31

Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2011, 150(1-4), 31-46

CHARGE MICROBIENNE DE PLANTES MÉDICINALES SÉCHÉES À L’AIR LIBRE (*)

Jihane ENNADIR ( 1 ) , Imane THAMI ALAMI ( 2 ) , Amina OUAZZANI TOUHAMI ( 3 ) , Rachida HASSIKOU ( 1 )

La charge fongique et microbienne a été évaluée sur onze espèces médicinales largement utilisées au Maroc et séchées à l’air libre : Aloysia citriodora, Artemisia herba-alba, Clinopodium nepeta, Laurus nobilis, Nigella sativa, Origanum compactum, O. elongatum, Rosa X centifolia, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis et Syzygium aromaticum.

L’isolement par la méthode de la plaque ou par celle de suspensions-dilutions donne des résultats différents. Des espèces fongiques ont été identifiées appartenant aux genres Acremonium, Aspergillus, Epicoccum, Penicillium, Pythium, Rhizopus et Stemphylium, ainsi que des levures et des mycéliums non sporulés. Des entérobactéries ont été également détectées.

(*) Manuscrit reçu le 24 février 2010. (1) Laboratoire de Botanique, Unité de mycologie, Faculté des Sciences, Université

Mohammed V, 4 Avenue Ibn Battouta, BP 1014 RP, 11000 Rabat, Maroc. ennadir_jihane27@hotmail.fr, hassi_rachida@yahoo.fr

(2) Laboratoire de microbiologie, unité d’amélioration des plantes, Institut National de la Recherche Agronomique, Av de la victoire, BP 415, 11000 Rabat, Maroc. thamialami_ma@yahoo.fr

(3) Laboratoire de Botanique et de Protection des Plantes, Faculté des Sciences, Université Ibn Tofaïl, 14000 Kénitra, Maroc. touhami01@hotmail.com

32

INTRODUCTION

L’usage des plantes médicinales au Maroc tend à se développer de par la sur vivance de l’herboristerie traditionnelle et le renouveau de la phytothérapie [3]. Cet engouement s’explique par la méfiance vis-à-vis des produits de synthèse et l’envie de consommer des produits « bio », le cout raisonnable des ces plantes en comparaison avec les médicaments conventionnels, conjugué à la diminution du pouvoir d’achat des populations, la relative disponibilité de ces plantes, surtout dans les régions les plus éloignées et au sein des populations les moins favorisées, notamment dans le milieu rural, les procédés de traitement et d’utilisation relativement faciles à mettre en œuvre [16].

Le Maroc offre une gamme complète de bioclimats méditerranéens favorisant une flore riche et variée avec un endémisme marqué. Sur les 5000 espèces et sous-espèces répertoriées en Afrique du nord, 4200 poussent au Maroc, dont au moins 500 sont potentiellement aromatiques et/ou médicinales et 250 sont utilisées [25].

L’exploitation de cette richesse est souvent effectuée de manière artisanale en tenant peu compte des systèmes modernes de production, des circuits de commercialisation et des techniques de valorisation [4].

Au Maroc, le séchage reste archaïque et peu en adéquation avec les exigences de qualité du marché international [3,17,30]. Le séchage traditionnel ne protège pas contre une reprise d’humidité pouvant favoriser le développement de moisissures et de bactéries avec comme risque une production de mycotoxines et de toxines [5-6].

Dans ce travail, la charge fongique et bactérienne de 17 échantillons de plantes médicinales a été évaluée qualitativement et/ ou quantitativement.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Échantillons végétaux

Quatorze échantillons de plantes médicinales ont été acquis d’herboristeries de différentes régions du Maroc séchés à l’air libre (Tableau I).

33

Tableau I : Origine des quatorze échantillons de plantes médicinales étudiées.

Nom latin Nom français

Famille Herbo- risterie

Lieu de récolte

Année récolte

Artemisia herba-alba Asso

Armoise blanche

Astéracées Salé Karsif sauvage

2009

Clinopodium nepeta (L.) Kuntze (= Calamintha nepeta (L.) Savi)

Calament officinal

Lamiacées Salé Shoul sauvage

2009

Origanum compactum Benth.

Origan compact

Lamiacées Rif Rif sauvage

2009

Origanum compactum Benth.

Origan compact

Lamiacées Moyen-Atlas

Moyen-Atlas sauvage

2009

Origanum compactum Benth.

Origan compact

Lamiacées Salé Ouazzane sauvage

2009

Rosmarinus officinalis L.

Romarin Lamiacées Moyen-Atlas

Moyen-Atlas sauvage

2009

Salvia officinalis L. Sauge officinale

Lamiacées Salé Sidi Allal Tazi cultivé

2009

Thymus vulgaris L. Thym Lamiacées Tafraout Tafraout sauvage

2009

Thymus vulgaris L. Thym Lamiacées Marrakech Ijoukak sauvage

2009

Laurus nobilis L. Laurier sauce

Lauracées Salé Beni Mellal cultivé

2009

Syzygium aromaticum (L.) Merr. et L.M.Perry

Giroflier Myrtacées Salé importé d’Asie

non commu-

niqué Nigella sativa L. Nigelle

cultivée Renonculacées Salé Marrakech

cultivé 2009

Rosa X centifolia L. Rosier de mai

Rosacées Salé Kalat Magouna cultivé

2009

Aloysia citriodora Palau (= Verbena triphylla L’Hér.)

Verveine Verbénacées Salé Tadla cultivé

2009

Évaluation quantitative de la flore fongique

Les champignons ont été isolés [8] sur milieu Sabouraud (peptone de caséine et de viande 10 g, glucose monohydrate 40 g, agar 15 g, eau distillée 1000 ml) stérilisé 20 min à 120°C. Du chloramphénicol (0,5 g/l) est additionné une fois la température du milieu descendue vers 47°C pour limiter l’accroissement des bactéries.

34

Deux méthodes d’isolement ont été appliquées, la méthode des suspensions-dilutions [22] et la méthode de la plaque [29]. Les pesées ont lieu sur papier propre avec des gants à usage unique afin d’éviter d’éventuelles contaminations par le manipulateur.

Pour la méthode des suspensions-dilutions, 10 g de chaque plante ont été introduits dans des sacs en plastique jetables stériles d’un broyeur mécanique Stomacher avec 90 ml d’eau distillée stérile afin d’obtenir une suspension homogène. Des tests préliminaires ont révélé que les échantillons ne renferment pas un taux élevé de contaminants et qu’il n’est pas utile de préparer d’autres dilutions. Un ml est ensemencé en surface sur toute la surface de la boite avec un étaloir en verre stérile.

Pour la méthode de la plaque, 15 mg de chaque échantillon sous forme de poudre (broyeur Moulinex) sont déposés au centre d’une boite de Petri contenant le milieu de culture auquel on additionne à l’aide d’une pipette stérile deux gouttes d’eau distillée stérile réparties sur toute la surface avec un étaloir.

Trois boites de Petri ont été ensemencées puis placées à l’obscurité dans une étuve réglée à 26°C pendant 3 à 5 jours. L’expérience a été répétée trois fois.

Les colonies sont alors dénombrées et correspondent à autant de spores (ufc : unité formant colonie). Une partie des espèces a pu être identifiée. Leur pourcentage par rapport au nombre total de colonies a été calculé.

Évaluation qualitative de la mycoflore

Les colonies formées sont repiquées jusqu’à trois fois dans des boites contenant le milieu Sabouraud afin d’obtenir des isolats purs.

On observe les caractères culturaux : forme des colonies (arrondie, rayonnante…), aspect du mycélium aérien (dense, poudreux…), couleur de la colonie qui dépend du milieu utilisé, sporulation, durée de croissance, aspect du revers de la culture qui donne une idée sur la pigmentation du milieu, odeur.

L’eau convient au montage de la préparation entre lame et lamelle ; une goutte de bleu coton peut améliorer la qualité du contraste [8]. L’observation microscopique permet de connaitre le type de mycélium (siphonné, cloisonné, épais, coloré…), les critères des spores (forme, cloisons, couleur, taille..), l’appareil de fructification, la présence de chlamydospores (solitaires, en paires ou en chaines).

35

L’emploi prudent de différentes clés d’identification [2,12-13,22,27-28] conduit à la détermination.

Évaluation quantitative de la flore bactérienne

Les bactéries ont été isolées [8] sur milieu Salmonella-Shigella (peptone 5 g, extrait de viande 5 g, lactose 10 g, citrate de sodium 10 g, citrate de fer III 1 g, sels biliaires 8,5 g, vert brillant 3,3 mg, rouge neutre 25 mg, thiosulfate de sodium 8,5 g, agar 12 g, eau distillée 1000 ml). Les sels biliaires, le vert brillant et la forte concentration en citrate de sodium ne favorisent que la croissance des Salmonella et Shigella. L’éventuelle fermentation du lactose acidifie le milieu qui devient au rouge en présence de l’indicateur coloré, le rouge neutre. La production d’H2S à partir du thiosulfate donnera avec le citrate ferrique un précipité noir au centre des colonies.

La détermination de la charge bactérienne a été réalisée sur dix des échantillons.

La méthode des suspensions-dilutions [22] a été appliquée. Un ml de l’échantillon à analyser (préalablement agité au vortex) a été prélevé aseptiquement à l’aide d’une micropipette et ajouté dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau physiologique stérile. Le tube agité au vortex correspond à la dilution 10-1, à partir de laquelle d’autres dilutions ont été réalisées jusqu’à 10-3.

Le milieu n’est pas autoclavé. Il est porté à ébullition et coulé à raison de 20 ml dans des boites de Petri de 9 cm de diamètre. 0,5 ml de chaque dilution est étalé uniformément à l’aide d’une anse en platine, en effectuant des stries à la surface de la gélose [20], en commençant par les dilutions les plus hautes. Pour chaque dilution, trois boites de Petri ont été ensemencées et l’essai est répété trois fois. Les boites sont incubées à 37°C à l’obscurité pendant 24 à 48 heures.

Après incubation, les colonies formées ont été dénombrées.

Évaluation qualitative de la flore bactérienne

Les colonies sont repiquées dans d’autres boites contenant le milieu salmonella-shigella jusqu’à purification. Il renferme un indicateur coloré de pH, le rouge neutre

Le test de catalase a été réalisé. Sur une lame propre on verse une goutte de H2O2 et on la met en contact avec une colonie isolée, prélevée

36

directement avec une anse plastique à usage unique. Les bactéries possédant la catalase forment des bulles.

Les souches ont été conservées selon le procédé suivant : purification sur milieu Muller Hinton, préparation de bouillon BHI (infusion de cœur et cerveau) additionné de 25 % de glycérol, répartition de la solution obtenue dans des cryotubes de 1,8 ml avec bouchon à vis, stérilisation à 121°C pendant 15 min, refroidissement du bouillon, prélèvement à l’aide d’une anse stérile des colonies bien isolées, réalisation d’une suspension dense par agitation des cryotubes contenant la souche au vortex et congélation à -80°C.

Analyse statistique

Les moyennes ont été comparées par le test post-hoc de comparaisons de moyennes et le test LSD [Least Significant Difference] au seuil de 5 %.

RÉSULTATS

Évaluation quantitative de la charge fongique

Les taux de charges fongiques diffèrent de manière significative entre les deux méthodes d’isolement (Figure 1). Le Giroflier ne présente pas de contamination.

Par la méthode des suspensions-dilutions, on distingue trois groupes :

- un groupe de plantes fortement attaquées représenté par Laurus nobilis (7399), Thymus vulgaris de Marrakech (7322) et Rosa X centifolia (7022 spores/g),

- un échantillon moyennement attaqué, Clinopodium nepeta (4066 spores/g),

- des échantillons avec une très faible charge fongique avec Thymus vulgaris de Tafraouat (1244), Aloysia citriodora (1144), Salvia officinalis (1033), Artemisia herba-alba (588), Origanum compactum de Salé (455), du Moyen-Atlas (222), du Rif (222), Rosmarinus officinalis (166), Nigella sativa (99) et Syzygium aromaticum (0 spores/g).

37

A

B

Fig. 1 : Comparaison des moyennes de la charge fongique (spores/g) de

treize échantillons de plantes médicinales par la méthode des suspensions-dilutions (A) et la méthode de la plaque (B).

Les moyennes ayant une même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 5 %.

38

La méthode « soil plate » met en évidence quatre groupes :

- Clinopodium nepeta avec une forte charge fongique (6318 spores/g).

- un groupe avec une charge fongique moyennement élevée, représenté par Laurus nobilis (4118), Artemisia herba-alba (3155), Aloysia citriodora (3081), Thymus vulgaris de Marrakech (2814), Rosmarinus officinalis (1896), Rosa X centifolia (1792) et Origanum compactum de Salé (1703 spores/g).

- un groupe avec un taux moyennement faible composé de Nigella sativa (1414), Origanum compactum du Moyen-Atlas (1288) et Thymus vulgaris de Tafraouat (1184 spores/g).

- des plantes possédant un taux très faible de contaminants, en l’occurrence Salvia officinalis (933), Origanum compactum du Rif (321) et Syzygium aromaticum (0 spores/ g).

Évaluation qualitative de la charge fongique

Plusieurs taxons fongiques ont été identifiés (Tableaux II et III). Certains ne sont détectés qu’avec la méthode des suspensions-dilutions : Aspergillus wentii, Myrothecium, Pythium, Rhizopus stolonifer. Epiccocum n’est détecté qu’avec la méthode de la plaque.

Par la technique des suspensions-dilutions (Tableau II), le genre Aspergillus domine (44,35 % des colonies déterminées) avec Aspergillus flavus (21,14), A. fumigatus (12,66), A. japonicus (11,85), A. wentii (0,79) et A. clavatus (0,79 %). Au deuxième rang, se positionnent les levures (28,56 %), puis Rhizopus (3,16 %). Les genres Penicillium, Myrothecium, Acremonium, Pythium et Stemphylium n’ont été détectés qu’une fois.

Par la technique de la plaque (Tableau III), le genre Penicillium domine (43,85 % des colonies déterminées) suivi par les levures (35,28 %). Les Aspergillus n’arrivent qu’en troisième position (20,06 %) avec A. fumigatus (10,90 %), A. japonicus (6,88 %), A. flavus (1,52 %), A. clavatus (0,76 %), et A. stemphylium (0,57 %). Acremonium et Epicoccum n’ont été détectés qu’une fois.

Tabl

eau

II :

Nom

bre

de c

olon

ies i

solé

es e

t dét

erm

inée

s de

trei

ze é

chan

tillo

ns d

e pl

ante

s méd

icin

ales

séch

ées p

ar la

m

étho

de d

es su

spen

sions

-dilu

tions

.

Plan

tes s

éché

es é

tudi

ées

Nig

elle

R

osie

r A

rmoi

se

Saug

e R

omar

in L

aurie

r O

rigan

G

irofli

er C

alam

ent

Ver

vein

e Th

ym

Espè

ces f

ongi

ques

cu

ltivé

e de

mai

bl

anch

e of

ficin

ale

sauc

e

Moy

en-

Atla

s R

if Sa

lé G

irofli

er

of

ficin

al

Ta

frao

uat

Mar

rake

ch

Aspe

rgill

us

japo

nicu

s -

- -

4 -

3 -

- -

- -

4 -

4

A. fu

mig

atus

-

- -

4 -

- -

- 4

- -

- 4

4 A.

wen

tii

- -

- -

1 -

- -

- -

- -

- -

A. fl

avus

6

6 -

- 2

- -

6 -

- -

6 1

- A.

cla

vatu

s -

- -

- -

- -

- -

- -

- 1

- Pe

nici

llum

sp. 3

-

- -

- -

- -

1 -

- -

- -

- M

yrot

heci

um

1 -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

Acre

mon

ium

sp. 1

-

- -

- -

- -

- -

- -

- -

1 Ac

rem

oniu

m sp

. 2

- -

- -

1 -

- -

- -

- -

- -

Pyth

ium

-

- -

- -

- -

- -

- 1

- -

- St

emph

yliu

m

sarc

inifo

rme

- -

- -

- -

- -

- -

- -

1 -

Rhiz

opus

stol

onife

r 2

- -

- -

- -

- 2

- -

- -

- m

ycél

ium

non

sp

orul

é -

- 2

- -

- 2

- -

- -

- -

-

levu

res

- -

- -

- -

4 4

- -

- -

28

-

Tabl

eau

III :

Nom

bre

de c

olon

ies i

solé

es e

t dét

erm

inée

s de

trei

ze é

chan

tillo

ns d

e pl

ante

s méd

icin

ales

séch

ées p

ar la

m

étho

de d

e la

pla

que.

Plan

tes s

éché

es é

tudi

ées

Nig

elle

R

osie

r A

rmoi

se

Saug

e R

omar

in L

aurie

r O

rigan

G

irofli

er C

alam

ent

Ver

vein

e Th

ym

Espè

ces f

ongi

ques

cu

ltivé

e de

mai

bl

anch

e of

ficin

ale

sauc

e

Moy

en-

Atla

s R

if Sa

lé G

irofli

er

of

ficin

al

Ta

frao

uat

Mar

rake

ch

Aspe

rgill

us

japo

nicu

s -

7 3

7 -

- -

1 -

- -

7 5

6

A. fu

mig

atus

-

- -

8 8

8 -

7 2

- -

8 8

8

A. fl

avus

3

- 2

- -

- 3

- -

- -

- -

-

A. c

lava

tus

2 2

- -

- -

- -

- -

- -

- -

Peni

cilli

um sp

. 1

9 -

9 7

- 6

9 3

9 -

144

- 29

-

Peni

cilli

um sp

. 2

- -

- -

1 -

- -

- -

- -

- -

Peni

cilli

um sp

. 3

4 -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

Epic

occu

m

- -

- -

- -

1 -

- -

- -

- -

Acre

mon

ium

sp. 2

-

- -

- 1

- -

- -

- -

- -

-

Stem

phyl

ium

sa

rcin

iform

e 1

- -

- -

- 1

- -

- -

- 1

-

myc

éliu

m n

on

spor

ulé

- -

- -

- -

- -

- -

- -

2 -

levu

res

36

- -

- 5

42

51

- -

- -

- 50

-

41

Évaluation quantitative de la charge bactérienne

Clinopodium nepeta possède la plus grande charge (127,7.102) suivi de Nigella sativa (95.102), Rosa X centifolia (63,8.102) et Artemisia herba-alba (35.102 bactéries/g) (Tableau IV).

Tableau IV : Évaluation de la charge microbienne de dix échantillons de plantes

médicinales.

Plantes séchées bactéries/g

Salmonelles (colonie

transparente avec centre

noir)

Coliformes (colonie

rose)

Colonie transparente sans centre

noir

Cata lase

Clinopodium nepeta 127,7.102 - + + milieu virant au jaune et

odeur

+

Nigella sativa 95.102 - + + + Rosa X centifolia 63,8.102 - - + + Artemisia herba-alba 35.102 - + + + Thymus vulgaris de Marrakech

50 - + + milieu virant

au jaune

+

Syzygium aromaticum 0 Rosmarinus officinalis

0

Origanum compactum du Rif

0

Origanum compactum du Moyen Atlas

0

Origanum compactum de Salé

0

Thymus vulgaris de Marrakech (50 bactéries/g) présente un faible taux de contamination et les autres espèces testées affichent une absence totale d’entérobactéries.

Évaluation qualitative de la charge bactérienne

Sur milieu Salmonella-Shigella, on n’observe pas de colonies transparentes à centre noir, caractéristiques de Salmonella (Tableau IV).

42

Par contre, on a des colonies transparentes sans centre noir qui peuvent correspondre à Shigella ou à d’autres bactéries. Sur ce milieu, les Shigella ne dégagent pas d’odeur et ne donnent pas un milieu virant au jaune car elles ne fermentent pas le lactose.

On note la présence de coliformes (colonies roses) pour Nigella sativa, Thymus vulgaris de Marrakech, Artemisia herba-alba et Clinopodium nepeta.

Les colonies isolées possèdent une catalase positive.

DISCUSSION ET CONCLUSION

Les deux méthodes d’isolement mettent en évidence une forte capacité d’accueil des plantes médicinales séchées à l’air libre vis-à-vis des microorganismes. Leur inventaire n’est probablement pas exhaustif. L’abondance de spores de Penicillium et Aspergillus peut masquer des espèces mineures par compétition pour le même substrat [23]. Le premier champignon colonisant un milieu peut prendre une position prépondérante [9,11]. Les espèces mineures ont en général une courte durée de vie et peuvent être remplacées par les espèces dites dominantes.

Par les deux méthodes, le Giroflier est sain et le Laurier sauce et le Calament officinal apparaissent relativement contaminés contrairement à l’Origan du Rif. Néanmoins la répartition de la charge fongique apparait relativement différente entre les deux méthodes, comme pour le Rosier de mai. L’inventaire des espèces dépend de la méthode utilisée. Les microorganismes détectés diffèrent nettement d’une méthode à l’autre.

Certains champignons n’ont été observés que sur certaines espèces : Rhizopus stolinifer n’a été observé qu’à partir de la Nigelle cultivée et l’Origan de Salé.

L’absence totale de contamination de Syzygium aromaticum pourrait être liée à ses propriétés antifongiques. L’eugénol possède une activité antifongique sur Aspergillus flavus et Penicillium [26].

43

Les Aspergillus sont absents pour le Calament officinal par les deux méthodes d’isolement. De même, on n’a pas de Penicillium pour le Rosier de mai et la Verveine. Ces deux espèces présentent des propriétés antifongiques [7,15].

Les Aspergillus, fréquemment rencontrés dans les écosystèmes, sont majoritaires avec la méthode des suspensions-dilutions et les Penicillium avec la méthode de la plaque. Selon Christensen et al. [10], les principales moisissures de stockage sont les Aspergillus et les Penicillium dont l’évolution dépend de la disponibilité d’eau dans le substrat, de la température et de l’humidité [14]. Ces espèces peuvent être des pathogènes mineurs ou majeurs selon les mycotoxines qu’elles sécrètent : les mycotoxines d’Aspergillus flavus comme l’aflatoxine B1 sont cancérogènes et il existe des genres peu ou non toxiques comme Acremonium [18].

En général, les Aspergillus sont considérés comme des contaminants fréquents des céréales [19] et des denrées alimentaires par la production de mycotoxines, métabolites secondaires peu solubles dans l’eau et difficilement métabolisés [1]. Ainsi, l’aflatoxine B1 produite par A. flavus possède un effet cancérogène [24]. Les Aspergillus peuvent mener à une détérioration de la qualité thérapeutique des plantes médicinales et générer des problèmes de santé non seulement par la formation de myxotoxines, mais aussi par leurs spores allergéniques [18].

Le séchage au soleil présente plusieurs inconvénients : durée de séchage longue d’où un risque accru de détérioration lié à la croissance des moisissures pouvant renfermer des mycotoxines, conditions de température et d’humidité non contrôlées, absence de protection contre les poussières, pierres, sables, attaque d’insectes, d’animaux, notamment de rongeurs apportant poils et excréments [3].

Il peut être amélioré par diverses opérations : le matériel végétal à sécher peut être étendu sur un sol bien nettoyé, couvert d’une bâche et des couvertures placées le soir peuvent empêcher le dépôt de la rosée du matin.

Les résultats de ce travail permettent d’affirmer que les PMA séchées hébergent de nombreux microorganismes indésirables tels que des Aspergillus et Penicillium. La modernisation du séchage est souhaitable.

44

Le séchage dans des séchoirs protège des contaminations. Le séchage industriel permet de maitriser les paramètres de contrôle comme le débit et la température de l’air [3], déterminant pour l’abondance ou l’absence des espèces fongiques dans le matériel végétal [21], et permet un séchage beaucoup plus court, d’où des produits séchés de bonne qualité.

RÉFÉRENCES

1 - Bankole (S.A.), Adebanjo (A.) - Mycotoxins in food in West Africa: current situation and possibilities of controlling it. - Afr. J. Biotechnol., 2003, 2(9), 254-263. http://tspace.library.utoronto.ca/ bitstream/1807/1433/1/jb03053.pdf

2 - Barnett (H.L) - Illustrated genera of imperfect fungi. 2nd ed., Minneapolis, Minn.: Burgess Publishing Co., 1960, 225 p.

3 - Benjilali (B.), Zrira (S.) - Plantes aromatiques & médicinales Atouts du secteur et exigences pour une valorisation durable. Rabat : Actes éditions, « Agriculture & Développement », 2005, 346 p.

4 - Bhija (S.) - Étude technico-économique d’installation d’une unité de séchage des plantes aromatiques et médicinales pour les produits d’herboristerie et les aromates alimentaire. Thèse 3e Cycle, Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat, 2000, 144 p.

5 - Boutnine (S.) - Séchage et qualité des plantes aromatiques : Cas de la sauge (Salvia officinalis L.). Thèse 3e Cycle, Inst. Agron. Vét. Hassan II, Rabat, Maroc, 1992, 85 p.

6 - Camara (M.) – Séchage solaire de la menthe verte. Mémoire 3e Cycle, Inst. Agron. Vét. Hassan II, Rabat, Maroc, 1993, 176 p.

7 - Casanova (E.), García-Mina (J.M.), Calvo (M.I.) - Antioxidant and antifungal activity of Verbena officinalis L. leaves. - Plant Foods Hum. Nutr., 2008, 63(3), 93-97.

8 - Champiat (D.), Larpent (J.P.) - Biologie des eaux. Méthodes et techniques. 2e tirage, Paris : Ed. Masson, 1994, 374 p.

9 - Christensen (C.M.) - Influence of moisture content, temperature, and time of storage upon invasion of rough rice by storage fungi. - Phytopathology, 1969, 59, 145-148.

10 - Christensen (C.M.), Meronuk (R.A.), Sauer (D.B.) - Microflora. Chapter 9. In Christensen (C.M.) (Ed.) Storage of cereal grains and their products. 3rd ed. St. Paul, Minn.: American Association of Cereal Chemists, 1982, p. 219-240 (544 p.).

45

11 - Delhate (J.) - Experimental study of infection of grain moulds. - Rev. Mycol., 1968, 33(1), 43-70.

12 - Domsch (K.H.), Gams (W.), Anderson (T.H.) - Compendium of soil fungi. London (UK): Academic Press, 1980, 1th ed., 85 p.

13 - Ellis (C.M.A.) - The size at maturity and breeding season of sardines in southern Lake Tanganyika. - Afr. J. Trop. Hydrobiol. Fish., 1971, 1(1), 59-66.

14 - Godon (B.), Loisel (W.) - Guide pratique d’analyses dans les industries des céréales. Paris: 2e ed., « Sciences et Techniques agroalimentaires », 1997, 840 p.

15 - Hanafy (M.S.M.), Hatem (M.E.) - Studies on the antimicrobial activity of Nigella sativa seed (black cumin). - J. Ethnopharmacol., 1991, 34(2-3), 275-278.

16 - Hmamouchi (M.) - Les plantes médicinales et aromatiques marocaines. Rabat : Hmamouchi, 2001, 383 p.

17 - Leyral (G.), Vierling (E.) - Microbiologie et toxicologie des aliments : Hygiène et sécurité alimentaire. - Série Sciences des aliments, centre régional de documentation pédagogique d’aquitaine, 2001, 16-269.

18 - Olsson (J.) - Modern methods in cereal grain mycology. Doct. Thesis, Swedish Univ. Agric. Sci., Dep. Microbiol. Uppsala, 2000, 241 p.

19 - Pfohl-Leszkowicz (A.) - Les mycotoxines dans l’alimentation : évaluation et gestion du risque. Paris : Tec & Doc, Lavoisier, « rapports du CSHPF », 1999, 478 p.

20 - Prescott (L.M.), Harley (J.P.), Klein (D.), Bacq-Calberg (C.M.), Dusart (J.) - Microbiologie. 2e ed., De Boeck Université, 2003, 1164 p.

21 - Raila (A.), Lugauskas (A.), Kemzuraite (A.), Zvicevicius (E.), Ragazinskiene (O.), Railiene (M.) - Different drying technologies and alternation of mycobiots in the raw material of Hyssopus officinalis L. - Ann. Agric. Environ. Med., 2009, 16(1), 93-101. http://www.aaem.pl/pdf/16093.htm

22 - Rapilly (F.) - Les techniques de mycologie en pathologie végétale. - Ann. Epiphyt., 1968, 19(Hors Sér.), 102 p.

23 - Rheeder (J.P.), Marasas (W.F.O), Van Wyk (P.S.) - Fungal associations in corn kernels and effects on germination. - Phytopathology, 1990, 80(2), 131-134.

24 - Shotwell (O.L.) - Mycotoxins corn related problems. - Cereal Foods World, 1977, 22(10), 524-527.

46

25 - Sijelmassi (A.) - Les plantes médicinales du Maroc. 2e ed. Casablanca : Le Fennec, 1991, 125 p.

26 - Suhr (K.I.), Nielsen (P.V.) - Antifungal activity of essential oils evaluated by two different application techniques against rye bread spoilage fungi. - J. Appl. Microbiol., 2003, 94(4), 665-647.

27 - Thom (C.), Church (M.B.) - The Aspergilli. London, Baltimore: The Williams & Wilkins Company, 1926, ix, 272 p.

28 - Wang (C.J.K.), Zabel (R.A.) - Identification manual for fungi from utility poles in the Eastern United States. Rockville: American Type culture collection, publisher, 1990, 356 p.

29 - Warcup (J.H.) - The soil-plate method for isolation of fungi from soil. - Nature, 1950, (166), 117-118.

30 - Zrira (S.), Benjilali (B.), Lamaty (G.) - Effet du séchage à l’air libre des feuilles d’E. camaldulensis sur le rendement et la composition de l’huile essentielle. - Actes Inst. Agron. Vét. Hassan II, Rabat, 1995, 15(4), 27-35. http://www.vulgarisation.net/actes/index.php/Actes_ IAVH2/article/download/236/215

ABSTRACT

Microflora of medicinal plants dried outdoors

Fungal and microbial load were estimated in 11 medicinal species widely used in Morocco and dried outdoors: Aloysia citriodora, Artemisia herba-alba, Clinopodium nepeta, Laurus nobilis, Nigella sativa, Origanum compactum, O. elongatum, Rosa X centifolia, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis and Syzygium aromaticum.

Isolation by the soil-plate and dilution-plates methods gave different results. Fungal species belonging to the genera Acremonium, Aspergillus, Epicoccum, Penicillium, Pythium, Rhizopus and Stemphylium were identified, as well as yeasts and non-sporulated mycelium. Enterobacteria were also detected. Key-words: free air drying, medicinal plants.

__________