable des cellules.Le rayon laser doit être utilisé ici pour permettre le seul éclairement de la microgoutte, sa finesse lui permet d'être adapté aux dimensions des cellules.Chaque cellule émet des signaux de diffusion (dispersion) et/ou de fluorescence.Ces signaux sont détectés par deux types de détecteur :

détecteur à lumière dispersée + détecteur de lumière de fluorescence.Les propriétés de diffusion et d'émission de lumière de chaque cellule sont analysées à l'aide d'un système informatique.Ces signaux analysés seront corrélés à des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cellules.

* Comment se fait le tri ?Les détecteurs transmettent les caractéristiques des microgouttelettes à un système informatique.Si la cellule présente les caractéristiques désirées, l'ordinateur les traduit en impulsions électriques.Ainsi, les gouttelettes contenant une cellule unique et possédant les caractéristiques sélectionnées au préalable reçoivent automatiquement une charge positive par exemple = charge électrique des gouttes du flux.Les gouttelettes contenant une cellule ayant d'autres caractéristiques sont elles chargées négativement.Les gouttelettes ne contenant pas de cellule ou contenant des amas cellulaires (forte lumière dispersée) ne sont pas chargées.Le flux de microgouttelettes passe ensuite entre deux plaques de charge électrique opposée.Selon leur charge électrique les gouttelettes sont déviées et recueillies dans des récipient de collecte.Trois sortes de récipients donc :

- récipient pour cellules chargées + = type cellulaire A, - récipient pour cellules chargées négativement = type cellulaire B,- récipient "poubelle" pour gouttes non chargées = amas de cellules ou pas de cellule c.à.d. que du liquide.

2. Paramètres étudiés

Les paramètres mesurables par ce type d'appareil permettent :l un examen de la morphologie des cellules ;l et une étude qualitative et quantitative de la composition + du fonctionnement des

cellules.

2.1. Les paramètres permettant un examen des caractéristiques morphologiques des cellulesL'analyse de ces paramètres ne nécessite aucun marquage cellulaire.Ils permettent en les combinant de définir des sous populations de cellules en se basant uniquement sur les caractéristiques morphologiques des cellules.Ils sont au nombre de trois :* paramètre FAS = forward angle scatter = FSC Analyse de la lumière diffusée sous un angle de 2° à 12° par rapport à l'axe du laser.Cette analyse fournit des données proportionnelles à la taille de la cellule.* paramère RAS = righ angle scatter = paramètre SSC ( side scatter ) Analyse de la lumière diffusée sous un angle droit (90°) par rapport à l'axe du laser.Cette analyse fournit des données sur la granularité ou le rapport nucléo-cytoplasmique de la cellule.* paramètre AXL = axial extension lengh Mesure de l'extension dans l'axe du laser.Cette analyse fournit des données sur le diamètre de la cellule.

2.2. Les paramètres permettant un examen de la composition et du fonctionnement des cellulesLa cytofluorimétrie de flux repose largement sur l'utilisation de sondes chimiques que sont les fluorochromes seuls ou immunologiques avec les anticorps couplés à des fluorochromes.La mesure des paramètres qui donnent des informations sur les caractéristiques cellulaires nécessite l'émission de fluorescence. En effet, peu de propriétés physiques ou biochimiques sont spontanément mesurables sur les cellules individuelles (matériel biologique en quantité indécelable).

Ces sondes fluorescentes permettent de révéler les macromolécules cellulaires.

L'émission de fluorescence peut être de deux types :----> fluorescence naturelle (autofluorescence) généralement très faible pour les cellules ;----> fluorescence conférée à la cellule par :

l la coloration spécifique d'un constituant cellulaire / ADN, ARN, calcium intracellulaire ...l un substrat fluorogénique (activité enzymatique ou cellulaire ex mesure de la fluidité

membranaire ...)l la fixation d'un ligand ou d'un anticorps couplé à un fluorochrome (immunofluorescence),

deux techniques de marquage sont envisageables :- IF directe l'anticorps est directement couplé au fluorochrome,- IF indirecte l'anticorps est révélé par un 2ème anticorps = antiglobuline marquée par un fluorochrome.

3. Les fluorochromes en cytofluorimétrie

3.1. Les fluorochromes et leur utilisationUn fluorochrome est défini par sa longueur d'onde maximale d'excitation ?1 et par sa longueur d'onde maximale d'émission ?2, avec ?2 > ?1.La raie laser utilisée doit correspondre à la longueur d'onde maximale d'excitation.Le jeu de filtre placé avant le détecteur de fluorescence doit correspondre à la longueur d'onde maximale d'émission.Ainsi dans un cytofluorimètre plusieurs rayons laser sont nécessaires et plusieurs détecteurs de fluorescence sont nécessaires.Les fluorochromes peuvent se fixer sélectivement sur certains constituants cellulaires, on peut alors visualiser certaines molécules ou visualiser les structures qui les supportent.Lorsque le fluorochrome est greffé sur un anticorps, on repère la molécule spécifiquement reconnue par l'anticorps.Les chercheurs ont une grande variété de fluorochromes capables de se fixer aux constituants cellulaires. Voir planche

3.2. Le double marquage* le fluorochrome se lie à des constituants cellulaires et permet de caractériser les structures cellulairesPar exemple on peut réaliser le marquage simultané des protéines et des acides nucléiques avec bien évidemment des fluorochromes dont les spectres d'émission sont différents, l'idéal étant l'utilisation d'un seul rayon laser c.à.d. choix de fluorochromes ayant une même longueur d'onde d'excitation.* Lorsque le fluorochrome est couplé à un anticorps Plusieurs épitopes (molécules) peuvent être révélés sur une même cellule en combinant plusieurs Ac couplé chacun à un fluorochrome différent (double, voire triple fluorescence).Le couple de fluorochrome classiquement utilisé est le suivant :

l fluorescéine ---> excitation 488 nm et émission de couleur vertel rhodamine ---> excitation 488 nm et émission de couleur rouge.

4. Le traitement des données en cytofluorimétrie

4.1. Le cytogrammeAvec le cytogramme, les informations relatives à chaque cellule sont visualisées sous forme

biparamétrique. Voir plancheDeux paramètres sont visualisés simultanément, chaque point symbolise une cellule.Il est possible de définir une sous-population sur la base de deux paramètres : par exemple, un paramètre morphologique pour définir le type cellulaire et un paramètre de fluorescence pour définir la fonction cellulaire. On peut observer des nuages de points localisés en des endroits différents du cytogramme, chaque nuage représente une population ou sous-population cellulaire.

4.2. L'histogrammeAvec le histogramme, les informations relatives à chaque cellule sont visualisées sous forme monoparamérique. Voir plancheC'est la fréquence (n) d'évènements caractérisés par le paramètre choisi.Cela donne le nombre de cellules qui possède une caractéristique donnée.

4.3. La représentation tridimensionnelle On fait une analyse en marquage multiple, on rassemble les informations du cytogramme et de l'histogramme pour en proposer une représentation tridimensionnelle. Voir plancheChaque population ou sous-population apparait sous forme d'un pic en trois dimensions et la hauteur du pic reflète le nombre de cellules appartenant à cette population ou sous-population.

5. Le tri

On ne l'envisage qu'après avoir analysé l'échantillon.Grâce à l'analyse, on repère les caractéristiques qualitatives (nature des paramètres) et quantitatives (intensité des paramètres) qui définissent le type cellulaire que l'on souhaite trier.Pour chaque paramètre on définit des limites, on dit aussi qu'on définit une "fenêtre" qui permettra d'éliminer ce qui n'est pas intéressant pour ne retenir que ce qui va présenter une intensité comprise dans la "fenêtre".En fonction des paramètres et des "fenêtres" retenus, une impulsion électrique est envoyée à chaque microgouttelette contenant la cellule intéressante à sa sortie de la chambre de détection.Les microgouttelettes chargées seront déviées vers une plaque de charge opposée et recueillie dans un même récipient de collecte.De plus, on peut connaitre le % d'évènements sélectionnés dans ces fenêtres par rapport au nombre total d'évènements c.à.d. le nombre de cellules possédant les caractéristiques sélectionnées dans la population cellulaire totale analysée.Notons que le tri ne constitue pas l'activité prépondérante d'un service de cytofluorimétrie, en général on y fait surtout de l'analyse.Performance : tri de 5 000 cellules / seconde et sélection d'une cellule parmi 1 000.Néanmoins la technologie du tri, bien qu'unique, reste relativement lente pour recueillir de grandes quantités de cellules.De plus elle est relativement délicate à mettre en ?uvre dans le cadre d'une application routinière.

6. Avantages et limites technologiques

6.1. Avantages- grande rapidité d'analyse qui permet d'analyser un nombre important de cellules ;- finesse et fidélité des mesures cellules par cellule ;

- multitudes des paramètres observables simultanément et de manière corrélée ;- grande sensibilité permettant d'étudier des éléments subcellulaires (à l'intérieur de la cellule) ;- possibilité d'un tri cellule par cellule.

6.2. Limites- le marquage sélectif des types cellulaires est souvent l'étape limitante de la cytofluorimétrie de flux (rien à voir avec les performances de l'appareil donc) ;- pas toujours facile d'obtenir un flux de cellules individualisées, par exemple avec des cellules qui ont tendance à s'agréger = à former des amas, donc notion de matériel cellulaire non analysable en cytofluorimétrie de flux ;- taille des cellules et dimension (diamètre) de la chambre d'analyse qui sont parfois incompatibles ;- nature et la puissance de la source de lumière excitatrice ne permet pas toujours de révéler des différences ;- sensibilité des photomultiplicateurs qui pourront ne pas permettre la détection d'un signal ;- capacité de la gestion électronique = informatique ;- rendement de l'opération de tri : si la catégorie cellulaire est peu représentée dans la population ---> passage de nombreuses cellules nécessaire ---> utilisation prolongée de l'appareil ---> coût élevé (généralement on fait une utilisation raisonnable du cytofluorimètre donc le nombre de cellules triés est réduit).

7. Remarques sur le clonage cellulaire

Le cytofluorimètre est utilisé par des spécialistes et ne peut pas faire l'objet d'une utilisation routinière.Au lieu de trier, pour s'adresser à un seul type cellulaire on peut aussi cloner les cellules.Un clone = une population cellulaire dérivée d'une cellule unique.* Le clonage en microbiologieLes cellules sont cultivées en suspension d'abord. Puis l'individualisation des cellules fait intervenir une culture en milieu solide (milieu de culture gélosé).La suspension est diluée de telle sorte qu'une fraction aliquote de cette suspension diluée et étalée à la surface d'un milieu solide permette l'obtention de colonies isolées.Chaque colonie représente un clone cellulaire.* Le clonage de cellules cultivées en suspension (ou en monocouche) La suspension est diluée de telle sorte qu'une fraction aliquote de volume déterminé ne contienne que 0 ou 1 cellule. Cette fraction est mise en culture dans un milieu approprié, très riche dont la composition est parfois délicate à établir. Exemple suspension à 106 cellules / mL, dilution 105 fois donne une suspension à 10 celules./mL, on peut répartir cette suspension dans des fractions de 100 µL voire 50 µL.

Chapitre : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE

1ère PARTIE : METHODES D'ETUDE DE LA MORPHOLOGIE DES CELLULES

1. Les microscopes 1.1. Les microscopes à lumière ou microscopes photoniques

1.1.1. Microscopes par transmission1.1.2. Les autres microscopes photoniques

* Le microscope à contraste de phase * Le microscope à fond noir* Le microscope à lumière polarisée* Le microscope à rayons UV (= microscope à fluorescence)* Le microscope confocal à balayage

1.2. Les microscopes électroniques1.2.1. Généralités

* Principe :* Performances * Inconvénients * Il existe deux types de microscope électronique.

1.2.2. Le microscope électronique par transmission1.2.3. Le microscope électronique à balayage

2. Les conditions d'observation aux microscopes2.1. Méthodes d'études par microscopie à lumière

2.1.1. Les contraintes et les différentes étapes du traitement des échantillons2.1.2. La fixation

* Fixation par traitement chimique* Fixation par traitement physique* Comparaison des performances

2.1.3. Durcissement de l'échantillon et obtention de coupes* Durcissement par inclusion * Durcissement par congélation* Comparaison des performances * Obtention de coupes

2.1.4. Obtention de contrastes et observation2.1.5. Valeurs des observations

2.2. Méthodes d'études par microscopie électronique2.2.1. Les contraintes et les différentes étapes du traitement des échantillons2.2.2. Observation d'objets de petite taille

* Observation en microscopie électronique par transmission (technique de l'ombrage + coloration négative)* Observation en microscopie électronique à balayage

2.2.3. Observation de coupes minces * Fixation* Durcissement* Confection de coupes* Obtention de contrastes

2.2.4. Observation de coupes épaisses2.2.5. Valeur des observations

(diffraction des rayons X aux petits angles + cryodécapage)

2ème PARTIE : METHODES D'ETUDE DE LA COMPOSITION BIOCHIMIQUE DES CELLULES

1. Les matériels cellulaires

1.1. Cellules entières ou à des coupes de cellules1.2. Broyats cellulaires = homogénats cellulaires

* Différentes techniques sont utilisables * Conditions de manipulation

1.3. Fractions cellulaires* Principe de la séparation des organites cellulaires* L'ultracentrifugation différentielle* L'ultracentrifugation sur gradient de densité* Vérification de la pureté des fractions

2. Les méthodes

2.1. Les méthodes d'analyse et de dosage biochimiques2.2. Les méthodes cytochimiques

* ex : localisation de polysaccharides : réaction à l'APS * ex : localisation d'acides nucléiques : test de Brachet et réaction de Feulgen* localisation d'Ag et d'Ac : utilisation des "outils anticorps"

3ème PARTIE : METHODES D'ETUDE DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES

1. Méthodes utilisant des molécules marquées par des radioisotopes = précurseurs radioactifs

1.1. Principe1.2. Les radioisotopes les plus utilisés1.3. Absorption des éléments radioactifs par les cellules

* Expériences in vivo* Expériences in vitro* Temps de pulse - temps de chasse

1.4. Méthodes de détection de la radioactivité dans des préparations biologiques* L'autoradiographie* Le compteur à scintillation liquide

2. Autres méthodes

2.1. La micromanipulation2.2. La micropuncture à UV et rayon laser2.3. La microcinématographie

4ème PARTIE : LA CYTOFLUORIMETRIE DE FLUX

1. Les différents éléments d'un cytofluorimètre - Principe de fonctionnement

2. Paramètres étudiés

2.1. Les paramètres permettant un examen des caractéristiques morphologiques des cellules2.2. Les paramètres permettant un examen de la composition et du fonctionnement des cell.

3. Les fluorochromes en cytofluorimétrie

3.1. Les fluorochromes et leur utilisation3.2. Le double marquage

4. Le traitement des données en cytofluorimétrie

4.1. Le cytogramme4.2. L'histogramme4.3. La représentation tridimentionnelle

5. Le tri

6. Avantages et limites technologiques

6.1. Avantages6.2. Limites

7. Remarques sur le clonage cellulaire