Chromatograhie methodes et principe

2008-2009 Chromatographie 1

Chromatographie

1 – Généralités

Cours TB2008 - 2009

Chromatographie 2

Introduction

- ensemble de méthodes de séparation des constituants d’un mélange - très employées (LA méthode de séparation actuelle) parce que :

- séparation possible de n’importe quel constituant - mise en œuvre possible à l’échelle analytique, préparative et industrielle

- seront envisagés* des généralités : définitions de la chromatographie et classification des méthodes chromatographiques* le principe des méthodes* les méthodologies et applications

2008-20092008-2009


1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux

Chromatographie (1/2)

1 1 1 - Définition

1 2 - Différents types de chromatographies

1 1 2 - Caractères généraux

1 2 1 - Classification selon l’état des phases1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire 1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile

1 3 - Étude théorique et modélisation1 3 1 - Modélisation intuitive1 3 2 - Volumes de rétention1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution


2 1 – Chromatographie d’adsorption2 2 – Chromatographie de partage2 3 – Chromatographie par échange d’ions2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

2 7 – Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography »)

2 – Principe et utilisation des méthodes de chromatographie

1 4 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne



3 – Méthodologie et applications

3 1 – Méthodologies3 1 1 – Chromatographie sur colonne

A - Chromatographie en phase liquideB - Chromatographie en phase gazeuse

3 1 2 – Chromatographie de surfaceA – Méthodologie généraleB – Différence

3 2 – Applications3 2 1 – Séparation des acides aminés3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC3 2 4 – Autres applications

Chromatographie (2/2)



Chromatographie 1 – Généralités

1 1 1 - Définition

Chromatographie : ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscibles : les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile le long d'unephase stationnaire.

Commentaires :« phase » : toute partie homogène d’un système. trois états physiques d’une phase : liquide, gazeux et solide.




1 1 2 - Caractères généraux- la séparation de solutés se réalise entre deux phases :

* une phase stationnaire, par définition immobile ; choisiepour sa grande affinité pour les divers solutés ;

affinitéquels mécanismes ?

cependant, affinité pas trop importante : les solutés doivent pouvoir êtredétachés

* une phase mobile qui entraîne les divers solutés

- en fait, les solutés se partagent entre la phase stationnaire et la phase mobile ; chromatographie = phénomène de partage généralisé


Phasestationnaire

Phasemobile

Cst

Cmo

Phasestationnaire

Phasemobile

K = ------- > 1

Schématisation

CstCmo




- la séparation est liée à la vitesse propre d’entraînement du soluté par la phase mobile :

* les substances qui migrent le plus sont celles qui ont le plus d’affinité pour la phase mobile,

* les substances qui migrent le moins, celles qui ont le moins d’affinité.

- les solutés restent ou non dans la phase stationnaire * initialement, du point de vue historique, les solutés restaient

dans la phase stationnaire ; ils étaient colorés et pouvaient être visualisés* vers la seconde guerre mondiale (Tiselius), on a pu

commencer à pouvoir mettre en évidence des solutés incolores parcolorimétrie (utilisation de la ninhydrine) : il était possible de laisser sortir lessolutés de la colonne (chromatographie d’élution).





- la mise en oeuvre est possible :

•à l’échelle laboratoire

•à l’échelle préparative

* à l’échelle industrielle.








1 2 1 - Classification selon l’état des phases

chromatographie liquide - liquideCPL chr. phase

chromatographie liquide - solide liquide

chromatographie gaz - liquide.CPG chr. phase

Chromatographiegazsolidegazeusedgazeuse


Phase mobile

Phase station.


1 2 - Différents types de chromatographies1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire

- ADS0RPTION : liaisons de faible énergie (liaisons polaires, ...) assurant la fixation des solutés à la phase stationnaire - PARTAGE : solubilisation des solutés dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amenés à se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins solubles; - ECHANGE D'IONS : liaisons ioniques entre charges électriques portées par les solutés et par la phase stationnaire (opposées)- GEL FILTRATION : pas de liaisons : diffusion / exclusion de solutés dans la phase stationnaire poreuse (chromatographie d'EXCLUSION DIFFUSION) - INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES : interactions biospécifiques (enzyme - substrat, antigène anticorps, ...) entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d’un ligand (appliquées aux protéines). - INTERACTIONS HYDROPHOBES : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés (nécessite de la présence de parties hydrophobes dans la structure du soluté) (s'applique aux protéines)- CHELATION : liaisons datives entre un métal divalent fixé sur un support (phase stationnaire) et les solutés porteurs de doublets libres (cas classique : His des protéines) .




1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire

La phase stationnaire immobilisée de 2 manières différentes : - soit étendue sur une surface plane : chromatographie de surface

* la chromatographie sur papier* la chromatographie sur couche mince

- soit à l'intérieur d'une colonne : chromatographie sur colonne .phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon)

maintenue dans une colonne introduction en tête de colonne de l'échantillon à analyser (au

moyen d'un injecteur) détection des solutés (grâce à un détecteur) collection de fractions (collecteur de fractions) .



1 2 - Différents types de chromatographies1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile

Maintien des solutés dans la phase stationnaire : ils se déplacent dans la phase stationnaire c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) où on révèle les solutés encore présents dans la phase stationnaire.


A - Chromatographie par élutionSortie des solutés de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne. ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mélange) qui réalisent la rupture différentielle des interactions entre phase stationnaire et solutés élution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilisé : force ionique, polarité par exemple soit d'une manière brusque (gradient discontinu) soit d'une manière continue (gradient continu). caractérisation des solutés dans l'éluat .

B - Chromatographie par déplacement


1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution


1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal



1 3 - Étude théorique et modélisation1 3 1 – Modélisations

A – Modélisation intuitive

- série de barques sans moteur sur une rivière. - courant est supposé constant, c’est à dire qu’il est identique que l’on soit au bord de la rive ou au milieu. - les barques transportent des passagers d’une ligne marquée « départ » à une ligne marquée « arrivée ». - les barques, au gré des passagers, sont susceptibles de s’arrêter sur la berge durant des temps variables.




A – Modélisation intuitive1 – Modèle de barques sur une rivière :

les barques attachées sur la ligne de départ

ArrivéeDépart

Au temps zéro

Courant

Au temps 0,.. Elles

libérées en même temps, au temps zéro




A – Modélisation intuitive

ArrivéeDépart

ArrivéeDépart

- avancée, dans le courant, à la même vitesse

- différence de durée du trajet entre les lignes de départ et celle d’arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs.




A – Modélisation intuitiveArrivéeDépart

- temps passé à naviguer tO identique pour toutes les barques- temps départ - arrivée tR différents du fait de la durée des arrêts

effectués t’R.. tR = tO + t'R

tR : temps mis par les barques pour atteindre l'arrivéetO : temps passé à naviguert’R: temps des arrêts sur la rive.



1 3 1 – ModélisationsA – Modélisation intuitive

2 – Retour à la chromatographie

barques = les différents solutés ; berge = la phase stationnaire ;la rivière = la phase mobile.

tR = to + t’R (1)tR : temps correspondant à la sortie du soluté de la colonne : temps de

rétention dans la colonne to : temps passé dans la phase mobile = temps mort t’R : temps passé dans la phase stationnaire.De même aucun soluté ne peut sortir avant le temps to, temps qui correspond

au transport dans la phase mobile. t’R est le temps de rétention réduit du temps mort, c’est à dire tR - to





Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941

Vapeur enrichie en soluté volatil

Liquide appauvri en soluté volatil

Colonne à plateau

Colonne de chromatographie

À chaque niveau, partage du soluté- entre la phase liquide

et la phase gazeuse (distillation)

- entre la phase stationnaire et la phase mobile

B – Analogie chromatographie / distillation




Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941Vapeur enrichie en

soluté volatilLiquide appauvri en soluté volatil

Colonne à plateau

• Plus une colonne comporte de plateaux (théoriques), meilleure sera la séparation

• Ou encore, plus la hauteur d’un plateau sera faible, meilleure sera la séparation

Plateaux théoriques

B – Analogie chromatographie / distillation





Remarque : représentation schématique d’une chromatographie

tR

C

0 tR

1 3 1 – ModélisationsB – Analogie chromatographie / distillation



1 3 - Étude théorique et modélisation1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal



1 3 - Étude théorique et modélisation1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution

séparation caractérisée par le nombre effectif de plateaux théoriques Neff .

Plus ce nombre est élevé, meilleure est la séparation.

On démontre que :tR

2 LNeff = ------- = ---------

σ2 H ou

H = L / N

avec L, longueur de la colonne (en cm)H, hauteur équivalente d’un plateau

théorique (en cm) (HEPT)σt

2, variance du pic (en unités de temps)

A – Efficacité de la colonne

tR

1

0,6

0,5ϖ 1/2

Pic gaussien

1,2

σ σ σ = ϖ1/2 / (8 Ln 2 )1/2

ϖ

tR

1




Neff peut également être calculé à partir de tR et de ω, ce dernier paramètre étant déterminé depuis l’intersection des tangentes au point d’inflexion avec la ligne de base.

Neff = 16 tR2 / ω2

Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 µm et une longueur de 25 cm, on arrive à 15000 - 20000 plateaux théoriques effectifs.

Souvent il est plus facile de mesurer la largeur du pic à mi hauteur ω1/2 :

Comme σ = ω1/2 / (8 ln 2)1/2

L tR2

Neff = --------- = 5,54 . ------------H ω1/2

2


tR

1

0,6

0,5ϖ 1/2

Pic gaussien

1,2

σ σ σ = ϖ1/2 / (8 Ln 2)1/2

ϖ

tR

1




Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).

H = A + B / u + C . U

8 . k’ . e2

H = 2 . dP . λ + 2 . τ . DM / u + --------------------------- . u2 . (1 + k’)2 . DS

Η : hauteur d’un plateau théoriqueλ : régularité du remplissage dp : diamètre des particules τ : facteur de tortuositéDM :: diffusivité de l’échantillon dans la phase mobileDS :: diffusivité de l’échantillon dans la phase stationnairek’ : facteur de capacitée : épaisseur de la phase stationnaire (grains) u : vitesse linéaire de déplacement de la phase mobile





Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).H = A + B / u + C . u

8 . k’ . e2

H = 2 . dP . λ + 2 . τ . DM / u + --------------------------- . u2 . (1 + k’)2 . DS

Α : diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente

B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l’analyse : diffusion longitudinale

C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse


Hauteur d’un plateau théorique






C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse

Α : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente

B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l’analyse : diffusion longitudinale





Conclusions :- existence d’un débit optimum pour obtenir une hauteur minimale d’un plateau théorique (nombre maximal de plateaux théoriques)- pour éviter la diffusion (élargissement des pics), il faut grains de faible diamètre (mais pertes de charge)- importance du remplissage de la colonne.


B/u C.u

A

Η

u

Hauteur d’un plateau théorique




La résolution est, pour une colonne, la capacité de séparation de deux solutés.

VR1 - VR2Rs = 2 ---------------------

ω1 + ω2

B – Résolution

ϖ1 ϖ2 VRVR1 VR2




VR

- Mise en contact des solutés avec la phase stationnaire (solutés susceptibles d’être fixés et solutés non susceptibles d’être fixés) : charge de la colonne

- passage d’une phase mobile 1 : sortie de la colonne (élution) des solutés non susceptibles d’être fixés et obtention de l’éluat 1 (filtrat)

- passage d’une phase mobile 2 : éluant vrai qui rompt les liaisons entre soluté et phase stationnaire (élution vraie) et obtention de l’éluat 2.




1 5 – Divers types de mise en œuvre d’une chromatographie en phase liquide

VR

- basse pression

- moyenne / haute pression ; actuellement chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC)


Chromatographie

2 – Principes des méthodes de chromatographie

Cours TB2008 - 2009


Chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption2 2 – Chromatographie de partage2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 4 – Chromatographie par gel filtration



2 7 – Chromatographie par chélation

2 – Principe des méthodes de chromatographie







Chromatographie 2 – Principe et utilisation des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

2 2 – Chromatographie de partage

2 3 – Chromatographie par échange d’ions




2 1 2 − Phase stationnaire2 1 3 − Phase mobile

2 1 1 − Principe : interaction

2 1 4 − Conditions de fixation et d’élution2 1 5 − Utilisation

2 7 – Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography »)


Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption2 1 1 − Principe

Η

δ−

δ+

δ+

δ−

Ο Η

Ο

Adsorption Désorption =remplacement parune autre molécule

Support solideSupport solide

Fixation, en général, par des liaisons liées à la polarité



2 1 – Chromatographie d’adsorption2 1 2 − Phase stationnaire,

Solide insoluble, finement divisé, "actif " (capable de fixer des solutés)- polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont à « activer ».- non polaire : carbone actif- sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines

2 1 3 − Phase mobile

Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG)Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire(phénomène de désorption)



2 1 – Chromatographie d’adsorption2 1 4 − Conditions de fixation et d’élution

- Cas des liaisons polaires :par ordre d'adsorption croissante,

esters, cétones et aldéhydes, alcools et les amines, acides et les bases

Utilisation de gradients de solvants organiques polaires

- Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate



2 1 5 − Utilisation2 1 – Chromatographie d’adsorption

- utilisée pour la séparation des molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol-1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire :

* fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gêner telleou telle méthode analytique. (phase liquide, échelle analytique)

* fixation de substances pyrogènes existant dans une solution destinée àl’usage parentéral. (phase liquide, échelle industrielle)

* séparation des acides gras (méthylés) (phase gazeuse, échelleanalytique).

-gel d'hydroxyapatite et le phosphate tricalcique utilisés pour la séparation des protéines ; techniques concurencées par la chromatographie d’interactions hydrophobes

-- mise en œuvre en basse presioon, CLHP, et chromatographie de surface



2 1 – Chromatographie d’adsorption

Fixation de solutés surun support solide parADSORPTION- Liaisons polaires

(le plus souvent)- Liaisons non polaires

(cas du carbone actif)

Solide insoluble, finement divisé, "actif "capable de fixer des solutés)- polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumineCes supports sont à activer

- non polaire : carbone actif- sels de calcium : phosphate tricalcique,hydroxyapatite pour les protéines

Liquide (CPL) ougazeuse (CPG)Réalise la rupturedes liaisons soluté -phase stationnaire(phénomène de désorption)

- Cas des liaisons polaires :par ordre d'adsorption

croissante, on a les esters, puis les cétones etaldéhydes, puis les alcools

et lesamines et enfin les acides et

lesbasesUtilisation de gradients de

solvants organiques polaires- Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate

- Sur colonne (CPL, CPG)- Sur couche mince (CCM)- Molécules organiques(M < 1000 g.mol-1

)commemétabolites,

médicaments- Séparation d'hydrocarburessur carbone actif

- Protéines : recherche(ancien)

Type d'interaction

Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre etApplications




2 2 1 − Principe

2 2 2 − Supports

2 2 3 − Conditions de fixation et d’élution

2 2 4 − Utilisation


phasesnormales

Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbée sur un support solide)

phasesinverses

Solubilisation dans une phase liquide apolaire adsorbée sur un support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixés sur un support solide


2 2 – Chromatographie de partage2 2 1 − Principe

Supportsolide

Phase stationnaire

Sol Sol

Phase mobile




φ

normales

Solubilisation dans unephase liquide(adsorbée sur un supportsolide)

Liquide polaire : eau, par exemple Solvants organiquespeu polaires

Gradient de polarité croissante - Sur colonne (CPL, CPG)- Sur couche mince (CCM)- Petites molécules polairescomme les acides aminés

φ

inverses

Solubilisation dans une phase liquide adsorbéesur un support ou radicaux hydrophobesfixés sur un support solide

- Liquide apolaire plus ou moins visqueux- Chaînes hydrocarbonées en C8, C16, C18,

phényl, …fixées sur de billes de silice, agarose, résine ou verre

Solvants organiquesplus polaires que la phase stationnaire

Gradient de polarité décroissante - Sur colonne (CPL, CLHP)- Petites molécules apolaires, comme des dérivés d'acides aminés



2 2 – Chromatographie de partage2 2 2 − Supports

- terme "support" à préciser : matériau inerte qui sert de fixateur (inerte) à la phase stationnaire liquide. Il permet à cette phase stationnaire d’être en un état physique liquide. = support à bien distinguer ici de la phase stationnaire.

- supports = solides finement divisés qui présentent une très grande surface, ceci afin de retenir dans un petit volume une grande quantité de phase liquide ; rétention énergique de phase stationnaire, sans interaction avec les solutés ; les propriétés d’adsorption doivent être totalement masquées.




- utilisation possible de la plupart des phases stationnaires de la chromatographie d’adsorption sous forme poreuse ou pelliculaire.

gel de silice très souvent employé car peut retenir jusqu’à 70 % deson poids d’eau ; grande capacité et bonne rétention des solvants mais gardecertaines propriétés d’adsorption..

Terre de diatomées, autre support siliceux, naturel (squelette siliceuxd’infusoires ou Kieselguhr ou célite) ; peut retenir de grandes quantités desolvant, même polaires.




- billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire l’objet de greffage de groupements fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : réalisation d’une « silanation », c’est à dire traitement par des dérivés permettant la fixation de groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses.

- sont également utilisables, la poudre de cellulose et un certain nombre de polymères synthétiques dérivés du vinylbenzène.



2 2 – Chromatographie de partage2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

A - Les phases stationnaires

-phase stationnaire liquide (assez) polaire : classiquement (Martin et Synge) des solutions aqueuses alcalines, acides ou tamponnées, de méthanol ou d’éthanol - simplement eau, - aussi de substances visqueuses :

étheroxydes rendus très polaires par la présence de groupements hydroxyles ou nitrile : éthers, glycols, polyéthylène glycols, ββ‘ oxydipropionitrile.

1 - Chromatographie en phases normales



2 2 – Chromatographie de partage2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

A - Les phases stationnaires

- phase stationnaire peu polaire ou apolaire

-chromatographie en phase gazeuse : polyesters de glycols, de polyethers de glycols, de silicones, de carbures saturés ;

- chromatographie en phase liquide : chaînes alkyles en C8 et C18 greffées sur de la silice

- d’une manière générale, phases stationnaires préparées par imprégnation (par exemple, en présence de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des dérivés halogénés du silane).

2 - Chromatographie en phases inverses




- choix et conditions d’emploi d’une phase mobile : mêmes considérations générales que celles de la chromatographie d’adsorption. :

- pouvoir solvant et inertie chimique vis à vis des solutés- compatibilité avec les systèmes de détection- inertie chimique et insolubilité vis à vis de la phase stationnaire

- Attention : une non miscibilité rigoureuse difficile à obtenir : saturation des phases les unes dans les autres par des contacts préalables :

mélange des solvants dans une ampoule à décanter et séparation ultérieure.ou, en CLHP, passage du solvant dans une précolonne, avant le système d’injection, chargée de phase stationnaire.

2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

B - Les phases mobiles




-En chromatographie de partage phases normales, phase stationnaire = eau et phase mobile = butanol, d’alcool benzylique, de chloroforme ou de

toluène.En CLHP, on utilise les pentane, cyclohexane, hexane (purs ou additionnés de

chloroforme), dichlorométhane, tétrahydrofurane, chloroforme, dioxanne, éther butylique, nitrométhane, hexane méthanol.

- En chromatographie en phases inversées, phase mobile (plus) polaire = eau, méthanol (CH3-OH), acétonitrile (CH3-CN)

ou mélange de ces solvants.

2 2 3 − Les phases stationnaires et mobilesB - Les phases mobiles



2 2 – Chromatographie de partage2 2 4 − Utilisation

- utilisée sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse.- sert à la séparation de molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol-1

- séparation d’antibiotiques, des substances anticancéreuses, des métabolites, de substances prohibées (drogues, substances « dopantes », ..…)- Phases normales (composés polaires)ou phases inverses (composés plus hydrophobes)- Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires d’ions (voir plus loin)

R1

R2

R3

R4

+ −

Échantillon moins hydrophobe

R1

R2

R3

R4

+−+

Complexe hydrophobe




2 3 1 − Principe

2 3 2 − Supports

2 3 3 − Conditions de fixation et d’élutions




2 3 – Chromatographie par échange d’ions2 3 1 − Principe

- solutés liés à la phase stationnaire par des liaisons ioniques

phase stationnaire = macromolécules échangeuses d'ions, solide

-phase mobile = tampon de pH et de force ionique définis : fait cesser les interactions entre solutés et phase stationnaire

Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006

57

Mélange à séparer

Λιβρατιον δε λα πηασε σολιδε (δσορπτιον)

+++

++ +

+++

+

+ ++

+ +

−−

−−

−

−−

−−

−

−

+

Support (Su)

Groupement charge ici positiveπορτευρ δε




58

Μλανγε ◊ σπαρεραυ χονταχτ δε λα πηασε στατιονναιρε

Φιξατιον δε λα προτινε(↔ αδσορπτιον ≈) αυ σενσ λαργε

Λιβρατιον δε λα πηασε σολιδε (δσορπτιον)

par augmentation du pH

+++

++ +

+++

+

+ ++

+ +

−−

−

−−

−

−−

−−

−

−

−− − − −

−−

−

−−

−− −

−−−

−−

− −−−

−−−

−−

+

++

++

+

+

++

++ +

++

+





2 3 – Chromatographie par échange d’ions2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions

1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique

Su-A+ Ye- + Xs- <====> Su-A+ Xe- + Ys-support chargé + soluté soluté fixé

Ye- = contre ion

Selon le type de charge de l’ion échangé, et la charge de l’échangeur,on distingue :

- échangeurs d’anions - échangeurs de cations.

A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs




1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique

Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive : en général d’amines I, II, III, IVgroupements les plus classiques pour les protéines : groupements DEAE et TEAE.

- CH2 - CH3

DEAE, Su O- CH2 - CH2 - N- CH2 - CH3

(échangeur faible, non ionisé à certains pH, pH acides)- CH2 - CH3 pKA = 9,5 - CH2 - CH3

Su O- CH2 - CH2 - N + H+ <=====> S O- CH2 - CH2 - N+ - H- CH2 - CH3 - CH2 - CH3

- CH2 - CH3TEAE, Su O- CH2 - CH2 - N+ - CH2 - CH3

- CH2 - CH3(échangeur fort, ionisé à tous les pH)





2 - Les échangeurs de cations, sous forme anionique

Su-A- Ye+ + Xs+ <==========> Su-A- Xe+ + Ys+

support chargé - soluté soluté fixéYe+ = contre ion





ECHANG

E D'IONS

Fixation de solutés par des liaisons ioniquesentre charges opposées (faiblement énergétique)

Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou minéraux (verre, silice, …) avec greffage de groupements ionisés ou ionisableséchangeant des anions ou des cations- Anions : DEAE, AE, …- Cations : CM, SP, …

Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et de µ donnés variant lors de l'élution

Gradient de pH (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu)

- Sur colonne (CPL, CLHP)- Séparation d'ions (acides aminés, …) et de macroions (protéines, acides nucléiques, …)





2 - les échangeurs de cations, sous forme anionique

Exemples de groupements fonctionnels : -SO3-, - COO-, SP, CM

SP : sulfopropyle Su - CH2 - CH2 - CH2 -SO3-CM carboxyméthyle Su - CH2 – COO-

Remarque : certains échangeurs avec les 2 types.(en particulier pour la désionisation de l’eau)




a - Polymères synthétiques

Document

2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions B - Les supports1 - Supports organiques

b - Polymères naturels

α - Dérivés du dextraneß - Dérivés de la celluloseγ - Dérivés de l’agaroseδ - Dérivés mixtes

2 - Supports minéraux





- modification des interactions électrostatiques entre soluté et phase stationnaire :changement de pH et/ou de force ionique.

- en discontinu ou en continu.

A - Fixation

- choix de la nature (forme anionique ou cationique) de l’échangeur utilisé - pH tel que les solutés se fixent- fixation en présence d’un tampon de faible force ionique

B - Elution



2 3 – Chromatographie par échange d’ions2 3 4 − Utilisation

- utilisée pour la séparation de toutes substances porteuses de charges électriques (acides aminé, protéines, …)

- particulièrement important pour les protéines (supports hydrophiles).


67


68

Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations)

Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur +(sur échangeur d’anions)

CM

DEAE




2 4 1 − Principe

2 1 2 − Supports






- également appelée chromatographie de perméation de gel, chromatographie d'exclusion - diffusion

- origine : mise sur le marché d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement

réticulé, le SEPHADEXTR, suite aux travaux en 1959 par PORATH et FLORKIN.


Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre etApplications

GEL FILTRATION

ABSENCEd'interactions au sens strictDiffusion plus ou moins grande dans un support poreux : les molécules les plus grosses sont éluées les premières

Liquide contenu dans les billes poreuses dont la matière constitue le supportLes supports sont des composés organiques naturels (dextrane, agarose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou des composés minéraux (verre ou silice)

Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et µ donnés

Simple percolation de la colonne par un tampon adéquat, sans modification au cours de l'élution (élution isocratique)

- Sur colonne (CPL, CLHP)- Séparation de macromolécules (ADN, protéines, …) selon leur taille- Détermination de M par la représentation :Kav = - log M + b






2 4 1 − Principe

- pas de liaison entre soluté et phase stationnaire = pas, ici, de "rétention«

- comportement différent des molécules du fait de leur diffusion ou non à l’intérieur d’une matrice poreuse = tamisage moléculaire inverse dans un gel

= sortie en premier des grosses molécules, exclues des billes d'un gel, ; en dernier, les petites qui ont diffusé= SEPARATION du fait de cette diffusion plus ou moins grande

Remarques : .- séparation selon la taille des molécules d’un type de forme déterminé (en général forme globulaire)- possibilité de déterminer les masses moléculaires.



vovevt



2 4 – Chromatographie par gel filtration2 4 1 − Principe

- constituée de grains de gel pourvus de pores de diamètres variables, ceci dans une gamme permettant la diffusion des solutés de masses moléculaires déterminées.

- pores de plus faible diamètre (diamètre minimal) - pores de plus grand diamètre (diamètre maximal)- ensemble de pores de diamètres intermédiaires

- un support de gel filtration ne permet la séparation que dans une gamme déterminée de masses moléculaires.

A - La phase stationnaire



2 4 – Chromatographie par gel filtration2 4 1 − Principe

- ne fait pas cesser des interactions entre solutés et phase stationnaire qui n’existent pas

- rôle : simplement à assurer le déplacement linéaire des solutés .

-simple liquide qui passe à travers la phase stationnaire = liquide qui permet de garder les molécules dans leur état natif, c’est à dire d’un simple tampon dans le cas des protéines

B -La phase mobile :

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2 4 2 − Supports

- par définition, poreux

- conditionnés sous forme de billes, pour faciliter le passage de la phase mobile, c’est à dire diminuer les pertes de charge et éviter le colmatage

- peuvent être organiques, minéraux ou mixtes.

Documents



2 4 – Chromatographie par gel filtration2 4 3 − Conditions de séparation

A - Description schématique du phénomèneSupposons le gel immobilisé dans une colonne. Le comportement des solutés se divise en 3 classes de comportements :

1 - Les grosses molécules2 - Les petites molécules3 - Les molécules de taille intermédiaire

Conclusion : Il y a pour chaque gel un domaine de masse moléculaire :- en dessous duquel il n'y a aucune séparation- au dessus duquel il n'y a aucune séparation- la séparation ne se réalise que dans un domaine de masse moléculaire spécifique

du gel considéré (en fait, il correspond au diamètre maximum (moyen) et minimum (moyen) despores).



Conclusion :Seule séparation

CONSTITUANTSNON SEPARES


Mélange initial



2 4 – Chromatographie par gel filtration2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution

B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

α - Vo : volume mortAucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonneIl correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel

ß - Vt : volume total de la colonneVt = volume du soluté correspondant à la percolation totale de la

colonne (extérieur et intérieur des billes)γ - Ve : volume d'élution ; valeur intermédiaire entre vo et vt

1 - Les divers volumes

a – Description : définition des divers volumes





Vo : volume entre les grainsVe : volume d'élution de la substance étudiéeVT : volume total, c’est à dire somme des volume mort Vo, volume des grains Vg, volume et volume de liquide dans les grains Vs.REMARQUES :- Vo et VT se retrouvent dans tous les types de chromatographie (cf caractères généraux)- Vo et VT sont caractéristiques d’une colonne remplie d’une phase stationnaire donnée,percolée avec une phase mobile à un débit donné ; il y a changement de ces divers volumescaractéristiques d'une colonne selon les conditions : débit de phase mobile, pression, phasemobile, température……d’où nécessité de l’utilisation d’un paramètre caractérisant ladiffusion d’un soluté indépendamment de ces conditions ce sera KD.

1 - Les divers volumes

b – Interprétation de ces divers volumes


Vt = Vo + Vs + Vg

VgVs

Vo

Approche de la valeur de Vsà partir de l’expression du volume total de la colonne


vovevt


Conclusion :Séparation







α - Définition du coefficient de diffusion KD

coefficient de diffusion KD d’un soluté : rapport du volume de soluté supérieur à Vo (soit Ve - Vo) sur le volume contenu dans

les grains Vs. Ve - Vo

KD = ----------------Vs

2 - Le coefficient de diffusion KD, le coefficient de diffusion accessible : Kav

a - Le coefficient de diffusion KD





On démontre que KD = ß - α . log MM , d’où

a - Le coefficient de diffusion KD

ß - Propriétés du coefficient de diffusion

0

1

KD

Log MM


Mais ceci concerne KD et log MM, avec

Ve - VoKD = ----------------

Vs

Or, pour déterminer KD, il faut connaître Vs. ……… ce qui n’est pas le cas ………..

d’où une approche de la valeur de Vs, par exemple,à partir de l’expression du volume total de la colonne

0

1KD

Log MM





Vt = Vo + Vs + Vgd’où Vs = Vt - Vo - Vg

Or Vg est négligeable. On peut donc admettre que Vs = Vt - Vo

détermination du coefficient de diffusion; alors appelé coefficient de diffusion accessible ... Kav (available = accessible)

Ve - VoKav = ---------------

Vt - Vo

b - Le coefficient de diffusion accessible KAV


vove vt

Kav

v

Log kDa

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KAV

log MM

0

1

log MM

KAV10

Courbes théoriquesCourbes expérimentales

et Log MM = - c . Ve + d





diverses opérations à réaliser :

- Détermination de Vo et Vt avec des substances appropriées

- Passage de substances étalons (dans de domaine de séparation) ; réalisationdes calculs de Kav ; construction de la courbe

- passage de la substance à analyser ; calcul de Kav et report sur la courbe

c - Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration


Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 1/2

1 - Détermination de vo et vt avec des substances appropriées

2 - Passage de substances étalons (dans le domaine de séparation) ; réalisation des calculs de Kav ; construction de la courbe

Log kDa

Kav

Calcul des Kav

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Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 2 / 2

3 - Passage de la substance à analyser ; calcul de Kav et report sur la courbe

Log kDa

Kav

Kav

Log kDaX

Calcul du Kav

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95

Expérience de dessalage


96


97



2 4 – Chromatographie par gel filtration2 4 4 − Utilisation

- initialement développée pour la séparation des protéines• séparation • détermination de la masse moléculaire, en concurrence avec l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant

- dessalage des solutions protéiques

- concentration des solutions protéiques (en batch).



2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d’affinité)

2 5 1 − PrincipeA - Généralités

- condition sine qua non : soluté à séparer (protéine) capable de se fixer réversiblement à un ligand spécifique qui est attaché à une matrice insoluble.

M + L <===== M LMacro- Ligand Complexe

molécule attaché à la matrice

- nécessite une connaissance préliminaire détaillée de la structure et de la spécificité biologique du composé à purifier


Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d’affinité)

2 5 1 − PrincipeA - Généralités

M + L <===== M L

(M L) KA = -----------------

(M) . (L)

- valeurs de KA comprises ici entre 105 et 108 M-1

- détermination de KA la méthodologie de Scatchard - ( RL)/(L) = KA n (P) - KA (RL)

( RL)/(L)

(RL)

KA n (P)

n (P)

101

Mélange à séparer au contact de la phase stationnaire

Fixation spécifique de la protéine(« adsorption ») au sens large Libération de la phase solide (désorption)


Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre etApplications

- Fixation des solutés par des interactions spécifiques avec un ligand fixé par covalence sur un support solide- Interactions protéine - ligand caractérisée par la constante de dissociation "KD"

- Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou minéraux (verre, silice, …) avec greffage d'un ligand par covalence- Exemples de ligands (classiquement de petites molécules) : 2',5'-ADP, 5'-AMP, arginine, bleu Cibacron, calmoduline, polyU, protéine A, protéine G, …

Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et µ donnés.Variation au cours de l'élution et / ou tampon contenant une substance à plus forte affinité pour le ligand

- Gradient de pH (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu)- Gradient de ligand de meilleure affinité

- Sur colonne (CPL, CLHP)- Exemples d'application :interaction enzyme -

substrat, antigène - anticorps, hormone - récepteur, …Très efficace lors de la

purification des enzymes

Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d’affinité)




2 5 1 − PrincipeB – La phase stationnaire

C – La phase mobile

- Support (solide) sur lequel est fixé un ligand par une liaison solide, une liaison covalente

- Tampon faisant diminuer les interactions entre solutés et phase stationnaire (ligand) ou contenant un ligand ayant davantage d’affinité pour le soluté macromoléculaire.



2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques2 5 2 − La phase stationnaire

A – Le support* propriétés de la matrice idéale pour la chromatographie d’interactions

biospécifiques :- posséder les groupements chimiques permettant la fixation covalente du

ligand et être stable dans les conditions de cette fixation- interagir faiblement avec les autres macromolécules pour minimiser les

adsorptions non spécifiques- posséder de bonnes propriétés de flux.

* En pratique, particules sphériques, uniformes, et rigides :- les dextranes réticulés (SEPHACRYL S)- l'agarose (SEPHAROSE, BIO - GEL A)- les gels de polyacrylamide (BIO - GELS P)- le polystyrène(BIO - BEADS S)- la cellulose- le verre poreux et la silice.



2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques2 5 2 − Les supports

B – Le ligand

- nature chimique du ligand déterminée par la connaissance préliminaire de la spécificité biologique du composé à purifier. - fréquemment possible de sélectionner un ligand qui montre une spécificité absolue- D'un autre coté, possible de sélectionner un ligand qui présente une sélectivité de groupe : il fixe des composés qui possèdent une spécificité chimique déterminée :

Exemple : AMP 5' qui peut fixer réversiblement beaucoup dedeshydrogénases à NAD+ car l'AMP 5' est analogue, du point de vue structure, àune partie de la structure du NAD+.

1 - Généralités : choix du ligand


2008-2009 Chromatographie 107Copie





B – Le ligand2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire

a - Groupement fonctionnel permettant la fixation

b - Utilisation d'un bras (« arm » - « spacer »)

c - Réactions de fixation




B – Le ligand2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire

Groupement fonctionnel permettant la fixation

- ligand avec groupement chimique adéquat pour permettre sa fixation à la matrice (support) : groupements fonctionnels comme : - NH2 , - COOH, - SH et – OH

- support avec groupements fonctionnels compatibles = activation (voir synthèse peptidique et immobilisation des enzymes).

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2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques2 5 3 − Conditions de fixation et d’élution

A – Fixation des solutés

Conditions favorisant les interactions : - pH,- force ionique assez forte pour minimiser l'adsorption non spécifique

des polyélectrolytes et des groupements chargés sur le ligand- présence de cofacteurs comme des ions métalliques nécessaires à

l'interaction entre le ligand et les macromolécules.Pour que la fixation soit complète, ces conditions doivent être optimisées.

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1 - Sortie des substances non fixées (éluat 1)Passage d'un tampon faisant sortir de la colonne ce qui n'est pas fixé.

2 - Élution non spécifiqueChangement de pH : acide acétique dilué ou de l’ammoniaque (NH4

+ OH-)= changement dans l'état d'ionisation de groupes ionisables du ligand ou de lamacromolécule (critique dans la liaison ligand macromolécule).

Changement de force ionique : peut être effectué sans changementconcomitant de pH : ceci provoque une élution due à la rupture des interactions entreligand et macromolécules ; utilisation, par exemple, de NaCl 1 M

B - Elution




3 - Elution spécifiqueutilisation de substances ayant une plus grande affinité pour le ligand ou

pour la macromolécule :- substrats ou inhibiteurs réversibles de la macromolécule s'il s'agit d'un enzyme- autre ligand ayant plus grande affinité pour la macromolécule : NADP+ dans le

cas de l'AMP 5'

Remarque : nécessité d’éliminer (par exemple par gel filtration) les produits utilisés pour l'élution :

sels, l’autre ligand, ....

B - Elution



2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques2 5 4 − Utilisation

A – Séparation d’une molécule présente dans un mélange

• Séparation spécifique de protéines :- enzymes :

- inhibiteur (compétitif) utilisé comme ligand (arginine, benzamidine, …)- analogues de coenzymes : 5’AMP, 2’,5’ ADP comme ligand- isolement d'enzymes du métabolisme des acides nucléiques par utilisation de nucléotides immobilisés comme ligand

- récepteurs d'hormones- hormone utilisée comme ligand

Remarque : utilisation également possible pour - la concentration de solutions diluées- la séparation de molécules natives de molécules dénaturées

1 - Spécificité absolue


Substances séparéesLigand


Ligand Substances séparées




A – Séparation d’une molécule présente dans un mélange

Séparation spécifique d’acides nucléiques :

* séparation d'ARN m par hybridation sur des colonnes de poly (U)-SEPHAROSE 4B

* séparation d'ARN viral sur des colonnes de poly (A)-SEPHAROSE 4B :ceci est utilisé pour la préparation des ADN copies

* séparation d'ARN complémentaire et d'ADN à partir d'ADN sb fixé surmatrice

1 - Spécificité absolue




A – Séparation d’une molécule d’un mélange

* utilisation de colorants fixant des familles de macromolécules "dye-ligand chromatography"

- BLEU CIBACRON : colorant couplé à un support par la triazine utilisé comme ligand pour purifier des protéines : interaction moins spécifique : séparation de sérum albumine (voir TP), d'interféron, de plasminogène et d’enzymes de restriction

- Rouge Procion (isolement d’enzymes ayant des cofacteurs nucléotidiques) * Autres substances

calmodulines,concavaline Aimmunoglobulines IgG : protéine G utilisée comme ligandlectineshéparine : isolement de facteurs de croissance et de coagulation -

2 - Spécificité de groupe


128


129



2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques2 5 4 − UtilisationB – Techniques dérivées

1 - Séparation de cellules- Séparation de cellules dans un mélange - Par exemple,

- utilisation des propriétés antigéniques de la surface cellulaire- utilisation de la nature chimique des résidus hydrates de carbone sur la surface - utilisation des interactions entre un récepteur membranaire et le ligand.

Exemples de ligand : la protéine A (qui assure la liaison avec les régions Fc des Ig),

les lectinesdes ligands spécifiques pour des récepteurs

membranaires.



2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques2 5 4 − UtilisationB – Techniques dérivées

- formation d'une liaison covalente entre le ligand lié et le composé à séparer (en général des protéines) = pont disulfure entre thiols

- support : thio-propyl SEPHAROSE et le thio-SEPHAROSE

- élution réalisée par addition de dithiothreitol ou de cystéine qui vont se fixer sur le support

- technique utilisée pour purifier la papaïne ou l’uréase qui ont beaucoup de groupements thiols, de même pour la séparation des mRNA nouvellement synthétisés.

2 - "Covalent chromatography"




Introduction : historique : • expériences de "contrôle" effectuées lors du développement des supports de chromatographie d'affinité• étude du comportement de matrices contenant des bras espaceurs en l'absence de ligands• dans la plupart des cas, aucune fixation notable = comportement espéré• dans certains cas (bras héxaméthylène), forte liaison des enzymes même en l'absence de groupements chargés (amine ou carboxylique ) aux extrémités qui auraient pu fonctionner comme des échangeurs d'ions• utilisation pour la séparation de protéines d’une « chromatographie d'interactions hydrophobes », c'est-à-dire d’une chromatographie fondée sur les interactions entre des chaînes aliphatiques d'un support et les régions hydrophobes à la surface de protéines.

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- Peu de fixation de protéines à de courtes chaînes aliphatiques à faible concentration saline (les interactions ioniques prédominent)

- les interactions hydrophobes augmentent avec l'augmentation de la force ionique : les sels masquent les interactions électrostatiques (et provoquent la précipitation par « SOLTING OUT » (sulfate d'ammonium)) = extension de la chromatographie à toutes les protéines

- Inconvénient : précipitation des protéines.

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2 6 1 − Principe- présence de résidus superficiels non polaires chez beaucoup de protéines

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136

Fixation de la protéine(« adsorption ») au sens large

sur les groupements hydrophobes

Élution de la protéine



2 6 1 − Principe




2 6 1 − Principe

- tampons permettant de diminuer les interactions hydrophobes entre support et protéines : par exemple, en diminuant la salinité du tampon.

A - Phase stationnaire- supports classiques possédant des groupements hydrophobes

B - Phase mobile

- possibilité d’utiliser ces interactions entre ces groupements et des groupements non polaires fixés à un support fixe.

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2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes2 6 2 − Les phases stationnaires

- le plus souvent dérivés de l’agarose (SEPHAROSETR) avec substitution par des groupements amino hexyl ou octyl.

- une des structures les plus classiques avec des groupements hydrophobes phényl ou octyl :

phénylSEPHAROSE - O - CH2 - CH - CH2 - O

OH (CH2)7 - CH3

(octyl)

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2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes2 6 3 − Conditions de fixation et d’élution

- forte force ionique afin de favoriser les interactions hydrophobes- en fait, concentration en sel (sulfate d'ammonium) juste inférieure à celle

provoquant la précipitation de la protéine à purifier.

- effet de la nature des ions sur les interactions hydrophobes et la précipitation :

anions :PO4

3- > SO42- > CH3-COO- > Cl- > Br- > SO4

2- > ClO4- > I- > SCN-

cations :NH4

+ < K+ < Na+ < Li+ < Mg2+ < Ca2+ < Ba2+

Plus la structure est perturbée, moins l'interaction hydrophobe est marquée

A - Fixation

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2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes2 6 3 − Conditions de fixation et d’élution

- diminution de la température- utilisation de solvants organiques- diminution de la force ionique (remplacer le sulfate d'ammonium par du

chlorure mercurique)- diminuer la polarité de l'éluant (éthylène glycol - SDS)- diminuer le pH : réduction des effets d'échange d'ions dus aux charges

positives associées au couplage de l'isourée dans la matrice.

B - Elution

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141


142



2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes2 6 4 − Utilisation

- Technique utilisée pour la séparation des protéines dans des conditions assez semblables à celles de la précipitation fractionnée par les sels.

- En fait, séparation sans très grande efficacité : chevauchement des composésles uns sur les autres. Après une précipitation fractionnée, les chancesd'obtenir une bonne séparation sont minces...

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2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes2 6 4 − Utilisation

- Aspects positifs : - capacité de rétention des protéines aussi importante que celle réalisée pour

l'échange d'ions- puisque la séparation est réalisée à haute concentration saline, il n'est pas

nécessaire de changer le tampon avant application- du fait de l'effet stabilisant des sels, le rendement de récupération de l’activité

biologique est le plus souvent excellent.

- Protéines fixées à faible concentration saline = celles ayant une faible solubilité dans l'eau : globulines, protéines associées aux membranes et protéines précipitant entre 20 et 40 % de sulfate d'ammonium ; peuvent être difficiles à éluer.- Technique en progression.

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- addition à la phase mobile de substances ioniques capables de former avec les solutés à séparer des paires d’ions à caractère hydrophobe

2 6 5 − Technique dérivée : chromatographie par appariement d’ions

- des sels d’ammonium quaternaires tels que les tétraéthyl ou tétrabutylammonium (+Nbu4) pour les composés ioniques

- des alkylsulfonates pour la séparation des cations formés par protonation des amines- favorise leur rétention sur les silices greffées n-octyle : C8 ou n-octadécyle : C18 = séparation possible de composés ionisés ou ionisables.

R1

R2

R3

R4

+ −


R1

R2

R3

R4

+−+

Complexe hydrophobe

Agent de la réalisation de la paire d’ions

Phases réverses



Agent de la réalisation de la paire d’ions

R1

R2

R3

R4

+ −


R1

R2

R3

R4

+−+

Complexe hydrophobe

Bu

Bu - N+ - Bu

Bu

Bu - = CH3 – CH2 – CH2 – CH2 –butyl

Séparation en phases inverses



2 7 – " Metal chelate chromatography" ou "Immobilised metal affinity chromatography » (IMAC)

• technique dérivée de la chromatographie d’affinité : • séparation des protéines de même taille et de même point isoélectrique selon leur affinité pour des ions métalliques immobilisés par chélation (Zn2+, Cu2+, Cd2+, Co2+ Hg2+ et Ni2+). • fixation des macromolécules en fonction du pH et de la présence d'un résidu histidine dans la macromolécule.

échantillon appliqué à pH neutre et élution du composé en diminuant le pH et la force ionique du tampon ou en incluant de l’EDTA dans le tampon (autres chélatants d'ions : l'acide iminodiacétique et le TRIS(carboxyméthyl) éthylènediamine)

(technique utilisée pour la séparation du fibrinogène, de la superoxyde dismutase et des protéines nucléaires différentes des histones)• utilisation pour des protéines recombinantes (de fusion) dans lesquelles sont inclus des « tags » (poly His) qui fixent des ions (Ni2+)

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148

- technique utilisée pour la séparation du fibrinogène, de la superoxydedismutase et des protéines nucléaires différentes des histones

- Utilisation pour des protéines recombinantes (de fusion) dans lesquelles sont inclus des « tags » (poly His) qui fixent des ions (Ni

2+)

- protéines de fusion : protéines obtenues par génie génétique (expression dans une cellule hôte E. coli) comprenant :- la protéine d’intérêt - un morceau (« domaine ») d’une protéine servant de marqueur (tag) :

ici poly His(mieux acceptée par la cellule hôte + facilité de séparation)Fixation des protéines (azote de His) par l’intermédiaire d’ions minéraux (Me

2+= Ni

2+ par exemple (Zn

2+, Cu

2+, Cd

2+, Co

2+Hg

2+et

Ni2+

)).

- élution par EDTA, par exemple


149

Expression

ADN recombinant = obtenu par génie génétique

gène d’intérêtSéquence « tag »

Protéines de fusion




Chromatographie


Cours TB2003 - 2004



Chromatographie

1 1 1 - Définition





1 3 1 - Modélisation intuitive

1 3 2 - Volumes de rétention

1 3 3 - Coefficient de partition, constante de distribution1 3 4 -Facteur de capacité, facteur de partition

1 3 5 - Facteur de sélectivité α

1 3 6 - Efficacité de la colonne et résolution

1 3 7 - Représentation schématique d’une chromatographie



Chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption2 2 – Chromatographie de partage2 3 – Chromatographie par échange d’ions




2 7 – Autres chromatographies

2 – Principe des méthodes de chromatographie







Chromatographie

3 – Méthodologie et applications3 1 – Méthodologies

3 1 1 – Chromatographie sur colonneA - Chromatographie en phase liquide

B - Chromatographie en phase gazeuse

3 1 2 – Chromatographie de surfaceA – Méthodologie générale

B – Différences


3 1 3 – Chromatographie en batch et méthodologies dérivées


2 – Basse pression

3 – Moyenne – haute pression

a – Les divers temps de mise œuvre et appareillageb – Les principales méthodologiesc – Les principales différences entre méthodologiesa – Appareillageb – Méthodologie

a – Appareillageb – Méthodologie

1 – Appareillage

2 – Méthodologie



A - Chromatographie en phase liquide


3 1 2 – Chromatographie de surfaceA – Méthodologie générale

B – Différences

Chromatographie 3 – Méthodologie et applications









1 - Généralitésa - Les divers temps de la mise en œuvre et

l’appareillage utiliséb – Les principales méthodologiesc –Principales différences entre les méthodologies






a1 – Les divers temps de la mise en œuvre


l’appareillage utilisé

- Mise en service et vérification de l’appareillage- Préparation des réactifs- Préparation et mise en place de la phase stationnaire- charge de la colonne- Élution des substances non fixées- Élution des substances fixées- Détection - Lavage - Exploitation des résultats






- support : choix avec nature chimique, granulométrie, état physique (sec ou humide) - colonne : choix de la forme (rapport hauteur / diamètre) qui doit êtreadapté au type de chromatographie choisi ; taille de la colonne ;préparation de la colonne (vérification de l’homogénéité du support =remplissage et le vérifier expérimentalement; garder les colonnes préparées(basse pression ; chambre froide))-réservoir de phase mobile et pompe : préparation de la phase mobile etvérification de son débit (stabilité) et de la pression- introduction de l'échantillon à analyser- élution : appareil à gradient ou non : gradient ; gradient discontinu etgradient continu ou absence de gradient (isocratique)



a2 – L’appareillage utilisé pour la mise en œuvre


Élution par gradient

Gradient discontinu Gradient continuEn ordonnées, intensité d’un paramètre physico-chimique P permettant l’élution (polarité, pH, force ionique , concentration en ligand, température)

Volume de phase mobile

Intensité de P


Intensité de P

Une seule étape

Plusieurs étapes

linéaire

concave

convexe

Attention : difficile pour pH

Existence de gradients décroissants


C1 C2

Vers colonne


Intensité de P

V1 V2

Appareil à gradient





- détecteur : détection des solutés et leur quantification - système informatique : stockage et traitement des informations,commande et contrôle du système

insérer figure des différentes parties d'un appareil de chromatographie



a2 – L’appareillage utilisé pour la mise en œuvre




1 - Initialement : phase stationnaire dans une colonne avec percolation de la phase mobile, éventuellement en augmentant la pression hydrostatique (en élevant le niveau du réservoir de solvant) pour obtenir un débit acceptable (1 mL / min)


1 - Généralitésb - Les principales méthodologies

mauvais comportement des supports :- colmatage du SEPHADEX devant l'augmentation de la pression - particules anguleuses (alumine et gel de silice) ; perturbation du flux et mauvaises performances= impossibilité d'augmenter les pressions (impossible d’obtenir qques atm)

maisH

= chromatographie basse pression




2 - apparition de nouveaux supports (adsorption et partage au début)- plus fins et billes (meilleure séparation) mais augmentation

des pertes de charges- résistant à une augmentation de pression

d'où le Concept de

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) ouChromatographie Liquide à Haute Pression(CLHP)






3 - De tels supports = non adaptés aux substances protéiques.PHARMACIA (1975 ?) : supports d'échange d'ions initialement

hydrophiles (résines) et permettant de fonctionner à une pression plus faible, adaptée au protéines :

concept de FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography").d'ou le concept de chromatographie à moyenne pression

4 - supports de propriétés semblables proposés par d'autres fabricants : supports de types plus nombreux, fonctionnant à pression plus réduite ; globalement augmentation des performances par rapport à la basse pression

Concept de Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) ou

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)






Conclusion :

On distinguera :- chromatographie basse pression - chromatographie à moyenne et haute pression

(chromatographie à haute performance)




- colonnes beaucoup plus petites en FPLC et HPLC pour échelle préparative etanalytique : quelques ml ont même efficacité que 100 ml en basse pression

- grosses colonnes à l'échelle développement et industriel : 10 litres ...60 cmde large et 50 cm de hauteur




1 - Généralitésc – Principales différences entre les méthodologies

α - Colonne

α1 - Taille

- grandes variétés : aspect commercial – voir catalogues- finement divisés ; homogénéité des supports

α2 - Support


Colonnes de chromatographique Principaux types (laboratoire)

Basse pression Moyenne / haute pression


Colonnes de chromatographique Principaux types (laboratoire)


Colonnes de chromatographique Principaux types (industrie)

Moyenne / haute pression



ß – Pression : basse pression jusqu'à 3 bars, HPLC vers 60 bars, aumaximum 200 bars

γ - Détection et traitement des résultats : technique très fine : d'où desdétecteurs "à la hauteur" : au delà des détecteurs classiques spectrométrie de masseapplicable aux protéines (recombinantes)

δ - Automatisation : poussée pour FPLC / HPLC

Conclusion :- basse pression : technique souvent manuelle ; mise en œuvre préparative- moyenne et haute pression : grand degré d'automatisation et d'informatisation :

toutes parties performantes : appareillage sophistiqué, utilisation aidée par l'informatique ;mise en œuvre analytique et industrielle




1 - Généralitésc – Principales différences entre les méthodologies





2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit.

a – Appareillage schéma d'une système basse pression

Réservoir d’éluant

Robinet

Colonne (avec adaptateur et jaquette)

Sortie de colonne

Injection


Réservoir d’éluant

Robinet

Colonne (avec adaptateur et jaquette)

Sortie de colonne

Injection







a1 - colonnetaille de l'ordre de 30 cm de haut,

diamètre 1,6 cm (en moyenne)support en fonction du type de

chromatographie choisi, c'est-à-dire en fonction du mélange de solutés : exemple PHARMACIA : gel filtration, échange d'ions, affinité, interactions hydrophobes ...

a2 – Phase mobileréservoir : un ou deuxpompe pour pression constante

(supérieure à la pression atm), gradient (?)



a – Appareillage







a3 – Dispositif d’injection simple par une seringue ou robinet à plusieurs voies (voir schémas

appareillage PHARMACIA)a4 - Détectionmanuelle (discontinue) ou spectrophotomètre à

280 nm ou autre longueur d'onde (254 nm)a5 - Recueil des fractions

- manuel : discontinu- collecteur de fractions

a6 - Résultats ; leur traitement



a – Appareillage




b1 - Mise en route (basse pression)comprend :

- montage ou remise en route de l'appareillage (absence de bulles) ;continuité liquide

- préparation de la phase mobile : qques litres ; nécessité de dégazerpour éviter la formation de bulles

- préparation de l'échantillon : changement de tampon (comment ?)utilisation d’un étalon (externe (standard)

ou interne)b2 - Injection

aiguille et seringueb3 - Élution

gradient discontinu / continu


2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit.b – Méthodologie




b4 - Lavagerégénération de la colonne : une colonne se garde en chambre

froide (en présence d’azoture de Na)

b5 - Traitement des résultats enregistreur en général pour obtenir le diagramme d’élution

détermination de la forme des pics : qualité de la séparationdétermination de la position des pics (tR) : identification du

solutédétermination de la surface des pics (intégration de A = f(V))

intégration manuelle : découpage du papier et pesée des pics (aspect historique)

intégration automatique comparaison avec un étalon externe




Détermination des concentrations des différents solutés d’un échantillon

Diagramme d’élution d’un standard

(solution des divers solutés de concentration connue et

traitée dans les mêmes conditions )

Diagramme d’élution d’un échantillon

Abs

Étalon externe

tr

Détermination deα = SstA / CstA

Détermination dela surface SeACeA = Se / αCeA = Se . CstA / SstA

tr

Abs

BA C

BA C

S = α . C




Conclusion :

long : 3 heures pour un temps de passage ;

utilisé à l'échelle préparative, souvent montages en chambre froide,

toujours utilisé, bien que l'HPLC devienne préparative ;

mg de produit.






a1 - colonne - beaucoup plus petites ; peuvent

être dans une enceinte thermostatée pour augmenter la reproductibilité ; FPLC colonne de 5 cm de haut

- taille des billes de l'ordre de 5 à 10 µm

a2 – Réservoirs et pompepour la phase mobile

- réservoirs : un, deux ou plus - pompe délivrant jusqu'à 300 bars

(au début), actuellement de l'ordre de 100 bars ; technologies différentes


3 – Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriela – Appareillage




a3 - Injecteur boucle d'injection de FPLC : systèmes à boucles : voir document

PHARMACIA

systèmes en HPLC


3 – Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel

a – Appareillage




Schéma d’un appareillage FPLC




a4 – DétecteurMéthodes optiques

•spectrophotométrie à 280 nm , 203 nm ; pour substances absorbant dans l'UVRemarque : spectrophotométrie spectrale : spectrophotomètre avec comme

récepteur une barrette de diodes ; permet l'obtention de chromatogrammestridimensionnels. traitement informatique (voir documents)* fluorimétrie : méthode beaucoup plus sensible.

Remarque : dérivatisation pré ou post-colonne* réfractométrie : sucres ; peu sensible

Méthodes électrochimiques : réaction d'oxydoréduction des composés élués, produit un courant électrique mis en évidence

Méthodes physiques : spectrométrie de masse


3 – Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriela – Appareillage




a5 - Traitement des résultats (Moyenne et haute pression)

enregistreur / intégrateur en généralenregistrement graphique ou visualisation sur écranintégration de la courbe d’élution stockage des données



a – Appareillage




informatisation poussée : sortie des % mais réglage : la machine peut faire n'importe quoi.reliée à des banques de données pour, par exemple,identification des impuretés présentes (cas d'un

médicament)



a – Appareillage

a5 - Traitement des résultats (Moyenne et haute pression)




échelle analytique, préparative et industrielleen analytique : jamais première étape de séparationen préparatif et industriel : peut maintenant être première (et unique)

étapeb1 - Mise en route

- remise en route de l'appareillage (allumer les diverses parties de l'appareillagedans l‘ordre défini)

- préparation de la phase mobile : nécessité de filtrer et de dégazer les différentesphases mobiles (tampons) pour éviter le formation de bulles et la présence de poussières quiencrasseraient (colmateraient la colonne)

- contrôle de l'appareillage : contrôle de la pression et contrôle de la ligne de baseen particulier


3 – Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industrielb – Méthodologie




b2 - Injection (Moyenne et haute pression)faible volume d'échantillon dans un tampon déterminé (problèmes de

nature du tampon, de force ionique)passeurs d'échantillons






b3 - Élutiongradient continu de phase mobile : 2 à 3 (ou plus phases mobiles) mélangées selon un gradient programmé ; recueil des fractions



b4 - Lavage (Moyenne et haute pression)

nettoyage de la colonne




b5 - Traitement des résultats

- enregistrement graphique des valeurs sur enregistreur et/ou visualisation sur écran ; stockage sous forme de fichier -calcul de la surface des pics selon divers modes de calculs : prise en compte des caractères de la ligne de base, du chevauchement, du bruit de fond, ....- certification BPL norme ISO 9002 assurance-qualité






b5 - Traitement des résultats

détermination de la forme des pics : qualité de la séparationdétermination de la position des pics (tR) : identification du solutédétermination de la surface des pics (intégration de A = f(V))

intégration automatique comparaison avec un étalon : étalon externe / étalon interne






Abs

tr


(solution des divers solutés de concentration connue et traitée dans les

mêmes conditions )

Étalon externeAbs

tr

Étalon interneAbs

tr


avec étalon interne




(solution des divers solutés de concentration connue et

traitée dans les mêmes conditions )


Abs

Étalon externe

tr

Détermination deα = SstA / CstA

Détermination dela surface SdACd = Sd / αCd = Sd . SstA / CstA

tr

Abs

BA C

BA C







- phase mobile gazeuse : importance de la température d’ébullition

- méthode utilisable pour la séparation de mélanges gazeux (azote, méthane, éthylène), de substances spontanément volatiles ou rendues volatiles par chauffage

- nécessite, de ce fait, une méthodologie particulière

- historiquement, amélioration de la méthodologie basse pression : possibilité de modifier les divers paramètres, donc d’optimiser la technique



1 - Appareillage



- grande pureté, - inertie par rapport aux substances à chromatographier, - très faible viscosité (la viscosité des gaz augmentant avec la température, il y aurait d'importantes diminutions de débit) ; -conductibilité thermique compatible avec le système de détection- les plus employés : azote, argon, hélium et hydrogène.



1 - Appareillage : les différentes parties




a - Réservoir de gaz vecteur

a1 - Le gaz vecteur ; propriétés et nature



.- qualité de la chromatographie liée au débit du gaz vecteur ; régulateurs permettent de contrôler et de choisir la vitesse désirée ; varie suivant le diamètre des colonnes :

colonnes de 1/4 de pouce 50 - 70 ml /min, colonne 1/8 de pouce 25 - 30 ml/min.



1 - Appareillage : les différentes partiesa - Réservoir de gaz vecteur

a2 – Conservation et détendeur

- conservé dans des bouteilles métalliques sous forte pression ; introduit aprèspassage dans des détendeurs dans le système chromatographique sous des pressions allant de 1 à 4 bars

a3 – Débit ; sa régulation


* échantillon à analyser gazeux ou préalablement mis en solution dans un solvant très volatil

* injection à l'aide d'une micro seringue Hamilton sous des volumes allant de 1 à 10 µl, à travers une membrane d'élastomère qui obture la chambre d'injection ; solutions ne doivent pas trop concentrées et injection rapide pour éviter les élargissements de pics

* double fonction de la chambre d'injection :- volatilisation instantanée de l'échantillon introduit- mélange homogène de la vapeur ainsi formée et du gaz vecteur

* volume et géométrie soigneusement étudiés ; maintenue à des températures élevées, en général de 20 à 30 °C supérieures à celles de la colonne ; attention à la décomposition thermique des substances de l'échantillon.




1 - Appareillage b - Chambre d'injection


- Température entre 150 et 300 °C.

- dispositif de programmation de la température permettant de l'augmenter progressivement (accélère la séparation) : gradient de température




1 - Appareillage

c - Le four


acier inoxydable ou verre au Cu -Al ou plastique1 à 4 m spirale (pour n'occuper que des espaces restreints).

- phase stationnaire liquide* fixée sur une phase solide constituée de particules solides* déposée sur la paroi de la colonne

polyesters ou polyéthers de glycol, silicones, carbures saturés- phase stationnaire solide :

petites particules solides ;greffage possible

remplissage est délicat , d'où utilisation de colonnes prêtes à l'emploi.




1 - Appareillage d – La colonne


-substances à détecter dans un état physique particulier, d'où des détecteurs particuliers

- modification des propriétés physiques et chimiques du gaz vecteur du fait de la présence des solutés : transformation de ces différences de propriétés en signaux électriques, amplifiés, enregistrés et, éventuellement, transcrits sous forme graphique par un enregistreur.

- observation de pics saillants par rapport à une ligne de base.




1 - Appareillage e - Le détecteur


- flamme de dihydrogène brûlant entre 2 électrodes polarisées- production d’ions du fait de la combustion des molécules organiques - production d’un courant électrique recueilli par les électrodes et transmis, après amplification, à l'enregistreur ; courant de base, en général, peu important.




1 - Appareillage e - Le détecteur

e1 - F I D (flame ionisation detector)


Insensible aux molécules minérales présentant un potentiel d’ionisation élevé : H20, CO, CO2, N2. Sensibilité variable selon les molécules : maximale pour hydrocarbures saturés ou non, diminue avec la présence de groupements halogène, amine, hydroxyle et surtout carbonyle et acide. Permet de déceler des quantités de l’ordre du nanogramme. Inconvénient : destructif





1 - Appareillage

e2 - Catharomètre

- Utilisation de la conductibilité thermique.

- fil métallique chauffé électriquement ; perd une quantité de chaleur constante dans le temps s'il est placé dans un gaz pur ; dans un mélange variation de la perte calorique d’où variation de la résistance ; variation est déterminée par un pont de Wheatstone.

e - Le détecteur


- source d'électrons pour transformer les molécules sortant de la colonne en ions qui sont attirés par une anode.

- Enregistrement de la variation de courant.

- utilisable uniquement pour les molécules capables de capter des électrons.




1 - Appareillage

e3 – Capture d’électrons

e - Le détecteur


Méthode très sensible ; permet d'élucider des structures.




1 - Appareillage

e4 – Spectrométrie de masse

e - Le détecteur


* Avantages de la CPG, par rapport à la chromatographie basse pression :

- grand nombre de facteurs sur lesquels on peut agir pour améliorer la séparation : température, nature et caractéristiques de passage de la phase mobile, nature de la phase stationnaire

- utilisation d'une phase mobile gazeuse, inerte par rapport au soluté et permettant une utilisation de méthode de détection très sensibles

- automatisation possible- rapidité des séparations réalisées ; encore améliorée avec des

colonnes de microdiamètre* Traitement de l’échantillon * Déroulement de la chromatographie




2 - Méthodologie

a - Caractéristiques générales


rendre l'échantillon volatil ; échantillons rarement d'emblée volatils.

Échantillons rendus plus volatils par introduction de groupement hydrophobes : séparation des molécules les unes des autres par absence de liaisons polaires entre elles....

b1 - Réaction de silylation : utilisation du triméthylsilane(TMS) -Si-(CH3)3

Le groupement se substitue à un H mobile (par exemple alcoolique)R-OH + Cl-Si-(CH3)3 ---------> R-O-Si-(CH3)3 + H Cl

chlorure de TMSfonction alcool polaire, responsable des interactions entre molécules :

volatilité liée à l'absence d'interactions ; on diminue la possibilité de réaliser des liaisons hydrogène




2 - Méthodologie b - Traitement de l’échantillon


b2 - Réaction d'alcoylation

- remplacement d'un H mobile par une radical R alcoyl (chaîne hydrocarbonée)

b3 - Réaction d'acylation

- remplacement d'un H mobile par une radical R acyl (chaîne hydrocarbonée d'un acide organique)

Remarque : Utilisable pour de petites molécules, pas d'application aux macromolécules ; utilisation pour les alcools, ce qui sort d'un fermenteur




2 - Méthodologie b - Traitement de l’échantillon


- technique la plus simple : maintien de la pression et la température constantes dans la colonne : chromatographie isotherme et isobare.

- pour éviter de trop long temps de migration d'augmenter progressivement la température de la colonne selon un programme préétabli (gradient de température) : chromatographie à température programmée ; l'augmentation de température modifie le débit gazeux ce qui conduit à l'emploi d' un système de régulation automatique de débit en fonction de la température.

Les températures les plus utilisées : 80 – 300 °C




2 - Méthodologie c - Déroulement de la chromatographie


Chromatographie


3 1 – Méthodologies3 1 2 – Chromatographie de surface

A – Méthodologie générale

B – Différences


Chromatographie



1 - Préparation de la phase mobile (simple ou complexe) monophasique ou biphasique


chromatographie de partage : système monophasique ou biphasique

Système monophasique Système biphasique N-butanol 3Acide acétique 1Eau 1

N-butanol 3Acide acétique 1Eau 4


Chromatographie



2 - Préparation du support ; en particulier découpage - ciseaux - traits au crayon de papier- ligne de dépôt

3 – Dépôts- équidistants



Chromatographie



4 – Migration : ascendante / descendante



Chromatographie



5 – Révélationréaction colorée permettant de mettre en évidence les solutés sous

forme de taches = spotsnature chimique des réactifs utilisés (corrosivité)

6 - Résultats et leur évaluationnoter le front du solvant :

calcul du Rf ou valeur relative à une substance de référence

reproductibilité



Front du solvant

Dépôt

Exemple de la CCM après révélation

Rf = d / D

d

D


Départ du front solvant

Dépôt


Rf = d / DRef

dDref


Départ du front

solvant

Dépôt


Rf = d / DRef

dDref




- papier servant de support inerte

- fixation de l'eau (en général) d'où une chromatographie de partage

- 80 cm : chromatographie descendante

- Révélation par des réactifs non corrosifs (ex : phtalate d’aniline pour les sucres)

B - Différences1 - Chromatographie sur papier (1944)


Chromatographie sur papier


Système biphasiqueCas de la chromatographie

sur papier

Phase organique

Phase aqueuse




- chromatographie sur couche mince : partage ou/et adsorption

- plaques 20 X 20 cm maximum : souvent plus petites

- Ascendante

- révélation par des réactifs corrosifs (acides forts)

B - Différences

2 - Chromatographie sur couches minces (Stahl 1956)




- automatisation possible : Rhône Poulenc

- CCM avec couche de concentration utilisé pour étapes préparatoires de HPLC : mise au point de systèmes de solvants optimisant la séparation.

B - Différences

2 - Chromatographie sur couches minces (Stahl 1956)


3 1 – Méthodologies3 1 3 – Mise en œuvre en batch

- addition de phase stationnaire au mélange à séparer = solide - mise en suspension par agitation


A – Mode opératoire


3 1 – Méthodologies3 1 3 – Mise en œuvre en batch

- décantation : séparation des deux phases


A – Mode opératoire

phase liquide

Traitement ultérieur

phase stationnaireÉlution en batch ou sur colonne

recueil de la phase intéressantesoit soit


3 1 – Méthodologies3 1 4 – Mise en œuvre en lit fluidisé


Mode opératoire

Élution en batch Élution en colonne

Charge en lit fluidisé

soit soit puis


3 2 – Applications : quelques exemples

3 2 1 – Séparation des acides aminés

3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC

3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC

3 2 4 – Autres applications



3 2 – Applications : quelques exemples3 2 1 – Séparation des acides aminés


- purification de la protéine à séquencer : isolement d’une chaîne polypeptidique - hydrolyse chimique acide et basique ; temps d’hydrolyse- séparation des mélanges obtenus par chromatographie - échange d’ions historiquement, actuellement interactions hydrophobes- automatisé

A – Séparation et dosage des acides aminés d’un hydrolysat de protéines = détermination de la composition totale en acides mainés


3 2 – Applications : quelques exemples3 2 1 – Séparation des acides aminés


- purification de la protéine à séquencer : isolement d’une chaîne polypeptidique - hydrolyse enzymatique de la chaîne- séparation et purification des divers fragments - travail sur un fragment donné : utilisation du réactif d’EDMAN , c’est à dire détachement récurrente d’acides aminés à partir de l’extrémité –NH2 (PHT aas)- séparation des acides aminés par chromatographie d’interactions hydrophobes- automatisé

B - Détermination de la structure primaire des protéines




Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations)

Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur + (sur échangeur d’anions)

CM

DEAE



3 2 – Applications : quelques exemples3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC








3 2 – Applications : quelques exemples3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC



3 2 – Applications3 2 4 – Autres applications





Chromatographie



1 - Préparation de la phase mobile (simple ou complexe) monophasique ou biphasique

2 - Préparation du support ; en particulier découpage 3 - Dépôts4 – Migration : ascendante / descendante5 – Révélation 6 - Résultats et leur évaluation

