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Chromatographie(Par type d'intéractions)

Malak MaamarSemestre 1Année Universitaire : 2014/2015

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• Chromatographie d'adsorption • Chromatographie de partage à polarité de phase normale• Chromatographie de partage à polarité de phase inversée• Chromatographie ionique• Chromatographie de paire d'ions• Chromatographie d'exclusion par la taille  

Plan

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Chromatographie d'adsorption

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La chromatographie d'adsorption utilise comme phase stationnaire les gels de silice (SiO2) et d'alumine (Al2O3).

Elle s'applique bien à la séparation de composés présentant des groupements polaires différents.

Phase stationnaire

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Un gel de silice peut être représenté théoriquement par : [SiO2-(x/2)(OH)x]n,(H2O)p

Ce sont des groupements OH ou groupements silanols présents à raison de 4.6OH/nm2 qui confèrent à la silice ses propriétés adsorbantes.

3 types de sites participent à des degrés divers au mécanisme de rétention : ◦ Les groupements silanols libres ◦ Les groupements silanols liés par des liaisons hydrogènes ◦ Les groupements silanols libres recouverts par une molécule d'eau ◦ Les groupements siloxanes

Phase stationnaire

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Les gels de silice ont une structure très poreuse qui leur confère des surfaces spécifiques très élevées comprises entre 200 et 600 m2/g.

Compte tenu des grands volumes d'éluant percolant sur les colonnes chromatographiques, il est recommandé de ne pas dépasser une valeur de pH=7.5 pour éviter la dissolution de la silice dans l'eau.

Phase stationnaire

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Energie d'adsorption du soluté Les énergies d'adsorption varient avec la nature des silanols selon qu'ils sont libres ou liés et selon qu'ils sont ou non recouverts par une molécule d'eau. Un soluté comportant un groupement unique ayant une grande énergie d'adsorption conduit à une adsorption localisée. Lorsque plusieurs groupements sont présents dans la molécule, le soluté va interagir avec plusieurs sites simultanément.

Mécanismes

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Influence de différents facteurs ◦ Surface spécifique

Plus la surface spécifique de la colonne est grande plus le soluté est retenu. Si l'augmentation de la surface spécifique entraine une diminution des diamètres des pores, il peut en résulter avec des silices de grandes surfaces spécifiques un phénomène d'exclusion pour les grosses molécules.

◦Activité, teneur en eau, solvant L'activité d'un adsorbant dépend de sa teneur en eau.L'obtention de séparation reproductible exige la constance de l'activité de l'adsorbant, c'est-à-dire l'obligation d'ajuster la teneur en eau de chaque solvant pour qu'elle soit en équilibre avec celle de l'adsorbant.

Mécanismes

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Force éluante de la phase mobile ◦Solvant pur

L'énergie libre d'adsorption des molécules de phase mobile communément appelée force éluante permet de contrôler la rétention des solutés.

◦Mélanges de solvantsIl est très rare qu'un solvant unique permette d'aboutir à des valeurs de facteurs de capacité convenables et surtout à une résolution optimale. C'est pourquoi on utilise très souvent des mélanges de solvants.

Mécanismes

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Pour couvrir une large gamme de forces éluantes et s'affranchir des problèmes d'immiscibilité des solvants, on met souvent en œuvre, comme phase mobile, des mélanges ternaires : solvant polaire (méthanol), solvant de polarité moyenne (acétate d'éthyle), solvant apolaire (iso-octane).

Phase mobile

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Chromatographie de partage à polarité de phase normale

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La chromatographie de partage de ce type utilise comme phase stationnaire des silices greffées de motifs organiques polaires.

Les propriétés remarquables des gels de silice (grande surface spécifique, résistance à la pression, disponibilité dans des diamètres trop petits) jointes au fait que les groupements silanols sont réactifs font qu'ils constituent un matériau de choix pour la synthèse des phases stationnaires greffées.

Phase stationnaire

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La méthode de greffage est la plus utilisée car elle consiste à faire réagir avec la silice un silane mono, di ou trifonctionnel, chloro (Cl-Si(R) 3) ou alkoxysilane (R’-O-Si(R)3).

Phase stationnaire

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Le mécanisme de cette séparation fait intervenir une solvatation des greffons polaires par le solvant le plus polaire contenu en faible quantités dans la phase mobile.

Les molécules de solutés vont soit interagir avec la phase liquide polaire stationnaire soit déplacer des molécules de celle-ci.

La rétention des solutés diminue lorsque la teneur en solvants polaires dans la phase mobile augmente.

Mécanisme

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La phase mobile est souvent constituée d'un alcane (comme solvant de base) et d'un solvant polaire (en faible teneur).

Phase mobile

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Chromatographie de partage à polarité de phase inversée

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Les phases stationnaires les plus utilisées sont les silices greffées alkyle.

Phase stationnaire

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Elles sont obtenues avec la méthode de greffage. Les greffons les plus courants sont : ◦ les chaines octyles (C8 ou Reversed Phase 8) ◦ les chaines octadéciles (C18 ou RP18).

Phase stationnaire

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Deux mécanismes de rétention macroscopique ont été proposés dans le cas des silices greffées alkyles : ◦Le solvant organique de la phase mobile se fixe

préférentiellement à la surface des greffons apolaires : il y a alors partage des solutés entre la phase mobile et la phase liquide adsorbée.

◦Une autre approche décrit la rétention comme une conséquence de l'effet hydrophobe : il y association réversible du soluté avec les greffons.

Mécanisme

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Le solvant de base est l'eau (pure). La rétention des solutés est régie par la nature et la teneur

du solvant organique associé (méthanol, acétonitryle …). Dans le cas de mélanges complexes ou de séparation

difficile, on est souvent amener à mettre en œuvre des mélanges ternaires (eau/méthanol/acétonitryle).

Phase mobile

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Chromatographie ionique

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La phase stationnaire est un échangeur d'ions c'est-à-dire un solide comportant les groupements fonctionnels ionisés, fixes, porteurs de charges positives ou négatives et des ions mobiles de signes contraires assurant l'électroneutralité.

Les ions, retenus au voisinage des groupements fonctionnels par des forces d'attraction électrostatiques sont interchangeables, en nombre équivalent, avec ceux de la solution mise en contact avec l'échangeur.

Phase stationnaire

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Tout échangeur d'ions comporte 2 parties : ◦Des groupements fonctionnels (qui lui confèrent ses

propriétés) : les échangeurs de cations dont les groupements sont chargés

négativement (sulfonates-SO3-)

les échangeurs d'anions dont les groupements sont chargés

positivement (ammonium quaternaire-NR+3)

◦La matrice ou le support (sur laquelle ces derniers sont greffés) : Le greffage des groupements échangeurs d'ions est effectué soit sur des microparticules de silice poreuse soit sur des copolymères organiques de structure macroporeuse.

Phase stationnaire

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Dans le cas d'un échangeur de cations initialement sous la forme d'un ion E+ placé au contact d'une solution totalement ionisée contenant des ions S+. Il s'établit un équilibre d'échange d'ions : S+

M + E+S = S+

S + E+M

La rétention du soluté S+ est régie par :◦ la différence d'affinité entre S+ et E+ pour l'échangeur

d'ions considéré◦ la concentration de E+ dans la phase éluante

Les différences d'affinité dépendent essentiellement des caractéristiques physiques des ions solvatés. En règle générale, l'échangeur d'ions marque une préférence pour les ions de plus petites dimensions.

Mécanisme

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On utilise le plus souvent une solution aqueuse en raison des caractères ionisant et dissociant de l'eau. Dans la mesure ou l'on opère souvent à une ionisation partielle des solutés organiques, on est fréquemment conduit à ajouter un alcool (méthanol ou éthanol) à la phase aqueuse afin d'augmenter la solubilité des formes non ioniques.

Phase mobile

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Chromatographie de paire d'ions

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Cette chromatographie encore appelée chromatographie d'intéractions d'ions constitue une alternative à la chromatographie d'échange d'ions pour l'analyse des composés ionisés ou ionisables.

Son principal avantage tient à ce qu'elle ne nécessite pas la mise en œuvre de phases stationnaires échangeuses d'ions, utilisant des phases stationnaires apolaires de chromatographie à polarité de phases inversées.

On appelle paire d'ions l'entité formée par l'association de 2 ions de charges opposées.

Présentation

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Les silices greffées octyl et octadécyle sont majoritairement utilisées en chromatographie de paires d'ions.

Le contre-ion présent d'une façon permanente dans la phase éluante se fixe sur les chaines alkyles de sorte que la phase stationnaire comporte des greffons recouverts par le contre-ion.

Phase stationnaire

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Deux mécanismes de rétention coexistent : ◦Echange d'ions avec le co-ion assurant l'électroneutralité

vis-à-vis du contre-ion fixe par effet hydrophobe à la surface des chaines alkyles (la partie ionisée est dirigée vers la phase mobile polaire). On génère ainsi in-situ un échangeur d'ions dont la capacité dépend de la concentration du contre-ion dans la phase éluante.

◦Partage hydrophobe à la surface des chaines demeurées libres de paires d'ions, formés entre les solutés qui doivent être alors suffisamment hydrophobes.

Mécanismes

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La rétention des solutés dépend de leur degré d'ionisation, la teneur en solvant organique, la nature et la concentration du contre-ion dans la phase éluante.

Quelques exemples de contre-ions utilisés : ◦Anioniques : alkyles et acyles sulfonates (pentane-

sulfonate C5), alkyles sulfates (octyle sulfate C8), anions inorganiques (trifluoroacetate)

◦Cationiques : ammonium quaternaire, amine protonnée

Phase mobile

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Chromatographie d'exclusion par la taille  

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La chromatographie d'exclusion par la taille (chromatographie de permeation sur gel, chromatographie d'exclusion stérique) est une technique qui permet de séparer des macromolécules naturelles ou synthétiques en fonction de leurs poids moléculaires.

Les phases stationnaires sont souvent des résines poreuses.

Présentation

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Les macromolécules de petites tailles vont pouvoir accéder à tous les pores et sortiront donc au volume de perméation totale.

Les macromolécules de très grandes tailles vont être exclues de tous les pores et sortiront au volume d'exclusion total.

Entre ces deux limites, la colonne possède une sélectivité vis-à-vis du poids moléculaire de la macromolécule : c'est le domaine de fractionnement de la colonne.

Principe

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Les phases mobiles utilisées sont presque exclusivement organiques.

Il faut utiliser un bon solvant pour dissoudre la macromolécule parfaitement.

Le tétrahydrofurane est le solvant le plus utilisé.

Phase mobile

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Types de chromatographies Principe

Chromatographie d'adsorption C'est la technique chromatographique la plus connue, en tant que méthode de séparation. La phase stationnaire est un solide doué de propriétés

absorbantes (gels de silice et d'alumine). La phase mobile utilisée est souvent un mélange ternaire (solvant polaire, solvant de polarité moyenne et

solvant apolaire). Le paramètre physico-chimique concerné est le coefficient d'adsorption.

Chromatographie de partage Le système se compose de deux liquides (la phase stationnaire immobilisée sur un support par adsorption

ou par formation de liaisons chimiques et la phase mobile) pratiquement non miscibles et d'une troisième

substance (soluté) soluble dans les deux phases. Le paramètre physico-chimique concerné est le

coefficient de partage.

Récapitulation

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Types de chromatographies Principe

Chromatographie ionique La phase stationnaire est couramment constituée par des particules sphériques (polystyrène), lesquelles ont été chimiquement transformées en surface pour faire apparaitre des groupements fonctionnels acides ou

basiques qui permettent l'échange de leurs contre-ions mobiles avec des ions, de même signe, présents dans

l'échantillon. La séparation repose sur le coefficient de distribution ionique.

Chromatographie d'exclusion La phase stationnaire est un gel de structure poreuse dont les dimensions sont choisies en rapport avec la

taille des espèces à séparer. On réalise ainsi une sorte de tamis à l'échelle moléculaire, à perméation

sélective. Le coefficient de distribution prend le nom de coefficient de diffusion. Le chromatogramme

donne la relation entre les volumes d'élution et la taille des molécules.

Récapitulation

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Merci pour votre attention